CN110257258A - 一种能促进木荷磷吸收的内生真菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能促进木荷磷吸收的内生真菌，该内生真菌MY72为青霉（Penicillium sp.），已于2019年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No.17479。该菌株是从木荷叶片中分离纯化得到的，其可显著促进幼苗根冠比的生长，提高幼苗SOD、根系酸性磷酸酶活性和可溶性蛋白含量，从而提高幼苗对低磷环境的适应性。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种能促进木荷磷吸收的内生真菌。
背景技术
磷是植物生长发育所需的三大营养元素之一，磷素缺乏会影响植物光合、物质能量转化等生命活动代谢过程。我国南方土壤普遍缺磷，且土壤中的磷几乎以无效磷的方式存在，可供植物吸收利用的部分很少。在低磷环境下，植物会自身演化一系列响应机制以缓解磷素供应不足对其生长的制约，如增加对环境中可利用性磷的吸收利用效率，减少生命过程对磷素的消耗和加速磷素的循环利用等。
木荷因具有优化林分结构、改良土壤肥力等多种优良特性，在我国的种植面积不断扩大，是我国重要的防火、绿化和用材树种。近年来，由于市场对木荷的需求量不断增大，引起木荷人工林的过度开发，加之粗放的木荷人工林经营模式，导致木荷林产量不断下降。此外，由于我国南方土壤普遍缺磷，可供植物吸收利用的有效磷含量很低。磷元素作为植物生长发育所需三大营养元素之一，磷素供应不足使木荷生长代谢过程受阻，造成木荷品质变差、林分产量降低，严重限制木荷人工林的发展规模。因此，提高木荷林的产量和品质，解决木荷林低产低效问题，尤其是低磷环境对木荷生长的制约，是目前木荷人工林经营过程中面临最大的挑战。
国内外学者已从植物体内筛选出多种具有促生和解磷效果的内生真菌，但目前的研究主要集中于禾木科植物相关菌株的筛选，有关于木本植物，尤其是对木荷内生真菌筛选鉴定的研究鲜见报道。从木荷组织器官中筛选出对木荷生长和抗逆性有益的内生真菌，建立木荷-内生真菌共生体系，以期获得可促进木荷生长，提高木荷在低磷胁迫下抗逆性的内生真菌，可为丰富木本植物内生真菌的菌种信息以及为木荷人工林经营制造生物菌肥提供数据基础和参考依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能促进木荷磷吸收的内生真菌，应用其制备的菌液对低磷环境下木荷的生长有显著促进作用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种能促进木荷磷吸收的内生真菌，该内生真菌MY72为青霉（Penicillium sp.），已于2019年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No. 17479，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。MY72的营养菌丝体无色。菌丝有横隔，分生孢子梗亦有横隔，光滑。基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，其分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚。分生孢子球形，光滑，生长时呈蓝绿色。
本发明提供的菌株是从木荷叶片中分离纯化得到的，其可制备成菌液，通过根际土壤浇施或苗木直接接种的方式可用于低磷环境下木荷苗木的种植。
所述菌液的制备方法为：将所述菌株接入液体培养基中，摇床恒温培养72h后，将所得培养液用无菌水稀释至5.5×106个•L-1，即得。所述液体培养基配方为：蛋白胨5.0g，酵母浸出粉2.0g，葡萄糖（C6H12O6•H2O）20.0g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0g，硫酸镁（MgSO4•7H2O）0.5g，超纯水1000ml，pH 6.2~6.6。
本发明所得菌株可显著促进幼苗根冠比的生长，提高幼苗SOD、根系酸性磷酸酶活性和可溶性蛋白含量，从而提高幼苗对低磷环境的适应性。
附图说明
图1为所得内生真菌MY72的菌落形态图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1 木荷内生真菌的分离
1. 主要仪器设备
超净工作台SW-CJ-1FD、恒温培养箱HH•B11-II、恒温培养振荡器zhwy-211B、万分之一天平AR1140、全自动立式灭菌器LMQ.C-4060、超纯水机P60-CW等。
2. 主要试剂和培养基
试剂：15%次氯酸钠、75%无水乙醇、引物PAGE 11-59bp OD 1-2、DNA电泳loadingbuffer、GoodViewTM 核酸染料、2×Tap PCR MasterMix、真菌DNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒。
培养基：（1）改良马丁琼脂培养基：蛋白胨5.0g，酵母浸出粉2.0g，葡萄糖（C6H12O6•H2O）20.0g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0g，硫酸镁（MgSO4•7H2O）0.5g，琼脂15.0g，超纯水1000ml，pH 6.2~6.6。
（2）改良马丁液体培养基：蛋白胨5.0g，酵母浸出粉2.0g，葡萄糖（C6H12O6•H2O）20.0g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.0g，硫酸镁（MgSO4•7H2O）0.5g，超纯水1000ml，pH 6.2~6.6。
