CN117586936B - 重组红色红球菌及其构建方法和应用 - Google Patents

重组红色红球菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请属生物技术、生物催化、基因工程领域，尤其涉及一种基因工程红色红球菌及其构建方法和应用。构建方法包括如下步骤：构建目标基因片段及其表达增强基因片段的融合表达载体；将融合表达载体转化至红色红球菌，构建重组红色红球菌；目标基因片段为漆酶基因的编码区中信号肽编码区域之外的区域，表达增强基因片段编码序列如SEQ ID NO.19或者SEQ ID NO.30所示的多肽；目标基因片段在所述表达增强基因片段的下游。本申请实施例构建的重组红色红球菌能够用于漆酶的异源可溶性表达，能广泛应用于真菌毒素降解、污水处理、染料降解、抗生素降解、有机合成等领域。

Description

重组红色红球菌及其构建方法和应用
技术领域
本申请属生物技术、生物催化、基因工程领域，尤其涉及一种基因工程红色红球菌及其构建方法和应用。
背景技术
漆酶（Laccase，EC 1.10.3.2）是一种含铜离子的酚氧化酶，广泛存在于动物、植物以及微生物当中，隶属于铜蓝氧化酶家族。漆酶的天然底物为酚类化合物，以水中的溶解氧作为电子的最终受体，底物被氧化为对应的自由基中间体，氧气被还原为水，无其他副产物生成，是名副其实的绿色氧化剂。就催化功能而言，漆酶既可以催化低分子有机物氧化聚合，也可以催化高分子有机物降解。根据酶分子中结构域的数目，漆酶可分为双结构域漆酶和三结构域漆酶。其中，三结构域漆最为常见，存在于多种真核以及原核生物当中，氧化还原电势较高；而双结构域漆酶仅存在于部分原核生物中，如热羧链霉菌、天蓝链霉菌等，氧化还原电势比三结构域漆酶低。鉴于催化反应类型的多样性以及较宽的底物谱，漆酶有望应用于造纸、染整、废水处理、食品加工、有机合成等多个领域。
漆酶的异源表达通常存在以下问题：（1）由于自身较高的氧化还原电势，胞内表达对宿主细胞具有一定的毒害作用，从而导致表达量偏低；（2）在大肠杆菌中通常以大量包涵体的形式存在，可溶性表达较为困难。如何解决这些问题对于漆酶得以广泛应用至关重要。
发明内容
基于此，本申请中的一个或者多个实施例提供了一种重组红色红球菌的构建方法，该方法构建的重组红色红球菌能用于漆酶的异源可溶性表达。
在本申请实施例的第一方面，提供一种重组红色红球菌，其含有目标基因片段及其表达增强基因片段；
所述目标基因片段包括漆酶基因的编码区中信号肽编码区域之外的区域；
所述表达增强基因片段编码氨基酸序列如SEQ ID NO.19或者SEQ ID NO.30所示的多肽；
所述目标基因片段位于所述表达增强基因片段的下游。
在本申请的一些实施方式中，所述表达增强基因片段的序列如SEQ ID NO.18所示和SEQ ID NO.29中任一项所示，或者与SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.29任一项所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性。
在本申请的一些实施方式中，所述漆酶基因的物种来源包括天蓝链霉菌、热羧链霉菌、红色红球菌、浑浊红球菌或者枯草芽孢杆菌。
在本申请的一些实施方式中，所述目标基因片段编码的漆酶的氨基酸序列如SEQID NO.1至SEQ ID NO.8中任一项所示，或者与SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示的序列相比具有一个或者多个氨基酸突变且突变后的漆酶功能不变，所述突变包括插入、缺失或替换。
在本申请的一些实施方式中，所述目标基因片段编码的漆酶的氨基酸序列如SEQID NO.28所示。
在本申请的一些实施方式中，所述目标基因片段的序列如SEQ ID NO.9至SEQ IDNO.16中任一项所示或者与SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.16任一项所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性。
在本申请的一些实施方式中，所述目标基因片段和所述表达增强基因片段的间隔为0bp-200bp。
在本申请的一些实施方式中，所述目标基因片段和所述表达增强基因片段的间隔为0bp-50bp。
在本申请实施例的第二方面，提供一种第一方面中所述的重组红色红球菌的构建方法，其包括将所述目标基因片段及其表达增强基因片段导入红色红球菌宿主构建重组红色红球菌的步骤。
在本申请的一些实施方式中，所述构建方法包括如下步骤：
构建所述目标基因片段及其表达增强基因片段的融合表达载体，以及用所述融合表达载体转化所述红色红球菌宿主，构建所述重组红色红球菌。
在本申请的一些实施方式中，所述融合表达载体包括pNV18.1质粒、pBNV质粒、pCR质粒或其衍生质粒。
在本申请实施例的第三方面，提供一种漆酶的生产方法，其包括第一方面中所述的重组红色红球菌进行发酵生产漆酶的步骤。
在本申请的一些实施方式中，发酵的条件满足如下条件中的一个或者多个：
（1）发酵的培养基包括10g/L-40g/L葡萄糖、2g/L-10g/L酵母膏、8g/L-12g/L尿素、1.5g/L-1.9g/L K2HPO4、0.75g/L-0.95g/L KH2PO4、0.8g/L-1.3g/L MgSO4·7H2O、0.8g/L-1.3g/L味精以及水，pH值为7.2-7.6；以及，
（2）发酵温度为25℃-32℃，发酵转速为170rpm-230rpm，发酵时间为24h-72h。
在本申请实施例的第四方面，提供一种目标底物的催化方法，其包括如下步骤：
采用三方面中的生产方法生产漆酶；以及，
用所述漆酶催化目标底物。
在本申请的一些实施方式中，催化的条件满足如下条件中的一个或者多个：
1）所述漆酶的用量为10U/L-5000U/L；以及，
2）在pH值为3-9的水相中进行，介体的浓度为0mM-1mM，温度为30℃-90℃，时间为0.5h-96h。
在本申请的一些实施方式中，所述介体包括2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、L-酪氨酸、维生素K3、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、特丁基对苯二酚、苯酚、2-甲氧基-4-甲基苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、愈创木酚、4-乙基愈创木酚、2-异丙基苯酚、2，6-二甲苯酚、2,6-二甲氧基苯酚、间苯二酚、香芹酚、2-甲氧基-4-丙基苯酚、3,4-二甲酚、邻甲硫基苯酚、2-乙基苯酚、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚、对丙基苯酚、3-丙烯基-6-乙氧基苯酚、邻-丙基苯酚、茶多酚、4-己基间苯二酚、丁香酚、异丁香酚、甲基丁香酚、对-甲酚、邻-甲酚、间-甲酚、百里香酚、麦芽酚、左旋多巴、儿茶酚、乙酰丁香酮、咖啡酸、对羟基肉桂酸、阿魏酸、丁香酸甲酯、苯酚红、丁香酸、丁香醛、2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基、和香草醛中的一种或者多种。
在本申请的一些实施方式中，所述目标底物包括真菌毒素、染料和抗生素中的一种或者多种。
相对于传统技术，本申请实施例具有如下有益效果：本申请实施例构建特定的目标基因片段及其表达增强基因片段的融合表达载体并将该融合表达载体转化至红色红球菌从而构建重组红色红球菌。该重组红色红球菌能够用于漆酶的异源可溶性表达，能广泛应用于真菌毒素降解、污水处理、染料降解、抗生素降解、有机合成等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为高效表达漆酶的重组红色红球菌构建流程；
图2为pNV18.1-Pa2-A-slac质粒图谱示意图；
图3为高效表达漆酶的重组红色红球菌发酵流程示意图；
图4为红色红球菌宿主表达的漆酶酶活随底物浓度变化趋势；
图5为红色红球菌宿主表达的漆酶酶活随温度变化趋势；
图6为漆酶突变体M1和M2在不同温度下的酶活性（pH=4）；
图7为pNV18.1-Pa2-A-slac（V261N）和pNV18.1-Pa2-A-slac（V261A）的质粒图谱；
图8为漆酶增强肽A、漆酶增强肽B对于漆酶SLAC酶活的影响；
图9为pNV18.1-Pa2-B-slac重组质粒的质粒图谱。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1~10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，%(w/w)与wt%均表示重量百分比，%(v/v)指体积百分比，%(w/v)指质量体积百分数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
红色红球菌（Rhodococcus ruber）是一种高GC含量的革兰氏阳性放线菌，是近年来备受关注的非模式菌株。独特的细胞壁结构和丰富的腈类及芳香族化合物代谢酶系赋予了红色红球菌极高的有机溶剂耐受性，目前已被成功应用于丙烯酰胺、丙烯酸等有机物的生物法合成。红色红球菌中氧化还原酶系十分丰富，细胞质中进行着频繁的电子传递过程，是氧化酶过表达的天然优良宿主。此外，红色红球菌还具有独特的尿素诱导机制——在廉价诱导剂尿素的诱导下可实现外源蛋白的高效可溶表达。这一特性使得红色红球菌有望成为通用的异源蛋白高效表达平台。
针对漆酶异源表达的难题，发明人提出采用新型的、氧化还原酶系丰富的外源蛋白表达宿主——红色红球菌进行漆酶的异源表达，在表达过程中为漆酶基因5’端连接漆酶表达增强肽序列。利用该种方法构建的基因工程菌株很好的实现了漆酶的异源可溶性表达，为漆酶的工业化应用奠定了良好的基础。
本申请实施例的第一方面
本申请实施例提供一种重组红色红球菌，其含有目标基因片段及其表达增强基因片段；
