CN103947683A - 一种采用风干污泥菌剂提高高羊茅抗旱性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用风干污泥菌剂提高高羊茅抗旱性的方法，其中所述的原料为：施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液。本研究结果表明，污泥复合微生物菌剂能与草坪植物形成良好的共生关系。复合微生物菌剂可能通过促进宿主植物根系对土壤水分吸收的直接作用和改善植物体内生理代谢活动、提高保护酶活性的间接作用来增强植株的抗旱性，促进植株生长。其中施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌的200倍稀释液的节水率高达57.39%。

Description

一种采用风干污泥菌剂提高高羊茅抗旱性的方法

技术领域

本发明属于环境保护技术领域，涉及风干污泥菌剂提高高羊茅抗旱性的方法。 

背景技术

草坪建植体系构建是现代城市生态建设中必须考虑的重要内容之一，是现代城市社会发展与经济实力的一个有力体现，草坪建植体系的构建对于改善城市投资环境、吸引外资、促进旅游等各个方面都起着不可忽略的作用，而城市中草坪绿化质量及面积也已成为评价城市环境质量的重要客观标准。草坪绿化也日益受到人们的重视。 

草坪对人类赖以生存的环境起着美化、保护和改善的良好作用。但是草坪草是生存于自然界的开放植物体系，虽然其地理分布范围广泛，如在高温、干旱到寒冷潮湿环境中都有分布，但其生命周期中也常遭受不良环境的影响。其中水分是制约草坪草成坪、生长及维持颜色青绿的主要环境因子。特别是在干旱、半干旱地区水资源数量有限，时空分布极不均匀，从而极大地限制了绿地草坪的建植，增加了保养难度，草坪水分管理不当，使其失去本来的美丽，水分胁迫还可使草坪加速老化，缩短草坪使用年限。加之，城市人工培植草坪与天然草坪相比，前者的耐旱能力较差，其草坪根系浅，摄取土壤水分和养分的能力不足，需要进行人工灌溉。研究表明，在我国北方城市，年灌水量大约为0.6-1.0 m³/m²。但是我国淡水资源匮乏，人均淡水资源拥有量居世界末位，我国大多数城市普遍存在水资源缺乏现象，这就进一歩加重了草坪生产管理中的干旱胁迫。因而对草坪草抗旱性研究对节约草坪灌溉用水，缓解城市水资源危机就显得至关重要。 

草坪的数量和质量是城市绿化水平的重要标志。目前，国内草坪建植的方式多种多样，铺设草皮虽然建坪成本高，但见效快，易操作，适用于所有草坪草，被广大绿化工作者普遍接受。北京市园林绿化局曾在2007年的首届京津地区草皮卷产业论坛上表示，到2020年，北京城市绿地率将达到44%至48%。天津泰达生态园林有限公司也在此介绍，滨海新区要建成宜居生态城区，规划2010年绿化率达额到40%，绿地覆盖率达到35%。因此，草皮卷市场空间非常大。冷季型草最适宜的播种时间是夏末初秋和早春，暖季型草坪草在春末夏初。在播种后40～50d后，草皮上的草坪草的覆盖率达95%以上时即可移坪。所以一般在五、六月份第一批草皮卷才可上市。如果能够缩短草皮生产的年周期，提早草皮上市时间，可大幅提高草皮卷的市场竞争力，提高人们的经济收入。而低温是限制草皮生产周期的主要因素。冬季低温还影响草坪草的绿期应用范围，降低其观赏价值。因此，要提早草皮卷上市时间以及建植高质量的草坪就必须深入细致地研究其抗寒性以便更好地在园林绿化中发挥其作用。 

针对以上问题，目前研究集中于选取抗逆性强的草坪植物、应用保水剂、施加化学改良剂、施肥等措施。而微生物菌剂作为一种高效、环保的生物肥料，其抗逆促生作用已得到认可，其抗逆作用方面也有一定研究。 

复合微生物菌剂由两种或两种以上且互不拮抗的微生物菌种按合适比例共同培养，充分发挥群体的联合作用优势，取得较佳应用效果的一种微生物制剂，此类菌剂一般具有有种类全、配伍合理、见效快、投资少、操作简单、不造成二次污染等优点，现已广泛应用于农业、工业、医药和环保等各个领域。 

    施肥是农业生产及草坪养护管理中很重要的措施之一。在目前大部分选用的是无机肥。无机肥虽然能够及时补充土壤养分，但是大量使用却能对地表水、地下水以及空气造成污染，对环境构成威胁。施加微生物肥料是在较低的生态影响条件下维持较高产量的更加和谐的一种施肥方式.比如最经典的菌根真菌、根瘤菌、根际促生细菌等。它的优点主要表现在：1.创造良好的根际生态环境。2.提高土壤以及空气造成污染的供肥能力3.对环境资源的有效利用。4.降低作物对化肥的依赖。5.抑制病虫害的发生。其原因一是有益细菌的大量繁殖大植物根隙区域形成优势种群，抑制了病原微生物生长繁殖，降低了植物酶、多酚氧化酶等，参与植物的防御反应，提高植物的抗病虫害能力。6.减少农药污染等具有重要作用。同时，以城乡有机废弃物为基质，采用现代化的工业技术，制造成具有多种功能(如固氮、解磷、活钾等)再生型复合生物肥料，将对资源的循环利用，实现生态经济、社会效益一体化同样具有重要意义。 