（3）磷酸三钙无机磷培养基（NBRIP）：葡萄糖（C6H12O6•H2O）10.0 g，硫酸铵（(NH4)2SO4）0.5 g，硫酸镁（MgSO4•7H2O）0.3 g，氯化钠（NaCl）0.3 g，氯化钾（KCl）0.3 g，硫酸亚铁（FeSO4•7H2O）0.03 g，硫酸锰（MnSO4•4H2O）0.03 g，磷酸三钙（Ca3(PO4)2）5.0 g，琼脂18.0g，蒸馏水1000 ml，pH 7.0～7.5。
3. 内生真菌的分离
（1）采用组织分离法，将木荷叶片经流水冲洗干净、阴干后于超净台内进行组织表面消毒，其操作流程为：75%无水乙醇消毒→无菌水清洗2~3遍→15%次氯酸钠消毒→无菌水清洗2~3遍。将消毒后的叶子切成2mm×2mm大小，置于改良马丁琼脂培养基上，28℃恒温避光培养。
（2）消毒效果的验证：将消毒最后一步清洗样品的无菌水涂布于未使用的改良马丁琼脂培养基上，28℃恒温培养4~7d，若无菌体长出则为消毒干净。采用组织印迹法，将消毒后的样本组织于未使用的改良马丁琼脂培养基上轻轻滚动或紧贴培养基放置5min后取走做对照，28℃恒温培养4~7d，如无菌体长出则为消毒干净。各对照重复3次。
4. 内生真菌的纯化
待组织材料培养3~5d后，用接种针挑取组织周围菌落生长良好的菌丝，分别于新的改良马丁琼脂培养基上采用划线法进行菌株纯化，倒置于恒温培养箱内，28℃恒温避光培养4~7d。反复纯化3~4次，得到纯化菌株。将纯化后的菌株接入斜面培养基，于4℃保存。
5. 内生真菌的筛选
（1）平板初筛：采用三点接种法，将于改良马丁琼脂培养基上活化后的菌株接种于NBRIP培养基，28℃恒温培养7d。每个菌株三个重复，根据平板内透明圈的大小初步筛选具有解磷能力的菌株。
（2）摇瓶复筛：于100ml三角瓶内加入40ml NBRIP液体培养基（不含琼脂），高温（115℃、20min）灭菌备用。将于改良马丁琼脂培养基上活化后的菌株接种于NBRIP液体培养基，摇床培养7d（28℃、180r min-1）。用无菌移液器吸取1.5ml菌液于离心管离心10min（4℃、10000r min-1），取上清液用钼蓝比色法测定菌液内有效P含量，得到目标菌株。每个菌株3个重复，以不接菌的NBRIP液体培养基为对照。
6. 内生真菌的DNA提取和鉴定
6.1 菌株总DNA的提取
将供试菌株用改良马丁琼脂培养基活化后，采用OMEGA 基因组DNA提取试剂盒（D3485-01）提取菌株的总DNA。
6.2 菌株18S rDNA的PCR扩增
利用真菌18S rDNA通用引物ITS1（5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇）和ITRS4（5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇）为正、反引物，扩增其ITS序列。
25μl PCR扩增反应体系：
，
PCR反应条件：
。
6.3 PCR产物回收
PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，割取目的条带，用天根回收试剂盒（DP214-03）进行纯化回收，进行测序。
6.4 菌株18S rDNA序列分析
将所得ITS rDNA序列提交NCBI数据库进行序列对比分析，选取与Genbank中同源性为99%以上的序列，初步确定菌株的属。
18S rDNA全序列为：
CTTCCGTAGGGGTACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGCGAGAATTCTCTGAATTCAACCTCCCACCCGTGTTTATTGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCATCTGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCTTGAACTCTGTATGAAAATTGCAGTCTGAGTCTAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCTCGTCCCCCTTCCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCAAAACTTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。
实施例2
菌液制备：将活化后的解磷菌接入40mL改良马丁液体培养基中，置于恒温摇床上培养72h（28℃、160 r•min-1）。用血球计数法计算计算孢子数量，将培养后的菌液用无菌水按十倍稀释法稀释成5.5×106个•L-1。
本试验采用土培盆栽试验，试验所选木荷幼苗为一年生实生苗，平均苗高为20cm，平均地径为3.0mm，由福建省林业科学研究院提供。在2016年3月3日选取长势一致的木荷幼苗定植于直径15cm、高10cm的塑料盆内。实验所需土壤经过混匀称量，每盆放入等量（4kg）的黄心土，该土壤中养分含量见表1。经一个月恢复性生长后，于2016年4月3日开始接菌，连续3天于木荷根际土壤施入等浓度的100mL菌液。每种菌液处理4次重复，并以蒸馏水处理为空白对照。
表1 基质土壤养分情况单位：mg/kg
低磷胁迫：根据预备试验和有关资料，以KH2PO4为磷肥设计了正常胁迫（16mg/kg）、轻度胁迫（8mg/kg），中度胁迫（4mg/kg）和重度胁迫（0mg/kg）4个磷处理，每个处理3个重复。于2016年4月18日进行低磷胁迫试验，并在胁迫试验后定期补充钾肥、氮肥及其他微量元素以满足木荷幼苗生长对营养元素的要求，分别在胁迫至15d、30d、45d、60d、90d和120d时进行全部木荷幼苗生长指标的测定。
测定指标：
1、根冠比测定：根冠比指标采用植株地下部分与地上部分的干物质质量比。
2、SOD测定：采用SOD试剂盒进行测定。
其具体操作为：准确称取木荷幼苗叶片0.25g，剪碎后放入2ml离心管内，按重量（g）：体积（ml）=1:4的比例加入4倍体积的匀浆介质，用内切式匀浆机冰水浴匀浆，制成20%的匀浆液。将离心管置于离心机内离心（4℃、3500r min-1、10min）。取上清液于新的5ml离心管内，按表2加入相应反应液。