所述目标基因片段包括漆酶基因的编码区中信号肽编码区域之外的区域；
所述表达增强片基因段编码序列如SEQ ID NO.19或者SEQ ID NO.30所示的多肽；
所述目标基因片段位于所述表达增强基因片段的下游。
目标基因可以整合在基因组上，也可以以游离质粒的形式存在。
在其中一些示例中，所述表达增强基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.18和SEQID NO.29中任一项所示，或者与SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.29任一项所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性（例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）。
本申请对漆酶基因的物种来源不做特别限定，例如可以来源于原核生物，包括但不限于天蓝链霉菌（Streptomyces coelicolor A3(2)）、热羧链霉菌（Streptomycesthermocarboxydus 41291）、红色红球菌（Rhodococcus ruber TH）、浑浊红球菌(Rhodococcus opacus R7)、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 168）等。
在其中一些示例中，所述目标基因片段编码的漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8中任一项所示，或者与SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示的序列相比具有一个或者多个氨基酸突变且突变后的漆酶功能不变，所述突变包括插入、缺失或替换。
截去信号肽序列之后，漆酶SLAC，StMCO，SufI，YfiH，LMCO1，LMCO2，LMCO3，BsCotA的具体序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示，所对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.9-SEQID NO.16所示示或者与SEQ ID NO.9至SEQ ID NO.16任一项所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性（例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）。
SEQ ID NO.1：
MAPAAKGITARTAPAGGEVRHLKMYAEKLADGQMGYGFEKGKASVPGPLIEVNEGDTLHIEFTNTMDVRASLHVHGLDYEISSDGTAMNKSDVEPGGTRTYTWRTHKPGRRDDGTWRPGSAGYWHYHDHVVGTEHGTGGIRNGLYGPVIVRRKGDVLPDATHTIVFNDMTINNRKPHTGPDFEATVGDRVEIVMITHGEYYHTFHMHGHRWADNRTGILTGPDDPSRVIDNKITGPADSFGFQIIAGEGVGAGAWMYHCHVQSHSDMGMVGLFLVKKPDGTIPGYEPHEHGGATAKSGESGEPTGGAAAHEHEH。
SEQ ID NO.2：
MDRRGFNRRVILGGAAVATTSLSTASEAASASTTARTAPAGGEVRRIKMYAERLSGGRMGYGFERGKASVPGPLIELNEGDTLHIEFENTMDVPVSLHVHGVDYEISSDGTRQNKSAVEPGGTRVYTWRTHKPGRREDGTWRAGSAGYWHYHDHVVGTVHGTGGIRNGLYGPVVVRRKGDILPDATHTIVFNDMTINNKPPHSGPDFEATMGDRVEIVMITHGEYYHTFHMHGHRWADNRTGILTGPDDPTRVVDTKICGPAESFGFQVIAGEGVGAGAWMYHCHVQSHSDMGMVGLFLVKKPDGTIPGYDPHEHARTASSGEKSGHAH。
SEQ ID NO.3：
SSPRSTIAESGLPVVEPAVLRSEAGVLRVELTVARTRLDQAGTAATMLTYNGTVPGPTWRVRPGDRLEVRVVNTLDAATNLHFHGLRVSPQGTGDNPFVSIEPGRSFDYRLDVPPDHPPGVFWYHPHRHGSVADQLFGGLYGTILVDGADAIPVARERVLVISDVSLAPDGSLARVSPQQVMAGREGELLLVNGRSEPRLTARPGDRERWRLVNACTSRYLRLTVDGHRLHLLGVDGGHEPGTPEVGEVPLAPGNRADLVVDIEAGTGRLRTLGYDRGGAMMGMMGGGTELSGTAMLATVVADGPPAADAGPVPQRAVDPDLRGRPIAASREITFTMGMGMGAMMGSGPGGAGMNFGFDNRAFDARRTDQGPAAGTIEQWTIRNPTPMDHPFHLHIWPMQVVEEHGGPVEQPRWRDVVNVPAGGRVQVLVDFTRFPGRSVYHCHILDHEDAGMMATVEVR。
SEQ ID NO.4：
MTQPVLRARRVVTTRAGGVSAPPYDSFNLGDHVGDDPAAVEANRRRLASVIGLPYERLVWMEQIHSRNVTVVDGPVRGPVPATDALVTREPGLALVTLSADCVPVLLSDEEAGVIAAVHAGRIGARVGIVSRVLDAMTELGARPERIGAFLGPAASGRRYEVPASMQADVEAHLPGSATRTVAGTPALDLRAGLRRQLLEHGVTAVAEDPRCTIEDPTLFSHRRQAPTGRLAAVIWLEAGPDPAAGGGR。
SEQ ID NO.5
AIGPDSPDVRAYAEAEERRFPGGRPVAYELSAAQSDVDIAGTRTAAWLYNTQLPGPILRANVGDRVQVRFRNQLSDSTTVHWHGLAIRNDMDGVPDVTQAPIPAGTEFVYDFIPPDPGTYWYHTHGDLQRGRGLYGALIIDDPGTPANYDTEFVVVLSDWLTDRTPSQVFDALRGGRMASMPEMTSPVLGGDSGDVRYAVYLLNGKPPGDPTVFTARPGQRARIRLINAGDDTAFRVALGGHRLTVTDTDGFPVEPVDTDSVLIGMGERYDAVVTLQDGVFPLVAVAEGKGAQGFAVVRTAGGAAPDPTVAPRELGPPPLTVADLRATDAVRLPVVDPGVTLEASLGGDMKQYTWTVNGQAYPDHTPLTVHRDQRVRLVYTNSTMMFHPMHLHGHTFAVARPDGSGPRKDTVIVLPGQTVAADIDATNPGQWITHCHNDYHLAAGMATIFSYV。
SEQ ID NO.6：
TTVIGPDSAAVKAAEQTRRANIGTGKTVTSSLQARPTRIDLGGVQVDTWAYNDRVPGREVRLRRGDLLRAELTNDLPAESTIHWHGIALRNDMDGVPGLTQSAIAPNTPFTYEFLAPDAGTHWLHPHVGMQFDRGLYAPVIVEDPAEGGDYDLEAVLVLDDWLDGVTGRTPDQQLDTLRQGGMPMSGMGMDHGGMSGMGMGAVTDPANPLGADTGDVEYPYYLINGTLAADPFSVRARPGQRIRLRIINAGADTAFRIAVGGHELTVTHTDGYPVEPVTGSSLLIGMGERFDAVVTLGDGVFPIVASAEGKQGQGFALIRTGAGRTPEPTIRPTELDAPPITGLGLRAREEVRLGSRDPDRVHELMLGMDMSGYRWTINGATYDQHTPLDVAEGQRVRLRFVNQTMMFHPMHLHGHTFQLVDGQGAGPRKDTTLVLPNQTVEVDLDADNPGQWLVHCHNLYHGEAGMMTTLSYTE。
SEQ ID NO.7
APSAAPPATETGGVHSGGHGGGVAGPTFRKGAVVDHAANGFDPTALLRDFDYGRVSQLPDGRVLREWVVAAADLDLEIAPGVRYPAWTFNGRIPGPTLRCQEGDLLRVQFVNTSAHPHTMHFHGIHPAEMDGIPDTGPGVIPSGGSFVYEFDAQPFGVHLYHCHVGPLAEHIARGLYGTFIVDPPEPRPPADEMVMVMHGYNTTFDGEGNQLYAVNGIPFHYMHEPVRVKRGELVRIYLVNALEYDPINTFHLHGNFFDYYPTGTRLEPSEYTDTIMQAQGQRGICEVRFPYPGRYMFHAHKTEFAELGWMGFFEVTD。
SEQ ID NO.8
MTLEKFVDALPIPDTLKPVQQSKEKTYYEVTMEECTHQLHRDLPPTRLWGYNGLFPGPTIEVKRNENVYVKWMNNLPSTHFLPIDHTIHHSDSQHEEPEVKTVVHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQTGPYFKREVYHYPNQQRGAILWYHDHAMALTRLNVYAGLVGAYIIHDPKEKRLKLPSDEYDVPLLITDRTINEDGSLFYPSAPENPSPSLPNPSIVPAFCGETILVNGKVWPYLEVEPRKYRFRVINASNTRTYNLSLDNGGDFIQIGSDGGLLPRSVKLNSFSLAPAERYDIIIDFTAYEGESIILANSAGCGGDVNPETDANIMQFRVTKPLAQKDESRKPKYLASYPSVQHERIQNIRTLKLAGTQDEYGRPVLLLNNKRWHDPVTETPKVGTTEIWSIINPTRGTHPIHLHLVSFRVLDRRPFDIARYQESGELSYTGPAVPPPPSEKGWKDTIQAHAGEVLRIAATFGPYSGRYVWHCHILEHEDYDMMRPMDITDPHK。