自20世纪70年代以来，欧美日本等国家或地区都相继研制成功了一些复合菌剂，很多已经开始进行大规模的生产，并形成了系列化的产品，主要用于处理生活污水，工农业废水以及其他一些化合物污染的治理。我国国内微生物发展状况经历了从50年代到90年代，从理论到实践，从单一菌种的利用到多个的混合应用，产品也从根瘤菌剂发展到复合微生物菌剂，相继取得了一些成果。 

目前多数研究已表明，微生物制剂应用于农业生产，能促进植物生长，且无毒、无公害、无污染，能持久均衡地供给农作物氮磷钾元素的，被广泛开发用作生物肥料。目前研发的生物菌肥的热点产品主要包括：有机物料腐熟菌剂（也称发酵菌剂）、土壤修复菌剂、根瘤菌剂和溶磷菌剂、烟草等经济作物专用的功能菌剂、生物有机肥、抗旱菌剂等。美国哥斯达黎加大学应用EM技术来种植香蕉，有效减小了香蕉叶斑病的发生和线虫类的侵袭，大大提高了其营养价值和生产效率。 

另外，复合微生物菌剂在畜禽养殖和水产养殖方面也有很明显的作用。复合微生物菌剂能防病抗病，提高成活率，提高生产性能，降低饲养成本，增加经济效， 改善产品品质，生产绿色食品。倪永珍等对鸡进行400d的EM饲喂结果表明，与对照组比较鸡的死亡率平均下降了35.5%。据石专林报道，在饲粮中添加5%的EM发酵饲料，可使肉仔鸡增重提高10.3%，料肉比下降7.8%。刘华周等试验也表明，蛋鸡日粮中 EM发酵饲料占20%时，蛋壳厚度增加6.99%，蛋白哈 氏单位提高10.31%，蛋黄颜色提高1.5罗氏级。 

目前，给草坪草施加微生物菌剂已有报道。真菌可以改良高羊茅、黑麦草等草坪植物的抗逆作用，提高了其抗寒性、抗旱性、抗水分胁迫以及抵抗生物危害的影响。有研究发现接种菌根真菌可使多年生黑麦草根系受到侵染，并可明显增加多年生黑麦草叶片中叶绿素含量，VA 菌根可促进黑麦草对 P、 F e 、 Cu、 M g 、 K、 B、 S i 、 S 和N 等矿质养分的吸收，但却使黑麦草组织中M n 的浓度降低。还研究表明，在干旱的条件下，丛枝菌根的侵染、菌丝的发育均良好，接种从枝菌根后，增强了白三叶草的抗旱能力。有也对五种押宝杆菌进行了研究，结果发现施加过微生物菌剂的黑麦草与没有施加菌剂的对照相比，其株高、干重、叶绿素含量、根系体积和总表面积、根系活力等都显著升高。 

城市污泥是城市污水处理厂在各级污水处理净化后所产生的含水量75%-99%的固体或者流体状物质。它包括污水中的泥砂、纤维、动植物残体等固体颗粒及其凝结的絮状物，各种胶体、有机物及吸附的金属元素、微生物、病菌、虫卵、杂草种子等综合固体物质。城市污泥中出现的微生物主要由细菌、放线菌、 真菌以及原生动物和后生动物等，其中细菌是最主要成分，细菌主要有菌胶团细菌和丝状菌，数量可占污泥中微生物总量的90%-95%左右。 

20世纪80年代之前，活性污泥菌群的研究主要以传统分离培养法为主。该方法从活性污泥中发现的主要优势菌群有：动胶杆菌属、丛毛单胞菌属、不动杆菌属、螺菌属、产碱杆菌属、短杆菌属、黄杆菌属和假单胞菌属等。但是后来大量研究发现，在活性污泥中经典纯培养方法能够培养的细菌数量只占活性污泥微生物总数的 1% ～15%。 

 20 世纪80年代后期，随着以16 S r RNA 为主要基石的细菌分子分类学的发展，PCR 技术、电泳技术、克隆库技术、荧光原位杂交和流式细胞术逐渐成为研究活性污泥菌群的主要手段，活性污泥中菌群的复杂性和多样性也以惊人的速度被人们认识，大量传统检测方法未能发现却在活性污泥中起关键作用的微生物陆续被发现，如具有除磷作用的类红环菌、小月菌、类Tetr asphaera 的棒状菌、俊片菌等；具有脱氮作用的反硝化生丝微菌属、固氮弧菌属相关菌、类硝化螺菌等;与污泥泡沫有关的诺卡氏菌形放线菌、丝状菌和等。 

