CN115768902A - 用katg酶酶促降解聚烯烃聚合物塑料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及KatG酶和酶组合物及其在塑料的酶促降解中的用途。

Description

用KATG酶酶促降解聚烯烃聚合物塑料
技术领域
本发明涉及酶促降解塑料的方法，所述塑料特别包括合成塑料聚烯烃(PA)聚合物，例如聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯(PS)和氯化聚乙烯(CPE)聚合物；涉及新型酶和酶组合物及其在酶促降解塑料中的用途。
背景技术
过去50年来，全球以化石燃料原料(煤、天然气和石油)生产合成塑料聚合物的产量持续增长，在2015年达到3.22亿吨。每年仅在欧洲就产生超过3000万吨的消费后塑料废物，这种废物中只有一小部分通过回收利用和能源生产过程得到回收。
因此，塑料污染现已被公认为具有巨大社会和经济影响的全球生态灾难。因此，迫切需要改进塑料废物的管理。
然而，塑料垃圾很顽固，在环境中存留很长时间(数百年至数千年)。因此，人们对其降解的酶促过程产生了相当大的兴趣，这可以开发成环境修复方法，以及用于回收利用或降解废塑料的工业反应器。
具有杂原子主链的塑料(PET和PUR)的降解
已经鉴定和开发了多种酶来降解含有杂原子主链和酯键的合成塑料(例如聚氨酯(PUR)和聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET))，其一般主链结构如下所示：
Figure BDA0003983902350000021
Wei和Zimmermann(2017)Microbial Biotechnology 10:1308-1322以及最近Danso等人(2019)Applied and Environmental Microbiology 85:e01095-19对这一领域进行了综述。
聚酯废塑料现在被广泛认为是特别容易处理的，因为它们的酯键可以被各种不同的酶所靶向。因此，这些聚酯废塑料代表了工业酶促废塑料降解的“唾手可得的果实”。
在本文中有用的酶包括各种蛋白酶、脂肪酶、羧酸酯酶和酯酶(特别包括角质酶)。还描述了具有增加的活性和/或热稳定性的工程化变体形式。例如，WO2020021118、WO2020021117、WO2020021116、WO2018011284、WO2018011281、WO2016146540和WO2016062695中描述了各种天然和工程化的酯酶，所述文献的内容通过引用并入本文。
WO2019122308和WO2018109183中描述了各种天然和工程化的蛋白酶，所述文献的内容也通过引用并入本文。大阪堺菌(I.sakaiensis)PET酶(PETase)和工程化变体的高分辨率X射线晶体结构描述在以下文献中：Austin等人(2018)PNAS 115(19):E4350-E4357。
可以这种方式降解的聚酯塑料包括PET，但也包括其他聚酯，如聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇异山梨醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚丁烯琥珀酸酯(PBS)、聚丁二酸己二酸丁二酯(PBSA)、聚己二酸对苯二甲酸丁二酯(PBAT)、聚呋喃二甲酸乙二醇酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)、聚丁二酸对苯二甲酸丁二酯(PBST)、聚丁二酸乙二醇酯(PES)、聚(丁二酸/对苯二甲酸/间苯二甲酸丁二醇酯)-共-(乳酸酯)(PBSTIL)和聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN))。
WO2014079844、WO2015067619、WO2015097104和WO2015173265中描述了用于酶促生物降解此类聚酯聚合物的工业方法。
聚烯烃(PA)酶促降解
上面讨论的与聚酯聚合物相关的发展有可能改善塑料废物的处理和回收。然而，具有C-C主链的合成塑料聚烯烃(PA)聚合物构成了大部分作为废物丢弃的塑料，并且这类聚合物具有独特的生物降解抗性。这些PA聚合物包括各种类型的聚乙烯(PE)，以及结构相关的具有C-C主链的聚烯烃聚合物(其可被视为取代聚乙烯)，包括聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)和氯化聚乙烯(CPE)。在这些塑料中，PE和PP占2015年塑料总产量的90％以上(The Economist,"Single-use refuse"，2015年10月2日版)。
这些PA聚合物的生物降解因C-C主链中缺乏可水解官能团而受阻，如根据下面所示的结构所显而易见的：
Figure BDA0003983902350000031
Danso等人(2019)Applied and Environmental Microbiology 85:e01095-19最近总数了这些高度顽固的PA聚合物的生物降解。正如这些作者所解释的那样，虽然已经发表了许多描述微生物群落降解化学添加剂的报告，但还没有任何酶作用于高分子量聚合物聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和聚乙烯(参见Danso等人(2019)，摘要)。
可能的PE降解与大量细菌属有关，包括假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Streptomyces)和芽孢杆菌属(Bacillus))。与PE降解相关的真菌属包括曲霉属(Aspergillus)、枝孢霉属(Cladosporium)和青霉属(Penicillium)。
这些研究使用可能含有化学添加剂(如增塑剂)的商业聚合物，并通过测量重量损失和傅里叶变换红外光谱法(FTIR)确定降解。由于重量损失和表面结构变化很可能归因于化学添加剂的降解，而化学添加剂通常占聚合物的很大一部分，因此结果不可靠。
此外，这些研究均未揭示参与PE分解的生化机制和酶(Danso等人，同上)。在这方面，各种能够降解木质素(一种在植物细胞壁中发现的具有可氧化C-C键的异质交联酚类聚合物)的微生物酶与至少一定程度的PE降解活性有关。这些包括漆酶(EC 1.10.3.2.)、锰过氧化物酶(MnP，EC 1.11.1.13)和木质素过氧化物酶(LiP，EC 1.11.1.14)。
来自赤红球菌(Rhodococcus ruber)C208的漆酶在铜的存在下降解培养物上清液和无细胞提取物中的UV-照射的PE膜(Santo等人(2013)Int Biodeterior Biodegradation84:204-210)，而另一种漆酶(来自变色栓菌(Trametes versicolor))在氧化介质(1-羟基苯并三唑)的存在下降解PE膜(Fujisawa等人(2001)J Polym Environ 9:103-108)。
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)在细胞外产生的漆酶和MnP与UV-照射的PE的降解有关(Sowmya等人(2014)Adv Polym Sci Technol-Int J 4:28-32)。然而，将类似预处理的PE与部分纯化的漆酶和来自简青霉(Penicillium simplicissimum)的MnP一起孵育导致可忽略不计的重量损失(小于1％-Sowmya等人(2015)Environ Develop Sustain 17:731-745)。Ehara等人(2000)J Wood Sci 46:180-183和Iiyoshi等人(1998)J Wood Sci 44:222-229报道了从真菌黄孢原毛平革菌(Phanerocheate chrysosporium)部分纯化的锰过氧化物酶对PE的降解。
Khatoon等人(2019Environmental Technology 40(11):1366-1375)报告了从黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)部分纯化的真菌木质素过氧化物酶中的PVC降解活性。
木质素脱色拜氏固氮菌(Azotobacter beijerinckii)的纯化氢醌过氧化物酶(EC1.11.1.7)在由二氯甲烷和水组成的双相系统中降解PS(Nakamiya等人(1997)J FermBioeng 84:480-482)。然而，这种两相方法还没有进一步开发用于回收利用过程。
然而，木质素氧化分解所需的氧化还原电位远低于PE的均质C-C主链所需的氧化还原电位，因此无法预期上述酶对PE的有效降解(Krueger等人(2015)Appl.Microbiol.Biotechnol.99:8857–8874)。此外，上述研究仅使用培养上清液或部分纯化的酶制剂，需要较长的孵育时间。
已经报告了蜡螟(Galleria mellonella)的毛毛虫降解PE(Bombelli(2017)Current Biology 27(8)R292-R293)，并且还已经观察到了从蜡虫和粉虫幼虫的内脏中分离出的新型细菌菌株对PE和PS的降解(Yang等人(2014)Environ Sci Technol 48:13776-13784)；Yang等人(2015)Environm Sci Technol 49:12087-12093)。该领域最近的报告包括Cassone等人(2020)Proc R Soc B 287:20200112；Lou等人(2020)Environ Sci Technol54:2821-2831；和Zhang等人(2020)Science of the Total Environment 704:135931)。然而，所涉及的酶尚未被鉴定出来。
分子量低于500Da(即主链长度小于40个碳原子)的直链石蜡分子被多种微生物利用(Albertsson等人(1987)Polymer Degradation and Stability 18:73-87)。该活性的酶促基础可能涉及AlkB家族(EC 1.14.15.3)的烷烃羟化酶(AH)，其可以催化通过末端或近末端氧化对烃低聚物的降解(Rojo(2010)In Handbook of Hydrocarbon and LipidMicrobiology,Timmis,K.N.(ed).Berlin,Heidelberg:Springer-Verlag,781-797)。
因此，应当理解，仍然迫切需要能够降解PA聚合物的替代和/或改进酶，以用于生物修复和用于塑料废物降解的反应器中。
本发明至少部分基于发现了KatG酶家族内的预料不到的聚烯烃酶活性，以及发现了过氧化氢酶-过氧化物酶(EC 1.11.1.21)类的酶表现出聚烯烃酶活性。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了用于降解聚烯烃(PA)聚合物的组合物，其包含KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶和合适的赋形剂。某些酶，特别是B2UBU5的突变形式是新的，并因此构成本发明的一个方面。因此，本发明提供了选自下组的SEQ ID NO:1的酶变体：B2UBU5 KatGN，具有以下突变中的一种或多种的酶：M248I、M248V、Y221F、Y221A、Y221L、W98A、W98F和/或R410N。酶与B2UBU5或B2UBU5 KatGN具有至少50％的同一性。优选的是包含Y221F和/或R410N突变的B2UBU5变体，更优选的是包含Y221F和R410N突变的B2UBU5变体。
根据本发明的第二个方面，提供了一种用于降解聚烯烃(PA)聚合物的酶组合物，该组合物包含KatG/EC 1.11.1.21 PA酶和一种或多种用于产生过氧化氢的辅助酶。
根据本发明的第三个方面，提供了一种塑食酶(plasticase)混合物组合物，该混合物包含KatG/EC 1.11.1.21 PA酶(PAase)和一种或多种辅助性塑食酶。
根据本发明的第四方面，提供了一种用于降解聚烯烃(PA)聚合物的废物修复酶混合物组合物，该混合物包含KatG/EC 1.11.1.21 PAase和一种或多种辅助性非塑食酶生物修复酶。
根据本发明的第五方面，提供了表达KatG/EC1.11.1.21 PAase或其变体的重组细胞宿主。
根据本发明的第六方面，提供了一种组合物，其中该组合物包含与PA聚合物底物组合的KatG/EC 1.11.1.21 PA酶。
根据本发明的第七方面，提供本发明的组合物用于生物修复被PA聚合物底物污染的材料。
根据本发明的第八方面，提供了包含KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶(和/或表达和/或分泌KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶的微生物)的KatG降解助剂，用作生物降解塑料添加剂。
根据本发明的第九方面，提供了一种复合KatG塑料，其包含与本发明的KatG降解助剂组合的塑料聚合物。
根据本发明的第十方面，提供了一种自降解PA聚合物，其包含与本发明的KatG降解助剂组合的PA聚合物。
根据本发明的第十一方面，提供了一种塑料制品，其包含本发明的KatG降解助剂、复合KatG塑料或自降解PA聚合物。
根据本发明的第十二方面，提供了一种用于酶促降解PA聚合物的方法，该方法包括以下步骤：使所述PA聚合物与包含本发明的PA酶的组合物接触，从而使PA聚合物中的C-C键被裂解，从而酶促降解PA聚合物。
根据本发明的第十三方面，提供了一种用于生产PA聚合物的片段、低聚物、重复单元片段、重复单元衍生物的方法，该方法包括降解所述聚合物的步骤，通过使所述聚合物与包含本发明的PA酶的组合物在使PA聚合物中的C-C键被裂解的条件下接触，从而酶促降解聚合物。衍生物包括以下的氧化产物：H-O-O-X(过氧化物)、HC(＝O)-X(醛)、HO(O＝)CX(羧酸)形式，以及相应的同型二取代变体(二过氧化物、二醛，特别是二羧酸)和混合的杂衍生物(混合的酸、醛、醇和过氧化物，经过必要的变通)，其中氧化的聚烯烃的氧化程度不同。典型的衍生物包括氧化的C2-C20聚烷烃，如草酸(乙二酸)、丙二酸、琥珀酸(丁二酸)、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一烷二酸、十二烷二酸、乙醇酸、乙醛酸、柠檬酸、糠酸和苯丙酮酸。
根据本发明的第十四方面，提供包含KatG/EC 1.11.1.21 PA酶的组合物用于降解PA聚合物的用途。
根据本发明的第十五方面，提供了包含PA酶的组合物用于生产PA聚合物的片段、低聚物、重复单元片段、重复单元衍生物的用途，通常如上所述。
根据本发明的第十六方面，提供包含PA酶的组合物用于生物修复被PA聚合物污染的材料的用途。
根据本发明的第十七方面，提供了一种生产微生物生物质的方法，包括以下步骤：(a)提供包含至少一种表达KatG/EC 1.11.1.21 PA酶的微生物的种子培养物；(b)提供包含PA聚合物的原料；(c)将所述种子培养物与所述原料混合以形成接种的原料；以及(d)孵育接种的原料，由此PA聚合物中的C-C键被裂解以产生所述聚合物的降解产物，该降解产物被所述微生物代谢产生所述微生物生物质。
根据本发明的第十八方面，提供了一种用于生产生物产品的方法，包括以下步骤：(a)提供包含至少一种表达KatG/EC 1.11.1.21 PA酶的微生物的种子培养物；(b)提供包含PA聚合物的原料；(c)将所述种子培养物与所述原料混合以形成接种的原料；以及(d)孵育接种的原料，由此PA聚合物中的C-C键被所述酶裂解以产生所述聚合物的降解产物，该降解产物被所述微生物代谢产生所述生物产品。
根据本发明的第十九方面，提供了一种用于生产超活性KatG酶的方法，包括以下步骤：
(a)提供具有第一PA酶活性的野生型KatG酶；
(b)提供所述野生型KatG酶的多个突变形式，其相对于野生型KatG的氨基酸序列具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入；
(c)确定步骤(b)的突变形式的PA酶活性；和
(d)鉴定具有高于所述第一PA酶活性的PA酶活性的超活性KatG酶。
根据本发明的第二十方面，提供了用于高通量筛选KatG突变形式的测定试剂盒，其包含可释放地偶联至发色团或荧光团的微珠，该发色团或荧光团通过PA酶活性释放。优选地，表达所述Kat G突变体的微生物在选择压力下生长，所述选择压力有利于表达KatG突变体的细胞的生长或抑制不表达此类突变体的细胞的生长。
根据第二十一方面，提供了一种用于生产二羧酸的方法，该方法包括在过氧化氢的存在下孵育KatG酶和聚烯烃(PA)聚合物。
根据第二十二方面，提供了一种生产二羧酸的方法，该方法包括在氧气的存在下孵育KatG酶与聚烯烃(PA)聚合物。
本发明还提供了一种用于降解聚烯烃聚合物的反应器，其包含如本文所述的KatG酶或如本文所述的KatG组合物。本发明还提供了一种用于进行如本文所述的聚烯烃聚合物降解过程的反应器。
本发明的其他方面、优选特征和特征的优选操作组合在所附权利要求中予以定义和描述。
发明详述
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和其他参考文献均出于所有目的通过引用以其整体并入本文，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请都明确且单独地指明通过引用并入且其内容已完整叙述一样。
1.定义和一般优选方案
术语KatG酶是技术术语，它定义了落在血红素过氧化物酶-过氧化氢酶(Px-Ct)超家族I类内的系统发育相关酶的结构亚类(Passardi等人Genomics89(2007)567–579)。因此，KatG不同于I类中的其他两个亚类(抗坏血酸过氧化物酶(APx，EC 1.11.1.11)和细胞色素c过氧化物酶(CcP，EC 1.11.1.5))。本发明的KatG酶裂解聚烯烃(PA)聚合物底物中的C-C键，从而将聚合物酶促降解为：(a)片段；和/或(b)低聚物；和/或(c)分离的单体或重复单元；和/或(d)单体或重复单元片段；和/或(e)单体或重复单元衍生物。优选的PA聚合物底物包含具有C-C主链的聚合物链段。更详细地说，在氧气或过氧化氢存在的情况下，PA聚合物底物通常降解为C1-C12二羧酸。产生的优选二羧酸包括：草酸(乙二酸)、丙二酸、琥珀酸(丁二酸)、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一烷二酸和十二烷二酸。此类化合物可以纯化并发现可用于本领域技术人员已知的一系列应用中。
此类化合物作为高价值特殊化学品的用途类别是本领域技术人员已知的，包括用于许多制造过程，例如电子、香精和香料、特种溶剂、聚酯、聚合物交联、食品添加剂和制药行业。作为进一步的实例，丙二酸(和丙二酸酯；MA)被用作构建块化学品以产生多种有价值的化合物。丙二酸和丙二酸的化学衍生物(例如丙二酸单烷基酯、丙二酸二烷基酯和2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(“米氏酸(Meldrum's acid)”))用于许多工业和消费产品的生产，包括聚酯、保护涂层、溶剂、电子产品、香精、香料、药品、手术粘合剂和食品添加剂。
术语过氧化氢酶-过氧化物酶EC 1.11.1.21是技术术语，它定义了表现出过氧化物酶和过氧化氢酶双重活性的功能性酶亚类。酶学委员会编号(Enzyme Commissionnumber，EC编号)是酶的数字分类方案，基于它们催化的化学反应。因此，EC编号本身并不指定酶(即不一定定义同质结构类别)，而是指定酶催化的反应(即EC编号定义功能类别)。因此，催化相同反应的不同酶获得相同的EC编号。此外，通过趋同进化，完全不同的蛋白折叠可能催化相同的反应，因此会被分配相同的EC编号(并被称为非同源同功异构酶(non-homologous isofunctional enzyme)，或NISE)。不希望受任何理论的束缚，据信天然存在的过氧化氢酶-过氧化物酶EC 1.11.1.21酶是KatG酶(如上所定义的)。
本发明人已经发现本发明的过氧化氢酶-过氧化物酶EC 1.11.1.21酶裂解聚烯烃(PA)聚合物底物中的C-C键，从而将聚合物酶促降解成：(a)片段；和/或(b)低聚物；和/或(c)分离的单体或重复单元；和/或(d)单体或重复单元片段；和/或(e)单体或重复单元衍生物。这样的衍生物包括具有C2-C12主链的二羧酸。主链可以是饱和的、部分饱和的并且可以是直链或支链形式。例如草酸(乙二酸)、丙二酸、琥珀酸(丁二酸)、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一烷二酸和十二烷二酸。其他降解产物包括乙醇酸、乙醛酸、柠檬酸、糠酸和苯丙酮酸。
优选的PA聚合物底物包含具有C-C主链的聚合物链段。
如本文所用，术语KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶定义了一种KatG酶(如本文所定义的)或过氧化氢酶-过氧化物酶EC 1.11.1.21(如本文所定义的)，其裂解聚烯烃(PA)聚合物底物中的C-C键，从而将聚合物酶促降解为：(a)片段；和/或(b)低聚物；和/或(e)单体或重复单元衍生物。为了便于阅读，此类KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶在本文中可称为本发明的PA酶(或当上下文允许时简称为PA酶)，并且它们应被理解为包括第3节(下文)中描述的各种天然和人工KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶/酶变体。
如本文所用，术语聚合物定义包含通过共价化学键连接的重复单元的化学化合物。重复单元可以通过单体的聚合形成。除非上下文另有说明，术语聚合物包括天然和合成聚合物。
连接的聚合单体或重复单元可以是单一种类(此类聚合物在本文中称为均聚物)或两种或更多种不同单体或重复单元的混合物(此类聚合物在本文中称为杂聚物或共聚物)。
包含两种不同重复单元(通常通过两种不同单体种类共聚获得的)的共聚物可称为二元共聚物，而那些包含三种(通常通过三种不同单体种类共聚获得的)或四种不同重复单元(通常通过四种不同单体种类共聚获得的)的共聚物可分别称为三元共聚物和四元共聚物。
因此，取决于重复单元的组织，共聚物可能含有两个或更多个不同的主链片段。
共聚物进一步分为无规(统计)、交替、嵌段或接枝共聚物(根据重复单元的排列)。
线性聚合物由单个主链(骨架)组成。支化聚合物(如支化聚乙烯和接枝共聚物作为一类)由具有一个或多个聚合侧链的单个主链或骨架组成。支化聚合物可以具有任何构型或结构，包括星形、规则或不规则梳状、刷状、网状、网络状和/或树枝状。
由2至50个、优选2-20个重复单元组成的聚合物在本文中称为低聚物。分子量小于2000Da的聚合物在其通过降解过程(例如，酶促降解)衍生自较长聚合物的情况下在本文中称为片段。
如本文所用，与某些合成塑料聚合物相关的术语聚酯定义为在其主链中含有酯官能团的那些。酯通常衍生自羧酸和醇。聚酯聚合物可以是芳香族的、脂肪族的或半芳香族的。
如本文所用，与某些合成塑料聚合物相关的术语聚酰胺定义为包含通过酰胺键连接的重复单元的那些聚合物。聚酰胺聚合物可以是芳香族的、脂肪族的或半芳香族的。
在聚合物降解的情况中，术语片段化、低聚和解聚应理解为分别产生：(a)片段；和/或(b)低聚物；和/或(c)分离的单体或重复单元、单体或重复单元片段或单体或重复单元衍生物。
如本文所用，术语聚烯烃酶(可缩写为PA酶)是一种酶，其裂解聚烯烃(PA)聚合物的骨架(或骨架片段)中的C-C键，从而使所述PA聚合物通过片段化、低聚和/或解聚被酶促降解。可以这种方式被本发明的PA酶降解的PA聚合物包括如第4.2.1节(下文)中定义和描述的各种PA聚合物中的一种或多种。PA聚合物底物包括如第4.3和4.4节(下文)中定义和描述的各种合成PA塑料底物和PA塑料产品。因此，在优选的实施方案中，本发明的PA酶裂解PA聚合物、合成PA塑料底物或PA塑料产品的骨架(或骨架链段)中的C-C键，由此所述PA聚合物、塑料或产品通过片段化、低聚和/或解聚被酶促降解。
如本文所用，术语聚乙烯酶(其可缩写为PE酶(PEase))定义了一种PA酶(如上文所定义的)，其裂解聚乙烯(PE)聚合物的骨架(或骨架链段)中的C-C键，由此所述PE聚合物通过片段化、低聚和/或解聚被酶促降解。可以这种方式被本发明的PE酶降解的PE聚合物包括如第4.2.1节(下文)中定义和描述的各种PE聚合物中的一种或多种。PE聚合物底物包括如第4.3和4.4节(下文)中定义和描述的各种合成PE塑料基底物和PE塑料产品。因此，在优选的实施方案中，本发明的PE酶裂解PE聚合物、合成PE塑料底物或PE塑料产品的骨架(或骨架链段)中的C-C键，由此所述PE聚合物、塑料或产品通过片段化、低聚和/或解聚被酶促降解。
如本文所用，术语聚丙烯酶(可缩写为PP酶())定义了一种PA酶(如上文所定义的)，其裂解聚丙烯(PP)聚合物骨架(或骨架链段)中的C-C键，由此所述PP聚合物通过片段化、低聚和/或解聚被酶促降解。可以这种方式被本发明的PP酶降解的PP聚合物包括如第4.2.2节(下文)中定义和描述的各种PP聚合物中的一种或多种。PP聚合物底物包括第4.3和4.4节(下文)中定义和描述的各种合成PP塑料底物和PP塑料产品。因此，在优选的实施方案中，本发明的PP酶裂解PP聚合物、合成PP塑料底物或PP塑料产品的骨架(或骨架链段)中的C-C键，由此所述PP聚合物、塑料或产品通过片段化、低聚和/或解聚被酶促降解。
如本文所用，术语聚氯乙烯酶(其可缩写为PVC酶(PVCase))定义了一种PA酶(如上文所定义的)，其裂解聚氯乙烯(PVC)聚合物的骨架(或骨架链段)中的C-C键，由此所述PVC聚合物通过片段化、低聚和/或解聚被酶促降解。可以这种方式被本发明的PVC酶降解的PVC聚合物包括如第4.2.3节(下文)中定义和描述的各种PVC聚合物中的一种或多种。PVC聚合物底物包括第4.3和4.4节(下文)中定义和描述的各种合成PVC塑料底物和PVC塑料产品。因此，在优选的实施方案中，本发明的PVC酶裂解PVC聚合物、合成PVC塑料底物或PVC塑料产品的骨架(或骨架链段)中的C-C键，由此所述PVC聚合物、塑料或产品通过片段化、低聚和/或解聚被酶促降解。
如本文所用，术语聚苯乙烯酶(可缩写为PS酶(PSase))定义了一种PA酶(如上文所定义的)，其裂解聚苯乙烯(PS)聚合物骨架(或骨架链段)中的C-C键，由此所述PS聚合物通过片段化、低聚和/或解聚被酶促降解。可以这种方式被本发明的PS酶降解的PS聚合物包括如第4.2.4节(下文)中定义和描述的各种PS聚合物中的一种或多种。PS聚合物底物包括第4.3和4.4节(下文)中定义和描述的各种合成PS塑料底物和PS塑料产品。因此，在优选的实施方案中，本发明的PS酶裂解PS聚合物、合成PS塑料底物或PS塑料产品的骨架(或骨架链段)中的C-C键，由此所述PS聚合物、塑料或产品通过片段化、低聚和/或解聚被酶促降解。