SEQ ID NO.9：
ATGGCGCCGGCAGCCAAGGGCATCACCGCCCGCACCGCGCCCGCCGGAGGCGAGGTGCGGCACCTGAAGATGTACGCCGAGAAGCTCGCCGATGGCCAGATGGGTTACGGATTCGAGAAGGGCAAGGCCAGCGTCCCCGGCCCGCTGATCGAGGTCAACGAGGGCGACACCCTGCACATCGAGTTCACCAACACGATGGACGTCCGCGCCTCCCTCCACGTGCACGGGCTCGACTACGAGATTAGCTCAGACGGCACCGCGATGAACAAGTCCGACGTCGAGCCCGGCGGGACACGAACCTACACCTGGCGCACGCACAAACCGGGCCGTCGCGACGACGGAACGTGGCGGCCTGGGAGTGCCGGTTACTGGCACTACCACGACCACGTCGTCGGCACCGAGCACGGCACCGGTGGAATCCGCAACGGCCTGTACGGCCCGGTCATCGTCCGGCGTAAGGGCGATGTGTTGCCCGACGCCACCCACACCATCGTGTTCAACGACATGACCATCAACAACCGGAAACCGCACACTGGGCCGGACTTCGAGGCGACCGTCGGGGACCGCGTGGAGATCGTGATGATCACGCATGGGGAGTACTACCACACGTTCCACATGCACGGGCACCGCTGGGCGGACAATAGGACCGGTATCCTCACGGGGCCCGACGACCCGTCCCGGGTGATCGACAACAAGATCACCGGCCCGGCCGATTCGTTCGGCTTCCAGATCATCGCGGGTGAAGGCGTGGGCGCCGGAGCGTGGATGTATCACTGCCACGTGCAGTCGCACAGCGACATGGGCATGGTGGGCCTGTTCCTCGTTAAGAAGCCCGATGGCACGATCCCGGGGTACGAGCCGCACGAACATGGCGGTGCGACGGCGAAGTCGGGCGAATCCGGCGAACCCACCGGGGGAGCGGCCGCGCACGAGCATGAACACTGA。
SEQ ID NO.10：
ATGGACAGACGCGGTTTCAACCGACGGGTAATCCTGGGCGGCGCCGCGGTGGCGACGACATCGTTGTCCACCGCATCCGAGGCCGCGAGCGCCTCCACCACGGCGAGAACCGCGCCCGCCGGGGGCGAGGTACGCCGGATCAAGATGTACGCCGAGCGCCTGTCCGGCGGGCGGATGGGCTACGGCTTCGAGAGGGGCAAGGCGTCCGTCCCCGGCCCGCTGATCGAGCTCAACGAGGGCGACACCCTGCACATCGAGTTCGAGAACACCATGGACGTCCCGGTCAGCCTGCACGTCCACGGCGTCGACTACGAGATCTCCAGCGACGGCACCCGGCAGAACAAGAGCGCCGTCGAGCCCGGCGGCACCCGCGTCTACACCTGGCGCACCCATAAGCCGGGCCGGCGCGAGGACGGCACCTGGCGGGCGGGCAGCGCCGGCTACTGGCACTACCACGACCACGTCGTCGGCACCGTGCACGGCACCGGCGGCATCCGCAACGGCCTCTACGGGCCGGTCGTCGTGCGCCGCAAGGGCGACATCCTGCCGGACGCCACCCACACCATCGTCTTCAACGACATGACGATCAACAACAAGCCGCCGCACTCGGGGCCCGACTTCGAGGCAACGATGGGCGACCGGGTCGAGATCGTCATGATCACGCACGGCGAGTACTACCACACGTTCCACATGCACGGTCATCGCTGGGCCGACAACCGCACCGGCATTCTCACCGGGCCCGACGACCCCACCCGGGTCGTCGACACCAAGATCTGCGGCCCTGCCGAGTCCTTCGGCTTCCAGGTCATCGCGGGGGAGGGGGTGGGCGCGGGCGCGTGGATGTACCACTGCCATGTCCAGAGCCACTCCGACATGGGCATGGTCGGCCTGTTCCTGGTCAAGAAACCCGACGGGACCATTCCCGGCTACGACCCGCACGAGCACGCACGCACTGCGTCCTCCGGGGAGAAGTCCGGGCACGCGCACTGA。
SEQ ID NO.11：
TCCTCCCCCCGCAGCACGATCGCCGAGTCGGGGTTGCCGGTGGTCGAGCCGGCGGTGCTGCGCAGCGAGGCCGGAGTGCTGCGGGTGGAGCTGACGGTGGCCCGCACCCGCCTCGATCAGGCCGGAACGGCGGCGACGATGCTGACCTACAACGGCACGGTGCCGGGCCCGACCTGGCGGGTCCGTCCCGGGGACCGCCTCGAGGTGCGGGTGGTCAACACCCTCGATGCGGCCACCAACCTGCACTTCCACGGCCTGCGCGTGTCCCCCCAGGGCACCGGCGACAATCCGTTCGTCAGCATCGAGCCCGGCCGGAGCTTCGACTACCGTCTCGACGTGCCGCCCGACCATCCCCCCGGCGTGTTCTGGTACCACCCGCATCGGCACGGTTCGGTCGCCGATCAGCTCTTCGGCGGTCTGTACGGCACGATCCTGGTCGACGGCGCCGACGCGATCCCGGTTGCGCGGGAGCGGGTGCTGGTGATCTCCGACGTCTCCCTCGCCCCGGACGGCTCCCTCGCCCGGGTGTCCCCCCAGCAGGTGATGGCCGGGCGGGAAGGAGAGCTGCTGCTGGTCAACGGCCGGTCCGAACCGCGGCTGACGGCCCGCCCCGGGGACCGTGAGCGGTGGCGGCTGGTCAACGCCTGCACCTCCCGCTACCTGCGCCTGACCGTCGATGGTCACCGGCTGCATCTGCTCGGCGTCGACGGCGGCCACGAACCCGGCACCCCCGAGGTCGGTGAGGTCCCCCTGGCCCCGGGCAACCGGGCCGACCTGGTGGTGGACATCGAGGCCGGGACCGGGCGGCTGCGCACCCTCGGCTACGACCGGGGCGGGGCGATGATGGGCATGATGGGCGGCGGCACCGAATTGTCCGGGACGGCGATGCTGGCCACCGTCGTCGCCGACGGGCCCCCGGCCGCCGACGCCGGTCCGGTACCGCAGCGGGCAGTCGATCCGGACCTGCGCGGACGCCCCATCGCCGCCTCCCGGGAGATCACCTTCACCATGGGCATGGGCATGGGCGCCATGATGGGCTCCGGGCCCGGCGGGGCGGGGATGAACTTCGGGTTCGACAACCGCGCCTTCGACGCCCGGCGCACCGACCAGGGTCCCGCCGCCGGGACGATCGAGCAGTGGACGATCCGTAACCCCACCCCGATGGACCACCCGTTCCACCTTCACATCTGGCCCATGCAGGTCGTCGAGGAGCACGGTGGACCCGTCGAGCAGCCGAGGTGGCGGGACGTGGTCAACGTCCCCGCGGGGGGCCGGGTGCAGGTGCTGGTCGACTTCACTCGATTCCCGGGGCGCAGCGTGTATCACTGCCACATTCTCGACCATGAGGACGCCGGCATGATGGCCACCGTCGAAGTCCGCTGA。
SEQ ID NO.12：
ATGACACAGCCGGTGCTGCGGGCGCGGCGGGTCGTCACCACCCGTGCCGGCGGCGTCTCCGCCCCGCCCTACGACTCTTTCAATCTCGGTGACCACGTGGGTGACGACCCGGCCGCGGTCGAGGCGAACCGGCGCCGGCTCGCCTCGGTGATCGGGCTGCCCTACGAGCGGCTCGTGTGGATGGAGCAGATCCACAGTCGCAACGTCACCGTCGTGGACGGCCCGGTCCGCGGCCCGGTGCCCGCGACCGACGCGCTGGTCACGCGCGAGCCCGGTCTCGCGCTCGTCACGTTGAGTGCGGACTGCGTGCCGGTGCTGCTGTCCGACGAGGAGGCGGGCGTGATCGCCGCCGTGCACGCGGGCCGGATCGGTGCCCGCGTGGGGATCGTGTCCCGGGTCCTGGACGCGATGACCGAACTCGGTGCGCGACCGGAGCGCATCGGCGCGTTCCTCGGACCTGCTGCGAGCGGCCGCCGGTACGAGGTGCCCGCTTCGATGCAGGCCGACGTGGAGGCGCATCTGCCCGGTAGCGCCACCCGCACCGTCGCGGGCACGCCCGCGCTGGACCTGCGGGCCGGGTTGCGACGGCAACTGCTCGAACACGGCGTCACGGCCGTCGCGGAGGATCCCCGATGCACCATCGAGGATCCGACGTTGTTCAGCCATCGCCGGCAGGCGCCGACCGGACGGCTGGCGGCGGTGATCTGGCTCGAGGCCGGACCGGACCCCGCCGCCGGAGGTGGCCGATGA。
SEQ ID NO.13：