近期的相关文献及实际生产表明：微生物菌剂在促进植物生长的同时就还能够明显提高植物的抗病、抗旱能力，降低土壤pH和含盐量，提高植物的抗冻能力。尽管植物接种微生物的效应研究报道较多，但大部分研究工作涉及的微生物菌剂只限于从土壤或垃圾堆肥中提取。有关污泥内部微生物菌种之间共生及相互影响关系，以及污泥微生物菌剂应用对植物生长和生理特性的影响方面的研究较少；而在草坪植物抗旱中的应用则更是尚无文献报道。 

城市污泥含有丰富的微生物种类，虽然有些是条件致病菌，但是也含有很多对植物有益菌种。例如假单胞菌的生防促生作用应经得到公认，这方面的研究报道也很多。固氮弧菌属有着高效的固氮作用，他能够侵入水稻、小麦和高粱根内，并提高了幼苗含氮量。并且污泥为微生物提供了一个天然的驯化场所，其微生物具有潜在利用价值。因此筛选污泥中微生物种，群筛选出合适的有益微生物菌株，配制成复合微生物菌剂，研究其对植物的促生作用已经植物在干旱、盐碱或寒冷等逆境条件下的影响是完全可行的。 

基于以上考虑，本技术的主要开展工作是：通过提取和鉴定城市污泥中的微生物，筛选出合适的有益微生物菌株，配制成不同的复合微生物菌剂，探索各污泥微生物菌剂对草坪植物生理生态的影响，筛选和复配出适合草坪植物生长和抵抗逆境的污泥复合微生物菌剂，为以后在此基础上增加其他功能菌株，制备更复杂的高效复合菌剂提供基础。 

综上所述，由于城市污泥的含有丰富的有机质和大量的植物生长所需营养元素，对污泥的园林绿地资源化利用已得到广泛报道。但对城市污泥利用于园林绿地的研究多集中于污泥经过各种处理后形成植物的生长基质，而对污泥微生物的利用则很少见。提取和鉴定城市污泥中微生物菌种，筛选出合适的有益微生物菌株，配制成不同浓度的复合微生物菌剂接种到草坪建植体系中。通过研究污泥复合微生物菌剂对高羊茅生理生态特性以及逆环境下生长的影响，为筛选优良堆肥复合微生物菌剂，提高草坪植物生长活性和抗旱性提供依据。同时为污泥资源有效化利用提供一条新的思路。 

干旱胁迫是植物逆境最普遍的形式，在许多地区是农林牧业发展的瓶颈。据统计，世界干旱、半干旱地区占地球陆地面积的1/3，我国干旱、半干旱地区约占国土面积的1/2，在这些地区建植草坪都会因干旱胁迫而使生长受碍，即使是降水多的地区也普遍存在季节性和非周期性干旱问题，因此干旱胁迫是限制草坪草生长的最主要环境因子之一。针对干旱问题，目前研究集中于选取抗旱性强的草坪植物、节水灌溉方式以及覆盖保水、应用保水剂等方面，亦有研究者利用氮磷钾肥来提高草坪草抗旱性。 

   有研究发现一定浓度的光合菌能够缓解干旱引起的欧李细胞膜丙二醛的增加，保护幼苗膜系统。人们发现枯草芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、胶质芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可提高玉米种子在干旱胁迫条件下的出苗率，促进幼苗及其根系的生长，增强幼苗抗旱能力。在干旱胁迫条件下，接种印度梨形孢真菌能够维持花生正常生长，使得花生从植株外部形态上表现出较强的抗旱性。但是目前关于假单胞菌，木霉及链霉菌的复合微生物菌剂的抗旱方面的研究还很少，其应用于草坪植物抗旱性的技术更是尚未见报道。 

本发明基于前期接种施氏假单胞菌，里氏木霉及灰黄链霉菌的复合微生物菌剂对草坪植物生理生态影响研究的基础上，筛选出合适的有益微生物菌株，配制成不同浓度的复合微生物菌剂接种到草坪建植体系中，进一步研究在水分胁迫条件下，复合微生物菌剂对栽培基质的保水性能及对高羊茅生理特性的影响，目的是为筛选优良抗旱污泥复合微生物菌剂，提高草坪植物抗旱性，促进干旱环境草坪植物的建植提供技术支撑。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用风干污泥菌剂提高高羊茅抗旱性的方法。本研究结果表明，污泥复合微生物菌剂能与草坪植物形成良好的共生关系。复合微生物菌剂可能通过促进宿主植物根系对土壤水分吸收的直接作用和改善植物体内生理代谢活动、提高保护酶活性的间接作用来增强植株的抗旱性，促进植株生长。为实现此目的，本发明提供如下的技术方案： 