如本文所用，术语氯化聚乙烯酶(其可缩写为CPE酶(CPEase))定义了一种PA酶(如上所定义的)，其裂解氯化聚乙烯(CPE)聚合物的骨架(或骨架链段)中的C-C键，由此所述CPE聚合物通过片段化、低聚和/或解聚被酶促降解。可以这种方式被本发明的CPE酶降解的CPE聚合物包括如第4.2.1节(下文)中定义和描述的各种CPE聚合物中的一种或多种。CPE聚合物底物包括第4.3和4.4节(下文)中定义和描述的各种合成CPE塑料底物和CPE塑料产品。因此，在优选的实施方案中，本发明的CPE酶裂解CPE聚合物、合成CPE塑料底物或CPE塑料产品的骨架(或骨架链段)中的C-C键，由此所述CPE聚合物、塑料或产品通过片段化、低聚和/或解聚被酶促降解。
如本文所用，术语聚烯烃(PA)聚合物定义为包含重复单元(通常对应于聚合的烯烃单体)的C-C骨架(或骨架链段，在PA共聚物的情况下)的聚合物。
优选的PA聚合物包含具有C-C骨架的聚合物链段，并包括各种类型的聚乙烯(PE)和结构相关的聚烯烃聚合物(其可被视为取代的聚乙烯)，如下文第4.2.1节所述。
因此，这些优选的PA聚合物包括各种类型的聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯(PS)、氯化聚乙烯(CPE)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、聚丁二烯(BR)和聚异戊二烯(IR)，其包含具有C-C骨架的聚合物束或链段，在第4.2节(下文)中有更详细的描述，并且可以示意性地表示如下：
Figure BDA0003983902350000141
Figure BDA0003983902350000151
如本文所用，术语合成聚烯烃(PA)塑料定义为非天然PA聚合物。此类聚合物在本领域中可称为聚烯烃，由化石燃料(包括石油和天然气)合成。本文定义的合成PA塑料具有至少5000Da的分子量，更通常具有至少20,000Da的分子量。本文定义的合成PA塑料还包含结晶、半结晶和/或无定形域，在大多数情况下都包含结晶(和/或半结晶)和无定形域。合成PA塑料在室温下通常是固体热塑性材料(尽管一些化学修饰和/或共聚物合成PA塑料(例如PEX)可能是热固性塑料)。聚烯烃骨架(或骨架链段，在PA共聚物的情况下)可以是直链或支链的。合成聚烯烃塑料包括通过生物加工生产的塑料，例如使用代谢途径工程化生产的聚异戊二烯聚合物(见下文第4.2.7节)。
因此，应当理解，可包含聚烯烃束、域或子结构的天然聚合物(例如某些蜡)通常具有低得多的分子量，合成石蜡和石油也是如此。天然橡胶具有较高的分子量(约106Da)，但在化学上与合成异戊二烯橡胶不同。上述天然聚合物不是本文定义的合成塑料聚烯烃(PA)塑料。
如本文所用，术语PA塑料产品定义为包含一种或多种已成型为制品的PA聚合物和/或合成PA塑料的塑料制品。塑料制品可以是模制塑料产品。它的特征可以是选自片材、薄膜、管、管道、吸管、杆、绳、带状物、线、网、网状片材、三维规则形状、块、护套、纤维、膜、编织物和非编织物、袋子、容器、瓶、胶囊、包装、盘、微球、(电子)机械组件、服装、一次性咖啡杯、一次性咖啡胶囊、建筑组件、
Figure BDA0003983902350000161
积木、涂层、面板以及模压和挤压型材。
优选的合成PA塑料和PA塑料产品包含上文描述的各种类型的PA聚合物，包括上文描述的聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯(PS)、氯化聚乙烯(CPE)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、聚丁二烯(BR)和聚异戊二烯(IR)聚合物。
如本文所用，术语塑食酶作为通用术语用于能够通过其片段化和/或解聚作用酶促降解任何合成塑料聚合物的任何酶。
如本文所用，术语KatGN定义了KatG酶的催化N末端结构域。
如本文所用，术语KatGC定义了KatG酶的非催化C末端结构域。
如本文所用，术语KatGN融合体定义了KatG酶变体，其包含融合到异源KatGC结构域(或其合成类似物)的KatGN结构域。
如本文所用，术语B2UBU5定义为具有如SEQ ID NO:1中所述序列的皮氏罗尔斯通氏菌(Ralstonia pickettii)(菌株12J)的KatG酶(UniProt登录号：B2UBU5，条目名称KATG_RALPJ，发布2020_01，条目版本76)。
如本文所用，术语B2UBU5 KatGN定义为B2UBU5的催化N末端结构域(氨基酸77-391)。
如本文所用，术语B2UBU5 KatGC定义为B2UBU5的非催化C末端结构域(氨基酸398-691)。
如本文所用，与蛋白质相关的术语直系同源物定义为该蛋白质的物种变体，其在物种形成事件后在不同的生物体中分化。直系同源物可以在发现它们的每个生物体中发挥相同或不同的作用。
如本文所用，术语B2UBU5直系同源物定义为与B2UBU5同源(即，基于涉及序列比较的系统发育分析，它们似乎具有共同的祖先)，但源自不同的生物体(即，它是在物种形成事件后可能在结构和/或功能上发生分化的物种或菌株变体)的KatG酶。
优选的B2UBU5直系同源物是KatG酶，其来自除皮氏罗尔斯通氏菌(菌株12J)以外的罗尔斯通氏菌属物种/菌株，更优选地来自选自以下的罗尔斯通氏菌属物种/菌株：罗尔斯通氏菌属物种NFACC01；伯克霍尔德氏菌科(Burkholderiaceae)细菌26；罗尔斯通氏菌属物种MD27；罗尔斯通氏菌属物种AU12-08；Ralstonia insidiosa；罗尔斯通氏菌属物种TCR112；皮氏罗尔斯通氏菌(菌株12D)；皮氏罗尔斯通氏菌(皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii))；罗尔斯通氏菌属物种5_2_56FAA；皮氏罗尔斯通氏菌OR214；解甘露醇罗尔斯通式菌(Ralstonia mannitolilytica)；罗尔斯通氏菌属物种SET104；罗尔斯通氏菌属物种GX3-BWBA；罗尔斯通氏菌属物种NT80；罗尔斯通氏菌属物种GV074；和罗尔斯通氏菌属物种UNC404CL21Col。
如本文所用，术语超活性KatG酶在与B2UBU5、B2UBU5 KatGN和B2UBU5直系同源物相关时用于定义为变体，其包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与B2UBU5、B2UBU5KatGN或B2UBU5直系同源物(尤其包括上文列出的优选的B2UBU5直系同源物)的氨基酸序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同，并且其具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，其相对于B2UBU5增加了聚烯烃酶活性。
如本文所用，术语M1FBG9定义为双鞭藻(微型原甲藻(Prorocentrum minimum))(UniProt登录号：M1FBG9，条目名称M1FBG9_PROMN，发布2019_11，条目版本16)的KatG酶。
如本文所用，与氨基酸序列相关的术语同一性定义为在两个多肽序列之间相同氨基酸残基的数量(或当以百分比表示时的分数，％)。序列同一性通过在比对时比较序列以最大化重叠和同一性同时最小化序列空位来确定，并且可以使用本领域技术人员已知的多种比对算法中的任何一种来确定。特别地，可以使用公共域BLAST(2.10.0)程序来确定序列同一性。
如本文所用，术语KatG降解助剂用于定义为包含本发明的KatG/EC
1.11.1.21聚烯烃酶(和/或表达和/或分泌KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶的微生物)的组合物，为适合用作降解助剂塑料添加剂或涂料的形式。
如本文所用，术语重组体用于定义通过统称为“重组DNA技术”的技术体系(例如，使用下文描述的核酸、载体和/或宿主细胞)产生的材料。
如本文所用，术语室温(r.t.)定义为20℃的温度。
如本文所用，术语aa是指氨基酸。
2.用于本发明用途的反应器
2.1一般考虑
用于本发明用途的反应器包括一个或多个反应器容器，用于容纳包含本发明的PA酶(或表达它的微生物)和PA酶聚合物底物的反应混合物。
PA酶和PA酶聚合物底物的更多详细信息在下文陈述(分别在第3节和第4节中)。
用于本发明用途的反应器还可以包含过氧化物源(例如过氧化氢源)或用于产生过氧化物的装置(例如用于产生过氧化氢的装置)。可以使用任何合适的过氧化物(氢)源或产生装置，包括电化学发生器。这样的发生器可以例如位于反应器内或邻近反应器，例如用于在反应器容器内产生过氧化氢(或用于向反应器容器供应过氧化氢)。
在优选的实施方案中，过氧化物源包括一种或多种辅助酶，其在反应器容器内与合适的底物、水和氧气源(例如压缩空气)一起产生过氧化物。
如果存在氧气，则本发明可以在不提供过氧化物的情况下实施。
用于本发明用途的反应器优选进一步包括加热和/或冷却盘管，并且还可以进一步包括用于监测和控制反应混合物的pH的装置。
用于本发明用途的反应器优选还包括曝气器和/或搅拌器。
用于本发明用途的反应器优选进一步包括用于在操作期间对反应混合物取样的装置，并且优选进一步包括用于监测聚合物降解的装置。合适的监测装置包括一种或多种用于分析反应混合物的化学、电化学、形态学、流变学、重量分析、光谱学和/或色谱特征的仪器。
用于本发明用途的反应器可适用于生物修复被PA聚合物底物污染的材料。污染材料可以选自土壤、底土、海洋沉积物、淡水沉积物、地下水、淡水、海水、饮用水和渗滤液。
特别优选的是气升式反应器(如下面第2.4.1节中更详细描述的)。
2.2生物反应器
用于本发明用途的反应器可以是生物反应器。如本文所用，术语生物反应器定义为反应器，其中反应混合物包含表达和分泌本发明的KatG/EC1.11.1.21聚烯烃酶(PA酶)的细胞。细胞可包含细胞KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶(PA酶)表达系统(如本文所定义的)。
细胞还可表达一种或多种辅助酶(如本文所定义的)和/或一种或多种辅助性塑食酶(如本文所定义的)和/或一种或多种辅助性非塑食酶生物修复酶(如本文所定义的)。在细胞表达一种或多种辅助酶、辅助性塑食酶和/或辅助性非塑食酶生物修复酶的情况下，这些酶可以在单个重组宿主细胞中共表达。
在本发明的生物反应器中可以使用任何合适的表达系统，包括涉及原核细胞和真核细胞的那些。Gomes等人(2016)Advances in Animal and Veterinary Sciences 4(4):346-356最近综述了合适的方法。
合适的原核细胞可选自：(a)大肠杆菌(Escherichia coli)；(b)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；(c)巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)；(d)地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；(e)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；(f)富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)；(g)假单胞菌属(Pseudomonas spp.)；(h)皮氏罗尔斯通氏菌；和(i)棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)。
特别优选作为异源宿主的是大肠杆菌菌株，其被工程化为使用AIDA-I自转运体(通过控制蛋白酶ompT(+/-)的状态)将PA酶输出到细胞表面(或细胞外)，如Fleetwood等人(2014)Microb Cell Fact 13:179；Jose和Meyer(2007)Microbiol Mol Biol Rev 71:600-619中所述。
合适的真核细胞可选自：(a)酵母；(b)真菌；(c)昆虫细胞；(d)哺乳动物细胞；(e)植物细胞。合适的酵母细胞可选自：(a)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；(b)多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；(c)法夫驹形氏酵母(Komagatella phaffii)；和(d)博伊丁假丝酵母(Candida biodini)；和(e)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。合适的真菌细胞可选自：(a)丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus spp.)和木霉属(Trichodermaspp.)，以及(b)嗜热毁丝霉菌(Myceliophthora thermophila)(例如C1表达系统)。
本发明的生物反应器还可以含有一种或多种微生物，它们单独地或作为微生物聚生体的一部分降解一种或多种塑料聚合物或污染物。示例性微生物在第5.3.4节(下文)中更详细地描述。
2.3酶反应器
用于本发明用途的反应器优选是酶反应器。如本文所用，术语酶反应器定义为一种反应器，其中KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶不是在反应器容器中由生物细胞或细胞表达系统产生的，而是以游离形式存在(或固定在一个或多个反应器组件中或上)。
本发明的酶反应器优选进一步包括一种或多种辅助酶(如本文所定义的)和/或一种或多种辅助性塑食酶(如本文所定义的)和/或一种或多种辅助性非塑食酶生物修复酶(如本文所定义的)。这些额外的酶可以以游离形式存在(或固定在一个或多个反应器组件中或上)。替代地(或另外地)，这些额外的酶中的一种或多种可以通过生物细胞或细胞表达系统在酶反应器容器中产生。
因此，应当理解，本发明的酶反应器可以包括表达除本发明的KatG/EC1.11.1.21聚烯烃酶以外的酶的生物细胞，包括上文第2.2节中描述的那些，条件是KatG/EC1.11.1.21聚烯烃酶本身不是由生物细胞或细胞表达系统在反应器容器中产生的。合适的微生物在第5.3.3节(下文)中进行了更详细的描述。
2.4反应器配置
用于本发明用途的反应器可以是间歇式或连续式反应器，并且本领域技术人员将能够在考虑加工体积、生产量要求、成本和塑料原料的性质的情况下选择适当的反应器类型和配置。
因此，合适的反应器配置包括以下：搅拌罐间歇式反应器(STR)(其中罐包含所有酶和底物并且罐被搅拌直到转化完成)；间歇式膜反应器(MR)，其中酶被保持在膜管内，该膜管允许底物扩散进来以及产物扩散出去(这可以半连续方式操作，对于几个批次使用相同的酶溶液)；填充床反应器(PBR)，也称为活塞流反应器(PFR)，含有固定化酶颗粒的固定床；连续流动搅拌罐反应器(CSTR)，它是STR的连续操作形式；连续流动膜反应器(CMR)，它是MR的连续操作模式以及流化床反应器(FBR)，其中气体和/或底物的流动使固定化酶颗粒保持流化状态。
2.4.1气升式反应器
优选的用于本发明用途的反应器是气升式反应器。
气升式反应器是反应器(其可以是如上文定义和描述的酶反应器或生物反应器)，其中反应介质通过在配备有导流管或另一装置(例如外管)的柱状反应器元件的底部引入空气或另一种气体(或气体混合物)保持混合和充气，通过该元件将反应器容积分成充气和未充气(或相对较少充气)区域，从而产生垂直循环流。因此，用于本发明用途的气升式反应器包括内部和外部环路气升式反应器。
气升式反应器可以用不锈钢构造并且导流管特别有利地由不锈钢制成，通常为圆柱形并且由连接到生物反应器容器内部的臂支撑在竖直位置。进气口一般位于导流管正下方，使气液混合物在导流管内上升，但是当进气口位于导流管外部时，也可以采用相反的循环方式。反应器的简单性及其与导流管的几何关系使得可以毫无困难地放大到1.000,000升或更大的尺寸。
3.用于本发明用途的KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶
根据本发明可以使用具有聚烯烃酶活性的任何KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶(PA酶)，包括在下文更详细地示例和描述的酶和酶类别。
PA酶优选以分离或纯化的形式存在于组合物中。例如，PA酶可以从微生物(例如从皮氏罗尔斯通氏菌)中表达、衍生、分泌、分离或纯化。例如，模式菌株ATCC 27511可用作用于本发明用途的PA酶的来源。可以通过本领域已知的生化技术纯化PA酶。
也可以使用细胞表达系统通过重组技术方便地产生PA酶(参见例如Johnsson等人(1997)J Biol Chem 272:2834-2840；Zámocky等人(2012)Biochimie 94:673-683；Doyle和Smith(1996)Biochem J 315(Pt 1):15-19)。
可以使用任何合适的表达系统，包括涉及原核细胞和真核细胞的那些。Gomes等人(2016)Advances in Animal and Veterinary Sciences 4(4):346-356最近综述了合适的方法。这种方法在第6.1节(下文)中进行了更详细的解释。
PA酶可以是天然存在的酶，或者可以是天然存在的酶的变体(如下所述)，因此本发明的PA酶应理解为包括下文描述的各种天然和人工KatG/EC1.11.1.21聚烯烃酶/酶变体。
3.1 KatG酶
KatG酶广泛(但不是普遍)分布在古生菌、真细菌和低等真核生物中，并且在这些物种中存在细胞质和周质/细胞外亚型(一些生物体同时表达细胞质和细胞外KatG)。尽管分布广泛，但来自不同来源的KatG之间几乎没有序列多样性，并且多序列比对表明尽管它们的起源不同，但它们是非常密切相关的酶(Passardi等人Gene,397(2007)101-113)。
野生型形式的KatG通常是多聚体(同源二聚体或同源四聚体)，在大多数情况下，KatG亚基是一个双结构域结构(具有不同的N末端和C末端结构域，其中每个结构域都有一个典型的过氧化物酶支架)。KatG的两个结构域结构在Px-Ct超家族(甚至在I类酶中)中都是独特的，并且似乎是基因复制和融合事件的结果。
所有已知的野生型形式的KatG酶都是过氧化氢酶-过氧化物酶EC 1.11.1.21类酶的成员。然而，如下文所解释的，本发明涵盖各种不是过氧化氢酶的KatG酶(如本文所定义的)。因此，这些变体构成了本发明的一个方面。
本发明人已发现了KatG酶可充当聚烯烃酶，鉴于此类酶的已知底物，这是一个出乎意料的发现(Gumiero等人(2010)Arch Biochem Biophys 500:13-20)。
3.2 B2UBU5
B2UBU5是一种包含两个结构域的721aa蛋白，每个结构域都与血红素过氧化物酶同源：N末端结构域(77-391)和C末端结构域(398-691)。前者在本文中被称为B2UBU5KatGN，后者被称为B2UBU5 KatGC。
B2UBU5(SEQ ID NO:1)
MTTEAKCPFSGHAPAASHAFGGGTANKDWWPNQLRVDLLNQHSEKSDPLGSNFNYRKSFNAIDYDALKADLRRLMTDSQDWWPADFGHYGPQFIRMAWHAAGTYRTGDGRGGAGRGQQRFAPLNSWPDNVNIDKSRRLLWPIKQKYGQAISWADLLILTGNVALETMGFRTFGFAAGREDTWEPDNDVYWGNETKWLEATRYSGERNLANPLAAVQMGLIYVNPEGPEHAHGDPLAAAKDIRETFARMAMDDEETVALIAGGHTFGKTHGAGPASHVGADVEAAPLEAQGLGWASTFGTGKGADAITSGLEVTWTQTPAQWSNFFFENLFKYEWVQEKSPAGALQWVAKDAEAIIPGPTPDSPKRRPTMLTTDLSLRFDPAYEKISRRFLDNPQAFAEAFARAWFKLTHRDLGPKSRYLGPEVPREDLIWQDPLPTATHKPTEADIADLKAKIAASGLSASELVAVAWASASTFRGSDKRGGANGARIRLAPQKDWAVNQPVAGTLARLEEIQRASGKASLADVIVLAGSVGIELAAKAAGTTITVPFTPGRVDATAEQTDATSFSVLEPVADGFRNYQKTQFAVPGEVLLLDRAQLLTLTAPELTVLIGGLRAININADGSQHGVFTSTPGALTNDFFVNLLDMNTEWKPAGDIYEGYDRKTGERKWTGTRVDLVFGSNSILRALAEVFGSADGKERFISEFVAAWVKVMNLDRFDLAAA
3.2.1 B2UBU5和变体
用于本发明用途的优选B2UBU5酶包含与B2UBU5 KatGN为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一的氨基酸序列，由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。由或基本上由与B2UBU5 KatGN为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一的氨基酸序列组成的B2UBU5变体可以是KatGN截短体，如下文所述。
用于本发明用途的特别优选的B2UBU5酶包含与B2UBU5至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一的氨基酸序列，由或基本上由该氨基酸序列组成。
更特别优选的是B2UBU5变体，其包含氨基酸序列，由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与B2UBU5或B2UBU5 KatGN至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一，并且具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，其中：
(a)增加聚烯烃酶活性；和/或
(b)增加热稳定性；和/或
(c)增加嗜冷性；和/或
(d)增加与有机溶剂、污染物、洗涤剂、pH和/或氧化剂(包括过氧化氢)相关的稳定性。
此类变体可以通过本领域公认的方法生产，包括定向进化和定点诱变(参见Zeymer和Hilvert(2018)Annual Review of Biochemistry 87:131-157；Watkins等人NatCommun 2017；8:358；Watanabe和Nakajima,Methods Enzymol 2016；580:455-470；Lichtenstein等人Biochem Soc Trans 2012；40:561-566；Anderson等人Chem Sci 2014；5:507-514；以及Grayson和Anderson,Curr Opin Struct Biol 2018；51:149-155。
3.2.2 B2UBU5直系同源物(https://www.uniprot.org/uniprot/B2UBU5)
与B2UBU5具有至少90％氨基酸序列同一性且适合用于根据本发明的用途的B2UBU5直系同源物包括以下KatG酶(UniProt登录号后跟条目名称，如果已分配，则在括号中)：
A0A1I5SK77(A0A1I5SK77_9RALS)
A0A0F0E7J1(A0A0F0E7J1_9BURK)
A0A0J9DTW2(A0A0J9DTW2_9RALS)
S9RSJ5(S9RSJ5_9RALS)
A0A191ZZS8(A0A191ZZS8_9RALS)
A0A5C6Y6C3(A0A5C6Y6C3_9RALS)
C6BD71(C6BD71_RALP1)
A0A2P4RN88(A0A2P4RN88_RALPI)
U3GIS7(U3GIS7_9RALS)
A0A1C0XEH7(A0A1C0XEH7_RALPI)
R0CJV6(R0CJV6_RALPI)
A0A2N4TPC1(A0A2N4TPC1_RALPI)
A0A2N5LD46(A0A2N5LD46_9RALS)
A0A291EI92(A0A291EI92_RALPI)
A0A401K9C7(A0A401K9C7_9RALS)
UPI00046A45B6
UPI000DD31867
UPI000CEF361E
UPI00073F3865
UPI00046AAE20
UPI0012AE63A9
UPI000D5F3903
UPI0004803C34
UPI000CEDCA44
用于本发明用途的优选的B2UBU5直系同源物包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与上述任何一种KatG酶至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一。
根据本发明用途还考虑B2UBU5直系同源物变体，其包含氨基酸序列、由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与上述任何一种KatG酶至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一，并且具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，其：
(a)增加聚烯烃酶活性；和/或
(b)增加热稳定性；和/或
(c)增加嗜冷性；和/或
(d)增加与有机溶剂、污染物、洗涤剂、pH和/或氧化剂(包括过氧化氢)相关的稳定性。
如上文所解释的，此类变体可以通过本领域公认的方法生产。
3.2.3非过氧化氢酶性KatG酶
天然KatG酶通过自催化交联事件进行翻译后修饰，产生交联的Met-Tyr-Trp(MYW)三肽(也称为三肽加合物或辅助因子)。三肽加合物位于或靠近与修复血红素铁原子相对的蛋白活性位点。在没有完整的交联三肽的情况下，KatG过氧化氢酶活性大大减弱，而过氧化物酶活性可能增加(见下表1，改编自Paul R.Ortiz de Montellano，Heme Peroxidases中的第1章：Self-processing of Peroxidases,2015,pp.1-30)。
Figure BDA0003983902350000271
表1：导致交联三肽不完全形成的KatG突变体的过氧化氢酶和过氧化物酶活性
因此，可以分离KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶的过氧化氢酶和过氧化物酶活性，并且可以衍生出非过氧化氢酶性变体(参见例如Ghiladi等人(2005)J Biol Chem 280:22651-22663；Ghiladi等人(2005)Biochemistry 44:15093-15105；Vlasits等人(2010)JInorg Biochem 104:648-656；Vlasits等人(2010)Biochim Biophys Acta 2010b；1804:799-805；Ortiz de Montellano(2010)Biocatalysis based on heme peroxidases:79-107；Jakopitsch等人(2003)J Biol Chem 278:20185-20191；Jakopitsch等人(2004)JBiol Chem 279:46082-46095；Jakopitsch等人(2003)FEBS Lett 552:135-140；Santoni等人(2004)Biopolymers 74:46-50；Yu等人(2003)J Biol Chem 278:44121-44127；和Bernroitner等人(2009)J Exp Bot 60:423-440)。