GCGATCGGGCCCGACTCTCCGGACGTACGCGCGTACGCCGAGGCCGAGGAACGCCGCTTCCCCGGGGGCAGACCGGTCGCCTACGAACTCTCCGCGGCACAATCCGACGTCGACATCGCAGGTACGCGCACTGCTGCGTGGCTGTACAACACTCAACTGCCGGGCCCGATACTGCGGGCGAACGTCGGGGACAGGGTCCAGGTGCGGTTTCGCAACCAGCTCTCGGATTCCACCACGGTGCACTGGCACGGGCTGGCCATCCGCAACGACATGGACGGGGTCCCGGATGTCACGCAGGCCCCGATACCGGCGGGCACAGAGTTCGTCTACGACTTCATCCCGCCCGACCCGGGCACCTACTGGTACCACACGCACGGCGATCTCCAGCGCGGCCGAGGGCTGTACGGGGCTCTGATCATCGACGATCCCGGGACACCCGCGAACTACGACACCGAGTTCGTCGTCGTGCTGTCCGACTGGTTGACCGACCGCACGCCGTCGCAGGTCTTCGACGCACTCCGCGGCGGGCGGATGGCGTCCATGCCCGAGATGACGTCGCCCGTGCTCGGCGGTGACTCCGGCGACGTCCGGTACGCCGTGTACCTGCTGAACGGGAAACCACCCGGCGATCCGACCGTGTTCACGGCGCGGCCGGGGCAACGCGCCCGCATCCGGCTGATCAACGCCGGCGACGACACCGCGTTCCGGGTCGCGCTGGGTGGCCACCGGCTGACCGTCACCGACACGGACGGCTTCCCCGTCGAACCGGTCGACACCGACTCGGTGCTGATCGGTATGGGCGAGCGGTACGACGCCGTCGTCACCCTGCAGGACGGGGTGTTCCCGCTGGTCGCGGTGGCCGAGGGGAAGGGCGCGCAGGGATTCGCCGTGGTGCGCACAGCAGGCGGCGCCGCCCCCGACCCCACCGTGGCGCCCCGCGAACTGGGCCCTCCCCCTCTCACCGTGGCCGACCTGAGGGCCACCGACGCCGTCCGGCTACCCGTCGTCGACCCGGGTGTCACCCTCGAGGCGTCGCTCGGCGGCGACATGAAGCAGTACACGTGGACGGTAAATGGCCAGGCCTATCCCGACCACACGCCGCTGACCGTCCACCGGGACCAGCGGGTACGGCTGGTCTACACGAACTCCACGATGATGTTCCACCCCATGCACCTGCACGGGCACACGTTCGCCGTGGCCCGGCCGGACGGCTCCGGACCGCGGAAGGACACCGTGATCGTGCTCCCCGGACAGACCGTCGCCGCCGACATCGACGCGACCAACCCGGGCCAGTGGATCACGCACTGCCACAACGACTATCACCTTGCCGCCGGAATGGCGACGATCTTCTCCTACGTGAGCTAA。
SEQ ID NO.14：
ACCACCGTCATCGGCCCCGACTCCGCTGCCGTAAAGGCGGCGGAGCAGACCCGCCGAGCCAACATCGGGACCGGGAAAACGGTCACCTCGTCGCTGCAGGCCCGCCCGACCCGGATCGACCTGGGAGGTGTCCAGGTCGACACCTGGGCCTACAACGACCGGGTGCCGGGCCGGGAAGTACGACTGCGCCGAGGGGATCTGCTGCGCGCCGAGCTGACCAACGACCTTCCGGCCGAGTCCACCATCCATTGGCACGGCATCGCGCTGCGCAACGACATGGACGGGGTGCCCGGGCTGACCCAGTCCGCTATCGCCCCGAACACTCCGTTCACCTACGAGTTCCTCGCCCCCGATGCCGGTACCCACTGGCTCCATCCGCACGTCGGGATGCAGTTCGACCGGGGCCTGTACGCGCCGGTCATCGTCGAGGATCCCGCCGAGGGCGGCGACTACGATCTCGAGGCCGTCCTGGTCCTCGACGACTGGCTCGACGGGGTGACCGGACGTACCCCCGACCAGCAACTGGATACCCTGCGCCAGGGCGGCATGCCGATGAGCGGCATGGGGATGGACCACGGCGGCATGAGCGGCATGGGAATGGGCGCCGTGACCGATCCGGCGAATCCCTTGGGCGCCGATACCGGGGATGTGGAATACCCGTACTACCTCATCAACGGCACCCTCGCCGCCGACCCGTTTTCGGTGCGCGCCCGCCCCGGCCAGCGCATTCGGTTGCGGATCATCAACGCAGGGGCGGACACCGCGTTCCGCATCGCGGTCGGCGGCCACGAGCTGACCGTCACCCACACTGACGGGTATCCGGTCGAACCGGTCACCGGATCATCGCTGTTGATCGGGATGGGCGAACGCTTCGATGCGGTCGTCACCCTCGGCGACGGGGTCTTCCCCATCGTCGCGTCCGCCGAAGGCAAGCAGGGTCAAGGTTTCGCCCTGATCCGCACCGGGGCAGGGCGGACACCGGAGCCGACCATCCGGCCCACCGAGCTCGACGCACCGCCGATCACGGGTCTGGGTCTGCGGGCCCGTGAGGAGGTCCGGCTCGGGAGCCGCGACCCCGACCGAGTACACGAGCTGATGCTGGGCATGGACATGTCCGGGTACCGGTGGACGATCAACGGCGCCACCTACGATCAGCACACCCCGCTCGACGTCGCCGAGGGGCAGCGGGTGCGGTTGCGATTTGTCAACCAGACCATGATGTTTCATCCCATGCACCTGCACGGGCACACCTTCCAGCTCGTCGACGGTCAAGGCGCCGGTCCCCGCAAGGACACCACGTTGGTTTTGCCGAACCAAACGGTCGAGGTGGACCTCGACGCGGACAACCCGGGCCAGTGGCTGGTGCACTGCCACAACCTGTACCACGGCGAGGCCGGGATGATGACCACCCTGTCCTACACCGAATAA。
SEQ ID NO.15：
GCTCCCTCCGCGGCGCCCCCAGCCACGGAAACCGGGGGCGTGCATTCCGGCGGGCACGGCGGCGGGGTCGCCGGGCCGACGTTCCGCAAGGGCGCCGTCGTCGACCACGCCGCGAACGGCTTCGACCCCACCGCCCTGCTGCGCGATTTCGACTACGGCCGGGTCTCCCAGCTGCCGGACGGCCGGGTGCTGCGGGAGTGGGTCGTCGCCGCCGCGGACCTCGACCTCGAGATCGCCCCCGGGGTCCGGTACCCGGCCTGGACGTTCAACGGCCGGATCCCCGGACCGACGCTGCGCTGCCAGGAAGGTGACCTGCTCCGGGTCCAGTTCGTCAACACCTCCGCGCACCCCCACACGATGCACTTCCACGGCATCCACCCCGCCGAGATGGACGGAATCCCCGACACCGGGCCCGGGGTGATCCCCTCCGGCGGCAGCTTCGTCTACGAGTTCGACGCGCAACCGTTCGGGGTGCACCTGTATCACTGCCACGTCGGCCCGCTCGCCGAGCACATCGCCCGCGGCCTGTACGGGACCTTCATCGTCGACCCACCCGAGCCGCGACCGCCCGCCGACGAGATGGTCATGGTGATGCACGGCTATAACACCACCTTCGACGGGGAGGGCAACCAGCTCTACGCCGTCAACGGCATCCCGTTCCACTACATGCACGAACCCGTTCGGGTGAAACGCGGCGAACTGGTGCGGATCTACCTGGTCAACGCCCTCGAATACGACCCGATCAACACCTTCCACCTGCACGGGAACTTCTTCGACTACTACCCCACCGGCACCCGGCTCGAGCCCTCCGAGTACACCGACACCATCATGCAGGCCCAGGGCCAGCGCGGGATCTGCGAAGTCCGCTTCCCCTACCCCGGCCGGTACATGTTCCACGCCCACAAGACCGAATTCGCCGAACTCGGCTGGATGGGATTCTTCGAGGTGACCGACTAA。
SEQ ID NO.16：
ATGACACTTGAAAAATTTGTGGATGCTCTCCCAATCCCAGATACACTAAAGCCAGTACAGCAATCAAAAGAAAAAACATACTACGAAGTCACCATGGAGGAATGCACTCATCAGCTCCATCGCGATCTCCCTCCAACCCGCCTGTGGGGCTACAACGGCTTATTTCCGGGACCGACCATTGAGGTTAAAAGAAATGAAAACGTATATGTAAAATGGATGAATAACCTTCCTTCCACGCATTTCCTTCCGATTGATCACACCATTCATCACAGTGACAGCCAGCATGAAGAGCCCGAGGTAAAGACTGTTGTTCATTTACACGGCGGCGTCACGCCAGATGATAGTGACGGGTATCCGGAGGCTTGGTTTTCCAAAGACTTTGAACAAACAGGACCTTATTTCAAAAGAGAGGTTTATCATTATCCAAACCAGCAGCGCGGGGCTATATTGTGGTATCACGATCACGCCATGGCGCTCACCAGGCTAAATGTCTATGCCGGACTTGTCGGTGCATATATCATTCATGACCCAAAGGAAAAACGCTTAAAACTGCCTTCAGACGAATACGATGTGCCGCTTCTTATCACAGACCGCACGATCAATGAGGATGGTTCTTTGTTTTATCCGAGCGCACCGGAAAACCCTTCTCCGTCACTGCCTAATCCTTCAATCGTTCCGGCTTTTTGCGGAGAAACCATACTCGTCAACGGGAAGGTATGGCCATACTTGGAAGTCGAGCCAAGGAAATACCGATTCCGTGTCATCAACGCCTCCAATACAAGAACCTATAACCTGTCACTCGATAATGGCGGAGATTTTATTCAGATTGGTTCAGATGGAGGGCTCCTGCCGCGATCTGTTAAACTGAATTCTTTCAGCCTTGCGCCTGCTGAACGTTACGATATCATCATTGACTTCACAGCATATGAAGGAGAATCGATCATTTTGGCAAACAGCGCGGGCTGCGGCGGTGACGTCAATCCTGAAACAGATGCGAATATCATGCAATTCAGAGTCACAAAACCATTGGCACAAAAAGACGAAAGCAGAAAGCCGAAGTACCTCGCCTCATACCCTTCGGTACAGCATGAAAGAATACAAAACATCAGAACGTTAAAACTGGCAGGCACCCAGGACGAATACGGCAGACCCGTCCTTCTGCTTAATAACAAACGCTGGCACGATCCCGTCACAGAAACACCAAAAGTCGGCACAACTGAAATATGGTCCATTATCAACCCGACACGCGGAACACATCCGATCCACCTGCATCTAGTCTCCTTCCGTGTATTAGACCGGCGGCCGTTTGATATCGCCCGTTATCAAGAAAGCGGGGAATTGTCCTATACCGGTCCGGCTGTCCCGCCGCCGCCAAGTGAAAAGGGCTGGAAAGACACCATTCAAGCGCATGCAGGTGAAGTCCTGAGAATCGCGGCGACATTCGGTCCGTACAGCGGACGATACGTATGGCATTGCCATATTCTAGAGCATGAAGACTATGACATGATGAGACCGATGGATATAACTGATCCCCATAAA。
可选地，所述目标基因片段编码的漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示。
在其中一些示例中，所述目标基因片段和所述表达增强基因片段的间隔为0bp-200bp（例如0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200bp）。可选地，所述目标基因片段和所述表达增强基因片段的间隔为0bp-50bp。进一步可选地，所述目标基因片段和所述表达增强基因片段的间隔为0bp。
本申请提供的是一种高效表达漆酶的基因工程红色红球菌菌株，以此菌株作为出发菌种，能高效发酵生产漆酶，所生产的漆酶可应用于饲料加工、污水处理、染料降解、抗生素降解、有机合成等领域。
本申请实施例的第二方面
本申请实施例提供一种第一方面中所述的重组红色红球菌的构建方法，其包括将所述目标基因片段及其表达增强基因片段导入红色红球菌宿主构建重组红色红球菌的步骤。
在其中一些示例中，所述构建方法包括如下步骤：
构建所述目标基因片段及其表达增强基因片段的融合表达载体，以及用所述融合表达载体转化所述红色红球菌宿主，构建所述重组红色红球菌。
本申请对融合表达载体的种类不做特别限定，可以选自包括但不限于pNV18.1质粒、pBNV质粒、pCR质粒或其衍生质粒。可选地，是pNV18.1质粒的衍生质粒；进一步可选地，为pNV18.1-Pa2-A，其具体序列为SEQ ID NO.17，序列中小写字母表示KpnI酶切位点。
SEQ ID NO.17：
AGCTTATCGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTGCGGACGGCGGATACGTCGTGGCTGGAGAAGGTTGGACGGTCGTCATGATAGGCACCTTTTCTCAACGTCTTTGAAGTGCTGGTACATCCGCAGCGGGCGATGCTCAGAGAATACATGCTGCCTAACGGAAGTAAAGATCCACGGAGGTGGACGTGCAAAGGAACGGACCCTGCCTATCGCTGTGAACAGGTGAGATTACGGAGAACGGGGCTTGTGGCCGTCCCTGTCGTGTCGTAACGTGTCCACAACGTTGCAGTTCATGCAATGTGGAACACTTCAAGTCGGAAGCAAACGTCGGGTCATGAGCGCCCGGCGAGTCACTAAGGAGTCTAGAATGACCATTCGTACCGAACCGCTGCGCCTGTCGCGTCGCGGTTTTTTGGCCGCAGGTGCAGGCGCCCTGGCAGCCACAGCCCTGGGCGGCTGGACCCCGGTCCATGCCggtaccGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTGGGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATGAGATCCCCGCGCTGGAGGATCATCCAGCCGGCGTCCCGGAAAACGATTCCGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATCCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCTTGGAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATCAGATCTTGATCCCCTGCGCCATCAGATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTTACCAGAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCCGGTTCGCTTGCTGTCCATAAAACCGCCCAGTCTAGCTATCGCCATGTAAGCCCACTGCAAGCTACCTGCTTTCTCTTTGCGCTTGCGTTTTCCCTTGTCCAGATAGCCCAGTAGCTGACATTCATCCGGGGTCAGCACCGTTTCTGCGGACTGGCTTTCTACGTGTTCCGCTTCCTTTAGCAGCCCTTGCGCCCTGAGTGCTTGCGGCAGCGTGAAGCTAGCGTCTACCAGGACTTTTACCTGTCCGACCCGTTGCAACGGAACCCCCCACGGAACCCCCGCGACACCCGCTCCCCAATTGCGTTAGAACAGCGGTGGATTGTCGGCTTCGTTGTGGGCCTTTTGAGCCGCTTCCTGTTCTGCCGCACGCTCTTTCCTCGCCCGATAGCCGAGTCGCTTAACGGTGTCCAGATGCAGCCCGAAATGTTTGGCCGTTTGCGGCCAAGAGTGGCCCTCGTCGTCGTGATAGGCGCGGATGCGTTCGCGGCGTGCAGCCTGCTCGGCGAGCCACTCGCTGCGTTCCTGCGCCACGAGCCGGACGACGTGGCGTTCGGATAGTCCGGTGATTCGAGCGCCTTCGGCGGCGGTCACGCGCCGCTTTTTGCGGACAGTCGGCTGCCGGTTGTAGCCGTCGCTGTAGCCGTCGCTCATAGCAATGCCTCCATGGCTGACGCGGACTTTGCGCGCCGCGCAACTGTGCTCGCCGCCGTGCGCGCTGCTGCGCCCTTCCGCGAGATGGCCGACTGGCGCGCACTGAGTGTGGCCTCGTAGACCACGATCCCGTCCGCCCAAATGCGCGACTTGGTTGTGATCCAACGCCAAATGCTGTTGGCGATGGCGCGGACCTCGCTGTCCGGTAGCGGTCCGGGACACACGTCGTTGCACGGGAACTCGGCGTTTCGCGCGTGGCACTCGGCATAGATCGCGCGGCCGAGTCCGTCCACGTTCCGGGTCGGCAGGTAGATCCGCATGAGGGCGGGACGATAGGCCCACAACCTGACGGAATCGAACAGTGCGCAATTCCGCCCTAGCGGCGTCGGAGCCGCTTTGTACGTGGTCTGCTGACGCCAGCGCGGCGGTGGCATGTTCGCGCCGAGCTCGGCCTCGATGTGGCTGAGTGTGTAGAGATCTGAGTGGAGCCATTCCGTTTCCCAGGCGATGTGGCCGGGGTTTTTGGTCATGAGGCCTGAGTAACTGCGGTCGCCGTCCACGGCGCGCCGAAGGCCTTCGGCGCACGCCGCCATGTATGCGAGCGGCTTACGCCGCGCGTATTCGGTGCGTGGAACAGGGGCGTTGAGTGCCCACACTGCGTGTGCGTGGCCGTTGGCGCGATTGCCCACGATCGCGTTGGGCAGCGGATGGGACCCCCGGGCGCTGAGCGCTCGGAGCGCTGCGTCTGGATGGTCTACGTCCACGACCAGCAGGTTTGCCAGCGCTGTTGGGTTCGCCTCGATGTACCGGCGGCCTAGGGCCGACGCGCGGCTTTGGCGGTAGATCCCCTCGAGCAGATCGTCGCTTGCCAGCGGCCAGTACGGCAGCCAGAGCTGCTCAAATTCGTCGGCGACGTGGCTCACGCTTGGTAGTAGACCACGATTAATCACCGGTGTATGGTCCGACACGAGCTCCAAGTCAGATATTTCGCTGAGGGGCCACCCCACAACTGCACACTCCCCCGCTCTCCCGTCGAGCCCTGGTGGTGGAACACCAGCGACAGCCGAGCACCCCCAACCACCTGTACCAACCAGGAGGAACACATGCGTCGTTTCGAGGACGTTTCCGGGCCGCTGAGAGCCGCTGTGGCGGCCGTACACGCCGCCTTAGACCCGTTAGACCCCCTGCCGCCTGAATGCGCGGGTACGAGCCACACAGCGCCCGAACTTACGGAGCTGGTGGGCTCACCTGGCTTTATGGCGTACGAATCGGCTGTGTGCGACCTGTTGGGCGAGGTGAGGTACGCGCTACTCACGCT。