一种风干污泥菌剂，其特征在于它是由下述成分组成：

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液；

其中施氏假单胞菌：里氏木霉：黄链霉菌的体积份数比为1:1:1

3菌种的菌落数在(2.15±0.03)×10⁹/ml~ (2.07±0.07)×10⁹/ml之间，假单胞菌的OD600 nm值为0.592。

优选的原料为：施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液。 

本发明进一步公开了一种采用风干污泥菌剂提高高羊茅抗旱性的方法，其特征在于按如下的步骤进行： 

（1）材料的选择：

 选取挑选籽粒饱满、均匀一致的高羊茅 ( Festuca arundinacea L .) 种子为试验材料；供试土壤为普通园土，pH 7.44，饱和含水量0.58 ml/g，有机质4.68%，全氮0.21%，有效磷22.03 mg/kg，全钾45.61g/kg；

（2）制备方法

复合微生物菌剂制备:选取施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，将分离出的菌种纯化培养2代取活化菌种，接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD600 nm值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线；选取对数生长期的菌种，按照下面要求配制复合微生物菌剂；

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液；

其中施氏假单胞菌：里氏木霉：黄链霉菌的体积份数比为1:1:1

（3）试验方法：

 试验采取室内盆栽的方法，选取直径75 cm，高8 cm的一次性水杯为草坪植物培植容器，装入基质土壤180 g，其最大持水量为43.54%；本试验采用重度干旱胁迫，胁迫程度为30~40%田间最大持水量（MFC），将0.4 g草坪种子播种其上，每天统一定量给水，以保持培养基质有较好的水分状况，经常调换各培养容器位置，以保证光照一致，待植物生长到10 d后，以浇灌的形式加入上述不同处理的微生物菌剂15ml，接种菌剂3天后，再进行干旱胁迫，采用称重浇水，按照胁迫程度进行定量给水，处理30天后进行植物各指标的测定。养期间实验室的平均温度为22~30℃；平均湿度为52.3 %。光照为自然光，然后进行各项指标测定；

所述的不同处理的微生物菌剂为：

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液；

其中施氏假单胞菌：里氏木霉：黄链霉菌的体积份数比为1:1:1

本发明同时也公开了污泥复合微生物菌剂在增强植株的抗旱性促进植株生长方面的应用。特别是在提高植物吸水吸肥能力缓解干旱压力以及在提高植株节水率方面的应用；其中所述的复合微生物菌剂为假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌的200倍稀释液。

本发明更加详细的制备方法如下: 

1 研制材料与方法

1.1 研制材料

（1）草种与土壤

选取挑选籽粒饱满、均匀一致的高羊茅 ( Festuca arundinacea L .) 种子为试验材料。供试土壤为天津师范大学校内园土，pH 7.44，饱和含水量0.58 ml/g，有机质4.68%，全氮0.21%，有效磷22.03 mg/kg，全钾45.61g/kg。

（2）菌株的培养 

称取新鲜污泥，采用稀释分离法制备10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的污泥悬浮液。根据所分离的微生物，取不同浓度的污泥悬浮液 (真菌取10^-3、10^-4，放线菌取10^-4、10^-5，细菌取10^-5、10^-6)，摇匀后吸取0.2 mL加入到预先制好的平板中。真菌用马丁氏琼脂平板；放线菌用高氏一号琼脂平板；细菌用牛肉膏蛋白胨平板。用灭菌的涂布器涂抹均匀，每处理重复 3次，28℃培养。根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度等特点，从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化。依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计数量。确定优势菌株，进行编号保存，待进一步鉴定。

（3）菌种的鉴定 

镜检：细菌的鉴定采用革兰氏染色法，放线菌采用印片法，丝状真菌直接镜下观察。

PCR鉴定：直接挑取单菌体溶于100 μL高纯水中，沸水中煮10 min裂解菌体，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版。细菌和放线菌采用通用引物27f(5’—AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3’)和1492R(5’—GGTTACCTTGTTACGACTT— 3’)进行PCR扩增16S rRNA基因。真菌采用真菌核糖体18S rDNA的通用引物ITS1(5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3’)和 ITS4 (5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC —3’）进行PCR扩增。PCR反应程序如下：94℃2 min，94℃1 min，57℃1 min，72℃1 min，25个循环；72℃10 min。扩增产物送至上海美吉基因公司测序。测序结果在NCBI网站上用BLAST软件与GenBank核酸数据库中相关种属的16S rDNA和18S rDNA序列进行同源性比较。 

（4）菌剂的配制 

选取对植物生长有利的细菌、真菌、放线菌各1种，分别为假单胞菌、木霉和链霉菌，将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD600 nm值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线。选取对数生长期的菌种，配制成菌剂。

1.2 研制方法 

     复合微生物菌剂制备:选取对植物生长有利的细菌、真菌、放线菌各1种，分别为施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD600 nm值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线。选取对数生长期的菌种，按照下面要求配制复合微生物菌剂。