如本文所用，术语非过氧化氢酶，如与KatG酶和过氧化氢酶-过氧化物酶EC1.11.1.21酶相关应用时，定义为一种酶，其中过氧化氢酶活性降低或消除但保留聚烯烃酶活性。优选的非过氧化氢酶性PA酶含有MYW三肽残基的一个或多个取代。
其他优选的非过氧化氢酶性PA酶在除MYW残基以外的氨基酸中含有氨基酸取代(包括那些损害MYW三肽功能的氨基酸)。例如，也可以利用对应于集胞藻属KatG(R410)的R439的精氨酸残基的取代来产生非过氧化氢酶变体(参见例如Jakopitsch等人(2004)JBiol Chem 279:46082-46095；Vlasits等人(2010)104:648-656；Carpena等人(2005)EMBORep 2005,6:1156-1162)。
此类非过氧化氢酶性KatG/过氧化氢酶-过氧化物酶EC 1.11.1.21酶可以表现出由于保留的过氧化物酶活性引起的改善的聚烯烃酶活性。因此，在优选的实施方案中，非过氧化氢酶性KatG/过氧化氢酶-过氧化物酶EC 1.11.1.21酶表现出由于保留的过氧化物酶活性引起的改善的聚烯烃酶活性。
因此，如本文所用，术语过氧化氢酶-过氧化物酶EC 1.11.1.21可广义地使用以定义为源自EC 1.11.1.21中的酶的功能类别的酶，但其表现出降低的(或消除的)过氧化氢酶活性(即，是非过氧化氢酶，如上文所定义的)，但表现出由于保留的过氧化物酶活性引起的聚烯烃酶活性。
因此，优选的非过氧化氢酶性PA酶含有一个或多个MYW残基的取代(和/或破坏或损害MYW三肽功能的其他突变)。因此，用于本发明用途的PA酶可以是KatG变体，其中MYW三肽(或该三肽本身)的功能被破坏，使得过氧化氢酶活性降低或消除。可以通过任何方式破坏MYW三肽，包括经由通过定点诱变取代一个或多个组分M、Y和/或W氨基酸。
在B2UBU5的情况下，MYW三肽残基是M248、Y221和W98。因此，B2UBU5的合适取代包括包含一个或多个以下氨基酸取代的变体：M248I、M248V、Y221F、Y221A、Y221L、W98A、W98F和/或R410N。优选的是包含Y221F和/或R410N取代的B2UBU5变体，特别是包含Y221F和R410N取代的B2UBU5变体。
在优选的实施方案中，非过氧化氢酶性PA酶是B2UBU5或B2UBU5直系同源物的变体，如上文所定义的。
上述原则经过必要的变通后适用于过氧化氢酶-过氧化物酶EC 1.11.1.21酶(其天然形式也表现出MYW三肽)，并且此类非过氧化氢酶性过氧化氢酶-过氧化物酶EC1.11.1.21酶变体可以表现出改善的聚烯烃酶活性。
3.2.4 KatGN截短体
KatG酶包含两个过氧化物酶样结构域。N末端结构域(KatGN)含有血红素基团并具有催化活性。C末端结构域(KatGC)缺少血红素辅助因子，没有催化活性，并且与活性位点相隔
Figure BDA0003983902350000291
KatGC似乎含有一个残留的“活性位点”，其中一个Arg残基替代了应该是His配体的部分，并且血红素结合被相邻氨基酸(Leu或Met)中突出到血红素结合腔中的大疏水性侧链阻碍。
然而，KatGC通常不是多余的(唯一报告的缺少C末端结构域的KatG是来自双鞭藻微型原甲藻的KatG-参见Guo和Ki,J Phycol.(2013)49(5):1011-6)。构建了仅含有KatGN结构域的KatG截短体，并显示其既不表现出过氧化氢酶活性也不表现出过氧化物酶活性。然而，分离的KatGN结构域保留了总的二级结构，两种活性都通过分别将表达和分离的KatGC添加回来而得到恢复(Baker等人，Biochem Biophys Res Commun.2004,320(3):833-9；Baker等人，Biochemistry 2006,45(23):7113-7121)。
因此，KatGC用作折叠N末端结构域的平台和稳定分子二聚体的支架，该分子二聚体可以作为单独的部分反式提供。
因此，本发明考虑使用由或基本上由KatGN结构域组成的KatG酶变体。此类变体在本文中称为KatGN截短体。在此类实施方案中，KatGN截短体可单独使用或与单独的KatGC(或其合成类似物)一起使用。
3.2.5 KatGN融合体
还考虑了使用包含与异源KatGC(或其合成类似物)融合的KatGN结构域的KatG酶变体。此类变体在本文中称为KatGN融合体。
与KatGN截短体(或作为KatGN融合体蛋白的一部分)组合使用的合适的KatGC合成类似物可通过本领域公认的合成生物(synbio)方法生产(参见例如Watkins等人，NatCommun 2017；8:358；Watanabe和Nakajima,Methods Enzymol 2016；580:455-470；Lichtenstein等人，Biochem Soc Trans 2012；40:561-566；Anderson等人，Chem Sci2014；5:507-514；以及Grayson和Anderson,Curr Opin Struct Biol 2018；51:149-155)。
3.2.6超活性和超稳定的KatG酶
本发明考虑了超活性KatG酶，其包含氨基酸序列，由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与B2UBU5或B2UBU5 KatGN至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一，并且具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，其相对于B2UBU5增加了聚烯烃酶的活性。优选的超活性KatG酶是B2UBU5变体，其包含氨基酸序列，由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与B2UBU5至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一，并且具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，其相对于B2UBU5增加了聚烯烃酶的活性。
本发明还考虑了超稳定KatG酶，其包含氨基酸序列，由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与B2UBU5或B2UBU5KatGN至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一，并且具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，其相对于B2UBU5增加了稳定性。优选的超稳定KatG酶是B2UBU5变体，其包含氨基酸序列，由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与B2UBU5至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一，并且具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，其相对于B2UBU5增加了稳定性。
在优选的实施方案中，本发明的超活性B2UBU5变体还优选具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，其：(a)增加聚烯烃酶活性；和/或(b)增加热稳定性；和/或(c)增加嗜冷性；和/或(d)增加与有机溶剂、污染物、洗涤剂、pH和/或氧化剂(包括过氧化氢)相关的稳定性。
术语“增加的热稳定性”表示相对于B2UBU5，本发明的PA酶在高温下，特别是在50℃至90℃之间的温度下抵抗其化学和/或物理结构变化的能力增加。
术语“增加的嗜冷性”表示相对于B2UBU5，本发明的PA酶在低温下，特别是在低于20℃、低于15℃、低于10℃或低于5℃的温度下表现出PA酶活性的能力增加。
热稳定性可以通过测量PA酶的解链温度(Tm)来确定。在本文中，“解链温度”是指所测定的酶群的一半未折叠或错误折叠时的温度。PA酶的解链温度(Tm)可以根据本领域已知的方法测量。例如，可以使用差示扫描荧光法(DSF)来量化PA酶的热变性温度的变化。
或者，可以通过使用圆二色性分析蛋白折叠来评估Tm。或者，可以通过在不同温度下孵育后测量PA酶活性并在所选条件下与B2UBU5的活性进行比较来评价热稳定性。
应当理解，此类技术也可用于确定与有机溶剂、污染物、洗涤剂、pH和/或氧化剂(尤其包括过氧化氢)相关的相对嗜冷性和稳定性。
上述KatG酶可以通过本领域公认的方法生产，包括定向进化和定点诱变(参见Zeymer和Hilvert(2018)Annual Review of Biochemistry 87:131-157；Watkins等人，NatCommun 2017；8:358；Watanabe和Nakajima,Methods Enzymol 2016；580:455-470；Lichtenstein等人，Biochem Soc Trans 2012；40:561-566；Anderson等人，Chem Sci2014；5:507-514；Grayson和Anderson,Curr Opin Struct Biol 2018；51:149-155；Currin等人(2019)ACS Synth Biol 8:1371-1378；Currin等人(2014)Protein Eng Design Sel27:273-280；Currin等人，(2017)Meth Mol Biol 1472:63-78；Currin等人(2015)Chem SocRev 44:1172-1239)。
超活性(即相对于B2UBU5增加的聚烯烃酶活性)可以在任何合适的测定中鉴定，包括本发明的高通量筛选测定。
3.2.7 KatG-PBP融合体
还考虑了使用KatG酶变体，其包含与塑料结合蛋白融合的KatG酶(如上文第3.1-3.2.6节中任一节所述的)或KatGN结构域。此类变体在本文中称为KatG-PBP融合体。
术语塑料结合蛋白在本文中用作技术术语，其定义为促进或介导本发明的PA酶吸附到合成PA塑料或PA塑料产品上的非酶蛋白。示例性塑料结合蛋白在第6.3节(下文)中进行描述。
3.2.8单结构域KatG酶
还考虑了使用KatG单结构域酶。
用于本发明用途的优选单结构域KatG酶包含氨基酸序列，由氨基酸序列组成或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与M1FBG9(M1FBG9_PROMN)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一。
M1FBG9(SEQ ID NO:2)
MNSLIAALLPIGVFGSCPFMDIGTPPSLKAEVISDSDFKTALEGLDIEALEQDLRILMTDSQTCWPADDGHYGGFMIRLAWHCAGTFRTSDQKGGCGGAGIRFPPESDWEDNGNLDKARALLVPIKQKYGDALSWGDLISFAGTVAIRDMGGPTNPHCFGRVDDADGNKSDIFGVTDSWQDTDCVVQGNCQEPMGAVKVGLIYVNPEGPLNDPNDLNSGQNPDPEKSAVEIREVFGRMGMNDSETASLIAGGHAFGKCHGAGVMTSGFEGPWTTTPSQWTNQFLTGMLDEEWEQVATPSGSAVQWQTKDRTSILAGTMRLTADLALVNDDAYLALAKHWVCDQQKLDIAFAASWKKLVESGGGWLPVEDRRCEPESKATGQQTDPQKNFHSVCATTTTDDSQEASTATKFCLSFLAVVLTPFSLGVHSWLA
优选的单结构域KatG酶是M1FBG9的突变形式，其包含与M1FBG9至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成。
更优选的单结构域KatG酶是M1FBG9的突变体形式，其包含与M1FBG9至少85％、90％、95％或99％同一的氨基酸序列，由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。
特别优选的单结构域KatG酶是M1FBG9的突变体形式，其包含与M1FBG9至少95％或99％同一的氨基酸序列，由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。
还考虑了为M1FBG9直系同源物的单结构域KatG酶。
更特别优选的是M1FBG9变体，其包含氨基酸序列，由氨基酸序列组成，或基本上由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与M1FBG9至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一，并且具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，其：
(a)增加聚烯烃酶活性；和/或
(b)增加热稳定性；和/或
(c)增加嗜冷性；和/或
(d)增加与有机溶剂、污染物、洗涤剂、pH和/或氧化剂(包括过氧化氢)相关的稳定性。
此类变体可以通过本领域公认的方法生产，包括定向进化和定点诱变(参见Zeymer和Hilvert(2018)Annual Review of Biochemistry 87:131-157；Watkins等人，NatCommun 2017；8:358；Watanabe和Nakajima,Methods Enzymol 2016；580:455-470；Lichtenstein等人，Biochem Soc Trans 2012；40:561-566；Anderson等人，Chem Sci2014；5:507-514；以及Grayson和Anderson,Curr Opin Struct Biol 2018；51:149-155。
4.KatG/EC1.11.1.21聚烯烃酶(PA酶)底物
4.1一般考虑
本发明的KatG/EC1.11.1.21聚烯烃酶(PA酶)裂解聚烯烃(PA)聚合物底物中的C-C键，从而将聚合物酶促降解为：(a)片段；和/或(b)低聚物；和/或(c)分离的单体或重复单元；和/或(d)单体或重复单元片段；和/或(e)单体或重复单元衍生物。
应当理解，通过本发明的PA酶裂解C-C键而实现的酶促降解不需要使PA聚合物底物完全解聚，并且降解的性质和程度尤其可以通过选择的PA酶、反应条件以及PA聚合物底物的化学性质和/或物理形式来确定。因此，由本发明的PA酶介导的C-C键裂解引起的酶促降解可能仅使PA聚合物底物片段化。例如，在包含非PA聚合物的长链(或片段)的PA共聚物的情况下，由本发明的PA酶介导的C-C键裂解的酶促降解可能产生包含源自共聚物链的非PA聚合物链段的片段。
或者，或此外，通过C-C键裂解的酶促降解可使PA聚合物底物低聚化。在许多情况下，本发明的PA酶通过C-C键裂解实现的酶促降解产生了PA聚合物底物的片段和低聚物。在其他情况下，本发明的PA酶通过C-C键裂解产生的酶促降解产生：(a)片段；和/或(b)低聚物；和/或(c)分离的单体或重复单元；和/或(d)单体或重复单元片段；和/或(e)PA聚合物底物的单体或重复单元衍生物。
在优选的实施方案中，由本发明的PA酶实现的C-C键裂解引起的酶促降解降低了PA聚合物底物的分子量，例如降低了至少50％。更优选地，由本发明的PA酶实现的C-C键裂解的酶促降解实现了PA聚合物底物的常用对数减少至少1、2或3。在聚合物底物具有相对高分子量的情况下，由本发明的PA酶实现的C-C键裂解引起的酶促降解可以相应地实现更高的常用对数减少，例如PA聚合物底物的常用对数减少至少4、5或6。
PA聚合物底物可以是均聚物或共聚物(如本文所定义)。
在PA聚合物底物是线性均聚物的情况下，被本发明的PA酶裂解的C-C键位于骨架中。在PA聚合物底物是支化均聚物的情况下，被本发明的PA酶裂解的C-C键可位于聚合物的主链、支链或主链和支链两者中。
在PA聚合物底物是包含两个或更多个不同聚合烯烃单体的共聚物的情况下，被本发明的PA酶裂解的C-C键可以位于任意不同的聚合烯烃单体之间，或仅位于相同种类的聚合单体之间。这些C-C键可能位于主链(backbone)和/或侧链(side branch)，如果存在)中。
在PA聚合物底物是包含聚合烯烃和非烯烃单体的共聚物的情况下，被本发明的PA酶裂解的C-C键可以仅位于聚合烯烃单体之间。在后一种情况下，C-C键可以位于主链中(例如在某些嵌段共聚物的情况下)，或位于侧链中(例如在某些接枝共聚物的情况下)。
在PA聚合物底物是包含聚合烯烃和非烯烃单体的交替共聚物的情况下，被本发明的PA酶裂解的C-C键位于重复的聚合烯烃单元内。在这样的实施方案中，本发明的PA酶通过C-C键裂解实现的酶促降解可产生包含聚合的烯烃和非烯烃单体的聚合物片段或低聚物。
在PA聚合物底物是包含烯烃和非烯烃单体的随机共聚物的情况下，被本发明的PA酶裂解的C-C键位于重复聚合的烯烃单体内。在此类实施方案中，本发明的PA酶通过C-C键裂解实现的酶促降解可产生包含聚合的烯烃和非烯烃单体的聚合物片段或低聚物以及仅包含聚合的非烯烃单体的片段(例如，对应于来自共聚物链的非PA聚合物链段)。
在PA聚合物底物是包含烯烃和非烯烃嵌段的嵌段共聚物的情况下，被本发明的PA酶裂解的C-C键位于烯烃嵌段内(并且可以仅位于所述烯烃嵌段内)。在此类实施方案中，本发明的PA酶通过C-C键裂解实现的酶促降解可产生对应于非烯烃嵌段的聚合物片段或低聚物(其中嵌段可例如对应于衍生自共聚物链的非PA聚合物链段)。
在PA聚合物底物是包含烯烃主链和非烯烃侧链的接枝共聚物的情况下，被本发明的PA酶裂解的C-C键位于烯烃主链内(并且可以仅位于所述烯烃主链内)。在此类实施方案中，本发明的PA酶通过C-C键裂解实现的酶促降解可产生对应于非烯烃侧链的聚合物片段或低聚物。
在PA聚合物底物是包含非烯烃主链和烯烃侧链的接枝共聚物的情况下，被本发明的PA酶裂解的C-C键位于烯烃侧链内(并且可以仅位于所述烯烃侧链内)。在此类实施方案中，本发明的PA酶通过C-C键裂解实现的酶促降解可产生对应于非烯烃主链的聚合物片段。
4.2优选的PA聚合物底物
优选的PA聚合物底物包含具有C-C主链的聚合物链段，并包括各种类型的聚乙烯(PE)和结构相关的聚烯烃聚合物(可被视为取代的聚乙烯)。
因此，这些优选的PA聚合物底物包括各种类型的聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)和氯化聚乙烯(CPE)，所有这些都包含具有C-C主链的聚合物束或链段，并且可以示意性地表示如下：
Figure BDA0003983902350000371
4.2.1聚乙烯(PE)
在优选的实施方案中，PA聚合物底物是聚乙烯(PE)聚合物。因此，本发明优选的PA酶具有PE降解活性(因此在本文中可称为本发明的PE酶)。PE是最广泛生产的合成塑料聚合物——2016年生产了1.16亿吨(Danso等人，同上)。
优选的PE底物的实例包括高密度PE(HDPE)、中密度PE(MDPE)、低密度PE(LDPE)、线性低密度PE(LLDPE)、超低分子量聚乙烯(ULMWPE))、高分子量聚乙烯(HMWPE)、超高分子量聚乙烯(UHMWPE)、高密度交联聚乙烯(HDXLPE)、交联聚乙烯(PEX或XLPE)、线性聚乙烯(LPE)和极低密度聚乙烯(VLDPE)。
HDPE的分子量通常为20,000-60,000Da(700至1,800个单体单元)，密度至少为0.941g/cm3。它包含一个C-C主链，它具有低程度的分支，可以这样表示：
Figure BDA0003983902350000372
大多数线性分子很好地堆积在一起，因此分子间力比高度支化的聚合物强。HDPE由铬/二氧化硅催化剂、齐格勒-纳塔(Ziegler-Natta)催化剂或茂金属催化剂生产，并且可以控制少量支化，因为这些催化剂促进在正在增长的聚乙烯主链末端形成自由基。它具有很高的拉伸强度，用于牛奶罐、洗涤剂瓶、黄油桶、垃圾容器和水管等产品和包装中。三分之一的玩具由HDPE制成。
MDPE的密度为0.926–0.940g/cm3。它通常用于燃气管道和配件、购物袋、收缩膜、包装膜、手提袋和螺丝封口。
LDPE的密度为0.910–0.940g/cm3。它具有高度的短链和长链支化，这意味着链不能很好地堆积到晶体结构中。它的支化的C-C主链可以这样表示：
Figure BDA0003983902350000381
因此，LDPE表现出相对低的拉伸强度和相对高的延展性。LDPE是通过自由基聚合产生的。具有长链的高度支化赋予熔融LDPE独特且理想的流动性能。它用于硬质容器和塑料薄膜应用，例如塑料袋和薄膜包装。
LLDPE的密度为0.915–0.925g/cm3。它是一种具有大量短支链的基本线性共聚物，通常通过乙烯与短链α-烯烃(例如，1-丁烯、1-己烯和1-辛烯)的共聚合制成。它的支化的C-C主链可以这样表示：
Figure BDA0003983902350000382
LLDPE具有比LDPE更高的拉伸强度，并且比LDPE具有更高的冲击和穿刺抗性。与LDPE相比，可以吹制厚度较低(规格)的薄膜，具有更好的环境应力开裂抗性，但它们不太容易加工。它用于包装，特别是袋子和薄片物的薄膜。与LDPE相比，可以使用更薄的厚度。它用于电缆外皮、玩具、盖子、桶、容器和管道。虽然还有其他应用，但LLDPE由于其韧性(toughness)、柔性(flexibility)和相对透明度而主要用于薄膜应用。
通常生产的线性PE的分子量为200,000Da至500,000Da。分子量为3-8x106Da的聚乙烯称为超高分子量聚乙烯或UHMWPE，通常每个分子具有100,000至250,000个单体单元。
交联聚乙烯(PEX或XLPE)是一种含有交联(产生热固性而非热塑性)的中密度至高密度聚乙烯。耐温性高于非交联的PE，化学抗性增强。
氯化聚乙烯CPE或PE-C是一种廉价的PE变体，氯含量为34％至44％。它与聚氯乙烯(PVC)混合使用，因为柔软的橡胶状氯化聚乙烯嵌入PVC基体中，从而提高了抗冲击性。氯化也增加了耐候性。与PE一样，CPE可以交联形成弹性体，用于电缆和橡胶业。CPE通常添加到其他聚烯烃聚合物中以降低可燃性。本发明优选的PA酶具有CPE降解活性(因此在本文中可称为本发明的CPE酶)。
PE也以多种共聚物形式生产。与不饱和羧酸(如丙烯酸形成乙烯丙烯酸，EAA)的共聚物可用作粘合剂。具有不饱和酯的共聚物可具有位于聚合物主链上的醇部分。一个实例是乙烯乙烯醇(EVOH)，如下所示：
Figure BDA0003983902350000391
如上所示，EVOH包含m个重复单元的一个C-C主链聚合物链段。EVOH高度透明、耐候、耐油和耐溶剂、柔韧、可模压，通常用作食品包装中的氧气阻隔层。
其他具有不饱和酯的共聚物具有位于聚合物主链上的酸部分。例如，乙烯-丙烯酸乙酯(EEA)共聚物具有以下结构：
Figure BDA0003983902350000392
相关的乙烯-丙烯酸丁酯(EBA)具有以下结构：
Figure BDA0003983902350000401
4.2.2聚丙烯(PP)
在其他优选实施例中，PA聚合物底物是聚丙烯(PP)聚合物。因此，本发明优选的PA酶具有PP降解活性(因此在本文中可称为本发明的PP酶)。PP是第二大生产最广泛的合成塑料聚合物(仅次于聚乙烯)——2016年生产了6800万吨(Danso等人，同上)。PP是由单体丙烯通过链增长聚合生产的。它是一种用途广泛的热塑性聚合物。它的物理性能与PE相似，但硬度稍高，耐热性更好。它通常用于包装和标签。
根据甲基的排列，聚丙烯分为无规聚丙烯(PP-at)、间规聚丙烯(PP-st)和等规聚丙烯(PP-it)。这些可以随机排列(PP-at)、交替排列(PP-st)或均匀排列(PP-it)。这对结晶度(无定形或半结晶)和热性能(包括玻璃转化点和熔点)有影响。
PP均聚物是最常见的PP级。它仅包含半结晶固体形式的丙烯单体。应用包括包装、纺织品、医疗保健、管道、汽车和电气。
PP也作为共聚物生产。PP共聚物包括随机共聚物和嵌段共聚物，均由丙烯和乙烯单体聚合而成。随机PP共聚物通过聚合乙烯和丙烯产生，其中乙烷单体通常占质量的6％，并随机地结合到聚丙烯链中。这些聚合物是柔韧且光学透明的。嵌段PP共聚物含有较高的乙烯含量(通常为5-15％)，是一种比随机共聚物更具韧性、更不易碎的热塑性塑料。
4.2.3聚氯乙烯(PVC)
在其他优选实施例中，PA聚合物底物是聚氯乙烯(PVC)聚合物。因此，本发明优选的PA酶具有PVC降解活性(因此在本文中可称为本发明的PVC酶)。聚氯乙烯(PVC)是第三大生产最广泛的合成塑料聚合物(仅次于聚乙烯和聚丙烯)——2016年生产了3800万吨(Danso等人，同上)。
PVC以两种形式生产：刚性(rigid)(有时缩写为RPVC)和柔性。刚性形式的PVC用于管道结构和门、窗等型材应用。它还用于制造瓶子、非食品包装、食品覆盖片和卡片(如银行卡或会员卡)。它可以通过添加增塑剂变得更柔软和更具柔性，最广泛使用的增塑剂是邻苯二甲酸盐。以这种形式，它还用于管道、电缆绝缘、仿皮、地板、标牌、留声机唱片、充气产品以及许多其他替代橡胶的应用。
聚偏二氯乙烯(PVDC)可被视为PVC的变体，具有以下结构：
Figure BDA0003983902350000411
PVC也作为共聚物生产，例如利用氯乙烯和乙酸乙烯酯单体。类似地，产生了PVDC共聚物。例如，约87％偏二氯乙烯和13％氯乙烯的共聚物已作为SaranTM上市销售，并以挤出形式用作食品包装。
4.2.4聚苯乙烯(PS)
在其他优选实施方案中，PA聚合物底物是聚苯乙烯(PS)聚合物。因此，本发明优选的PA酶具有PS降解活性(因此在本文中可称为本发明的PS酶)。PS是第六大生产最广泛的合成塑料聚合物(仅次于PE、PP、PVC、PET和PUR)——2016年生产了1400万吨(Danso等人，同上)。PS由苯乙烯单体聚合而成。每个PS分子通常由几千个单体组成，产生的分子量为100,000-400,000Da。
PS以固体和泡沫形式制造。通用聚苯乙烯透明、坚硬且易碎。它是每单位重量的廉价树脂。它对氧气和水蒸气的阻隔性很差，熔点相对较低。用途包括保护性包装(如CD和DVD盒)、容器、盖子、瓶子、托盘、玻璃杯和一次性餐具。
作为热塑性聚合物，PS在室温下为玻璃状固体，在约100℃(其玻璃转化温度)以上流动。这被用于挤出(如聚苯乙烯泡沫塑料)，也用于模塑和真空成型，因为它可以被浇铸到具有精细细节的模具中。
根据苯基的排列方式分为无规聚苯乙烯(PS-at)、间规聚苯乙烯(PS-st)和等规聚苯乙烯(PS-it)(即随机聚苯乙烯(PS-at)、交替聚苯乙烯(PS-st))或均匀聚苯乙烯(PS-it))。标准聚苯乙烯是无规聚苯乙烯。等规聚苯乙烯目前尚未商业化生产。