本申请实施例的第三方面
本申请实施例提供一种漆酶的生产方法，其包括第一方面中所述的重组红色红球菌进行发酵生产漆酶的步骤。
在其中一些示例中，发酵的条件满足如下条件中的一个或者多个：
（1）发酵的培养基包括：10g/L-40g/L（例如10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40g/L）葡萄糖、2g/L-10g/L（例如为2、3、4、5、6、7、8、9、10g/L）酵母膏、8g/L-12g/L（例如为8、9、10、11、12g/L）尿素、1.5g/L-1.9g/L（例如为1.5、1.6、1.7、1.8、1.9g/L）K2HPO4、0.75g/L-0.95g/L（例如为0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95g/L） KH2PO4、0.8g/L-1.3g/L（例如为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3g/L）MgSO4·7H2O、0.8g/L-1.3g/L（例如为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3g/L）味精以及水，pH值为7.2-7.6（例如为7.2、7.3、7.4、7.5、7.6）；以及，
（2）发酵温度为25℃-32℃（例如为25、26、27、28、29、30、31、32℃），发酵转速为170rpm-230rpm（例如为170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230rpm），发酵时间为24h-72h（例如为24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72h）。
在采用重组红色红球菌进行发酵生产漆酶的过程中，可以采用但不限于通过如下步骤制备漆酶粗酶液：
将构建的重组红色红球菌划线于红色红球菌平板培养基上进行活化，25℃-32℃培养24h-72h；之后接种一环菌苔至红色红球菌种子培养基中，25℃-32℃ 170rpm-230rpm培养48 h-60 h；以8%-12%的接种量接种于红色红球菌发酵培养基中，25℃-32℃ 170rpm-230rpm培养48 h-60 h；发酵结束后不分离发酵液上清和菌体，直接进行高压匀浆破碎，并添加终浓度为0.5-5 mM的Cu2+，3℃-5℃静置过夜，得到漆酶粗酶液。
红球菌种子培养基包括：10g/L-40g/L（例如10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40g/L）葡萄糖、2g/L-10g/L（例如为2、3、4、5、6、7、8、9、10g/L）酵母膏、8g/L-12g/L（例如为8、9、10、11、12g/L）尿素、1.5g/L-1.9g/L（例如为1.5、1.6、1.7、1.8、1.9g/L）K2HPO4、0.75g/L-0.95g/L（例如为0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95g/L） KH2PO4、0.8g/L-1.3g/L（例如为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3g/L）MgSO4·7H2O、0.8g/L-1.3g/L（例如为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3g/L）味精以及水，pH值为7.2-7.6（例如为7.2、7.3、7.4、7.5、7.6）。
本申请实施例的第四方面
本申请实施例提供一种目标底物的催化方法，其包括如下步骤：
采用三方面中的生产方法生产漆酶；以及，
用所述漆酶催化目标底物。
在本申请的一些实施方式中，催化的条件满足如下条件中的一个或者多个：
1）所述漆酶的用量为10U/L-5000U/L（例如为10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1300、1500、1700、1900、2100、2300、2500、2700、2900、3100、3300、3500、3700、3900、4100、4300、4500、4700、5000 U/L）；以及，
2）在pH值为3-9（例如为3、4、5、6、7、8、9）的水相中进行，介体的浓度为0mM-1mM（例如为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1mM），温度为30℃-90℃（例如为30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90℃），时间为0.5h-96h（例如为0.5、1、2、4、6、8、12、16、18、20、24、28、32、36、40、46、50、56、64、68、72、76、80、84、88、90、96）。
在添加介体的情况下，本申请对介体的种类不做特别限定，包括但不限于2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、L-酪氨酸、维生素K3、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、特丁基对苯二酚、苯酚、2-甲氧基-4-甲基苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、愈创木酚、4-乙基愈创木酚、2-异丙基苯酚、2，6-二甲苯酚、2,6-二甲氧基苯酚、间苯二酚、香芹酚、2-甲氧基-4-丙基苯酚、3,4-二甲酚、邻甲硫基苯酚、2-乙基苯酚、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚、对丙基苯酚、3-丙烯基-6-乙氧基苯酚、邻-丙基苯酚、茶多酚、4-己基间苯二酚、丁香酚、异丁香酚、甲基丁香酚、对-甲酚、邻-甲酚、间-甲酚、百里香酚、麦芽酚、左旋多巴、儿茶酚、乙酰丁香酮、咖啡酸、对羟基肉桂酸、阿魏酸、丁香酸甲酯、苯酚红、丁香酸、丁香醛、2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基、和香草醛中的一种或者多种。
本申请对目标底物的种类不做特别限定，包括但不限于真菌毒素、染料和抗生素。
本申请实施例的第五方面
本申请实施例提供一种漆酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示。
本申请实施例的第六方面
本申请实施例提供一种核酸分子，其编码第五方面中所述的漆酶突变体。
本申请实施例的第七方面
本申请实施例提供一种表达载体，其包括第六方面中所述的核酸分子。
本申请实施例的第八方面
本申请实施例提供一种基因工程菌，其包括第六方面中所述的核酸分子或者第七方面中所述的表达载体。
本申请实施例对基因工程菌的种类不做特别限定，例如可以选用细菌。本申请对细菌的种类也不做特别限定，例如可以是红球菌（例如红色红球菌（Rhodococcus ruber）、浑浊红球菌（Rhodococcus opacus））、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等。其中，红球菌是一种好氧的革兰氏阳性菌，为非模式菌株。由于具有较高的有机溶剂耐受性、丰富的腈类及芳香族化合物代谢酶系，红球菌在生物催化、环境修复、生物合成及木质降解利用等领域有着广泛的应用。例如：在生物催化领域，红球菌已被成功应用于丙烯酰胺、丙烯酸等化合物的生物法生产；在生物合成领域，红球菌能够合成生物表面活性剂、类胡萝卜素、抗菌剂、三酰甘油和聚羟基烷酸酯等诸多高附加值产物。此外，红球菌也是高效的蛋白表达宿主，例如在玫瑰红球菌（Rhodococcus rhodochrous）中，腈水合酶能够占到可溶性蛋白总量的45%左右。上述应用领域均为通过在红球菌胞内表达目标蛋白来实现生物催化、生物合成等目的。鉴于红球菌的诸多特性及重要的潜在应用价值，提高红球菌对目标蛋白的分泌表达能力对于拓宽红球菌应用领域，开发红球菌催化、合成平台具有重要的作用。
本申请实施例的基因工程菌可以包含上述载体，也可以是基因组中整合所述的核酸分子。
本申请实施例的第九方面
本申请实施例提供一种第八方面中所述的基因工程菌的构建方法，其包括在宿主中导入第六方面中所述的核酸分子构建基因工程菌的步骤。
本申请实施例的第十方面
本申请实施例提供一种漆酶突变体的生产方法，其包括培养第九方面中所述的基因工程菌；以及，从所得培养物中分离所述漆酶突变体。
在其中一些示例中，发酵的条件满足如下条件中的一个或者多个：
（1）发酵的培养基包括：10g/L-40g/L（例如10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40g/L）葡萄糖、2g/L-10g/L（例如为2、3、4、5、6、7、8、9、10g/L）酵母膏、8g/L-12g/L（例如为8、9、10、11、12g/L）尿素、1.5g/L-1.9g/L（例如为1.5、1.6、1.7、1.8、1.9g/L）K2HPO4、0.75g/L-0.95g/L（例如为0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95g/L） KH2PO4、0.8g/L-1.3g/L（例如为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3g/L）MgSO4·7H2O、0.8g/L-1.3g/L（例如为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3g/L）味精以及水，pH值为7.2-7.6（例如为7.2、7.3、7.4、7.5、7.6）；以及，