1.3 技术设计 

试验采取室内盆栽的方法，选取直径75 cm，高8 cm的一次性水杯为草坪植物培植容器。装入基质土壤180 g，其最大持水量为43.54%。试验共设11个处理，分别是处理1为对照，不接种菌剂（CK）；处理2加入施氏假单胞菌+里氏木霉原菌液（CM₁）；处理3加入施氏假单胞菌+里氏木霉100倍稀释液的菌剂（CM₂）；处理4加入施氏假单胞菌+里氏木霉200倍稀释液的菌剂（CM₃）；处理5加入施氏假单胞菌+里氏木霉300倍稀释液菌剂（CM₄）；处理6加入施氏假单胞菌+里氏木霉400倍稀释液菌剂（CM₅），处理7加入施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌原菌液（CD₁）；处理8加入假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌100倍稀释液的菌剂（CD₂）；处理9加入假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌200倍稀释液的菌剂（CD₃）；处理10加入假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌300倍稀释液菌剂（CD₄）；处理11加入假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌400倍稀释液菌剂（CD₅）。各处理菌液按体积比为1：1和1：1：1的比例混合后用无菌水稀释，以上各处理分别为15ml，每个处理3次重复。本试验采用重度干旱胁迫，胁迫程度为30~40%田间最大持水量（MFC）。将0.4 g草坪种子播种其上。每天统一定量给水，以保持培养基质有较好的水分状况，经常调换各培养容器位置，以保证光照一致。待植物生长到10 d后，以浇灌的形式加入上述不同处理的微生物菌剂15ml，接种菌剂3天后，再进行干旱胁迫，采用称重浇水，按照胁迫程度进行定量给水，处理30天后进行植物各指标的测定。养期间实验室的平均温度为22~30℃；平均湿度为52.3 %。光照为自然光。

1.4 测定指标 

1.4.1叶绿素含量的测定：

叶绿素含量的测定：取0.1 g叶片，剪成1-2 mm碎片，浸泡于丙酮:乙醇（V:V=1:1）溶液中24小时，浸泡液为待测液。用分光光度计于波长633 nm和645 nm下测量吸光值，并根据公式计算叶绿素含量；计算公式结果计算：

                                                          

1.4.2 脯氨酸含量的测定

    采用酸性茚三酮比色法；称取0.5 g叶片剪碎，分别置于大试管中，然后分别加入10 ml 3%的黄基水杨酸，在沸水浴中提取10min（提取过程要经常摇动），冷却后在3000 r·min^-1离心10min，吸取2ml提取液于另一干净的带塞试管中，加入2 ml冰醋酸及2 ml酸性茚三酮，沸水中加热30 min，冷却用4 ml甲苯提取，3000 r·min^-1离心5 min，取上层液于520 nm下测吸光值。结果计算：标准曲线查出2 ml测定液中脯氨酸含量(ug/ml)，然后计算样品中脯氨酸含量百分数。公式如下：

  

1.4.3 丙二醛（MDA）含量的测定

采用硫代巴比妥酸法；称取0.5 g叶片，用10%TCA提取，定容10 ml，4000 r·min^-1离心10 min，取上层液2 ml再加入2 ml的0.6%TBA，沸水中15min，离心10 min，取上清液于532 nm和450 nm下测吸光值。

1.4.4 保护酶含量测定 

粗酶液提取：准确称取0.5 g样叶，用磷酸缓冲液（PBS，pH7.8）冰浴研磨提取，定容25 ml，取10 ml于离心管中，10000 r·min^-1EPPENDOFF离心机离心20 min，上清液为粗酶提取液。

POD活性测定采用愈创木酚法，3mL的反应混合液（PH6.0的磷酸缓冲液50mL，加入愈创木酚28μL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30％过氧化氢19μL，混合均匀，保存于冰箱中），加入酶液100μL，立即开启秒表计时，在470 nm波长下测量吸光度值，每隔0.5 min读数一次。以每分钟OD值变化表示酶活性的大小，即以△OD470/min表示。并以每分钟△A470变化0.01为一个过氧化物酶活性单位。 

SOD活性测定采用NBT法（Sundar等，2004），在盛有3ml反应混合液（54ml 14.5mmol/L dl-甲硫氨酸中分别加入3μmol/L EDTA、2.25mmol/L NBT、60μmol/L核黄素溶液各2ml）的试管中，加入50μL的粗酶液，混合后放在透明的试管架上，于光照培养箱中在4000 Lx日光灯下准确照光反应20 min，以不加酶液的照光管为光照对照，同时将对照管置于暗处（以缓冲液代替酶液），用做调零。SOD活性单位是以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位，在560nm波长下测定吸光度值，计算反应被抑制的百分比。 