与PP一样，PS也以共聚物形式生产。虽然均聚PS具有出色的透明度、表面质量和刚度，但其多功能性通过共聚和其他改性得到扩展。使用了几种基于苯乙烯的共聚物。苯乙烯-丁二烯共聚物(无规和嵌段共聚物形式)克服了与均聚聚苯乙烯的脆性相关的问题，而苯乙烯和丙烯腈(SAN)的共聚物更耐热应力、热和化学品(同时保持透明度)。PS共聚物包括苯乙烯马来酸酐(SMA，与马来酸酐的共聚物)、苯乙烯-丙烯腈树脂(SAN)和丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)，下文将对其进行更详细的描述。
4.2.5丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)
在其他优选实施例中，PA聚合物底物是丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)聚合物。因此，本发明优选的PA酶具有ABS降解活性(因此在本文中可称为本发明的ABS酶(ABSase))。
三元共聚物ABS是由苯乙烯和丙烯腈在聚丁二烯存在下聚合而成。比例可以从15％到35％丙烯腈、5％到30％丁二烯和40％到60％苯乙烯变化。结果是长链聚丁二烯与短链聚(苯乙烯-共聚-丙烯腈)交叉，如下图所示：
Figure BDA0003983902350000431
4.2.5聚丁二烯(BR)
聚丁二烯(也称为丁二烯橡胶，BR)，其示意图如下所示：
Figure BDA0003983902350000432
BR是由单体1,3-丁二烯聚合而成的合成橡胶。聚丁二烯具有高耐磨性，用于制造汽车轮胎(约占产量的70％)。它还广泛用作添加剂，以提高其他塑料(包括上述PS和ABS聚合物)的抗冲击性。它还用于制造高尔夫球和封装电子组件。
4.2.7聚异戊二烯(IR)
在其他优选实施方案中，PA聚合物底物是聚异戊二烯(IR)聚合物。因此，本发明优选的PA酶具有IR降解活性(因此在本文中可称为本发明的IR酶(IRase))。
三叶橡胶(Hevea rubber)和古塔胶(Gutta percha)是自20世纪初开始商业开发的非合成橡胶(天然橡胶，NR)。三叶橡胶是商业上从巴西三叶胶树(Hevea brasiliensis)的树液中提取的，古塔胶是从胶木属(Palaquium)的树中提取的。两种天然橡胶均由顺式1,4-聚异戊二烯组成，平均分子量约为106Da：
Figure BDA0003983902350000433
因此，天然形式的天然橡胶是完全可生物降解的，因为聚合物主链中存在易于热降解和氧化降解(导致断链)的双键。
合成等价物是聚异戊二烯(IR)，这是通过2-甲基-1,3-丁二烯与齐格勒-纳塔催化剂聚合产生的异戊二烯聚合而生产的聚合物的统称。重复单元的各种异构形式可以示意性地表示如下：
Figure BDA0003983902350000441
合成异戊二烯是顺式-1,4、反式-1,4-和3,4-聚合物的混合物，顺式-1,4通常占90％至98％。顺式-1,4的增加通常会降低玻璃转化温度，增加结晶度，并提高机械强度。
NR和IR通常通过硫化过程转化为橡胶产品，硫化过程通过在元素硫存在下加热(例如，在通常也含有BR的轮胎的制造过程中)或分别通过辐照和过氧化(如NR乳胶手套的情况)而在聚合物链之间产生交联。IR也可以使用生物过程产生，例如使用代谢途径工程从葡萄糖产生异戊二烯单体(Whited等人(2010)Industrial Biotechnology 6：152-163)。
4.3合成的PA塑料底物
如上所述，本发明的PA酶裂解聚烯烃(PA)聚合物底物中的C-C键，从而酶促降解该聚合物。4.1和4.2节中描述的各种PA聚合物底物在以合成PA塑料(如本文定义)形式时可以作为PA酶底物。因此，本发明优选的PA酶具有降解合成PA塑料的活性，因此可应用于合成PA塑料的降解。
本文定义的合成PA塑料具有至少5000Da的分子量，更通常具有至少20,000Da的分子量。在这方面，应注意包含C-C主链/主链链段的合成PA聚合物包括分子量可为5000-20,000Da的合成PE蜡。因此应当理解，可包含聚烯烃段、链段、域或子结构的天然聚合物(例如某些蜡)具有低得多的分子量，合成石蜡和油也是如此。因此，上述聚合物不是本文定义的合成PA塑料。
合成的PA塑料通常包含结晶、半结晶和/或无定形区域，在大多数情况下包含结晶(和/或半结晶)和无定形区域。结晶度是某些功能上重要的结构特性的决定因素。合成塑料PA聚合物底物在室温下通常是固体热塑性材料。然而，一些化学改性和/或共聚物合成PA塑料(例如PEX)可以是热固性塑料。
4.4作为合成PA塑料底物的塑料制品
如上所述，本发明的PA酶裂解聚烯烃(PA)聚合物底物中的C-C键，从而酶促降解该聚合物。此外，第4.1节和第4.2节中描述的各种PA聚合物底物在合成PA塑料的形式下可用作PA酶底物(如第4.3节中所述)。
如下所述，第4.3节中描述的合成PA塑料当是各种PA塑料产品中的任何一种形式时可以作为PA酶底物。因此，本发明优选的PA酶具有降解PA塑料产品的活性，因此可应用在PA塑料产品的降解中。
如本文所用，术语PA塑料产品定义了一种塑料产品，该塑料产品包含一种或多种已成型为制品的合成PA塑料。塑料制品可以是模制塑料制品。它的特征可以是选自片材、薄膜、管子(tube)、管道、吸管、杆、绳、弦、线、网、网状片材、三维规则形状、块、护套、纤维、膜、纺织物和无纺织物、袋子、容器、瓶子、胶囊、包装、圆盘、微球、(电子)机械组件、服装、一次性咖啡杯、一次性咖啡胶囊、建筑组件、
Figure BDA0003983902350000451
积木、涂层、面板以及模压和挤压型材。
PA塑料产品可以包含单一类别的合成PA塑料(例如，仅包含合成PE塑料)，或者可以包含两种或更多种不同合成PA塑料的组合(例如，合成PE和PP塑料的组合)。或者，PA塑料产品可包含一种或多种合成PA塑料(例如PE、PP和/或PVC)与一种或多种合成的非PA塑料(例如PET和/或PUR和/或聚酰胺)的组合。
当与其他塑料结合使用时，合成PA塑料可与其他合成非PA塑料形成混合物的一部分。或者，或此外，合成PA塑料可以作为复合塑料产品的一部分存在(例如，作为涂层、层或夹杂物，例如在共熔之后)或作为机械、物理和/或化学附着的其中的组成部分。例如，PA塑料产品可以包括连续多层的不同塑料材料。
PA塑料产品底物还可以包含各种添加剂，例如酸清除剂、降解助剂、抗氧化剂、抗静电剂、阻燃剂、光稳定剂、热稳定剂、润滑剂、防滑化合物、增塑剂、颜料、染料和矿物或有机填料(包括金属，如镉、铬、铅、汞、钴和锌)。PS聚合物中常见的添加剂包括：2-(2'-羟基-5'-甲基苯基)苯并三唑(Tinuvin P)、Acrawax、脂环族溴、双(2,2,6,6-四甲基-4-哌啶基)癸二酸酯(Tinuvin770)、十溴二苯乙烷(S-8010)、十溴二苯醚、二溴乙基二溴环己烷(Saytex BCL-462)、亚乙基双四溴降冰片二甲酰亚胺(Saytex BT-93)、六溴环十二烷、矿物油、3,5-二叔丁基-4-羟基肉桂酸十八烷基酯(Irganox 1076)、五溴氯环己烷、硬脂酸、四溴双酚A、三壬苯基亚磷酸酯(Wytox)和硬脂酸锌。
应当理解，本发明的PA酶的PA塑料产品降解活性不需要完全降解PA塑料产品，并且降解的性质和程度尤其可以通过所选择的PA酶酶、反应条件和PA塑料产品底物的化学性质和/或物理形式确定。
PA塑料产品底物可包含或源自家庭、商业或工业混合或分类的废物流或收集的塑料废物。例如，用作PA酶底物的PA塑料产品可以选自塑料瓶、塑料袋、塑料包装和纺织废料。
因此，在某些实施方案中，PA塑料产品可包含合成PA塑料和一种或多种额外的塑料。所述额外的塑料可以例如选自乙烯乙烯醇(EVOH)、聚乙烯呋喃酸酯(PEF)、聚氨酯(PUR)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚(氧化亚苯基)(PPO)、聚碳酸酯(PC)，膦酰基和羧酸的共聚物(PCA)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲醛(POM)、苯乙烯丙烯腈(SAN)、聚酯聚合物合金(PEPA)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)、苯乙烯-丁二烯(SB)和上述塑料的共混物/混合物。
在优选实施方案中，所述额外的塑料选自聚酯和/或聚酰胺。优选的聚酯是聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇异山梨醇酯(PElT)、聚乳酸(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(D-乳酸)(PDLA)，聚(D，L乳酸)(PDLLA)，PLA立体复合物(scPLA)，聚羟基链烷酸酯(PHA)，聚(3-羟基丁酸酯)(P(3HB)/PHB)，聚(3-羟基戊酸酯))(P(3HV)/PHV),聚(3-羟基己酸酯)(P(3HHx)),聚(3-羟基辛酸酯)(P(3HO)),聚(3-羟基癸酸酯)(P(3HD)),聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)(P(3HB-co-3HV)/PHBV),聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)(P(3HB-co-3HHx)/(PHBHHx)),聚(3-羟基丁酸酯-共-5-羟基戊酸酯)(PHB5HV),聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯)(PHB3HP),聚羟基丁酸酯-共-羟基辛酸酯(PHBO),聚羟基丁酸酯-共-羟基辛酸酯(PHBOd)、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯-共-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-3HV-co-4HB))、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚丁二酸己二酸丁二醇酯(PBSA)、聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚乙烯呋喃酸酯(PEP)、聚己内酯(PCL)、聚己二酸乙二醇酯(PEA)和上述塑料的共混物/混合物。
优选的聚酰胺(尼龙)是聚酰胺-6或聚(β-己内酰胺)或聚己酰胺(PA6)、聚酰胺-6,6或聚(己二酰己二胺)(PA6,6)、聚(11-氨基十一酰胺)(PA11)、聚十二内酰胺(PA12)、聚(己二酰丁二胺)(PA4,6)、聚(亚戊基癸二酰胺)(PA5,10)、聚(六亚甲基壬二酰胺)(PA6,9)、聚(六亚甲基癸二酰胺)(PA6,10)、聚(六亚甲基十二酰胺)(PA6,12)、聚(己二酰间苯二甲胺)(PAMXD6)、聚己二酰己二胺/聚对苯二甲酰己二胺共聚物(PA66/6T)、聚己二酰己二胺/聚间苯二甲酰己二胺共聚物(PA66/6I)以及上述塑料的共混物/混合物。
5.用于本发明的反应混合物组合物的加工塑料产品
5.1一般考虑
如第4.1-4.3节(上文)所述，本发明的PA酶可具有PA塑料产品降解活性，因此可应用于PA塑料产品的降解。如第4.4节(上文)中进一步解释的，范围广泛的PA塑料产品中的任何一种均可用作本发明的PA酶的底物。
在此类应用中，PA酶和PA塑料产品可形成用于本发明反应器的反应混合物组合物的一部分。此类反应混合物包含本发明的PA酶以及待降解的PA塑料产品。
在反应混合物的优选实施方案中，PA塑料产品在引入反应混合物(和/或与PA酶接触)之前、期间或之后进行加工。例如，PA塑料产品可以在PA酶介导的酶促降解过程之前(即通过某种形式的预处理)、过程中、或之后的下游过程中进行加工。
在优选的实施方案中，所述加工包括PA塑料产品的预处理(即在与本发明的PA酶接触之前)。
因此，本发明包括同时或依次使用本发明的PA酶酶以及一个或多个非生物和/或生物加工步骤(例如，酶促降解和/或与一种或多种微生物和/或昆虫/昆虫幼虫一起孵育)，以降解PA塑料产品，特别是在PA塑料产品具有以下情形的情况下：
(a)构成家庭、商业或工业混合或分类废物流或收集的塑料废物的一部分；和/或
(b)与其他塑料组合存在，或者作为与其他合成的非PA塑料的混合物的一部分；和/或
(c)作为复合塑料产品的一部分存在(例如，作为涂层、层、夹杂物或分散相，例如在共熔之后)或作为其机械、物理和/或化学连接的组成部分(例如，在PA塑料产品包含不同塑料材料层(例如层压板)和/或可互操作的组件和/或机械耦合组件和/或空间分离的阵列)。
这种加工可能会促进或加速PA塑料产品的PA酶介导的酶促降解(和/或由可能存在的任何辅助或互补食塑酶介导的酶促降解-参见第5.3.1节)。
因此，此类处理可以：
(a)增加酶促PA酶降解的速率(和/或任何5.3.1节中描述的辅助或互补食塑酶，如果存在的话)；和/或
(b)增加酶促PA酶降解的程度(和/或第5.3.1节中描述的任何辅助或互补食塑酶，如果存在的话)；和/或
(c)允许PA塑料产品的酶促PA酶降解，否则不能用作PA酶底物(例如，在PA塑料产品涂有不是PA酶底物的塑料的情况下)。类似的考虑适用于第5.3.1节中描述的任何辅助或互补食塑酶(如果存在)。
在一些实施方案中，上述加工物理地改变了PA塑料产品的结构，优选增加了可用于与PA酶接触的表面积和/或将PA塑料产品内的结晶或半结晶域暴露于PA酶。因此，研磨是优选的非生物加工步骤。
在其他实施方案中，上述处理在化学上改变了PA塑料产品，优选增加了其对PA酶介导的酶促降解的敏感性。
在其他实施方案中，上述处理不改变PA塑料产品，而是改变(物理和/或化学上)与PA塑料产品相关的其他材料。此类材料包括其他塑料(包括上文第4.4节中描述的那些)、非塑料污染物(包括下文第5.3.2节中描述的那些)和木质纤维素生物质(也在下文第5.3.2节中描述)，后者是在PA酶底物作为家庭、商业或工业混合废物流的一部分存在的情况下特别重要，所述混合废物流中含有塑料和混合的木质纤维素物质(例如生活垃圾、工业垃圾、花园垃圾、厨房垃圾、农业垃圾、锯末、木屑、木片、纸板(carboard)、纸板浆(cardboardpulp)、纸张、纸浆和塑料及非塑料包装)。
5.2非生物加工
在优选实施方案中，PA塑料产品的加工是非生物的。示例性非生物处理包括选自机械、物理和化学处理或其两种或更多种的组合的处理。
非生物加工优选在与本发明的PA酶接触之前或期间进行，即作为预处理或作为共加工步骤。非生物加工最优选作为预处理加工步骤进行。
非生物加工可以例如包括通过选自以下的处理对PA塑料产品进行机械加工：洗涤、离心、清洁、碰撞、分选、研磨、均质化(例如，高压均质化)、粉碎、切割、冲击、压碎、剪切、切碎(例如圆盘筛切碎)、转鼓翻滚、分级、超声处理、熔化、挤压、旋转、液化、浸渍、微粉化、团粒化(pelletization)、螺旋压榨、活塞压榨和粒化(granulation)，以及以上两种或多种的组合。
研磨是特别优选的，任选地与上面列出的一种或多种其他非生物加工步骤一起。
在PA塑料产品形成家庭、商业或工业混合或分类废物流或收集的塑料废物的一部分的情况下，特别优选洗涤、清洁和/或分类作为预处理。
或者，或此外，PA塑料产品可通过选自以下的处理进行物理加工：辐照，例如干燥、UV辐照、非晶化、附聚、加热(例如通过微波)、冷却、冷冻、干燥，以及上述两项或多项的组合。
在优选实施方案中，PA塑料产品的物理处理包括非晶化。WO2017198786中描述了合适的非晶化处理。它们包括加热，例如在挤出机中。这种非晶化步骤可以包括加热到高于以下的温度：(a)塑料产品中PA聚合物的结晶温度(Tc)；和/或(b)塑料产品中PA聚合物的熔化温度(Tm)。
或者，或此外，PA塑料产品可以通过氧化进行化学处理。
或者，或此外，PA塑料产品可以通过与表面活性剂或塑料粘合剂接触来加工。塑料粘合剂介导PA酶吸附到塑料底物上，而表面活性剂可以促进PA酶接触PA塑料产品，例如通过促进PA酶与塑料产品的疏水表面接触。优选的表面活性剂包括非离子表面活性剂。其他优选的表面活性剂包括Tween 80、Tween 20和CHAPSO(已显示它们可促进部分纯化的MnP对PE的降解(如Iiyoshi等人(1998)op.cit.和Ehara等人(2000)所述)同上)。
或者，或此外，PA塑料产品可以通过用塑料结合蛋白(PBP)处理来加工。PBP是促进或介导本发明的PA酶吸附到合成PA塑料或PA塑料产品上的非酶蛋白，在下文第6.3节中有详细描述。
5.3生物加工
作为第5.2节中描述的非生物加工的替代或优选补充，PA塑料产品的加工包括生物过程。在优选的实施方案中，除了研磨之外还使用一种或多种下述生物过程。
生物加工包括使PA塑料产品与以下接触：(a)除了本发明的PA酶之外的一种或多种酶；和/或(b)一种或多种微生物和/或(c)一种或多种昆虫/昆虫幼虫。
5.3.1辅助食塑酶处理
应当理解，PA塑料产品可能不会被本发明的PA酶的酶活性完全降解，并且降解的性质和程度尤其可以通过所选择的PA酶、反应条件、PA塑料产品底物的化学性质和/或物理形态来确定。
因此，用本发明的PA酶以外的一种或多种辅助食塑酶加工PA塑料产品可以：(a)增加酶PA酶降解的速率(例如，通过增加底物被PA酶利用的速率)；和/或(b)增加酶促PA酶降解的程度(例如，通过释放一部分PA塑料产品，否则这些产品将与本发明的PA酶隔离)；和/或(c)允许酶促PA酶降解不会以其他方式用作PA酶底物的PA塑料产品(例如，在PA塑料产品涂有不是PA酶底物但通过使用其他酶处理而降解的塑料的情况下)。
如本文所用，术语辅助食塑酶定义酶促降解一种或多种合成塑料聚合物的酶，但其不是PA酶(如本文定义的)。优选的辅助食塑酶包括增补食塑酶(augmentaryplasticase)。
增补食塑酶
如本文所用，术语增补食塑酶定义了一种酶，其表现出(至少一些)针对PA聚合物的降解活性，但其不是PA酶(如本文定义的)。
优选的增补食塑酶包括：(a)漆酶(EC1.10.3.2.)；(b)锰过氧化物酶(MnP，EC1.11.1.13)；(c)木质素过氧化物酶(LiP,EC1.11.1.14)；(d)上述两项或多项的组合。
互补食塑酶(complementary plasticase)
还优选作为辅助食塑酶的是互补食塑酶，特别是在PA塑料产品：(a)构成家庭、商业或工业混合或分类废物流或收集的塑料废物的一部分的情况下；和/或(b)与其他塑料结合存在，作为与其他合成非PA塑料的混合物的一部分和/或作为复合塑料产品的一部分存在(例如，作为涂层、层或夹杂物)，例如在共熔之后)或作为其机械、物理和/或化学连接的组成部分(例如，PA塑料产品可包含多个连续层的不同塑料材料)。
如本文所用，术语互补食塑酶定义了一种酶，其表现出(至少一些)针对非PA聚合物的降解活性，并且其不是PA酶(如本文定义的)。
因此，互补食塑酶可以降解第4.4节(上文)中列出的一种或多种额外的塑料底物，因此包括降解塑料的酶，这些塑料选自乙烯乙烯醇(EVOH)、聚乙烯呋喃酸酯(PEF)、聚氨酯(PUR)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚(氧化亚苯基)(PPO)、聚碳酸酯(PC)、膦酰基和羧酸共聚物(PCA)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲醛(POM)、苯乙烯丙烯腈(SAN)、聚酯聚合物合金(PEPA)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)和苯乙烯-丁二烯(SB)。
因此，互补食塑酶可以降解聚酯和/或聚酰胺。
聚酯包括聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇异山梨醇酯(PElT)、聚乳酸(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(D-乳酸))(PDLA)、聚(D,L乳酸)(PDLLA)、PLA立体复合物(scPLA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚(3-羟基丁酸酯)(P(3HB)/PHB)、聚(3-羟基戊酸酯)(P(3HV)/PHV)，聚(3-羟基己酸酯)(P(3HHx))，聚(3-羟基辛酸酯)(P(3HO))，聚(3-羟基癸酸酯)(P(3HD))，聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯)(P(3HB-co-3HV)/PHBV),聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯)(P(3HB-co-3HHx)/(PHBHHx)),聚(3-羟基丁酸酯-共-5-羟基戊酸酯)(PHB5HV)、聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基丙酸酯)(PHB3HP)、聚羟基丁酸酯-共-羟基辛酸酯(PHBO)、聚羟基丁酸酯-共-羟基辛酸酯(PHBOd),聚(3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯-共-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-3HV-co-4HB)),聚丁二酸丁二醇酯(PBS),聚丁二酸己二酸丁二醇酯(PBSA)、聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚乙烯呋喃酸酯(PEF)、聚己内酯(PCL)和聚己二酸乙二醇酯(PEA)。
聚酰胺(尼龙)包括聚酰胺6或聚(β-己内酰胺)或聚己酰胺(PA6)、聚酰胺-6,6或聚(己二酰己二胺)(PA6,6)、聚(11-氨基十一酰胺)(PA11)、聚十二内酰胺(PA12)、聚(己二酰丁二胺)(PA4,6)、聚(亚戊基癸二酰胺)(PA5,10)、聚(六亚甲基壬二酰胺)(PA6,9)、聚(六亚甲基癸二酰胺)(PA6,10)、聚(六亚甲基十二酰胺)(PA6,12)、聚(己二酰间苯二甲胺)(PAMXD6)、聚己二酰己二胺/聚对苯二甲酰己二胺共聚物(PA66/6T)和聚己二酰己二胺/聚间苯二甲酰己二胺共聚物(PA66/6I)。
示例性互补食塑酶包括：(a)漆酶(EC1.10.3.2.)；(b)锰过氧化物酶(MnP，EC1.11.1.13)；(c)木质素过氧化物酶(LiP,EC1.11.1.14)；(d)多功能过氧化物酶；(e)蛋白酶；(f)脂肪酶；(g)羧酸酯酶；(h)酯酶；(i)上述两项或多项的组合。特别优选的互补食塑酶包括角质酶和/或PET酶。
示例性的互补食塑酶包括氧化酶，优选选自漆酶、脂肪氧化酶、过氧化物酶、卤素过氧化物酶、单加氧酶、双加氧酶、过加氧酶和羟化酶。
合适的木质素和锰过氧化物酶包括来自链霉菌属和黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的那些。
合适的漆酶包括来自赤红球菌(Rhodococcus ruber)DSM 45332的那些和来自变色栓菌(Trametes versicolor)的商业漆酶。
特别优选的互补食塑酶包括角质酶和/或PET酶，例如选自角质酶(EC 3.1.1.74)、脂肪酶(EC 3.1.1.3)、酯酶、羧酸酯酶(EC 3.1.1.1)、对硝基苄基酯酶、丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21.64)、蛋白酶、酰胺酶、芳基酰基酰胺酶(EC 3.5.1.13)、低聚物水解酶(例如6-氨基己酸环状二聚体水解酶(EC 3.5.2.12))、氨基甲酸乙酯酶(urethanase)、6-氨基己酸二聚体水解酶(EC 3.5.1.46)、6-氨基己酸低聚物水解酶(EC 3.5.1.117)、过氧化物酶和漆酶(EC 1.10.3.2)。
合适的丝氨酸蛋白酶包括来自白色念球菌(Tritirachium album)的蛋白酶K和来自拟无枝酸属(Amycolatopsis sp.)的PLA解聚酶。来自马杜拉放线菌属(Actinomadurasp.)的丝氨酸蛋白酶特别适用于降解包含聚乳酸的塑料产品。
合适的脂肪酶包括来自南极假丝酵母(Candida antarctica)，隐球菌属(Cryptococcus sp.)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)和黑曲霉(Aspergillus niger)的那些，并特别适用于降解包含PET或PTT的塑料产品。
合适的酯酶包括来自耐卤嗜热裂孢菌(Thermobifida halotolerans)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和球毛壳菌(Chaetomium globosum)的那些，并发现尤其可用在包含聚氨酯的塑料产品的降解中。发现来自节杆菌属(Arthrobacter sp.)或肠杆菌属(Enterobacter sp.)的酯酶或脂肪酶尤其可用于包含聚碳酸酯的塑料产品的降解中。
合适的角质酶包括来自太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)、纤维素嗜热裂孢菌(Thermobifida cellulosityca)、白色嗜热裂孢菌(Thermobifida alba)、耐卤嗜热裂孢菌(Thermobifida halotolerans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、特异腐质霉(Humicola insolens)和腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)的那些。
合适的芳基-酰基酰胺酶包括来自鼻疽诺卡菌(Nocardia farcinica)的那些。
合适的寡聚物水解酶包括来自节杆菌属(Arthrobacter sp.)的6-氨基己酸寡聚物水解酶。合适的酰胺酶包括来自布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)的酰胺酶。
5.3.2辅助非食塑酶生物修复酶
应当理解，PA塑料产品可能与非塑料沾染物和污染物物理相关，特别是在PA塑料产品形成家庭、商业或工业混合废物流或收集的塑料废物的一部分的情况下。
还应理解，沾染物和污染物可在PE酶介导的降解过程中(和/或在用辅助(增补或互补)食塑酶处理过程中)释放。例如，如上所述，PA塑料产品底物还可包含各种添加剂，例如酸清除剂、降解助剂、抗氧化剂、抗静电剂、阻燃剂、光稳定剂、热稳定剂、润滑剂、防滑化合物、增塑剂、颜料、染料和矿物或有机填料(包括金属，如镉、铬、铅、汞、钴和锌)，其中任何一种都可在酶促降解过程中释放出来。
因此，用一种或多种辅助非食塑酶生物修复酶与本发明的PA酶(以及任何辅助(增补或互补)食塑酶)一起加工PA塑料产品可能是有利的，并且可以减少或消除使用本发明的PA酶酶促降解过程中的污染物。
如本文所用，术语辅助非食塑酶生物修复酶定义这样一种酶，其酶促降解一种或多种非塑性污染物，并且其不是PA酶(如本文定义的)。
本领域的技术人员将了解大量此类辅助性非食塑酶生物修复酶，并且将能够根据PA塑料产品的性质(及其物理环境，例如是否作为家庭、商业或工业混合废物流的一部分存在)选择合适的生物修复酶(或酶混合物)。最近该领域进行了回顾(Karigar和Rao(2011)Enzyme Research Volume 2011，文章ID 805187，11页，doi:10.4061/2011/805187-特别参见表1，其内容通过引用并入本文)。