（2）发酵温度为25℃-32℃（例如为25、26、27、28、29、30、31、32℃），发酵转速为170rpm-230rpm（例如为170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230rpm），发酵时间为24h-72h（例如为24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72h）。
本申请实施例的第十一方面
本申请实施例提供一种目标底物的催化方法，其包括如下步骤：用第五方面中所述的漆酶突变体催化目标底物。
可选地，催化的条件满足如下条件中的一个或者多个：
1）所述漆酶的用量为10U/L-5000U/L（例如为10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1300、1500、1700、1900、2100、2300、2500、2700、2900、3100、3300、3500、3700、3900、4100、4300、4500、4700、5000 U/L）；以及，
2）在pH值为3-9（例如为3、4、5、6、7、8、9）的水相中进行，介体的浓度为0mM-1mM（例如为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1mM），温度为30℃-90℃（例如为30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90℃），时间为0.5h-96h（例如为0.5、1、2、4、6、8、12、16、18、20、24、28、32、36、40、46、50、56、64、68、72、76、80、84、88、90、96）。
在添加介体的情况下，本申请对介体的种类不做特别限定，包括但不限于2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、L-酪氨酸、维生素K3、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、特丁基对苯二酚、苯酚、2-甲氧基-4-甲基苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、愈创木酚、4-乙基愈创木酚、2-异丙基苯酚、2，6-二甲苯酚、2,6-二甲氧基苯酚、间苯二酚、香芹酚、2-甲氧基-4-丙基苯酚、3,4-二甲酚、邻甲硫基苯酚、2-乙基苯酚、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚、对丙基苯酚、3-丙烯基-6-乙氧基苯酚、邻-丙基苯酚、茶多酚、4-己基间苯二酚、丁香酚、异丁香酚、甲基丁香酚、对-甲酚、邻-甲酚、间-甲酚、百里香酚、麦芽酚、左旋多巴、儿茶酚、乙酰丁香酮、咖啡酸、对羟基肉桂酸、阿魏酸、丁香酸甲酯、苯酚红、丁香酸、丁香醛、2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基、和香草醛中的一种或者多种。
本申请对目标底物的种类不做特别限定，包括但不限于真菌毒素、染料和抗生素。
图1为高效表达漆酶的重组红色红球菌构建流程，下面将结合图1和各实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1、pNV18.1-Pa2-A-slac重组质粒构建
1.选取来源于天蓝链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)的双结构域漆酶SLAC作为待表达的目标酶，针对红色红球菌（Rhodococcus ruber）进行密码子优化，优化后核苷酸序列如SEQ ID NO.9。采用化学全合成法获得基因片段。基因合成工作委托金斯瑞生物科技股份有限公司完成。
2.以SLAC-F/SLAC-R为引物，以合成的基因片段为模板，通过PCR反应扩增得到slac基因片段，并进行回收和纯化。利用pNV-F/pNV-R引物通过PCR法对质粒骨架pNV18.1-Pa2-A进行线性化，对线性化质粒进行回收纯化。利用Gibson Assembly试剂盒（Clonesmarter品牌，购于中美泰和生物技术（北京）有限公司）进行重组质粒的连接。
PCR反应体系为：模板1μL（1ng/μL），上游引物2μL，下游引物2μL，Phanta MaxMaster Mix 25μL，无菌水20μL，总体积50μL；
PCR反应条件为：95℃ 3min；95℃ 30s，55℃ 15s，72℃ 1min，35个循环；72℃5min；4℃forever。
pNV18.1-Pa2-A中的A表示SEQ ID NO.18所示的核酸分子，SEQ ID NO.18：ATGACCATTCGTACCGAACCGCTGCGCCTGTCGCGTCGCGGTTTTTTGGCCGCAGGTGCAGGCGCCCTGGCAGCCACAGCCCTGGGCGGCTGGACCCCGGTCCATGCC。
该核酸分子编码SEQ ID NO.19所示的多肽，SEQ ID NO.19 (36aa)：MTIRTEPLRLSRRGFLAAGAGALAATALGGWTPVHA。
3.取10μL的连接体系加入到100μL大肠杆菌trans10感受态细胞中（购于北京全式金生物技术有限公司），轻弹混匀后冰上放置30min，42℃热激60s，冰上继续放置2min；加入900μL无菌SOC培养基，37℃ 200rpm复苏1h。取100-200μL菌液涂布于还有50μg/mL的LB固体培养基上，37℃倒置过夜培养，挑选阳性克隆，并进行PCR验证以及测序验证，得到重组质粒pNV18.1-Pa2-A-slac，图谱如说明书附图2所示。
SOC培养基配方：蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，氯化钠0.5g/L，2.5mM氯化钾，10mM氯化镁，20mM葡萄糖，水。
LB固体培养基配方：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH=7.0，固体平板培养基含有琼脂1.5wt%-2wt%，水。
引物由苏州安升达生物技术有限公司合成，用无菌水稀释至10μM使用。PCR扩增采用南京诺唯赞公司的高保真DNA聚合酶Phanta Max Master 2×mix。
引物的序列（5’-3’）如下：
SLAC-F（SEQ ID NO.20）：TGGACCCCGGTCCATGCCGCGCCGGCAGCCAAGGGC；
SLAC-R（SEQ ID NO.21）：
GAATTCGAGCTCGGTACCTCAGTGTTCATGCTCGTGCGCG；
pNV-F（SEQ ID NO.22）：TGAACACTGAGGTACCGAGCTCGAATTC；
pNV-R（SEQ ID NO.23）：CGGCGCGGCATGGACCGGGGTCCAGCC。
实施例2、含重组质粒pNV18.1-Pa2-A-slac的基因重组红色红球菌构建
提取实施例1所构建的重组质粒，取1-2μg加入到100μL红色红球菌Rhodococcusruber TH感受态中，轻弹混匀后置于冰上10min。用移液器吸取混合有重组质粒的感受态细胞置于2mm电转杯中，2.5kV电击后迅速加入900μL LBHIS培养基。28℃ 200rpm复苏2-3h。复苏结束后，13000rpm离心3min，去掉700μL上清液，细胞重选后全部涂布于含有25μg/mL的红色红球菌固体培养基平板上。28℃倒置培养48-60h后进行菌落PCR，挑取阳性克隆即得到所需重组菌株。重组菌株的构建流程如图1所示。
LBHIS培养基：5g/L蛋白胨，5g/L氯化钠，2.5g/L酵母粉，18.5g/L脑心浸出液，91g/L山梨醇，水。
红色红球菌固体培养基：10g/L葡萄糖，3g/L酵母膏，1g/L氯化钠，2g/L三水合磷酸氢二钾，0.2g/L七水合硫酸镁，15g/L琼脂，水，自然pH。
实施例3、含重组质粒pNV18.1-Pa2-A-slac的基因工程红色红球菌发酵生产漆酶
1.菌种活化：将重组红色红球菌划线于红色红球菌固体培养基上，28℃培养48h。
2.种子培养：用10μL无菌接种环挑取一环菌落，接种于红球菌种子培养基中，28℃200 rpm培养48h。
3.发酵培养：以体积比10%的接种量将红球菌种子接种于红色红球菌发酵培养基中，28℃ 200rpm培养48h。
4.菌体破碎：使用高压匀浆机对发酵液原液进行破碎，制备粗酶液。
发酵流程如说明书附图3所示。
实施例4、产漆酶突变体M1/M2的基因工程红色红球菌构建
1.利用V261N-F/V261N-R引物对实施例1构建的pNV18.1-Pa2-A-slac重组质粒进行线性化扩增，并利用Gibson Assembly试剂盒（Clonesmarter品牌，购于中美泰和生物技术（北京）有限公司）进行重组质粒的连接。将连接体系转化至大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒载体pNV18.1-Pa2-A-slac（V261N）。
2.利用V261A-F/V261A-R引物对实施例1构建的pNV18.1-Pa2-A-slac重组质粒进行线性化扩增，并利用Gibson Assembly试剂盒（Clonesmarter品牌，购于中美泰和生物技术（北京）有限公司）进行重组质粒的连接。将连接体系转化至大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒载体pNV18.1-Pa2-A-slac（V261A）。pNV18.1-Pa2-A-slac（V261N）和pNV18.1-Pa2-A-slac（V261A）的质粒图谱见图7。
3.分别将步骤1和步骤2所构建的重组质粒转化至红色红球菌TH感受态细胞，挑取阳性克隆后分别得到重组红色红球菌M1（V261N）和重组红色红球菌M2（V261A）。引物序列如下：