CAT活性测定采用紫外分光光度法，在试管中加入反应混合液（pH7.8的磷酸缓冲液1.5ml、酶液0.2ml、蒸馏水1.0ml），对照管用缓冲液代替酶液，然后在测定管中加入0.3ml浓度为0.1mol/L的过氧化氢（30%过氧化氢1.13ml蒸馏水定容到100ml），同时立即计时，迅速在240nm波长下测量吸光度值，每隔0.5 min读数一次。以每分钟△A240变化0.01为一个过氧化氢酶活性单位。 

1.4.5 离体叶片持水力的测定 

将准确称过鲜重的植物叶片，放入25℃~30℃的干燥器中，在黑暗条件下干燥2~6 h，再称量失水后叶片的重量，按下式计算失水率：失水率（%）＝（鲜重－失水后重）/ 鲜重×100%  

1.4.6 节水率的测定

   记录各处理每天的给水量，计算实验期间各处理给水总量。按下式计算节水率：节水率（%）＝（处理组总给水量－对照组总给水量）/ 对照组总给水量×100%  

1.5 数据分析

采用Microsoft Excel 2003和 SPSS 11.5软件进行处理。

2 研制结果分析 

2.1 菌种筛选

由表1可以看出，所得微生物菌剂中富含施氏假单胞菌、里氏木霉、灰黄链霉菌，3菌种的菌落数在(2.15±0.03)×10⁹/ml~ (2.07±0.07)×10⁹/ml之间，假单胞菌的OD600 nm值为0.592。

表1微生物菌剂所含的菌落数 

菌剂	1mL菌落数	15 mL菌落数	OD600 nm
				施氏假单胞菌	(2.15±0.03)×109	（3.23±0.03)×1010	0.592±0.001
里氏木霉	(2.01±0.13)×109	(3.01±0.13)×1010	-
				灰黄链霉菌	(2.07±0.07)×109	(3.11±0.07)×1010	2.150±0.003

2.2微生物菌剂对干旱胁迫下高羊茅叶绿素含量的影

 接种菌剂后能明显提高高羊茅叶绿素的含量（表2）。叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素都以CD₃处理即假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉200倍稀释液效果最为显著，分别比空白对照高出了90.19%、126.31%和99.71%。而假单胞菌+里氏木霉组则以其100倍稀释液效果最好，分别比对照高出35%、84.21%和72.61%。但是特显著低于CD₃处理组，其降低的百分数分别为11.34%、18.60%和15.70%。说明微生物菌剂的施入可明显增强草坪草对光能的吸收和利用，提高草坪草叶绿素含量。

表2不同菌剂对高羊茅叶绿素含量的影响（mg.g-1 FW） 

注：同行数据不同字母表示差异显著P<0.05下同

2.3 微生物菌剂对干旱胁迫下高羊茅丙二醛、脯氨酸含量、离体叶片持水率的影响

干旱胁迫下复合微生物菌剂处理高羊茅叶片脯氨酸含量均显著低于未接种的对照植株（表3）。对于CM菌剂，高羊茅叶片脯氨酸含量表现出先降后生的趋势，在100倍稀释液复合菌剂处理下，达到对低值，此时高羊茅叶片脯氨酸含量比对照降低了38.81%，后随着稀释倍数的增加，脯氨酸含量也在升高。对于CD菌剂也表现出相同的趋势。所不同的是，CD菌剂在200倍稀释液菌剂处理下达到最低值，比对照降低了41.07%。从表上可以看出CD3比CM2的效果更加显著（P<0.05）。丙二醛的含量和叶片持水力同样如此，CM菌剂在100倍稀释液处理下效果最好，CD菌剂则在200倍稀释液下效果最好，但是200倍的CD菌液要比100倍的CM菌液效果显著。CM菌剂在100倍稀释液处理，高羊茅丙二醛含量下比对照下降了62.11%，离体叶片的持水力比对照提高了13.6%；CD菌剂在200倍稀释液下；高羊茅丙二醛含量下比对照下降了68.22%，离体叶片的持水力比对照提高了16.41%。说明接种污泥微生物菌剂使植物保持较高的离体叶片持水力，有利于植物提高自身的抗旱能力。

      表3微生物菌剂对高羊茅丙二醛、脯氨酸含量、离体叶片持水率的影响 

注：同行数据不同字母表示差异显著P<0.05下

2.4  微生物菌剂对干旱胁迫下草坪植物叶片保护酶活性的影响 

干旱胁迫下复合微生物菌剂处理高羊茅叶片三种保护酶含量均显著高于未接种的对照植株（表4）。对于CM菌剂，高羊茅三种保护酶含量表现出先升后降的趋势，在100倍稀释液复合菌剂处理下，达到对高值，此时高羊茅叶片CAT活性、POD活性以及SOD活性分别比对照降升高了138%、37.38%、459%。对于CD菌剂也表现出相同的趋势。所不同的是，CD菌剂在200倍稀释液菌剂处理下达到最高值，此时高羊茅叶片CAT活性、POD活性以及SOD活性分别比对照降升高了156%、49.01%、567%。从表上可以看出CD3比CM2的效果更加显著（P<0.05）。