因此，合适的辅助非食塑酶生物修复酶包括选自以下的酶：(a)氧化还原酶；(b)加氧酶；(c)单加氧酶；(d)双加氧酶；(e)漆酶；(f)过氧化物酶；(g)水解酶；(h)过加氧酶(例如来自柱状田头菇(Agrocybe aegerita)的过加氧酶)；(i)上述两种或多种的组合。
Martinez等人(2017)35：815-831最近对氧化还原酶在工业生物转化中的应用进行了综述。
优选的辅助非食塑酶生物修复酶是水解酶，例如选自以下的水解酶：(a)脂肪酶；(b)纤维素酶；(c)蛋白酶；(d)上述两种或多种的组合。
5.3.3辅助纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶
应当理解，PA塑料产品可能与木质纤维素物质物理相关，特别是在PA塑料产品形成家庭、商业或工业混合废物流或收集的塑料废物的一部分的情况下。
木质纤维素是地球上最丰富的生物聚合物。现在正在开发木质纤维素生物质(例如，从原始生物质、废生物质或能源作物)酶促降解以产生可发酵糖、糖酸和酚类物质，以通过生物燃料(通常是生物乙醇)的工业生产提供化石燃料的替代品以及用于生产其他有价值的生物产品。
如本文所用，在本发明的上下文中，生物质定义任何木质纤维素物质。合适的木质纤维素物质包括草类(包括芦苇草、普通芦苇、小麦秸秆、能量草、象草、柳枝稷、绳索草和黑麦草)、麸皮和秸秆(例如水稻、黑麦、小麦、大麦、燕麦、油菜和大麦麸皮和稻草)、燕麦壳和斯佩耳特小麦、高粱、稻壳、甘蔗渣、压榨甘蔗杆、玉米纤维、亚麻、小麦、亚麻籽、果肉、纸浆、甜菜浆、刺槐豆浆、棉籽、花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆、棕榈仁、椰子、魔芋、刺槐豆胶、瓜尔豆胶、大豆、酒糟、麦糟、玉米芯、能源甘蔗、木薯皮、可可豆荚、废糖蜜(viansse)、木浆纤维、锯末、秸秆、硬木和软木(包括例如桉树、桦木、柳树、白杨、杨树)或其任何组合。
因此，该术语不应与微生物生物质混淆，微生物生物质是本发明方法的产物(见下文第7.4节)。
有关此技术的评论，请参阅Sun等人(2002)Bioresource Technology 83:1-11；和Pathak和Navneet(2017)Bioresour.Bioprocess.4:15 DOI 10.1186/s40643-017-0145-9。
因此，本发明的PA酶在与降解纤维素、半纤维素和/或木质纤维素的辅助酶组合时，可用于含PA聚合物(例如如上所述作为合成PA塑料或作为PA塑料产物存在时)的生物质原料的酶促转化。
在PA酶底物作为包含木质纤维素物质的家庭、商业或工业混合废物流(例如花园废物、厨房废物、农业废物、锯屑、木屑、纸板、纸板浆、纸、纸浆和非塑料包装)的一部分存在的情况下，这种应用特别重要。
因此，使用本发明的PA酶与辅助纤维素酶、半纤维素酶和/或木质酶(并任选地进一步与(a)辅助酶；和/或(b)辅助食塑酶(包括增补食塑酶和/或互补食塑酶)；和/或(c)辅助非食塑酶生物修复酶，如第5.3.1、5.3.2(上文)和6.2(下文)节所述)的组合可能是有利的，并且可促进自混合废物原料生产有价值的生物产品(包括生物燃料)。
合适的辅助纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶包括各种木质素过氧化物酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、葡聚糖酶，糖苷水解酶和酯酶。示例性的纤维素酶包括细菌或真菌来源的内切葡聚糖酶，包括内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)。一些木葡聚糖酶也具有内切葡聚糖酶活性，因此充当纤维素酶。其他合适的纤维素酶公开于U.S4,435,307(来自特异腐质霉)和EP0495257。合适的单组分内切葡聚糖酶可获自黑耳(Exidia glandulosa)、毛皮伞(Crinipellis scabella)、木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)、毡被孔菌属(Spongipellis sp.)、玫色根毛霉(Rhizophlyctis rosea)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)、闪光须霉(Phycomyces nitens)和弗雷生剌枝霉(Chaetostylum fresenii)、棉色二孢(Diplodia gossypina)、小球壳孢属(Microsphaeropsis sp.)、Ulosporabilgramii、短梗霉属(Aureobasidium sp.)、菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)、Ascobolus stictoides、Saccobolus dilutellus、盘菌属(Peziza)、疣孢青霉(Penicillium verruculosum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和疣顶孢(Thermomyces verrucosus)、里氏木霉(Trichoderma reesei aka)、红褐肉座菌(Hypocreajecorina)、Diaporthe syngenesia、葫芦科刺盘孢(Colletotrichum lagenarium)、鹿角炭角菌(Xylaria hypoxylon)、黑孢霉属(Nigrospora sp.)、Nodulisporum sp.和Polinoniapunctata sp.、松色丛赤壳菌(Nectria pinea)、Volutella colletotrichoides、粪生粪壳(Sordaria fimicola)、大孢粪壳(Sordaria macrospora)、嗜热梭孢霉(Thielaviathermophila)、Syspastospora boninensis、Cladorrhinum foecundissimum、突孢毛壳(Chaetomium murorum)、绿色毛壳(Chaetomium virescens)、Chaetomium brasiliensis、Chaetomium cunicolorum、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、链孢粘帚霉(Gliocladium catenulatum)、Scytalidium acarrediumphila ium solani、蛇形镰刀菌(Fusarium anguioides)、梨孢镰刀菌(Fusarium poae)、尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusariumoxysporum ssp.Lycopersici)、Fusarium oxysporum ssp.passiflora、黑腐质霉(Humicola nigrescens)、Humicola grisea、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)和特异腐质霉(Humicola insolens)。
可商购的木葡聚糖酶包括
Figure BDA0003983902350000581
(Novozymes A/S)。
市售纤维素酶包括
Figure BDA0003983902350000582
(来自里氏木霉)、
Figure BDA0003983902350000583
(来自特异腐质霉)。可商购的内切葡聚糖酶包括
Figure BDA0003983902350000584
和
Figure BDA0003983902350000585
KAC-500(B)TM、ClazinaseTM、PuradaxTMEG L和Puradax HA。
合适的糖苷水解酶家族61(GH61)描述于WO2005/074647、WO2008/148131和WO2011/035027(来自太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris))、WO2005/074656和WO2010/065830(来自橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus))、WO2007/089290和WO2012/149344(来自里氏木霉)、WO2009/085935、WO2009/085859、WO2009/085864和WO2009/085868(来自嗜热毁丝霉菌(Myceliophthora thermophila))、WO2010/138754(来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus))、WO2011/005867(来自嗜松青霉(Penicilliumpinophilum))、WO2011/039319(来自嗜热子囊菌属(Thermoascus sp.))、WO2011/041397(来自青霉属(Penicillium sp.))、WO2011/041504(来自嗜热子囊菌(Thermoascuscrustaceus))、WO2012/030799(来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus))、WO2012/113340(来自疏绵状嗜热霉(Thermomyces lanuginosus))、WO2012/122477(来自毛色毛孢藻(Aurantiporus alborubescens)、Trichophaea saccata和托姆青霉(Penicilliumthomii))，WO2012/135659(来自柄篮状菌(Talaromyces stipitatus))，WO2012/146171(来自特异腐质霉)，WO2012/101206(来自樟绒枝霉(Maibranchea cinnamomea)、莱色篮状菌(Talaromyces leycettanus)和Chaetomium thermophilum)，WO2013/043910(来自梭孢端梗霉(Acrophialophora fusispora)和瘤孢棒囊孢壳(Corynascus sepedonium))。
5.3.4微生物消化
如上所述，生物加工包括将PA塑料产品与一种或多种微生物接触。微生物可以表达和/或分泌一种或多种上述酶(辅助的(增补的或互补的)食塑酶和/或辅助的非食塑酶生物修复酶)。或者，或此外，微生物可产生一种或多种促进一种或多种所述酶的降解活性的介导化合物或辅助因子。在优选的实施方案中，使用包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种不同微生物的微生物群落。
本领域的技术人员将了解大量合适的微生物，并将能够根据PA塑料产品的性质(及其物理环境，例如是否作为家庭、商业或工业混合废流的一部分存在)进行相应的选择。最近对该领域进行了回顾((Pathak和Navneet(2017)Bioresour.Bioprocess.4:15DOI10.1186/s40643-017-0145-9；Varjani和Upasani(2017)InternationalBiodeterioration&Biodegradation 120 71e83；Varjani(2017)Bioresource Technology223:277–286(特别参见表1，其通过引用并入本文)；Ho等人(2018)Critical Reviews inBiotechnology,38:2:308-320(特别参见表4，其通过引用并入本文)；Jaiswal等人(2020)Environmental Technology&Innovation 17:100567(特别参见表1和2，它们通过引用并入本文)。
在采用涉及微生物消化的生物加工的实施方案中，PA塑料产品可以与含有微生物(接种物)以及碳源(例如葡萄糖)和氮源(例如，选自蛋白胨、肉膏、酵母膏和玉米浆的有机氮源，或无机氮源(例如硫酸铵或氯化铵)的培养基接触。培养基还可以包含无机盐(例如钠、钾、钙、镁、硫酸盐、氯盐、磷酸盐)并且可以补充微量成分例如维生素和氨基酸。
在优选的实施方案中，微生物选自以下属：无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、产碱杆菌属(Alcaligines)、食烷菌属(Alcanivorax)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、古生球菌属(Archaeoglobus)、Aromatoleum、节杆菌属(Arthrobacter)、曲霉属(Aspergillus)、固氮弧菌属(Azoarcus)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、生赤壳属(Bionectria)、棒束孢属(Isaria)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、镰刀菌属(Fusarium)、白僵菌属(Beauveria)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、假丝酵母属(Candida)、毛壳菌属(Chaetomium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、枝孢霉属(Cladosporium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、革盖菌属(Coriolus)、拟棒状杆菌属(Coryneformes)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、弯孢霉属(Curvularia)、解环菌属(Cycloclasticus)、代尔夫特菌属(Delftia)、脱硫球菌属(Desulfococcus)、脱硫八叠球菌属(Desulfosarcina)、Dictyodontium、双球菌属(Diplococcus)、侧齿霉属(Engyodontium)、肠杆菌属(Enterobacter)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、胶质细菌属(Gliobacterium)、戈登菌属(Gordonia)、嗜盐菌属(Halomonas)、汉逊酵母属(Hansenula)、拟孢囊菌属(Kibdelosporangium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、纤毛菌属(Leptothrix)、李斯特菌属(Listeria)、海杆菌属(Marinobacter)、微杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)、莫拉菌属(Moraxella)、被孢霉属(Mortierella)、毛霉属(Mucor)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、解油螺旋菌属(Oleispira)、Paecylomyces、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、青霉属(Penicillium)、黄孢平革菌属(Phanerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、变形菌属(Proteobacterium)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Pseudozyma、芽霉菌属(Pullularia)、拉恩氏菌属(Rahnella)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、根霉菌属(Rhizopus)、红球菌属(Rhodococcus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、酵母菌属(Saccharomyces)、沙雷氏菌属(Serratia)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、链球菌属(Streptococcus)、篮状菌属(Talaromyces)、深海弯曲菌属(Thalassolituus)、高温单孢菌属(Thermomonospora)、栓菌属(Trametes)、木霉属(Trichoderma)、麦轴梗霉属(Tritirachium)、弧菌属(Vibrio)、黄单胞菌属(Xanthomonas)以及上述两种或多种的组合。
示例性物种包括米曲霉(Aspergillus oryzae)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、桔青霉(Penicillium citrinum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和Thermobifida cellulolysitica(合成和分泌角质酶)。进一步的例子包括南极假丝酵母(Candida antarctica)、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)和Triticum aestivum(合成一种解聚PET的脂肪酶)。
其他实例包括拟无枝酸属(Amycolatopsis sp.)K104-1和K104-2，白色念球菌(Tritirachium album)ATCC22563，解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)TB-13，荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)JCM 15 7912、Saccharothrixwaywayandensis JCM 9114、东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)IFO 12362和角质化马杜拉放线菌(Actinomadura keratinilytica)T16-l(尤其适用于降解含有PLA的塑料产品)。其他实例包括烟曲霉(Aspergillus fumigatus)NKCM1706和淡色生赤壳菌(Bionectria ochroleuca)BFM-Xl(它们特别适用于降解含有PBS的塑料产品)。还有其他实例包括褐色高温单孢菌(Thermomonospora fusca)K13g和K7a-3，以及玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)NKCM1712(它们特别适用于降解含有PBAT的塑料产品)。烟管菌(Bjerkandera adusta)产生锰过氧化物酶，特别适用于降解含有聚酰胺聚合物的塑料产品。
5.3.5昆虫和昆虫幼虫
如上所述，生物加工包括使PA塑料产品与一种或多种昆虫或昆虫幼虫接触。昆虫/幼虫可能携带(例如在肠道中)一种或多种上述微生物，这些微生物又可以表达和/或分泌一种或多种上述酶(辅助(增补或互补)食塑酶和/或辅助非食塑酶生物修复酶)，从而使昆虫/昆虫幼虫能够降解PA塑料产品。
合适的昆虫和昆虫幼虫在WO2014/067081中有所描述，它们包括鞘翅目(Coleoptera)和鳞翅目(Lepidoptera)成员，因此包括但不限于肉食亚目(Adephaga)、原鞘亚目(Archostemata)、藻食亚目(Myxophaga)和多食亚目(Polyphaga)。多食亚目(Polyphaga suborder)的实例包括长蠹虫下目(Bostrichiformia)、扁甲下目(Cucujiformia)、叩头虫下目(Elateriformia)、金龟下目(Scarabeiformia)和隐翅虫下目(Staphyliniformia)。扁甲下目(Cucujiformia infraorder)的实例包括叶甲总科(Chrysomeloidea)、郭公甲总科(Cleroidea)、扁甲总科(Cucujoidea)、象甲总科(Curculionoidea)、筒蠹总科(Lymexyloidea)和拟步甲总科(Tenebrionoidea)。拟步甲总科(Tenebrionoidea superfamily)的实例包括拟细颈虫科(Aderidae)、蚁形甲科(Anthicidae)、始隐科(Archeocrypticidae)、盘胸甲科(Boridae)、拟金甲虫科(Chalcodryidae)、筒蕈甲科(Ciidae)、长朽木甲科(Melandryidae)、芫菁科(Meloidae)、花蚤科(Mordellidae)、小蕈虫科(Mycetophagidae)、Mycteridae、拟天牛科(Oedemeridae)、Perimylopidae、尖颚扁虫科(Prostomidae)、斑翅甲科(Pterogeniidae)、赤翅甲科(Pyrochroidae)、树皮甲科(Pythidae)、大花蚤科(Rhipiphoridae)、角甲科(Salpingidae)、拟花蚤科(Scraptiidae)、拟步甲科(Tenebrionidae)、斑蕈甲科(Tetratomidae)、Trachelostenidae、三栉牛科(Trictenotomidae)、乌络甲科(Ulodidae)和幽甲科(Zopheridae)。拟步甲科(Tenebrionidae family)的实例包括亚科成员朽木甲亚科(Alleculinae)、圆甲亚科(Coelometopinae)、菌甲亚科(Diaperinae)、伪叶甲亚科(Lagriinae)、Palorinae、心甲亚科(Phrenapatinae)、漠甲亚科(Pimeliinae)、拟步甲亚科(Tenebrioninae)和澳甲亚科(Zolodininae)。拟步甲科(Tenebrionidae family)的实例还包括属成员Adelina、粉虫属(Alphitobius)、烁甲属(Amarygmus)、Ammophorus、Archeoglenes、Blapstinus、菌甲属(Diaperis)、Epantius、Eutochia、谷盗属(Gnathocerus)、潜沙虫属(Gonocephalum)、Hypophloeus、Latheticus、Lobometopon、Lyphia、毛土甲属(Mesomorphus)、Myrmechixenus、洋虫属(Palembus)、粉盗属(Palorus)、Phaleria、宽菌甲属(Platydema)、Sciophagus、Tagalus、拟步甲属(Tenebrio)、拟谷盗属(Tribolium)和齿甲属(Uloma)。优选的昆虫是黄粉虫(Tenebrio molitor)、大麦虫(Zophobas morio)、蜡螟(Galleria mellonella)和印度谷螟(Plodia interpunctella)。
6.本发明的组合物
6.1一般考虑
本发明的组合物中存在的PA酶的量可以由技术人员容易地通过参考尤其是PA聚合物底物的性质和(相对量)9s)和/或存在于组合物中的任何额外的酶的数量而确定。例如，在优选的实施方案中，本发明的PA酶的用量按PA聚合物底物的重量计最多5％，更优选最多1％，甚至更优选最多0.1％，还更优选最多PA聚合物底物重量的0.05％。例如，本发明的PA酶的量可以在PA聚合物底物重量的0.001％至5％的范围内，优选在0.001％至1％的范围内，更优选在0.001％至0.1％的范围内，甚至更优选在PA聚合物底物重量的0.001％至0.05％的范围内。
因此，选择本发明组合物中存在的PA酶的量以方便地促进上述剂量比，因此在优选的实施方案中，组合物优选包含基于组合物的总重量至少0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％或30％重量的PA酶。在一些实施方案中，基于组合物的总重量，组合物优选包含按重量计最多0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％或30％的PA酶。在一些优选的实施方案中，组合物包含0.1％至50％，或0.1％至40％，或0.1％至30％，或0.1％至20％，或0.1％至10％PA酶(基于组合物的总重量)。
PA酶优选以分离或纯化的形式存在于组合物中。例如，PA酶可以从微生物(例如从皮氏罗尔斯通氏菌)中表达、衍生、分泌、分离或纯化。可以通过本领域已知的生化技术纯化PA酶。
包含PA酶的组合物优选基本上无水，例如呈颗粒或粉末的形式。无水组合物可以通过本领域技术人员已知的任何合适的技术来制备，包括冻干、冷冻干燥、喷雾干燥、超临界干燥、向下通风蒸发、薄层蒸发、离心蒸发、传送带干燥、流化床干燥、滚筒干燥和上述技术的组合。优选地，PA酶是冷冻干燥的或喷雾干燥的。
在基本上无水的组合物的情况下，PA酶优选进一步包含选自淀粉、糊精(例如环糊精和/或麦芽糖糊精)、糖(例如山梨糖醇、海藻糖和/或乳糖)、羧甲基纤维素、聚电解质、海藻糖的惰性填充剂，以及选自脯氨酸、甜菜碱、谷氨酸和甘油的兼容性溶质。
在优选的实施方案中，PA酶是稳定的形式。例如，它可以是交联酶(CLE)、结晶交联酶(CLEC)和/或聚集交联酶(CLEA)的形式(参见例如Velasco-Lozano等人(2015年))Biocatalysis 1:166-177，用于回顾合适的技术)。
PA酶可以通过涂层来稳定。在这种情况下，包含本发明的PA酶的组合物可以采用包衣酶颗粒的形式(例如，如WO00/01793、WO2004/003188、WO2004/067739、WO99/32595、WO2006/034710和WO2007/044968中所述)。
在其他实施方案中，PA酶是溶液、悬浮液、乳液或分散液的形式，任选地是水溶液、悬浮液、乳液或分散液的形式。在某些实施方案中，PA酶可以以固定的形式存在于组合物中，例如结合到细胞膜、脂质囊泡内，或附着到固体支持物、基质或颗粒(例如选自玻璃珠和矿物、聚合物或金属颗粒或基质)。
PA酶可以与一种或多种赋形剂一起存在于组合物中。此类赋形剂包括缓冲剂、防腐剂(例如选自苯甲酸钠、山梨酸钠和抗坏血酸钠)、填充剂、保护剂和/或稳定剂(例如选自羧甲基纤维素、淀粉、糊精、阿拉伯胶、盐、糖(例如山梨糖醇、海藻糖和/或乳糖)、甘油、聚乙二醇、聚丙二醇、丙二醇、螯合剂(例如EDTA)、还原剂、氨基酸、载体(例如水性或有机溶剂或悬浮介质)、聚电解质、海藻糖、以及兼容的溶质，例如脯氨酸、甜菜碱、谷氨酸和/或甘油。
PA酶也可以与各种反应物和/或辅助因子一起存在于组合物中。此类反应物和辅助因子可由本发明的PA酶使用，或由也可存在于组合物中的任何辅助(增补或互补酶)或辅助酶使用。
可以使用细胞表达系统通过重组技术方便地产生PA酶(参见例如Johnsson等人(1997)J Biol Chem 272：2834-2840；
Figure BDA0003983902350000651
等人(2012)Biochimie 94：673-683；Doyle和Smith(1996)Biochem J 315(Pt1)：15-19)。
可以使用任何合适的表达系统，包括涉及原核细胞和真核细胞的那些。Gomes等人(2016)Advances in Animal and Veterinary Sciences 4(4):346-356最近回顾了合适的方法。
合适的原核细胞可选自：(a)大肠杆菌(Escherichia coli)；(b)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；(c)巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)；(d)地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；(e)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；(f)富养罗尔斯通氏菌；(g)假单胞菌属(Pseudomonas spp.)；(h)皮氏罗尔斯通氏菌；(i)棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)。
作为异源宿主特别优选的是使用AIDA-I自转运体(通过控制蛋白酶ompT(+/-)的状态)将PA酶输出到细胞表面(或细胞外)的工程化大肠杆菌菌株，如Fleetwood等人(2014)Microb Cell Fact 13:179；Jose and Meyer(2007)Microbiol Mol Biol Rev 71:600-619所述。
合适的真核细胞可选自：(a)酵母；(b)真菌；(c)昆虫细胞；(d)哺乳动物细胞；(e)植物细胞。合适的酵母细胞可选自：(a)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；(b)多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；(c)法夫驹形氏酵母；(d)博伊丁假丝酵母(Candidabiodini)；(e)粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。合适的真菌细胞可选自：(a)丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus spp.)和木霉属(Trichoderma spp.)，以及(b)嗜热毁丝霉菌(Myceliophthora thermophila)(例如C1表达系统)。
应当注意，上述考虑是普遍适用的，因此在必要时加以必要的修正适用于本发明组合物中可能存在的任何其他酶。因此，上述考虑适用于第5.3.1、5.3.2、5.3.3(上文)和6.2(下文)节中描述的其他每一种酶，因此延及：(a)辅助酶；和/或(b)辅助食塑酶(包括增补酶和/或互补食塑酶)；和/或(c)辅助的非食塑酶生物修复酶；和/或(d)辅助纤维素酶、半纤维素酶和/或木质素酶，如果存在于本发明的组合物中。
本发明涉及包含本发明的PA酶的各种组合物，包括以下：
·包含本发明的PA酶和一种或多种用于产生过氧化氢的辅助酶的酶系统组合物。
·包含本发明的PA酶和塑料结合蛋白的酶组合物。
·包含本发明的PA酶和一种或多种辅助性食塑酶的食塑酶混合物组合物。
·包含本发明的PA酶和一种或多种辅助性非食塑酶生物修复酶的废物修复酶混合物组合物。
·包含本发明的PA酶和一种或多种辅助纤维素、半纤维素和/或木质素酶的木质纤维素生物质酶混合物组合物。
·表达(并任选地分泌)前述酶组合物的重组细胞宿主。
·包含本发明的PA酶和PA聚合物底物的反应混合物组合物。
·KatG降解组合物。
·包含PA聚合物和KatG降解助剂的复合KatG塑料。
·包含KatG降解助剂的自降解PA聚合物。
依次更详细地考虑每一个：
6.2 PA酶酶系统组成
本发明提供了酶系统组合物，其包含本发明的PA酶和一种或多种用于产生过氧化氢的辅助酶，如下所述。
本发明的PA酶催化以下反应：
PA供体+H2O2→氧化的PA供体+2H2O
因此，在(简化的)PE塑料(其中塑料聚合物表示为CH3CH3但是-CH2CH2-主链的较长链的一部分)情况下的反应可表示为：
H2O2+CH3CH3→HOCH2CH2OH+2H
此外，任何可使用此类过氧化氢的进一步氧化反应还可导致H-O-O-X(过氧化物)、HC(＝O)-X(醛)、HO(O＝)C-X(羧酸)形式的进一步氧化产物，以及相应的均-双-取代变体(二过氧化物、二醛，特别是二羧酸)，以及混合杂衍生物(混合的酸、醛、醇和过氧化物，经过必要的修改)，其中氧化聚烯烃的氧化程度各不相同。
在此类反应中，过氧化物可以方便地由一种或多种催化过氧化物(优选过氧化氢)形成的酶提供，其在与PA酶和PA塑料底物偶联时，提供了PA酶氧化PA塑料底物所需的过氧化氢。
此类酶可以提供逐渐供应的过氧化物，将其浓度维持在(接近)化学计量水平(因此减少或防止反应混合物中存在的酶的不可逆过氧化物介导的失活)。它们在本文中被定义为帮助酶(helper enzyme)，因为它们起到促进PA酶的过氧化物酶活性的作用(它们本身不直接参与食塑酶活性)。
优选的帮助酶通过分子氧(O2)的还原产生过氧化氢。这样的酶(通常是氧化酶)可以作为级联作用，例如使用甲酸盐、甲醇或乙醇作为用于将O2还原成H2O2的还原当量的来源。
特别优选的帮助酶包括甲酸氧化酶(FOx)和甲酸脱氢酶作为多酶原位过氧化氢生成级联(如Pesic等人(2018)Z.Naturforsch.2019；74(3–4)c:101-104中所述)，可以这样表示：
Figure BDA0003983902350000671
Santos等人(2018)ACS Catal 8:4789-4799描述了另一种合适的帮助系统，可以表示如下：
Figure BDA0003983902350000681
在一个特别优选的实施方案中，用于产生H2O2的还原当量来源是醇，例如甲醇，如下：
Figure BDA0003983902350000682
上述(几乎是圆形的)帮助系统特别适用于气升式反应器，在气升式反应器中可以通过加压空气进料供应氧反应物。
合适的甲酸氧化酶描述于Doubayashi等人(2019)J Biochem 166:67-75；Doubayashi等人(2011)Biosci Biotechnol Biochem 75:1662-1667；Maeda等人(2009)Biosci Biotechnol Biochem 73:2645-2649；Robbins等人(2018)Arch Biochem Biophys643:24-31；Robbins等人(2018b)Biochemistry57:5818-5826；Robbins等人(2017)Biochemistry 56:3800-3807；Tieves等人(2019)Angew Chem Int Ed Engl 58:7873-7877，和Uchida等人(2007)Appl Microbiol Biotechnol 74:805-812。
合适的甲醇氧化酶描述于Vonck等人(2016)PLoS One 11:e0159476和deOliveira等人(2012)Fungal Genet Biol 49:922-932。
合适的甲醛歧化酶描述于Blaschke等人(2017)J Biotechnol 241:69-75；Mason和Sanders(1989)Biochemistry 28:2160-2168；Ni等人(2016)Angewandte Chemie-International Edition 55:798-801；van der Waals等人(2016)Chemistry 22:11568-11573；Yanase等人(2002)Biosci Biotechnol Biochem 66:85-91；Yonemitsu和Kikuchi(2018)Biosci Biotechnol Biochem 82:49-56；Yonemitsu等人(2016)Biosci BiotechnolBiochem 80:2264-2270；Kato等人(1983)Agric Biol Chem 47:39-46；Hasegawa等人(2002)Acta Cryst A8:C102和Yonemitsu等人(2016)Biosci Biotechnol Biochem 80:2264-2270。
本发明的酶系统组合物优选还包含一种或多种用于产生过氧化氢的帮助酶的底物。在优选的实施方案中，所述一种或多种底物包括甲醇和/或乙醇和/或甲酸盐(酯)。
在另一个实施方案中，氧化能力由分子氧(O2)提供，包括来自空气的分子氧，而不是过氧化氢或除了过氧化氢之外，提供与上述相同系列的产品。
6.3 PA酶-塑料结合蛋白组合物
如本文所用，术语塑料结合蛋白定义为促进或介导本发明的PA酶吸附到合成PA塑料或PA塑料产品上的非酶蛋白。
塑料结合蛋白包括吸附到疏水物质上并在塑料的疏水表面和周围的亲水水相之间形成界面的生物表面活性剂。示例性的生物表面活性剂包括疏水蛋白(hydrophobin)，它是含有8个位置保守的半胱氨酸残基和独特疏水块的分泌性的小的真菌蛋白。疏水蛋白吸附到疏水物质以及疏水(塑料)和亲水(水性介质)相之间的界面，并组装成两亲结构并降低塑料和PA酶之间的界面能(Takahashi.等人(2005)Mol.Microbiol.57,1780-1796；Espino-Rammer等人(2013)AEM 79:4230-4238)。优选地，疏水蛋白刚性足以在与蛋白质融合时保持疏水块暴露(Paananen等人(2013)Soft Matter 9:1612-1619)。
其他塑料结合蛋白包括“破坏性”或“无形诱导性”蛋白(综述于Arantes和Saddler(2010)Biotechnol.Biofuels 3:4)。它们包括通过削弱PA塑料的相邻聚合链之间的氢键发挥作用的破坏性蛋白质(例如扩张蛋白(expansin)和膨胀蛋白(swollenin))。实例包括扩张蛋白(Cosgrove(2000)Nature 407(6802):321-326)，细菌扩张蛋白样蛋白(Lee等人(2010)Mol.Cells 29(4):379-385)，原纤维形成蛋白(Banka等人(1998)WorldJ.Microbiol.Biotechnol.14(4):551-560)，某些碳水化合物结合模块(Din等人,(1991)Nat.Biotechnol.9:1096-1099；Din等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91(24):11383-11387；Gao等人(2001)Acta Biochimica et Biophysica Sinica 33(1):13-18)，真菌扩张蛋白样蛋白，松散蛋白(Loosenin)(
Figure BDA0003983902350000701
等人(2011)Microb.CellFact.10:8)，和膨胀蛋白(Gourlay等人(2012)Biotechnol.Biofuels 5(1):51；
Figure BDA0003983902350000702
等人(2011)Biotechnol.Biofuels 4(33)；Saloheimo等人(2002)Eur.J.Biochem.269(17):4202-4211和Verma等人(2013)PLoS One,8(2)(2013),p.e57187)。
本发明提供包含本发明的PA酶和一种或多种塑料结合蛋白(如本文所定义)的PA酶组合物。
塑料结合蛋白可以与PA酶混合提供，但也可以与PA酶融合。因此，本发明涉及包含PA酶-塑料结合蛋白融合蛋白的组合物(如上文第3.2.7节所述)。
6.4食塑酶混合物组合物
在某些实施方案中，本发明的PA酶可以与对一种或多种合成塑料聚合物表现出降解活性的各种其他酶组合使用。因此，本发明提供了一种食塑酶混合物组合物，其包含本发明的PA酶和一种或多种辅助食塑酶。
优选的辅助食塑酶包括增补食塑酶和互补食塑酶。
因此，此类辅助酶对于本发明的PE酶对PE聚合物的酶促降解不是必需的，但可以应用于PE聚合物与其他塑料混合存在的情况(例如PE聚合物以异质PE聚合物组合物，例如源自未分类的塑料废料流的情况)或PE聚合物的性质和/或加工条件可由其他PE酶有效互补或增补的情况。
有用的辅助酶/酶类(包括示例性增补食塑酶和互补食塑酶)的实例在第5.3.1节(上文)中有详细描述。
优选的互补食塑酶包括那些降解第4.4节(上文)中列出的一种或多种额外塑料底物的酶。
6.5辅助生物修复酶混合物组合物
本发明涉及包含本发明的PA酶和辅助的非食塑酶生物修复酶的组合物。此类组合物优选进一步包含：(a)如第6.2节(上文)所述的酶系统组合物；和/或(b)一种或多种辅助的(例如增补的和/或互补的)食塑酶(如上文第6.4节所述)。
如本文所用，术语辅助非食塑酶生物修复酶定义了这样的酶，其酶促降解一种或多种非塑性污染物，并且其不是PA酶(如本文定义的)。
因此，此类辅助酶对于本发明的PE酶对PE聚合物的酶促降解不是必需的，但可以应用于PE聚合物与其他污染物混合存在的情况(例如PE聚合物与其他环境污染物一起存在，例如来自受污染的垃圾填埋场样本的情况)。
本发明的辅助性非食塑酶生物修复酶组合物可用于减少或消除在使用本发明的PA酶进行酶促降解期间存在(和/或由其产生)的污染物，如第5.3.2节(上文)所述。
本领域的技术人员将了解大量此类辅助性非食塑酶生物修复酶，并且将能够根据PA塑料产品的性质(及其物理环境，例如是否作为家庭、商业或工业混合废物流的一部分存在)选择合适的生物修复酶(或酶混合物)。因此，合适的辅助性非食塑酶生物修复酶包括选自以下的酶：(a)氧化还原酶；(b)加氧酶；(c)单加氧酶；(d)双加氧酶；(e)漆酶；(f)过氧化物酶；(g)水解酶；(h)过加氧酶(例如来自柱状田头菇(Agrocybe aegerita)的过加氧酶)；(i)上述两种或更多种的组合。优选的辅助性非食塑酶生物修复酶是水解酶，例如选自以下的水解酶：(a)脂肪酶；(b)纤维素；(c)蛋白酶；(d)上述两种或更多种的组合。
合适的辅助性生物修复酶在第5.3.2节(上文)中有详细描述。
优选的辅助生物修复酶包括降解一种或多种塑料添加剂的酶，例如酸清除剂、降解助剂、抗氧化剂、抗静电剂、阻燃剂、光稳定剂、热稳定剂、润滑剂、防滑化合物、增塑剂、颜料、染料和矿物质或有机填料(包括金属，如镉、铬、铅、汞、钴和锌)。这些在第4.4节(上文)中有更详细的描述。
6.6辅助纤维素酶、半纤维素酶和木质纤维素酶
本发明考虑包含本发明的PA酶和辅助纤维素酶、半纤维素酶和/或木质纤维素酶的组合物。
此类组合物优选还包含：(a)如第6.2节(上文)所述的酶系统组合物；和/或(b)一种或多种辅助性(例如，增补的和/或互补的)塑食酶(plasticase)(如上文第6.3节所述)和/或(c)一种或多种辅助性非塑食酶生物修复酶(如上文第6.4节所述)。
合适的纤维素酶、半纤维素酶和木质纤维素酶在第5.3.3节(上文)中描述。
6.7细胞表达系统组合物
本发明提供了表达本发明的PA酶以及优选的一种或多种以下酶/蛋白质的重组细胞宿主：
(a)第6.2节(上文)中描述的一种或多种帮助(helper)酶；和/或
(b)第6.3节(上文)中描述的一种或多种塑料结合蛋白；和/或
(c)第6.4节(上文)中提到的一种或多种辅助性(adjuctive)(即增补的和/或互补的)塑食酶；和/或
(d)第6.5节(上文)中提到的一种或多种辅助性(ancillary)非塑食酶生物修复酶；和/或
(e)第6.6节(上文)中提到的一种或多种辅助纤维素酶、半纤维素酶和木质纤维素酶。
特别优选的是表达本发明的PA酶以及一种或多种帮助酶的重组细胞宿主。更特别优选的是表达本发明的PA酶以及(a)一种或多种帮助酶；和(b)一种或多种辅助性塑食酶的重组细胞宿主。
PA酶和一种或多种其他酶/蛋白优选地与细胞宿主是异源的。因此，在优选实施方案中，本发明考虑表达本发明的PA酶以及一种或多种帮助酶的重组细胞宿主，其中PA酶和帮助酶与所述宿主是异源的。
在更优选的实施方案中，本发明考虑表达本发明的PA酶以及(a)一种或多种帮助酶；(b)一种或多种辅助性塑食酶的重组细胞宿主，其中PA酶、帮助酶和辅助性塑食酶都与所述宿主是异源的。合适的细胞宿主在第2.2节(上文)中描述。
本发明还考虑了编码本发明的PA酶以及一种或多种酶/蛋白质(a)-(e)(上文)的核酸。核酸可以是DNA或RNA。优选地，核酸是多顺反子DNA。
本发明还考虑包含本发明的核酸的载体(例如表达载体)。载体的性质对本发明并不是关键的。可以使用任何合适的载体，包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微染色体、脂质体或机械载体。
本发明的优选表达载体是适于在第2.2节(上文)中描述的细胞宿主之一中表达编码本发明的PA酶和其他酶/蛋白质的DNA的DNA构建体。优选的表达载体包括：(a)调节元件(例如启动子、操纵子、激活子、阻抑子和/或增强子)，(b)转录成mRNA的结构或编码序列和(c)适当的转录、翻译、起始和终止序列。它们还可以含有编码任何各种标签(例如以促进所表达的蛋白质的后续纯化，例如亲和(例如His)标签)的序列和/或信号序列(例如以指导所编码的产物的分泌)。
特别优选的是包含有效连接到本发明的DNA以提供其以合适水平表达的一个或多个表达元件的载体。可以使用多种表达元件中的任何一种，并且一个或多个表达元件可以例如选自启动子、增强子、核糖体结合位点、操纵子和激活序列。此类表达元件可以包含增强子，并且例如可以是可调控的，例如是可诱导的(通过添加诱导剂)。
术语有效连接是指线性DNA序列的部分能够影响同一线性DNA序列的其他部分的活性的情况。例如，如果信号肽的DNA(分泌前导序列)被表达为参与多肽分泌的前体，则它与多肽的DNA有效连接；如果启动子控制序列的转录，则启动子有效连接到编码序列；如果核糖体结合位点位于允许翻译的位置，则它有效连接到编码序列。
该载体还可包含阳性可选择标记和/或阴性可选择标记。使用阳性可选择标记有助于选择和/或鉴定含有载体的细胞。
6.8反应混合物组合物
本发明提供用于本发明的反应器的反应混合物组合物，其中该混合物包含本发明的PA酶与PA聚合物的组合。
反应混合物中的聚合物优选是第4.1节(上文)中所述的PA聚合物底物。更优选的是第4.2节(上文)中描述的PE、PP、PVC、PS和CEP聚合物底物。还更优选的是包含选自第4.3节(上文)中所述的合成PA塑料底物的PA聚合物的反应混合物。
还优选的是包含呈第4.4节(上文)中所述的PA塑料产品形式的PA聚合物的反应混合物。在此类实施方案中，PA塑料产品优选在引入反应混合物之前进行加工。
在优选实施方案中，反应混合物包含如第5部分(上文)中所述加工的PA塑料产品形式的PA聚合物。反应混合物还可以包含水性溶剂，并且可以是水溶液、悬浮液或分散液的形式。反应混合物还可包含一种或多种缓冲液。
反应混合物还可包含一种或多种上述其他酶组合物，因此包括：(a)帮助酶；和/或(b)辅助性塑食酶(包括增补的和/或互补的塑食酶)；和/或(c)辅助性非塑食酶生物修复酶；和/或(d)辅助性纤维素酶、半纤维素酶和/或木质素酶。
反应混合物还可以包含如本文定义的(且于上文第6.3节中描述的)塑料结合蛋白。反应混合物优选还包含氧气和/或甲醇和/或乙醇和/或甲酸盐。
反应混合物还优选包含表面活性剂。表面活性剂可以促进PA酶接触PA塑料产品，例如通过促进PA酶与塑料产品的疏水表面接触。优选的表面活性剂包括非离子表面活性剂。其他优选的表面活性剂包括Tween 80、Tween 20和CHAPSO(已显示它们可促进部分纯化的MnP对PE的降解(如Iiyoshi等人(1998)同上和Ehara等人(2000)同上所述)。
反应混合物还优选包含一种或多种辅助因子。在优选实施方案中，该一种或多种辅助因子包括血红素和/或铁和/或黄素单核苷酸(FMN)和/或FAD(H2)和/或NAD(H)。
6.9含有KatG降解助剂的复合塑料
6.9.1可降解塑料
已经开发了各种不同的物理、化学和/或生物化学方法来提高合成塑料产品在环境中和/或作为废物处理系统中的原料处理后的降解速度。例如，塑料制品可以由聚烯烃和生物可降解聚合物的混合物制成，这些生物可降解聚合物可以是天然的(例如，淀粉或纤维素)或合成的。
然而，这些所谓的“可生物降解”塑料价格昂贵，不易加工，并且通常具有相对较差的机械性能。此外，只有聚合物混合物的可生物降解组分被降解，聚烯烃聚合物基本上保持完整。
含氧可降解塑料(主要基于聚乙烯)含有非生物降解助剂，其催化氧化反应，使塑料变弱和片段化。它们有时被称为“可热裂解的”或“可光裂解的”塑料。最常见的非生物降解助剂是过渡金属Fe、Co或Mn，它们以盐、脂肪酸酯、酰胺、二硫代氨基甲酸盐、二茂铁和金属氧化物的形式以痕量引入到聚合物产品中。其他方法包括引入降低光、热或湿气稳定性的有机基团(例如羰基、氧代-羟基、不饱和醇和酯、二苯甲酮、γ-吡喃酮、β-二酮、聚异丁烯、胺和过氧化物)。
然而，几乎没有证据表明可氧降解聚合物在环境中会完全降解：相反，可氧降解聚合物似乎只是变得片段化，在这种状态下它们可以以不可恢复的形式作为微塑料持续存在于环境中。微塑料污染现在被认为是一种日益严重的生态威胁，尤其是在海洋生态系统中。
6.9.2 KatG酶作为一类新型生物降解助剂
本发明的KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶(和/或表达和/或分泌它们的微生物)可以应用在一类新的可自降解塑料的生产中作为新型生物降解助剂，其中KatG降解助剂被引入到塑料中(例如作为内含物或作为(单或多)分散相分布在整个大块塑料基质中)，或作为表面涂层设置在其上。
在可自降解塑料为塑料容器(例如，瓶、袋、盒、泡罩包装或小袋)形式的实施方案中，表面涂层可能是特别优选的，此时KatG降解助剂可有利地作为外涂层存在。
在本文中，以及如本文所用，术语KatG降解助剂用于定义包含本发明的KatG/EC1.11.1.21聚烯烃酶(和/或表达和/或分泌KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶的微生物)的组合物，其用作生物降解助剂塑料添加剂。与KatG降解助剂(如上定义)相结合(例如包含或被其涂覆)的塑料聚合物在本文中被称为复合KatG塑料，而与KatG降解助剂(如上定义)相结合(例如含有或被其涂覆)的PA聚合物在本文中被称为可自降解的PA聚合物。
KatG降解助剂PA酶酶可以以无活性酶原的形式存在，其含有一个或多个用于产生活性PA酶的切割位点。此类切割位点可以被酶(例如水解酶)或化学物质(例如酸)靶向，它们然后可以用作活化剂(见下文第6.9.7节)。
KatG降解助剂还可以包含一种或多种帮助酶(如本文所定义)。在此类实施方案中，帮助酶优选地形成用于产生过氧化氢的酶系统的一部分，因此还可以包含用于产生过氧化氢的帮助酶的一种或多种底物。
在优选实施方案中，一种或多种帮助酶包括一种或多种选自以下的帮助酶：(a)甲酸氧化酶；(b)甲酸脱氢酶；(c)甲醛歧化酶；(d)甲醇氧化酶。在优选实施方案中，帮助酶包括甲酸氧化酶和甲酸脱氢酶。在另一个优选实施方案中，帮助酶包括甲醇氧化酶、甲醛歧化酶和甲酸氧化酶。在此类实施方案中，合适的底物包括甲醇和/或乙醇和/或甲酸盐。
KatG降解原还可以包含一种或多种辅助性塑食酶(如本文所定义)。或者或此外，KatG降解助剂还可以包含一种或多种辅助性非塑食酶生物修复酶(如本文所定义)。
6.9.3 KatG降解助剂组合物
上述KatG降解助剂可以采用任何物理形式。
在优选实施方案中，KatG降解助剂组合物是固体形式。优选的固体形式是颗粒和粉末。在此类情况下，一种或多种酶可以呈交联酶(CLE)、结晶交联酶(CLEC)和/或聚集交联酶(CLEA)的形式。
KatG降解助剂组合物可以被冷冻干燥或喷雾干燥。在此类实施方案中，它们还可包含选自淀粉、乳糖、羧甲基纤维素、聚电解质、海藻糖和相容性溶质如脯氨酸、甜菜碱、谷氨酸和/或甘油的惰性填充剂。
KatG降解助剂组合物也可以是液体形式。例如，KatG降解助剂组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液或分散体的形式。在这种情况下，溶液、悬浮液、乳液或分散体优选是水性的，并且可以包含一种或多种载体。此类载体可以选自天然树胶，包括阿拉伯树胶、瓜尔胶、黄芪胶和刺梧桐树胶。溶液、悬浮液、乳液或分散体也可以是有机溶剂，并且可以包含一种或多种载体。此类基于有机溶剂的液体KatG降解助剂组合物可以在涉及与熔融热塑性塑料混合的复合KatG塑料的生产中得到特殊应用(见下文)。
与直觉相反，含有液体形式的KatG降解助剂内含物的聚合物可能会表现出改进的物理性能(例如，改进的刚度)-参见Style等人(2015)Nature Physics 11:82-87。WO2019043145中描述了适合使用液体形式的KatG降解助剂聚合物内含物的合适的制剂和方法。
6.9.4复合KatG塑料
因此，本发明提供了包含KatG降解助剂(如上所定义)的塑料聚合物复合材料。在优选实施方案中，复合KatG塑料是复合KatG热塑性塑料。
在优选实施方案中，塑料聚合物复合材料包含与KatG降解助剂组合的PA聚合物。在此类实施方案中，PA聚合物复合材料是可自降解的PA聚合物，因为KatG降解助剂在处理后可在环境中和/或在废物处理系统中用作原料时被激活，以降解PA聚合物。
合适的PA聚合物包括上述PE聚合物，以及PA聚合物(其可以被认为是取代的PE聚合物)PP、PS和PVC(也如上所述)。
在其他优选实施方案中，塑料聚合物复合材料不包含PA聚合物，而是包含不同类别的塑料聚合物(例如，具有杂原子主链的聚合物)。在此类实施方案中，塑料聚合物复合材料本身可能不是自降解的，而是充当KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶的来源，用于降解存在于环境中或废物处理系统的混合塑料原料中的共存(co-localized)的PA聚合物。
不同类别的塑料聚合物可以是非PA聚合物，例如是具有杂原子主链的聚合物，例如PET或PUR。不同类别的塑料聚合物优选是热塑性塑料。根据本发明的这个方面可以使用的非PA聚合物的例子包括在US2016333147、WO2016198652、WO2016198650、WO2016097325和WO2019043145中列出的那些(其内容通过引用并入本文)。
在塑料聚合物复合材料包含PA聚合物与KatG降解助剂的组合的实施方案中，KatG降解助剂还包含一种或多种辅助性塑食酶，PA聚合物复合材料不仅是可自降解的，而且还用作塑食酶混合物的来源，用于降解存在于环境或废物处理系统的混合塑料原料中的其他共存的塑料聚合物，包括非PA聚合物。
在塑料聚合物复合材料包含PA聚合物与KatG降解助剂的组合的实施方案中，KatG降解助剂还包含一种或多种辅助性非塑食酶生物修复酶，PA聚合物复合材料是可自降解的，并且还充当生物修复酶混合物的来源，用于降解存在于环境或废物处理系统的原料中的其他共存的污染物。
6.9.5复合KatG塑料的生产
可以通过本领域技术人员已知的多种合适的技术将KatG降解助剂引入聚合物中。例如，本领域技术人员将能够从US2016333147、WO2016198652、WO2016198650、WO2016097325和WO2019043145(其内容通过引用并入本文)中描述的方法进行选择和改编。