表2
将各管反应液用旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40min。取出于各管内加入2ml显色剂，置于室温显色10min后放入紫外可见分光光度计内于550nm波长处测定各管吸光值。
SOD的计算公式如下：
。
单位定义：每克植物植株在本反应体系中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（Ｕ）。
3、可溶性蛋白含量的测定：
准确称取木荷幼苗叶片0.1g置于2ml离心管内，按重量（g）：体积（ml）=1:9的比例加入9倍体积的生理盐水，用内切式匀浆机冰水浴匀浆，置于离心机内离心（4℃、3500r min-1、10min）,取上清液用生理盐水按1:4稀释成2%的组织匀浆，按表3加入相应反应试剂。
表3
混匀后静置10min，于紫外可见分光光度计内测定各管在595nm下的吸光度值。
可溶性蛋白含量的计算公式如下：
。
4、根系酸性磷酸酶活性的测定
准确称取木荷幼苗叶片0.1g，按重量（g）：体积（ml）=1:9的比例加入9倍体积的生理盐水，用内切式匀浆机冰水浴匀浆，置于离心机内离心（4℃、3500r min-1、10min），取上清液于新的96孔酶标仪空板内（新的96孔酶标仪空板在使用前已扫描），按表4加入相应反应液。
表4
将加入反应液的96孔板用保鲜膜封住放入人工气候箱内温浴30min，取出后于每孔内加入80μl碱液和80μl显色剂，轻轻振摇孔板混匀，静置显色10min，放入酶标仪内于520nm波长处测定各孔吸光度。
磷酸酶活性的计算公式如下：
单位定义：每克组织蛋白在37℃与基质作用30分钟产生1mg酚为1金氏单位。
试验结果见表5-9。
表5 低磷胁迫下内生真菌感染对木荷幼苗生物量和根冠比的影响（120d）
表6 低磷胁迫下内生真菌感染对木荷幼苗SOD活性的影响
表7 低磷胁迫下内生真菌感染对木荷幼苗可溶性蛋白含量的影响
表8 低磷胁迫下内生真菌感染对木荷幼苗根系酸性磷酸酶活性的影响
由结果可见，当胁迫至120d时，在4种供磷处理条件下，菌株MG72处理的根冠比均高于CK处理，且在重度胁迫、中度胁迫和轻度胁迫条件下与对照处理的差异达到显著水平（P<0.05），分别较对照处理分别增加了24%、12%、73%和9%。MY72菌株处理的SOD含量在重度胁迫、中度胁迫和正常胁迫的整个胁迫周期均显著高于对照处理（P<0.05）。MY72菌株处理的可溶性蛋白含量在重度胁迫和轻度胁迫的整个胁迫周期均显著高于对照处理（P<0.05），MY72菌株在中度胁迫和正常胁迫的整个胁迫周期内均可促进幼苗的可溶性蛋白含量，但未达到显著差异水平（P>0.05）。MY72菌株处理的根系酸性磷酸酶活性在4种胁迫条件下的整个胁迫周期均显著高于对照处理（P<0.05）。由此表明，菌株MY72能够提高幼苗耐低磷性的能力，主要表现在该菌株可显著促进幼苗根冠比的生长，提高幼苗SOD、根系酸性磷酸酶活性和可溶性蛋白含量，从而提高幼苗对低磷环境的适应性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种能促进木荷磷吸收的内生真菌
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
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<211> 585
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
cttccgtagg ggtacctgcg gaaggatcat taccgagcga gaattctctg aattcaacct 60
cccacccgtg tttattgtac cttgttgctt cggcgggccc gcctcacggc cgccgggggg 120
catctgcccc cgggcccgcg cccgccgaag acaccttgaa ctctgtatga aaattgcagt 180
ctgagtctaa atataaatta tttaaaactt tcaacaacgg atctcttggt tccggcatcg 240
atgaagaacg cagcgaaatg cgatacgtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga 300
gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat 360
tgctgccctc aagcccggct tgtgtgttgg gtctcgtccc ccttcccggg gggacgggcc 420
cgaaaggcag cggcggcacc gcgtccggtc ctcgagcgta tggggctttg tcacccgctc 480
tgtaggcccg gccggcgctt gccgatcaac caaaactttt ttccaggttg acctcggatc 540
aggtagggat acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg gagga 585
Claims (2)
1. 一种能促进木荷磷吸收的内生真菌，其特征在于：内生真菌MY72为青霉（Penicillium sp.），已于2019年4月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No. 17479。
2.一种如权利要求1所述能促进木荷磷吸收的内生真菌在木荷苗木种植中的应用。
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