表4 CM对干旱胁迫下草坪植物叶片保护酶活性的影响 

2.5微生物菌剂对干旱胁迫下高羊茅用水量的影响 

2.6干旱胁迫下复合微生物菌剂处理高羊茅与未接种复合微生物菌剂的高羊茅相比，给天给水量与总给水量并没有显著性差异（表5）。但是从上述数据可以看出，接种微生物菌剂后，高羊茅的生理指标如叶绿素、脯氨酸、丙二醛和保护酶都显著好于未接种的高羊茅。因此，接种污泥微生物菌剂能够提高高羊茅的耐旱程度。

表5 CM对干旱胁迫下草坪植物叶片保护酶活性的影响 

3 研制结论

本研究结果表明，污泥复合微生物菌剂能与草坪植物形成良好的共生关系。复合微生物菌剂可能通过促进宿主植物根系对土壤水分吸收的直接作用和改善植物体内生理代谢活动、提高保护酶活性的间接作用来增强植株的抗旱性，促进植株生长。在水分胁迫下，用CM和CD 菌剂处理能显著植物的生长，为其吸收深层土壤水分提供了形态基础，而植物体内脯氨酸，保护酶，SOD比活力和叶片离体持水力的增加，提高了植物吸水吸肥能力，所以在干旱条件下使用菌剂能有效缓解干旱压力，并且对于高羊茅来说，不同菌种及不同稀释倍液不同的复合菌剂效果也不同。对于施氏假单胞菌+里氏木霉以稀释100倍效果最好，施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌则以稀释200倍效果最好，并且要施氏假单胞菌+里氏木霉的100倍稀释的效果好。施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌的200倍稀释液的节水率高达57.39%。

附图说明： 

图1为施氏假单胞菌的生长曲线；                                    

   图2为黄链霉菌的生长曲线。

 具体实施方式： 

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。其中所用到的化学试剂均有市售。其中施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌均由市售，也可以根据实施例1的方法加以配制。所述的马丁氏琼脂平板培养基、高氏一号琼脂平板培养基、牛肉膏蛋白胨平板培养基均有市售。

实施例1 

 (1)菌株的培养

称取新鲜污泥，采用稀释分离法制备10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的污泥悬浮液。根据所分离的微生物，取不同浓度的污泥悬浮液 (真菌取10^-3、10^-4，放线菌取10^-4、10^-5，细菌取10^-5、10^-6)，摇匀后吸取0.2 mL加入到预先制好的平板中。真菌用马丁氏琼脂平板；放线菌用高氏一号琼脂平板；细菌用牛肉膏蛋白胨平板。用灭菌的涂布器涂抹均匀，每处理重复 3次，28℃培养。根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度等特点，从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化。依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计数量。确定优势菌株，进行编号保存，待进一步鉴定。

(2)菌种的鉴定 

镜检：细菌的鉴定采用革兰氏染色法，放线菌采用印片法，丝状真菌直接镜下观察。

PCR鉴定：直接挑取单菌体溶于100 μL高纯水中，沸水中煮10 min裂解菌体，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版。细菌和放线菌采用通用引物27f(5’—AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3’)和1492R(5’—GGTTACCTTGTTACGACTT— 3’)进行PCR扩增16S rRNA基因。真菌采用真菌核糖体18S rDNA的通用引物ITS1(5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3’)和 ITS4 (5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC —3’）进行PCR扩增。PCR反应程序如下：94℃2 min，94℃1 min，57℃1 min，72℃1 min，25个循环；72℃10 min。扩增产物送至上海美吉基因公司测序。测序结果在NCBI网站上用BLAST软件与GenBank核酸数据库中相关种属的16S rDNA和18S rDNA序列进行同源性比较。 

(3)菌剂的配制 

复合微生物菌剂制备：选取对植物生长有利的细菌、真菌、放线菌各1种，分别为施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD600 nm值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线。选取对数生长期的菌种，按照下面要求配制复合微生物菌剂。

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或 

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液；其中施氏假单胞菌：里氏木霉：黄链霉菌的体积份数比为1:1:1。

实施例2 

一种采用风干污泥菌剂提高高羊茅抗旱性的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）材料的选择：

 选取挑选籽粒饱满、均匀一致的高羊茅 ( Festuca arundinacea L .) 种子为试验材料；供试土壤为普通园土，pH 7.44，饱和含水量0.58 ml/g，有机质4.68%，全氮0.21%，有效磷22.03 mg/kg，全钾45.61g/kg；

（2）制备方法

复合微生物菌剂制备:选取施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD600 nm值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线；选取对数生长期的菌种，按照下面要求配制复合微生物菌剂；施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液；其中施氏假单胞菌：里氏木霉：黄链霉菌的体积份数比为1:1:1