V261A-F（SEQ ID NO.24）：
ACTGCCACGCCCAGTCGCACAGCGACATGGG；
V261A-R（SEQ ID NO.25）：TGTGCGACTGGGCGTGGCAGTGATACATCCACGC。
V261N-F（SEQ ID NO.26）：TCACTGCCACAACCAGTCGCACAGCGACATGGGCATG；
V261N-R（SEQ ID NO.27）：CGCTGTGCGACTGGTTGTGGCAGTGATACATCCACG。
实施例5、漆酶活性测定
参照实施例3提供的方法，分别对实施例2构建的重组红色红球菌以及实施例4构建的重组红色红球菌M1（V261N）和重组红色红球菌M2（V261N）进行发酵，制备粗酶液进行活性测定。
1、以ABTS为底物
采用Boxbio漆酶活性检测试剂盒（AKAO018M），说明书：https://www.boxbio.cn/product/764.html?goodsno=AKAO018M。具体如下：
取30μL粗酶液与170μL底物溶液混合（空白对照组为30 μL蒸馏水与170μL底物溶液混合），立即混匀后开始计时，测定10s时420nm吸光度，记为A1测定和A1空白；42℃反应180s后立即测定420nm吸光度，记为A2测定和A2空白。计算ΔA测定=A2测定-A1测定；ΔA空白= A2空白-A1空白。ΔA=ΔA测定-ΔA空白。根据以下公式计算漆酶活性：
漆酶活性（U/L）=(ΔA×V反总×106)/(ε×d1×V样品×T) ×1000=123.46×ΔA
酶活定义为每分钟氧化1μmol ABTS所需要的酶量。
V反总：0.2 mL；106：1mol=106 μmol；ε: ABTS摩尔消光系数，3.6×104 L/mol/cm；d1：96孔板光径，0.5 cm；V样品：0.03 mL；T：3min。
2、以愈创木酚为底物
配制一定浓度的愈创木酚底物溶液，取2.4 mL底物溶液置于10 mL离心管中，在一定温度下温育3min，加入粗酶液0.6mL（空白组加入等体积的水）。一定温度下反应30min。测定465 nm处的吸光度。酶活计算公式如下：
X—样品的酶活力µmol/ml/min；
3—反应总体积（mL）；
0.6—测定所取酶液体积（mL）；
12000—愈创木酚摩尔消光系数；
30—反应时间（min）；
A—465nm处测定吸光度；
106—1mol=106μmol。
实施例2构建的重组红色红球菌所制备的融合漆酶酶活随底物浓度变化趋势如说明书附图4所示，酶活随温度变化趋势如说明书附图5所示，图4和图5对应的pH为4.8。漆酶突变体M1和M2在pH=4条件下，不同温度的酶活性，测试结果如说明书附图6所示。
参照实施例1的方法分别构建pNV18.1-Pa2-slac和pNV18.1-Pa2-A-slac重组质粒并参照实施例2的方法相应构建重组红色红球菌、参照实施例3产漆酶。
漆酶M1的氨基酸序列（SEQ ID NO.28）：
APAAKGITARTAPAGGEVRHLKMYAEKLADGQMGYGFEKGKASVPGPLIEVNEGDTLHIEFTNTMDVRASLHVHGLMDYEISSDGTAMNKSDVEPGGTRTYTWRTHKPGRRDDGTWRPGSAGYWHYHDHVVGTEHGTGGIRNGLYGPVIVRRKGDVLPDATHTIVFNDMTINNRKPHTGPDFEATVGDRVEIVMITHGEYYHTFHMHGHRWADNRTGILTGPDDPSRVIDNKITGPADSFGFQIIAGEGVGAGAWMYHCHNQSHSDMGMVGLFLVKKPDGTIPGYEPHEHGGATAKSGESGEPTGGAAAHEHEH。
同时，参照实施例1的方法构建pNV18.1-Pa2-B-slac重组质粒（图9），参照实施例2构建pNV18.1-Pa2-B-slac的基因重组红色红球菌、参照实施例3生产漆酶。
其中，B表示SEQ ID NO.29所示的核酸分子，SEQ ID NO.29：
ATGATCCGACGCGCACTCACCACCGCCGCCCTCGCGGCCGCCGCGACACTAGTCCTCGCTCCGACCGCCACCGCC。
B编码的多肽如下SEQ ID NO.30：MIRRALTTAALAAAATLVLAPTATA。
在构建过程中，以SLAC-F1/SLAC-R1以合成的基因片段为模板，通过PCR反应扩增得到slac基因片段，并进行回收和纯化。利用pNV-F1/pNV-R1引物通过PCR法对质粒骨架pNV18.1-Pa2-B进行线性化，对线性化质粒进行回收纯化。利用Gibson Assembly试剂盒（Clonesmarter品牌，购于中美泰和生物技术（北京）有限公司）进行重组质粒的连接。
引物的序列（5’-3’）如下：
SLAC-F1（SEQ ID NO.31）：
CACCGCCGCGCCGGCAGCCAAGGGC；
SLAC-R1（SEQ ID NO.32）：
ATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCTCAGTGTTCATGCTCGTGCGC；
pNV-F1（SEQ ID NO.33）：GTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATG；
pNV-R1（SEQ ID NO.34）：
TTGGCTGCCGGCGCGGCGGTGGCGGTCGGAGCG。
参照实施例5进行漆酶检测，结果见图8（以愈创木酚为底物）。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (14)

1.重组红色红球菌，其含有目标基因片段及其表达增强基因片段；
所述目标基因片段包括漆酶基因的编码区中信号肽编码区域之外的区域；
所述表达增强基因片段编码氨基酸序列如SEQ ID NO.19或者SEQ ID NO.30所示的多肽；
所述目标基因片段位于所述表达增强基因片段的下游；
所述目标基因片段编码的漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.28所示。
2. 根据权利要求1所述的重组红色红球菌，其中，所述表达增强基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.29中任一项所示。
3. 根据权利要求1所述的重组红色红球菌，其中，所述目标基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组红色红球菌，其中，所述目标基因片段和所述表达增强基因片段的间隔为0bp-200bp。
5.根据权利要求4所述的重组红色红球菌，其中，所述目标基因片段和所述表达增强基因片段的间隔为0bp-50bp。
6.权利要求1至5中任一项所述的重组红色红球菌的构建方法，其包括将所述目标基因片段及其表达增强基因片段导入红色红球菌宿主构建重组红色红球菌的步骤。
7.根据权利要求6所述的重组红色红球菌的构建方法，其包括如下步骤：
构建所述目标基因片段及其表达增强基因片段的融合表达载体，以及用所述融合表达载体转化所述红色红球菌宿主，构建所述重组红色红球菌。
8.根据权利要求7所述的重组红色红球菌的构建方法，其中，所述融合表达载体包括pNV18.1质粒、pBNV质粒、pCR质粒或其衍生质粒。
9.漆酶的生产方法，其包括对权利要求1至5中任一项所述的重组红色红球菌进行发酵生产漆酶的步骤。
10.根据权利要求9所述的漆酶的生产方法，其中，发酵的条件满足如下条件中的一个或者多个：
（1）发酵的培养基包括10g/L-40g/L葡萄糖、2g/L-10g/L酵母膏、8g/L-12g/L尿素、1.5g/L-1.9g/L K2HPO4、0.75g/L-0.95g/L KH2PO4、0.8g/L-1.3g/L MgSO4·7H2O、0.8g/L-1.3g/L味精以及水，pH值为7.2-7.6；以及，
（2）发酵温度为25℃-32℃，发酵转速为170rpm-230rpm，发酵时间为24h-72h。
11.目标底物的催化方法，其包括如下步骤：
采用权利要求9或者10所述的生产方法生产漆酶；以及，
用所述漆酶催化目标底物。
12.根据权利要求11所述的目标底物的催化方法，其中，催化的条件满足如下条件中的一个或者多个：
1）所述漆酶的用量为10U/L-5000U/L；以及，
2）在pH值为3-9的水相中进行，介体的浓度为0mM-1mM，温度为30℃-90℃，时间为0.5h-96h。
13.根据权利要求12所述的目标底物的催化方法，其中，所述介体包括2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、L-酪氨酸、维生素K3、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、特丁基对苯二酚、苯酚、2-甲氧基-4-甲基苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、愈创木酚、4-乙基愈创木酚、2-异丙基苯酚、2，6-二甲苯酚、2,6-二甲氧基苯酚、间苯二酚、香芹酚、2-甲氧基-4-丙基苯酚、3,4-二甲酚、邻甲硫基苯酚、2-乙基苯酚、4-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚、对丙基苯酚、3-丙烯基-6-乙氧基苯酚、邻-丙基苯酚、茶多酚、4-己基间苯二酚、丁香酚、异丁香酚、甲基丁香酚、对-甲酚、邻-甲酚、间-甲酚、百里香酚、麦芽酚、左旋多巴、儿茶酚、乙酰丁香酮、咖啡酸、对羟基肉桂酸、阿魏酸、丁香酸甲酯、苯酚红、丁香酸、丁香醛、2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基、和香草醛中的一种或者多种。
14.根据权利要求11至13中任一项所述目标底物的催化方法，其中，所述目标底物包括真菌毒素、染料和抗生素中的一种或者多种。
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