在优选实施方案中，KatG降解助剂通过分散体引入聚合物的液相中，使得分散的材料在固化后保留在聚合物基质中。优选地，分散材料是单分散的，但在一些实施方案中，分散材料可以是多分散的。
因此，在聚合物塑料是热塑性塑料的优选情况下，本发明的复合KatG塑料可以通过包括以下步骤的方法来生产：在玻璃化转变温度下(参见例如Karakolis等人(2019)Environ Sci Tech Let 6:334-340)或在聚合物处于部分或完全熔融状态的温度下共挤出聚合物与KatG降解助剂。在这种情况下，KatG降解助剂和聚合物在玻璃化转变温度和聚合物熔点之间的温度下混合，或者在其熔点下混合。在特定的实施方案中，它们在80℃和250℃之间，优选地在120℃和210℃之间的温度下混合。
混合可以通过任何方式实现，但方便地使用挤出、双螺杆挤出、单螺杆挤出、注塑成型、浇铸、热成型、旋转成型、压缩、压延、熨烫、涂覆、分层、膨胀、拉挤成型、挤出吹塑-模塑、挤出-溶胀、压缩-造粒或水包油包水双重乳液蒸发来进行。合适的挤出装置描述于WO2016198796(其内容通过引用并入本文)中。
6.9.6复合KatG塑料制品
本发明的复合KatG塑料可用于生产范围广泛的塑料制品中的任何一种。优选的是模塑塑料制品。塑料制品的特征可以在于选自片、薄膜、管、管道、吸管、杆、粗绳、细绳、线、网、网状片、三维规则形状、块、护套、纤维、膜、织造和非织造纺织品、袋、容器、瓶、胶囊、包装、圆盘、微球、(电子)机械部件、服装、一次性咖啡杯、一次性咖啡胶囊、建筑组件、
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积木、涂层、面板和模塑和挤压型材。
本发明的复合KatG塑料可用于生产控释药物递送系统，其中药物包含在复合KatG塑料中，例如以剂型或装置的形式。合适的形式、装置和药物的实例在WO2019020679中描述。
6.9.7复合KatG塑料的自降解
本发明的复合KatG塑料的自降解可以通过在KatG降解助剂被激活以开始酶促降解与其结合的PA聚合物的条件下使复合KatG塑料与水性反应混合物接触来引发。
例如，在优选实施方案中，KatG降解助剂包含一种或多种选自以下的帮助酶：(a)甲酸氧化酶；(b)甲酸脱氢酶；(c)甲醛歧化酶；(d)甲醇氧化酶(如上所述)，可以通过研磨复合KatG塑料并将研磨物与包含甲醇和/或乙醇和/或甲酸盐的水性反应混合物接触的简单权宜之计来实现激活。
还应当理解，在处理后暴露于环境中的湿气和氧气可以激活自降解，特别是在KatG降解助剂组合物包含合适的共反应物(例如甲醇和/或乙醇和/或甲酸盐)的情况下，或者当后者被KatG酶从环境中清除时。
在PA酶以无活性酶原形式存在的实施方案中(参见上文第6.9.2节)时，可以通过暴露于将酶原形式裂解以产生活性PA酶的活性剂(例如水解酶或酸)而激活自降解。
7.方法、过程和用途
7.1方法
本发明提供了一种酶促降解PA聚合物底物的方法，该方法包括以下步骤：在使得PA聚合物底物中的C-C键被裂解的条件下，使所述PA聚合物底物与包含本发明的PA酶的组合物接触，从而酶促降解聚合物。
酶促降解不需要使PA聚合物底物完全解聚，并且降解的性质和程度可以通过所选的PA酶、反应条件和PA聚合物底物的化学性质和/或物理形式等来确定。
因此，由本发明的PA酶介导的C-C键裂解引起的酶促降解可能仅使PA聚合物底物片段化。例如，在包含非PA聚合物的长链(或片段)的PA共聚物的情况下，由本发明的PA酶介导的C-C键裂解引起的酶促降解可能产生包含源自共聚物链的非PA聚合物片段的片段。
在优选实施方案中，PA酶将PA聚合物底物酶促降解为：(a)片段；和/或(b)低聚物；和/或(c)分离的单体或重复单元；和/或(d)单体或重复单元片段；和/或(e)单体或重复单元衍生物。
或者，或此外，通过C-C键裂解引起的酶促降解可使PA聚合物底物低聚化。在许多情况下，由本发明的PA酶通过C-C键裂解实现的酶促降解产生PA聚合物底物的片段和低聚物。在其他情况下，由本发明的PA酶通过C-C键裂解实现的酶促降解产生PA聚合物底物的：(a)片段；和/或(b)低聚物；和/或(c)分离的单体或重复单元；和/或(d)单体或重复单元片段；和/或(e)单体或重复单元衍生物。
在优选实施方案中，由本发明的PA酶实现的通过C-C键裂解引起的酶促降解降低了PA聚合物底物的分子量，例如降低了至少50％。更优选地，由本发明的PA酶实现的通过C-C键裂解引起的酶促降解实现PA聚合物底物的至少1、2或3的对数减少。在聚合物底物具有相对高分子量的情况下，由本发明的PA酶实现的通过C-C键裂解引起的酶促降解可以相应地实现PA聚合物底物的更高的对数减少，例如至少4、5或6。
在优选实施方案中，PA聚合物底物如第4.1-4.4节(上文)中所述。
在PA聚合物底物包含PA塑料产品的情况下，该方法优选还包括一个或多个生物或非生物加工步骤，例如第5节(上文)中所述。
在优选实施方案中，该方法在20℃至90℃、优选40℃至80℃、更优选50℃至70℃、更优选60℃至70℃的温度下进行。
在优选实施方案中，该方法在中性或酸性pH下进行，优选在酸性pH下进行。例如，该方法优选在2至7的pH下进行，优选在3至6的pH下进行，更优选在3.5至5.5的pH下进行，甚至更优选在约4.5至5的pH下进行。
在优选实施方案中，本发明的PA酶的用量为PA聚合物底物重量的最多5％，更优选最多1％，甚至更优选最多0.1％，还更优选PA聚合物底物重量的最多0.05％。例如，本发明的PA酶的量可以在PA聚合物底物重量的0.001％至5％的范围内，优选在0.001％至1％的范围内，更优选在0.001％至0.1％的范围内，甚至更优选在PA聚合物底物重量的0.001％至0.05％的范围内。
在优选实施方案中，该方法还包括搅拌反应物以改善PA酶和PA聚合物底物之间的接触，从而促进酶吸附到底物上。该步骤可包括连续搅拌，例如以介于100rpm和5000rpm之间的速率。或者，可以通过在气升式反应器中运行该方法来实现连续搅拌(如上文第2.4.1节所述)。
本领域技术人员将能够通过参考PA聚合物底物的性质、所选的PA酶酶和所需的降解程度来确定合适的反应时间。在优选实施方案中，酶促降解可在5至72小时的反应时间内进行。或者，该方法可以在使用连续反应器的情况下连续运行(见上文第2节)。
该方法还可以包括分离产生的降解产物的步骤。合适的分离步骤包括汽提、通过水溶液分离、蒸汽选择性冷凝、过滤、分离、蒸馏、真空蒸发、萃取、电渗析、吸附、离子交换、沉淀、结晶、浓缩和加酸脱水和沉淀、纳滤、酸催化剂处理、半连续模式蒸馏或连续模式蒸馏、溶剂萃取、蒸发浓缩、蒸发结晶、液/液萃取、氢化、共沸蒸馏过程、吸附、柱色谱、简单真空蒸馏和微滤以及前述两种或更多种的组合。
7.2生产降解产物的方法
本发明提供了一种生产以下的方法：PA聚合物底物的(a)片段；和/或(b)低聚物；和/或(e)单体或重复单元衍生物，该方法包括以下步骤：通过在使得PA聚合物底物中的C-C键被裂解的条件下使所述底物与包含本发明的PA酶的组合物接触，使所述底物降解，从而酶促降解聚合物。
酶促降解不需要使PA聚合物底物完全解聚，并且降解的性质和程度可以通过所选的PA酶、反应条件和PA聚合物底物的化学性质和/或物理形式等来确定。
因此，由本发明的PA酶介导的C-C键裂解引起的酶促降解可能仅使PA聚合物底物片段化。例如，在包含非PA聚合物的长链(或片段)的PA共聚物的情况下，由本发明的PA酶介导的C-C键裂解引起的酶促降解可能产生包含源自共聚物链的非PA聚合物片段的片段。
在优选实施方案中，PA酶将PA聚合物底物酶促降解为：(a)片段；和/或(b)低聚物；和/或(c)分离的单体或重复单元；和/或(d)单体或重复单元片段；和/或(e)单体或重复单元衍生物。
或者，或此外，通过C-C键裂解引起的酶促降解可使PA聚合物底物低聚化。在许多情况下，由本发明的PA酶通过C-C键裂解实现的酶促降解产生PA聚合物底物的片段和低聚物。在其他情况下，由本发明的PA酶通过C-C键裂解实现的酶促降解产生PA聚合物底物的：(a)片段；和/或(b)低聚物和/或(e)单体或重复单元衍生物。更详细地，本发明提供了酶与聚烯烃在O2和/或过氧化物存在下的反应产物如二酸的产生和用途。此类二酸包括草酸(乙二酸)、缩苹果酸(丙二酸)、琥珀酸(丁二酸)、胶酸(戊二酸)、肥酸(己二酸)、薄桃酸(庚二酸)、软木酸(辛二酸)、杜鹃酸(壬二酸)、皮脂酸(癸二酸)、十一烷二酸和十二烷二酸。预期的其他氧化化合物包括乙醇酸、乙醛酸、柠檬酸、糠酸、苯丙酮酸。
在优选实施方案中，PA聚合物底物如第4.1-4.4节(上文)中所述。
在PA聚合物底物包含PA塑料产品的情况下，该过程优选还包括一个或多个生物或非生物加工步骤，例如第5节(上文)中所述。
在优选实施方案中，该方法在20℃至90℃、优选20℃至60℃，更优选20℃至50℃，更优选20℃至40℃的温度下进行。
在优选实施方案中，该方法在中性或酸性pH下进行，优选在酸性pH下进行。例如，该方法优选在2至7的pH下进行，优选在3至6的pH下进行，更优选在3.5至5.5的pH下进行，甚至更优选在约4.5至5的pH下进行。
在优选实施方案中，本发明的PA酶的用量为PA聚合物底物重量的最多5％，更优选最多1％，甚至更优选最多0.1％，还更优选PA聚合物底物重量的最多0.05％。例如，本发明的PA酶的量可以在PA聚合物底物重量的0.001％至5％的范围内，优选在0.001％至1％的范围内，更优选在0.001％至0.1％的范围内，甚至更优选在PA聚合物底物重量的0.001％至0.05％的范围内。
在优选实施方案中，该方法还包括搅拌反应物以改善PA酶和PA聚合物底物之间的接触，从而促进酶吸附到底物上。该步骤可包括连续搅拌，例如以介于100rpm和5000rpm之间的速率。或者，可以通过在气升式反应器中运行该方法来实现连续搅拌(如上文第2.4.1节所述)。
本领域技术人员将能够通过参考PA聚合物底物的性质、所选的PA酶酶和所需的降解程度来确定合适的反应时间。在优选实施方案中，酶促降解可在5至72小时的反应时间内进行。或者，该方法可以在使用连续反应器的情况下连续运行(见上文第2节)。
该方法还可包括分离片段、低聚物、分离的单体或重复单元、单体或重复单元片段和/或单体或重复单元衍生物的步骤。
合适的分离步骤包括汽提、通过水溶液分离、蒸汽选择性冷凝、过滤、分离、蒸馏、真空蒸发、萃取、电渗析、吸附、离子交换、沉淀、结晶、浓缩和加酸脱水和沉淀、纳滤、酸催化剂处理、半连续模式蒸馏或连续模式蒸馏、溶剂萃取、蒸发浓缩、蒸发结晶、液/液萃取、氢化、共沸蒸馏过程、吸附、柱色谱、简单真空蒸馏和微滤以及前述两种或更多种的组合。
7.3本发明的PA酶的用途
本发明考虑了本发明的PA酶的各种用途，包括使用包含PA酶的组合物来降解PA聚合物底物(例如，如上文第4节所述的任何PA聚合物底物)。
本发明还考虑了本发明的PA酶用于产生PA聚合物底物的片段、低聚物、分离的单体或重复单元、单体或重复单元片段和/或单体或重复单元衍生物的用途。
本发明还考虑了本发明的PA酶用于被PA聚合物底物污染的材料的生物修复的用途。
7.4生产微生物生物质的方法
本发明提供了一种生产微生物生物质的方法，其包括以下步骤：(a)提供包含至少一种表达KatG/EC 1.11.1.21 PA酶的微生物的种子培养物；(b)提供包含PA聚合物底物的原料；(c)将所述种子培养物与所述原料混合以形成接种的原料；(d)在使得PA聚合物底物中的C-C键被裂解以产生所述聚合物的降解产物的条件下孵育接种的原料，所述降解产物被所述微生物代谢以产生所述微生物生物质和/或其他产物。在优选实施方案中，表达KatG/EC 1.11.1.21 PA酶的微生物从聚烯烃聚合物的降解中获得其碳源。
微生物生物质可以以任何合适的形式(例如通过离心造粒)回收。它可以随后被处理(例如裂解和/或分馏)。它随后可以被用作分离生物产品的起始材料，包括作为蛋白质和/或氨基酸的来源，例如用于动物饲料。
KatG酶及其衍生物与聚烯烃的反应的其他产物也可以根据已建立的方法从沉淀物和上清液中回收。
7.5生产生物产品的方法
本发明提供了一种生产生物产品的方法，其包括以下步骤：(a)提供包含至少一种表达KatG/EC 1.11.1.21 PA酶的微生物的种子培养物；(b)提供包含PA聚合物底物的原料；(c)将所述种子培养物与所述原料混合以形成接种的原料；(d)在使得PA聚合物底物中的C-C键被所述酶裂解以产生所述聚合物的降解产物的条件下孵育接种的原料，所述降解产物被所述微生物代谢以产生所述生物产品。
生物产品可包括生物燃料，例如选自生物醇(例如生物乙醇)、生物柴油、沼气和合成气的生物燃料。或者，或此外，生物产品可包括乙二醇和/或丙二醇。
生物产品可包括一种或多种二羧酸和/或一种或多种醛。生物产品可包括一种或多种二羧酸。生物产品可包括一种或多种醛。碳链可以是饱和的、部分饱和的或不饱和的、支链的或直链的。
二羧酸(也称为“二酸”)可以选自具有式CnHn-2O4的任何化合物，其中n可以选自2至20。n的值可以选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。优选地，n的值可以是3(即丙二酸)。
酶与聚烯烃在O2和/或过氧化物存在下反应的产物，例如二酸，例如二酸包括草酸(乙二酸)、缩苹果酸(丙二酸)、琥珀酸(丁二酸)、胶酸(戊二酸)、肥酸(己二酸)、薄桃酸(庚二酸)、软木酸(辛二酸)、杜鹃酸(壬二酸)、皮脂酸(癸二酸)、十一烷二酸和十二烷二酸。预期的其他氧化化合物包括乙醇酸、乙醛酸、柠檬酸、糠酸、苯丙酮酸。
此类化合物作为专用化学品具有很高的价值，并且涉及诸如电子、香精和香料、特种溶剂、聚酯、聚合物交联、食品添加剂和制药等多个制造过程。作为进一步的例子，丙二酸(和丙二酸盐；MA)被用作构建块化学品以产生多种有价值的化合物。丙二酸和丙二酸的化学衍生物(例如丙二酸单烷基酯、丙二酸二烷基酯和2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4,6-二酮(“米氏酸”))被用于许多工业和消费品的生产，包括聚酯、保护涂层、溶剂、电子产品、香精、香料、药品、手术粘合剂和食品添加剂。
醛可以选自具有式CnHn-2O3的任何化合物，其中n可以选自2至20。
7.6生产超活性KatG酶的方法
本发明提供了一种生产超活性KatG酶的方法，包括以下步骤：(a)提供具有第一PA酶活性的野生型KatG酶；(b)提供所述野生型KatG酶的多个突变形式，其相对于野生型KatG的氨基酸序列具有一处或多处氨基酸取代、缺失或插入；(c)确定步骤(b)的突变形式的PA酶活性；(d)鉴定具有高于所述第一PA酶活性的PA酶活性的超活性KatG酶。
优选地，步骤(a)的野生型KatG酶是B2UBU5。步骤(b)的突变形式可以通过定点诱变或定向进化提供。步骤(c)优选包括使PA聚合物与步骤(b)的突变形式接触并通过包括一种或多种选自以下的分析方法的方法监测聚合物的降解的步骤：化学、电化学、形态学、流变学、重量分析、光谱和/或色谱方法。
在优选实施方案中，步骤(c)包括使由PA聚合物形成的微珠的悬浮液与步骤(b)的突变形式接触，然后监测伴随微珠降解的微珠悬浮液光密度的降低。
在优选实施方案中，步骤(c)包括使步骤(b)的突变形式与可释放地偶联至发色团或荧光团的微珠接触，该发色团或荧光团通过PA酶活性释放。在此类实施方案中，微珠可通过易于被PA酶活性裂解的聚乙烯接头可释放地偶联至发色团或荧光团。
或者，微珠可包含PA聚合物，发色团或荧光团被引入或封装在微珠内，并在微珠暴露于PE酶活性时释放。
在优选实施方案中，步骤(d)包括流式细胞术，借此通过高通量筛选鉴定超活性KatG酶。
该方法优选还包括确定超活性KatG酶的氨基酸序列的步骤。在此类实施方案中，该方法还可以包括合成编码所述氨基酸序列的DNA然后在细胞表达系统例如如上定义和描述的表达系统中表达所述编码DNA的步骤。
8.KatG测定试剂盒
本发明提供了一种用于高通量筛选KatG突变形式的测定试剂盒，其包含可释放地偶联至发色团或荧光团的微珠，该发色团或荧光团通过PA酶活性释放。微珠可包含PA聚合物，发色团或荧光团可被引入或封装在微珠内，并在微珠暴露于PA酶活性时释放。
另一方面，本发明提供了一种用于高通量筛选KatG突变形式的测定试剂盒，其包含可悬浮在反应介质中并被PA酶活性降解的PA聚合物微珠。本发明的检测试剂盒还可以包含KatG酶，例如B2UBU5。
范例
现在将参照具体实施例描述本发明。这些仅仅是示例性的并且仅用于说明目的：它们不旨在以任何方式限制所要求垄断保护的或范围所描述的发明。
附图说明
图1：聚乙烯(灰色)和聚丙烯(黑色)以100mg(A组)和200mg(B组)与皮氏罗尔斯通氏菌(ATCC 27511)孵育28天时的质量损失。
图2：LDPE薄膜在与皮氏罗尔斯通氏菌(ATCC 27511)孵育后的生物降解。
图3：皮氏罗尔斯通氏菌培养上清液对聚乙烯珠生物降解的影响。
图4：低密度聚乙烯(LDPE)薄膜用皮氏罗尔斯通氏菌上清液的生物降解。
图5：含有重组皮氏罗尔斯通氏菌KatG的微生物提取物对聚乙烯珠的生物降解。
图6：纯化的重组His标记的KatG对聚乙烯珠的生物降解。
图7：重组KatG对荧光PS珠降解的高通量流式细胞仪分析。
图8：使用KatG帮助酶系统的塑料生物降解。
图9：从与KatG和H2O2孵育的各种聚合物生产丙二酸。
图10：从与KatG和H2O2孵育的聚乙烯生产各种化合物。
图11：从在没有H2O2的情况下与KatG孵育的聚乙烯生产丙二酸。
图12：从在没有H2O2的情况下与KatG孵育的聚乙烯生产各种化合物。
图13：通过聚乙烯与KatG的孵育产生的丙二酸的质谱，以及真实标准品的质谱。
图14：通过聚乙烯与KatG的孵育产生的癸二酸的质谱，以及真实标准品的质谱。
图15：通过聚乙烯与KatG的孵育产生的壬二酸的质谱，以及真实标准品的质谱。
实施例1：皮氏罗尔斯通氏菌(ATCC 27511)在塑料薄膜上的生长
液体无碳基础培养基(LCFBM)是一种不含任何添加碳源的培养基，由Yang等人(2014)Evidence of polyethylene biodegradation by bacterial strains from theguts of plastic-eating waxworms Environ Sci Technol 48:13776-13784描述。用100mg或200mg灭菌PP或PE粉末(Goonvean Fibers HM20/70P和Goodfellow ET316031)建立皮氏罗尔斯通氏菌的平行50mL LCFBM培养物。将培养物用现有的皮氏罗尔斯通氏菌储液接种，并在30℃下孵育3、7、10、14、21和28天。移除后，将每种培养物离心以移除细胞。将塑料倒出、过滤并在2％SDS溶液中洗涤4h。然后将塑料在蒸馏水中洗涤4次并晾干过夜。然后称重以记录重量变化。
使用与所有其他培养物相同的洗涤和干燥过程，用聚合物但不用细胞来制备对照。没有观察到生长或聚合物降解。
图1显示了以100mg(A)和200mg(B)孵育时聚乙烯(灰色)和聚丙烯(黑色)的质量损失百分比。
将LDPE薄膜(Goodfellow ET311126)切成50mm×50mm的正方形，用70％乙醇消毒，并在无菌罩中干燥过夜。制备了LCFBM琼脂(Yang等人(2014)同上)，并将50μL的皮氏罗尔斯通氏菌培养物移液到板的中间，然后通过无菌环铺展。然后将一个LDPE正方形放在接种物上，然后将板用ParafilmTM密封，然后在30℃下孵育3天。可以清楚地观察到大面积的生物降解(图2)。
实施例2：PE珠被皮氏罗尔斯通氏菌培养物上清液的生物降解
将2.24mg的32-38μm Cospheric PE微球(UVPMS-BY2-1.00)置于玻璃小瓶中，悬浮于1mL LCFBM(如上所述)中，并在30℃下用5mM H2O2孵育2天。将样品涡旋并移至载玻片上，然后在台式显微镜下观察。珠没有变化(图3A)
在30℃下将皮氏罗尔斯通氏菌培养物与浓度为100mg/100mL的灭菌聚丙烯(Goonvean Fibers HM20/70P)在LCFBM(如上所述)中生长3天。将培养物以10,000×g离心3分钟。去除上清液，并使用Amicon搅拌池浓缩器浓缩。将1mL的120倍浓缩的上清液与5mMH2O2一起添加到2.24mg的32-38μm Cospheric微球(UVPMS-BY2-1.00 32-38μm)中，并在30℃下孵育2天。将样品涡旋并移至载玻片上，然后在台式显微镜下观察。明显发生了很多降解(图3B)
使皮氏罗尔斯通氏菌培养物生长，并精确地如上所述获得和浓缩上清液，除了在加入到Cospheric微球中之前，先将上清液煮沸10分钟。珠没有变化(图3C)。
实施例3：低密度聚乙烯(LDPE)薄膜被皮氏罗尔斯通氏菌上清液生物降解
通过在0.1M氢氧化钠中孵育1小时，然后用无菌水洗涤5次，用LCFBM洗涤1次，然后在无菌罩中干燥，将100mg LDPE薄膜(Goodfellow ET311126)灭菌。将薄膜加入到50mLLCFBM中，孵育3天。使用Keyence VHX-7000显微镜对薄膜进行成像。
薄膜保持完整(图4A)。
如上所述将100mg LDPE薄膜(Goodfellow ET311126)灭菌。将薄膜添加到如实施例2所述制备的50mL皮氏罗尔斯通氏菌上清液中并孵育3天。使用Keyence VHX-7000显微镜对薄膜进行成像。
观察到聚合物薄膜的广泛片段化(图4B)。
实施例4：含有重组皮氏罗尔斯通氏菌KatG的微生物提取物对聚乙烯珠的生物降解
将来自皮氏罗尔斯通氏菌的KatG克隆到pET载体中，将大肠杆菌BL21细胞转化以引入该质粒。通过使50ml培养物在30℃下于自诱导TB肉汤(ForMedium)中生长并将离心后的细菌沉淀物重悬于补充有0.1mg/ml溶菌酶的2ml醋酸盐缓冲液(醋酸钠45mM，醋酸55mM，氯化钠50mM，pH4.5)中，制备裂解产物。使样品经历用Tissue Lyser II(Qiagen)中的大约30mg 0.5mm氧化锆珠在29.9KHz下进行的珠磨约2分钟，随后在37℃下以500rpm摇动孵育1小时。通过以10,000g离心细胞碎片10分钟获得无细胞裂解产物。
将2.24mg 32-38μm Cospheric微球(UVPMS-BY2-1.00 32-38μm)置于玻璃小瓶中，并悬浮于200μm LCFBM(如上所述)中。添加H2O2至终浓度为5mM，并将样品在30℃下孵育2天。将样品涡旋并在Keyence VHX-7000显微镜下观察。没有观察到降解(图5A)。
将2.24mg 32-38μm Cospheric微球(UVPMS-BY2-1.00 32-38μm)置于玻璃小瓶中。从细胞中提取200uL重组KatG裂解产物，并添加到珠中。添加H2O2至终浓度为5mM。将样品在30℃下孵育2天。将样品涡旋并在Keyence VHX-7000显微镜下观察。观察到显著的降解(图5B)。
将2.24mg 32-38um Cospheric微球(UVPMS-BY2-1.00 32-38um)置于玻璃小瓶中。从细胞中提取200uL重组KatG裂解产物，并在99℃下煮沸10分钟。将裂解产物冷却至室温，并添加到珠中。添加H2O2至终浓度为5mM。将样品在30℃下孵育2天。将样品涡旋并在KeyenceVHX-7000显微镜下观察。没有观察到降解(图5C)。
实施例5：通过纯化的重组His标记的KatG对聚乙烯珠的生物降解
将2.24mg 32-38μm Cospheric微球(UVPMS-BY2-1.00 32-38μm)置于玻璃小瓶中，并悬浮在200μm的LCFBM(如上所述)中。添加H2O2至终浓度为5mM，并将样品在30℃下孵育2天。将样品涡旋并在Keyence VHX-7000显微镜下观察。没有观察到降解(图6A)。
将2.24mg 32-38μm Cospheric微球(UVPMS-BY2-1.00 32-38μm)置于玻璃小瓶中。将2.24mg 32-38μm Cospheric微球(UVPMS-BY2-1.00 32-38μm)置于玻璃小瓶中。使用B-Per裂解缓冲液(Thermo)从细胞中提取10mL重组KatG裂解产物，并根据制造商的说明使用His-Pur Ni-NTA磁珠(Thermo)进行纯化。将200μL纯化的酶溶液添加到珠中，并添加H2O2至终浓度为5mM。将样品在30℃下孵育2天。将样品涡旋并在Keyence VHX-7000显微镜下观察。观察到显著的降解(图6B)。
实施例6：通过纯化的重组His标记的KatG和KatG变体对聚丙烯和聚乙烯珠进行生物降解
使用聚丙烯(PP；Goonvean Fibers HM20/70P)和聚乙烯(PE；Cospherics CPMS-0.96 38-45μm)珠评估与重组KatG和衍生物一起孵育所伴随的质量损失。
向预先称重的1.5ml Eppendorf离心管中加入PP或PE珠，并重新检查管重量以确定珠的初始重量。256-3和256-6是表达重组皮氏罗尔斯通氏菌KatG酶的BL21大肠杆菌裂解产物。256-3是野生型序列，而256-6是野生型序列的Y221F/R410N变体。测试的所有重组KatG酶都包含C端His标签。
通过使50ml培养物在37℃下于自诱导TB肉汤(ForMedium)中生长并将离心后的细菌沉淀物重悬于补充有0.1mg/ml溶菌酶的2ml醋酸盐缓冲液(醋酸钠45mM，醋酸55mM，氯化钠50mM，pH 4.5)中，制备裂解产物。使样品经历用Tissue Lyser II(Qiagen)中的大约30mg0.5mm氧化锆珠在29.9KHz下进行的珠磨约2分钟，随后在37℃下以500rpm摇动孵育1小时。通过在4℃下以10,000g离心细胞碎片10分钟获得无细胞裂解产物。
皮氏罗尔斯通氏菌的模式菌株(ATCC 275111)接种于500ml液态无碳基础培养基(见上文)，以20g保鲜膜作为碳源，并在30℃下于摇床上培养5天。通过将细胞沉淀物离心而回收上清液并经由Amicon搅拌池浓缩器浓缩并将缓冲液更换成上述醋酸盐缓冲液至最终体积为约2ml。
为了进行测定，将补充有H2O2(5mM最终浓度)的400μl裂解产物/上清液与珠涡旋，并在30℃下以200RPM孵育24小时。通过以8000g离心5分钟将水溶液与珠分离，随后将珠用水洗涤，然后用乙醇洗涤，通过离心再次实现分离。通过真空离心(SpeedVac，Thermo)去除残留的乙醇。再次检查干珠和管的重量以确定质量损失。
表1(下表)显示了正好孵育24小时后的质量损失。相对于仅在缓冲液/H2O2中孵育，对于聚丙烯和聚乙烯珠均观察到显著的质量损失。
表1
Figure BDA0003983902350000931
实施例7：荧光PE珠被重组KatG降解的高通量流式细胞术分析
如实施例6中所述制备细胞提取物256-3。然后使用200μl通过Zeba旋转脱盐柱脱盐到调节至pH 5的PBS中，向其中加入如实施例6中所述的1.2mg Cospherics珠。荧光珠由聚合物球组成，黄色、水不溶性荧光团的单个“石块”分散在其中。上述测定中使用了150μl。
使用Intellicyt iQue Screener Plus分析样品；显示的数据使用488nm的激发和675±30nm的发射。图7A显示了侧向散射(指示大小)相对于检测到的颗粒荧光(该仪器上的BL4检测通道)的点图。珠的初始大小意味着它们的侧向散射实际上超出了量程(>107个单位)。荧光信号的离散大小反映了珠中荧光内含物以及无塑料荧光团颗粒的离散性质。2,000到20,000之间的许多事件都是背景噪声。正如在光散射和荧光通道中观察到的，非常明显的是珠已经发生了极其广泛的降解。图7B将A的数据子集显示为荧光矩形图，强调其离散性质。