（3）试验方法：

 试验采取室内盆栽的方法，选取直径75 cm，高8 cm的一次性水杯为草坪植物培植容器，装入基质土壤180 g，其最大持水量为43.54%；本试验采用重度干旱胁迫，胁迫程度为30~40%田间最大持水量（MFC），将0.4 g草坪种子播种其上，每天统一定量给水，以保持培养基质有较好的水分状况，经常调换各培养容器位置，以保证光照一致，待植物生长到10 d后，以浇灌的形式加入上述不同处理的微生物菌剂15ml，接种菌剂3天后，再进行干旱胁迫，采用称重浇水，按照胁迫程度进行定量给水，处理30天后进行植物各指标的测定。养期间实验室的平均温度为22℃；平均湿度为52.3 %。光照为自然光，然后进行各项指标测定。

实施例3 

一种风干污泥菌剂，其特征在于它是由下述成分组成：

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液；其中施氏假单胞菌：里氏木霉：黄链霉菌的体积份数比为1:1:1；3菌种的菌落数在(2.15±0.03)×10⁹/ml~ (2.07±0.07)×10⁹/ml之间，假单胞菌的OD600 nm值为0.592，按如下的步骤进行：

（1）材料的选择：

 选取挑选籽粒饱满、均匀一致的高羊茅 ( Festuca arundinacea L .) 种子为试验材料；供试土壤为普通园土，pH 7.44，饱和含水量0.58 ml/g，有机质4.68%，全氮0.21%，有效磷22.03 mg/kg，全钾45.61g/kg；

（2）制备方法

复合微生物菌剂制备:选取施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD600 nm值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线；选取对数生长期的菌种，按照下面要求配制复合微生物菌剂；生长曲线图如下：

（3）试验方法：

 试验采取室内盆栽的方法，选取直径75 cm，高8 cm的一次性水杯为草坪植物培植容器，装入基质土壤180 g，其最大持水量为43.54%；本试验采用重度干旱胁迫，胁迫程度为30~40%田间最大持水量（MFC），将0.4 g草坪种子播种其上，每天统一定量给水，以保持培养基质有较好的水分状况，经常调换各培养容器位置，以保证光照一致，待植物生长到10 d后，以浇灌的形式加入上述不同处理的微生物菌剂15ml，接种菌剂3天后，再进行干旱胁迫，采用称重浇水，按照胁迫程度进行定量给水，处理30天后进行植物各指标的测定。养期间实验室的平均温度为28℃；平均湿度为52.3 %。光照为自然光，然后进行各项指标测定。

Claims (6)

1.一种风干污泥菌剂，其特征在于它是由下述成分组成：

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液；

其中施氏假单胞菌：里氏木霉：黄链霉菌的体积份数比为1:1:1； 

3菌种的菌落数在(2.15±0.03)×10⁹/ml~ (2.07±0.07)×10⁹/ml之间，假单胞菌的OD600 nm值为0.592。

2.权利要求1所述的风干污泥菌剂，其中所述的原料为：施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液。

3.一种采用风干污泥菌剂提高高羊茅抗旱性的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）材料的选择：

 选取挑选籽粒饱满、均匀一致的高羊茅 ( Festuca arundinacea L .) 种子为试验材料； 

（2）制备方法

复合微生物菌剂制备:选取施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，将分离出的菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，以菌悬液的OD600 nm值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制微生物的生长曲线；选取对数生长期的菌种，按照下面要求配制复合微生物菌剂； 

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液；

其中施氏假单胞菌：里氏木霉：黄链霉菌的体积份数比为1:1:1；

（3）试验方法：

 试验采取室内盆栽的方法，选取直径75 cm，高8 cm的一次性水杯为草坪植物培植容器，装入基质土壤180 g，其最大持水量为43.54%；本试验采用重度干旱胁迫，胁迫程度为30~40%田间最大持水量，将0.4 g草坪种子播种其上，每天统一定量给水，以保持培养基质有较好的水分状况，经常调换各培养容器位置，以保证光照一致，待植物生长到10 d后，以浇灌的形式加入上述不同处理的微生物菌剂15ml，接种菌剂3天后，再进行干旱胁迫，采用称重浇水，按照胁迫程度进行定量给水，处理30天后进行植物各指标的测定，养期间实验室的平均温度为22~30℃；平均湿度为52.3 %，光照为自然光，然后进行各项指标测定；

所述的不同处理的微生物菌剂为：

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或

施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液；

其中施氏假单胞菌：里氏木霉：黄链霉菌的体积份数比为1:1:1。

4.污泥复合微生物菌剂在增强植株的抗旱性促进植株生长方面的应用。

5.污泥复合微生物菌剂在提高植物吸水吸肥能力缓解干旱压力方面的应用。

6.污泥复合微生物菌剂在提高植株节水率方面的应用；其中所述的复合微生物菌剂为假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌的200倍稀释液。