实施例8：使用KatG帮助酶酶系统的塑料生物降解
使用来自黑曲霉的葡萄糖(D+)和葡萄糖氧化酶(均来自Sigma)，采用H2O2再生系统。测定中补充有0.1M葡萄糖和2U葡萄糖氧化酶，但另外如实施例7那样用细胞提取物256-3进行4天。图8A显示了没有酶的对照，而图8B显示了酶系统的降解效果。
实施例9：在有和没有H2O2的情况下，通过与聚烯烃塑料一起孵育的纯化的KatG生产化学品
裂解产物
版本256-6。将Y221F/R410N katG突变体转化到BL21大肠杆菌中，并使选定的菌落在包含羧苄青霉素的LB中生长。使用LB培养物来接种1L自诱导TB肉汤并在30℃下生长24小时。通过在10ml的50mM磷酸氢二钠和0.1mg/ml溶酶体(lysosyme)和100mg/ml DNAse I中再悬浮并在30℃下摇动孵育1小时来回收所产生的细菌生长物。通过Constant细胞破碎系统(Constant Systems)对悬浮液进行细胞裂解，并将破碎的裂解产物以12000g离心15分钟。回收所得裂解产物的上清液并用于后续测定。该裂解产物的pH值为6.4。
纯化的KatG
Sumo Y221F/R410N katG是一种His标记的蛋白，其C端肽序列被His标记的Sumo蛋白酶识别，在消化后留下带有无痕标签的katG酶。将带有N末端可切割的his-SUMO标签的katG突变体(Y221F/R410N)的编码序列克隆到带有卡那霉素抗性标记物的PE-SUMOPro(LifeSensors，PE-1000-K100)载体中，并转化到BL21(DE3)大肠杆菌细胞中。如对256-6所述(如实施例6)制备克隆，不同之处在于将细菌细胞重悬于20mM磷酸钠缓冲液pH7.4、300mMNaCl中，以允许使用带级分收集器的
Figure BDA0003983902350000951
Start色谱系统，将裂解产物上清液直接加载到用同一缓冲液初始化的His TrapTM HP纯化柱(Cytivia)上。通过用20mM磷酸钠缓冲液pH7.4、300mM NaCl、500mM咪唑进行梯度洗脱来纯化重组酶。然后将分馏的His标记的KatG酶(大约12ml)与200ml 7mg/ml Sumo蛋白酶在25℃下孵育过夜，使用
Figure BDA0003983902350000952
渗析管(Thermo Scientific)相对于50mM Tris-HCl，pH 8.0/150mM NaCl/1mM DTT进行渗析。然后将经渗析的、Sumo蛋白酶消化的KatG返回到His Trap柱，并通过流过柱而收集无标签突变体(Y221F/R410N)，而His标签保留在柱上，直到用咪唑梯度洗脱。
然后使用PD-10脱盐柱使20mM磷酸钠缓冲液pH 7.4、300mM NaCl中的经纯化的KatG突变体(Y221F/R410N)进行缓冲液交换，进入0.1M醋酸钠pH 5，并用于后续测定。在这个实施例中，该制备用于下面的实验，并被称为KatG。
孵育条件
将超高分子量聚乙烯(UHMWPE)粉末(Sigma 434272)、14-20μm直径聚苯乙烯微球(Cospheric PSMS-1.07)、聚氯乙烯(PVC)粉末(Goodfellow 996-673-33)、聚丙烯(PP)粉末(Goonvean Fibres HM20/70P)和聚四氟乙烯(PTFE)粉末(Goodfellow 531-672-48)称重到单独的玻璃小瓶中。将纯化的KatG突变体(Y221F/R410N)酶和0.1M醋酸盐缓冲液pH 5添加到小瓶中，使酶和聚合物的最终浓度分别为1.25μM(～0.1mg.mL-1)和5mg/mL，总反应体积为2.5mL。对于每种聚合物，使用通过在80℃下与10mM DTT(REF)孵育30分钟而变性的经纯化的KatG和酶阴性对照，与对照一起设置两个生物平行反应。所有样品均在30℃和250RPM下孵育。每小时取出样品并向反应混合物中添加稀释1000倍的2μL 9.8M过氧化氢(SigmaH1009)。
在第一次添加过氧化氢和孵育之前，取等分试样、淬灭并储存在-80℃用于质谱(MS)分析。对于除PTFE之外的所有样品，在孵育5小时和10小时后取出等分试样。对于PTFE反应，在孵育5小时后，仅取出一份等分试样。将等分试样添加到预冷至-80℃的MS级甲醇中。然后将甲醇中的样品涡旋并在4℃和14,000RPM下离心15分钟，然后将上清液转移到在-80℃下储存的微量离心管中。具体而言，将样品稀释1比4.5(100mL样品+350mL甲醇)。然后将75mL的该混合物干燥并在注射前重新悬浮在40mL中。
然后在不添加过氧化氢的情况下对UHMWPE重复该过程。在孵育5小时和57小时后，取出等分试样并如上所述淬灭用于MS。
质谱
使用Wright Muelas M,Roberts I,Mughal F,O’Hagan S,Day PJ,Kell DB:Anuntargeted metabolomics strategy to measure differences in metabolite uptakeand excretion by mammalian cell lines.Metabolomics 2020；16:107中描述和以开放获取形式发表的方法，在Orbitrap仪器上以正模式和负模式获得如上所述孵育的样品的质谱。此处显示的那些是使用负电离获得的。
质子NMR光谱
1H 1D NMR光谱是在配备TCI冷冻探针的Bruker 700MHz Avance IIIHD光谱仪上获得的，使用标准供应商提供的脉冲序列(noesygppr1d和cpmgpr1d)，在298K(25℃)下以4s扫描间延迟32个瞬变和64k点获得。使用99.8％氘代甲醇标准品和标准2mM蔗糖参比的3D匀场校准温度以确保质量。对于所有光谱，在乙酸的线宽上进行样品质量控制。
在各种提取物中鉴定出的化合物通常在分子量上相差14、28或56amu，包括草酸(乙二酸)、缩苹果酸(丙二酸)、琥珀酸(丁二酸)、胶酸(戊二酸)、肥酸(己二酸)、薄桃酸(庚二酸)、软木酸(辛二酸)、杜鹃酸(壬二酸)、皮脂酸(癸二酸)、十一烷二酸和十二烷二酸。有时，还观察到乙醇酸、乙醛酸、柠檬酸、糠酸和苯丙酮酸。
丙二酸和柠檬酸通过NMR光谱得到具体证实。
等同
前面的描述详细给出了本发明的当前优选的实施方案。在考虑这些描述后，预期本领域技术人员会想到实践中的许多等同物、修改和变化。这些修改和变化包含在或旨在包含在所附权利要求中。
序列表
<110> 美利济生物科技有限公司（Mellizyme Biotechnology Limited）
<120> 塑料的酶促降解
<130> P33396WO1
<150> GB2005073.8
<151> 2020-04-06
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 721
<212> PRT
<213> 皮氏罗尔斯通氏菌（Ralstonia pickettii）
<400> 1
Met Thr Thr Glu Ala Lys Cys Pro Phe Ser Gly His Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
Ser His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Ala Asn Lys Asp Trp Trp Pro Asn
20 25 30
Gln Leu Arg Val Asp Leu Leu Asn Gln His Ser Glu Lys Ser Asp Pro
35 40 45
Leu Gly Ser Asn Phe Asn Tyr Arg Lys Ser Phe Asn Ala Ile Asp Tyr
50 55 60
Asp Ala Leu Lys Ala Asp Leu Arg Arg Leu Met Thr Asp Ser Gln Asp
65 70 75 80
Trp Trp Pro Ala Asp Phe Gly His Tyr Gly Pro Gln Phe Ile Arg Met
85 90 95
Ala Trp His Ala Ala Gly Thr Tyr Arg Thr Gly Asp Gly Arg Gly Gly
100 105 110
Ala Gly Arg Gly Gln Gln Arg Phe Ala Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp
115 120 125
Asn Val Asn Ile Asp Lys Ser Arg Arg Leu Leu Trp Pro Ile Lys Gln
130 135 140
Lys Tyr Gly Gln Ala Ile Ser Trp Ala Asp Leu Leu Ile Leu Thr Gly
145 150 155 160
Asn Val Ala Leu Glu Thr Met Gly Phe Arg Thr Phe Gly Phe Ala Ala
165 170 175
Gly Arg Glu Asp Thr Trp Glu Pro Asp Asn Asp Val Tyr Trp Gly Asn
180 185 190
Glu Thr Lys Trp Leu Glu Ala Thr Arg Tyr Ser Gly Glu Arg Asn Leu
195 200 205
Ala Asn Pro Leu Ala Ala Val Gln Met Gly Leu Ile Tyr Val Asn Pro
210 215 220
Glu Gly Pro Glu His Ala His Gly Asp Pro Leu Ala Ala Ala Lys Asp
225 230 235 240
Ile Arg Glu Thr Phe Ala Arg Met Ala Met Asp Asp Glu Glu Thr Val
245 250 255
Ala Leu Ile Ala Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Thr His Gly Ala Gly
260 265 270
Pro Ala Ser His Val Gly Ala Asp Val Glu Ala Ala Pro Leu Glu Ala
275 280 285
Gln Gly Leu Gly Trp Ala Ser Thr Phe Gly Thr Gly Lys Gly Ala Asp
290 295 300
Ala Ile Thr Ser Gly Leu Glu Val Thr Trp Thr Gln Thr Pro Ala Gln
305 310 315 320
Trp Ser Asn Phe Phe Phe Glu Asn Leu Phe Lys Tyr Glu Trp Val Gln
325 330 335
Glu Lys Ser Pro Ala Gly Ala Leu Gln Trp Val Ala Lys Asp Ala Glu
340 345 350
Ala Ile Ile Pro Gly Pro Thr Pro Asp Ser Pro Lys Arg Arg Pro Thr
355 360 365
Met Leu Thr Thr Asp Leu Ser Leu Arg Phe Asp Pro Ala Tyr Glu Lys
370 375 380
Ile Ser Arg Arg Phe Leu Asp Asn Pro Gln Ala Phe Ala Glu Ala Phe
385 390 395 400
Ala Arg Ala Trp Phe Lys Leu Thr His Arg Asp Leu Gly Pro Lys Ser
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Leu Lys Ala Lys Ile Ala Ala Ser Gly Leu Ser Ala Ser Glu Leu Val
450 455 460
Ala Val Ala Trp Ala Ser Ala Ser Thr Phe Arg Gly Ser Asp Lys Arg
465 470 475 480
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485 490 495
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Gly Ser Val Gly Ile Glu Leu Ala Ala Lys Ala Ala Gly Thr Thr Ile
530 535 540
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545 550 555 560
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<210> 2
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<213> 皮氏罗尔斯通氏菌（Ralstonia pickettii）
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Val Val Leu Thr Pro Phe Ser Leu Gly Val His Ser Trp Leu Ala
420 425 430

Claims (55)

1.一种适用于降解合成塑料聚烯烃聚合物的组合物，所述组合物包含KatG/EC1.11.1.21聚烯烃酶(PA酶)和合适的赋形剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中KatG/EC 1.11.1.21PA酶是KatG酶。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述KatG酶包含B2UBU5KatGN或其变体的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述变体包含与B2UBU5 KatGN至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。
4.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述KatG酶包含B2UBU5或其变体的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述变体包含与B2UBU5至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。
5.如权利要求1至4所述的组合物，其中所述KatG酶是B2UBU5直系同源物。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述B2UBU5直系同源物选自：
A0A1I5SK77(A0A1I5SK77_9RALS)
A0A0F0E7J1(A0A0F0E7J1_9BURK)
A0A0J9DTW2(A0A0J9DTW2_9RALS)
S9RSJ5(S9RSJ5_9RALS)
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C6BD71(C6BD71_RALP1)
A0A2P4RN88(A0A2P4RN88_RALPI)
U3GIS7(U3GIS7_9RALS)
A0A1C0XEH7(A0A1C0XEH7_RALPI)
R0CJV6(R0CJV6_RALPI)
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A0A291EI92(A0A291EI92_RALPI)
A0A401K9C7(A0A401K9C7_9RALS)
UPI00046A45B6
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UPI00046AAE20
UPI0012AE63A9
UPI000D5F3903
UPI0004803C34
UPI000CEDCA44。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述KatG酶是超活性KatG酶。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述KatG酶是非过氧化氢酶性KatG变体。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述非过氧化氢酶性KatG变体包含被破坏的三肽加合物。
10.如权利要求8或9所述的组合物，其中所述非过氧化氢酶性KatG变体是非过氧化氢酶性B2UBU5变体或权利要求6的任一直系同源物的非过氧化氢酶性变体。
11.如权利要求8至10所述的组合物，其中所述非过氧化氢酶性KatG变体包含一个或多个以下氨基酸取代：M248I、M248V、Y221F、Y221A、Y221L、W98A、W98F和/或R410N。
12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述KatG酶是单结构域KatG酶。
13.如权利要求1至12所述的组合物，其还包含能够生成过氧化物的酶。
14.如权利要求1或13所述的组合物，其还包含塑料结合剂。
15.如权利要求13所述的组合物，其中生成过氧化物的酶选自：甲酸氧化酶、甲酸脱氢酶、甲醛歧化酶、甲醇氧化酶或其组合。
16.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含一种或多种辅助性塑食酶。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述辅助性塑食酶选自：(a)漆酶(EC1.10.3.2.)；(b)锰过氧化物酶(MnP，EC 1.11.1.13)；(c)木质素过氧化物酶(LiP，EC1.11.1.14)；(d)上述两种或更多种的组合。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述一种或多种辅助性塑食酶包括互补塑食酶。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述互补塑食酶选自：(a)漆酶(EC 1.10.3.2.)；(b)锰过氧化物酶(MnP，EC 1.11.1.13)；(c)木质素过氧化物酶(LiP，EC 1.11.1.14)；(d)多功能过氧化物酶；(e)蛋白酶；(f)脂肪酶；(g)羧酸酯酶；(h)酯酶；和(i)上述两种或更多种的组合。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述互补塑食酶包括角质酶和/或PET酶。
21.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含废物修复酶混合物，所述废物修复酶混合物包含一种或多种辅助性非塑食酶生物修复酶。
22.如权利要求21所述的组合物，其中一种或多种辅助性生物修复酶选自：(a)氧化还原酶；(b)加氧酶；(c)单加氧酶；(d)双加氧酶；(e)漆酶；(f)过氧化物酶；(g)水解酶；(h)过加氧酶，例如来自柱状田头菇(Agrocybe aegerita)；和(i)上述两种或更多种的组合。
23.如权利要求21或权利要求22所述的组合物，其中辅助性生物修复酶包括选自以下的水解酶：(a)脂肪酶；(b)纤维素酶；(c)蛋白酶；(d)上述两种或更多种的组合。
24.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含一种或多种辅助纤维素、半纤维素和/或木质素酶。
25.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含一种或多种辅助因子。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述一种或多种辅助因子包括血红素和/或铁和/或黄素单核苷酸(FMN)和/或FAD(H2)和/或NAD(H)。
27.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物的一种或多种酶由表达和分泌所述酶的重组宿主原位产生。
28.如权利要求27所述的组合物，其中两种或更多种酶通过宿主的表达和分泌产生。
29.如权利要求27或28所述的组合物，其中宿主选自：大肠杆菌；枯草芽孢杆菌；巨大芽孢杆菌；地衣芽孢杆菌；乳酸乳球菌；富养罗尔斯通氏菌；假单胞菌属；皮氏罗尔斯通氏菌；棒状杆菌属；酿酒酵母；多形汉逊酵母；法夫驹形氏酵母；博伊丁假丝酵母；粟酒裂殖酵母；丝状真菌，例如曲霉属和木霉属，以及嗜热毁丝霉菌，任选地以C1表达系统的形式存在。
30.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含一种或多种选自以下属的微生物：无色杆菌属、不动杆菌属、马杜拉放线菌属、产碱杆菌属、食烷菌属、拟无枝酸菌属、硫胺素芽孢杆菌属、古生球菌属、Aromatoleum、节杆菌属、曲霉属、固氮弧菌属、马杜拉放线菌属、生赤壳属、棒束孢、芽孢杆菌属、假单胞菌属、镰刀菌属、白僵菌属、短芽孢杆菌属、短杆菌属、短波单胞菌属、假丝酵母属、毛壳菌属、柠檬酸杆菌属、枝孢霉属、丛毛单胞菌属、革盖菌属、拟棒状杆菌属、棒状杆菌属、小克银汉霉属、弯孢霉属、解环菌属、代尔夫特菌属、脱硫球菌属、脱硫八叠球菌属、Dictyodontium、双球菌属、侧齿霉属、肠杆菌属、微小杆菌属、黄杆菌属、胶质细菌属、戈登菌属、嗜盐菌属、汉逊酵母属、拟孢囊菌属、克雷伯氏菌属、克鲁维酵母菌属、纤毛菌属、李斯特菌属、海杆菌属、微杆菌属、微球菌属、莫拉菌属、被孢霉属、毛霉属、分枝杆菌属、诺卡氏菌属、苍白杆菌属、解油螺旋菌属、Paecylomyces、类芽孢杆菌属、青霉属、黄孢平革菌属、侧耳属、变形菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、Pseudozyma、芽霉菌属、拉恩氏菌属、罗尔斯通氏菌属、根霉菌属、红球菌属、鞘氨醇单胞菌属、酵母菌属、沙雷氏菌属、鞘氨醇杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、寡养单胞菌属、链球菌属、篮状菌属、深海弯曲菌属、高温单孢菌属、栓菌属、木霉属、麦轴梗霉属、弧菌属、黄单胞菌属以及上述两种或多种的组合。
31.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中一种或多种酶被固定在支持物上。
32.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述KatG酶是B2UBU5或M1FBG9。
33.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其为水溶液、乳液、悬浮液或分散体的形式。
34.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于PA聚合物的降解。
35.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于被PA聚合物污染的材料的生物修复。
36.一种用于PA聚合物的酶促降解的方法，所述方法包括使PA聚合物与权利要求1至33中任一项所述的组合物接触。
37.如权利要求35所述的方法，其中PA聚合物的酶促降解发生在反应器中。
38.一种生产PA聚合物的片段、低聚物、分离的单体或重复单元、单体或重复单元片段和/或单体或重复单元衍生物的方法，所述方法包括通过使所述聚合物与权利要求1至33中任一项所述的组合物接触而使其降解的步骤。
39.一种生产微生物生物质的方法，其包括以下步骤：(a)提供包含至少一种表达KatG/EC 1.11.1.21PA酶的微生物的种子培养物；(b)提供包含PA聚合物的原料；(c)将所述种子培养物与所述原料混合以形成接种的原料；和(d)在使得PA聚合物中的C-C键裂解以产生所述聚合物的降解产物的条件下孵育接种的原料，所述降解产物被所述微生物代谢以产生所述微生物生物质。
40.一种用于生产生物产品的方法，其包括以下步骤：(a)提供包含至少一种表达KatG/EC 1.11.1.21PA酶的微生物的种子培养物；(b)提供包含PA聚合物的原料；(c)将所述种子培养物与所述原料混合以形成接种的原料；和(d)在使得PA聚合物中的C-C键被所述酶裂解以产生所述聚合物的降解产物的条件下孵育接种的原料，所述降解产物被所述微生物代谢以产生所述生物产品。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述生物产品包括生物燃料。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述生物产品包括一种或多种羧酸、醛或二羧酸。
43.如权利要求40至42所述的方法，其中所述生物产品包括一种或多种选自下组的化合物：草酸(乙二酸)、缩苹果酸(丙二酸)、琥珀酸(丁二酸)、胶酸(戊二酸)、肥酸(己二酸)、薄桃酸(庚二酸)、软木酸(辛二酸)、杜鹃酸(壬二酸)、皮脂酸(癸二酸)、十一烷二酸和十二烷二酸、乙醇酸、乙醛酸、柠檬酸、糠酸和苯丙酮酸。
44.如权利要求40至43所述的方法，其中对PA聚合物进行非生物预处理。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述非生物预处理选自机械、物理和化学处理或其两种或更多种的组合。
46.权利要求1至33中任一项所述的组合物用于降解PA聚合物的用途。
47.权利要求1至33中任一项所述的组合物用于生产PA聚合物的片段、低聚物、分离的单体或重复单元、单体或重复单元片段和/或单体或重复单元衍生物的用途。
48.权利要求1至33中任一项所述的组合物用于被PA聚合物污染的材料的生物修复的用途。
49.一种包含KatG/EC 1.11.1.21聚烯烃酶(和/或表达和/或分泌KatG/EC1.11.1.21聚烯烃酶的微生物)的KatG降解助剂，其用作生物降解助剂塑料添加剂，任选地其中PA酶以无活性酶原的形式存在。
50.一种复合KatG塑料，其包含与权利要求50所述的KatG降解助剂组合的塑料聚合物。
51.一种自降解PA聚合物，其包含与权利要求50所述的KatG降解助剂组合的PA聚合物。
52.如权利要求51或52所述的复合KatG塑料或自降解聚合物，其中所述KatG降解助剂包含在聚合物的内部或置于聚合物的表面上。
53.一种塑料制品，其包含权利要求51至53中任一项所述的KatG降解助剂、复合KatG塑料或自降解PA聚合物。
54.一种KatG EC 1.11.1.21酶，其包含一个或多个以下氨基酸取代：M248I、M248V、Y221F、Y221A、Y221L、W98A、W98F和/或R410N。
55.如本文所要求保护的组合物，其中KatG/EC1.11.1.21酶是权利要求53所述的酶。
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