CN114874963B - 一种生产羟基酪醇的重组需钠弧菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种生产羟基酪醇的重组需钠弧菌及其应用。本发明提供了需钠弧菌在生产羟基酪醇中的新用途。经改造获得的需钠弧菌工程菌可用于全细胞催化合成羟基酪醇，并能够高效促进羟基酪醇的积累，还可作为底盘菌用于构建羟基酪醇生产菌株。本发明提供的基于需钠弧菌生产羟基酪醇的方法，在保证羟基酪醇产量的同时可以缩短羟基酪醇的生产周期，提高羟基酪醇的得率，并降低下游内毒素的去除难度。

Description

一种生产羟基酪醇的重组需钠弧菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种生产羟基酪醇的重组需钠弧菌及其应用。
背景技术
羟基酪醇(hydroxytyrosol，HT)是一种天然多酚类化合物，其化学名称为3,4-二羟基苯乙醇，分子式为C4H10O3，相对分子质量为154.16。
羟基酪醇是一种淡黄色油状液体，属于两亲性分子，具有较好的水溶性和脂溶性。流行病学调查发现：长期食用橄榄油的地中海国家居民，其心血管疾病、癌症等的发病率和死亡率均较低；这一健康效应与橄榄油中富含的多酚类化合物羟基酪醇密切相关。作为多酚类化合物，羟基酪醇具有良好的抗氧化性，研究发现其对于氧化应激疾病、神经系统疾病、心血管疾病、代谢综合征、炎症、肿瘤等疾病均有治疗效果。此外，羟基酪醇因其特殊的生物和药理活性，用途十分广泛：在食品工业中，可作为天然的防腐剂，防止食品的氧化变质；在营养保健领域，可作为营养补充剂、抗菌剂，添加到各种食品中。
目前，生产羟基酪醇的方法有化学合成和植物提取。化学合成羟基酪醇方法复杂、涉及的有机试剂毒性大、对环境污染严重，且所用催化剂价格昂贵。
现有技术中生物合成羟基酪醇使用的宿主多为大肠杆菌，例如：专利申请CN110616180A公开了在大肠杆菌表达基因工程菌中导入L-苯丙氨酶脱氢酶、α-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶的基因，以L-多巴为底物催化合成羟基酪醇。目前，生物合成羟基酪醇的产率仍有待提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产羟基酪醇的重组需钠弧菌及其应用。本发明的另一目的是提供利用需钠弧菌生产羟基酪醇的方法。
不同生物化学品的生物合成通常需要选择适宜的微生物平台，例如：大肠杆菌虽然是最为常用的微生物平台，但因其胞内代谢通量的分配特点以及对某些物质具有过于活跃的分解代谢等特点，大肠杆菌适用于一些生物化学品的生物合成，但也存在一些生物化学品不适于利用大肠杆菌进行生物合成。关于羟基酪醇的生物合成，几乎所有现有技术均是利用大肠杆菌进行，未见利用需钠弧菌(Vibrio natriegens)生产羟基酪醇的报道。目前对于需钠弧菌中羟基酪醇的降解和调控机制尚不明晰，发明人在前期研发过程中发现需钠弧菌对于羟基酪醇具有非常强的降解能力，这可能也是目前没有采用需钠弧菌生产羟基酪醇的原因所在。但在后续研究中，发明人意外地发现，对羟基酪醇具有强降解能力的需钠弧菌也能够高效积累羟基酪醇，其催化合成羟基酪醇的能力甚至高于大肠杆菌。基于上述发现进一步完成了本发明。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供需钠弧菌在生产羟基酪醇中的应用。
优选地，所述应用为利用需钠弧菌进行全细胞催化生产羟基酪醇。
优选地，所述应用包括使需钠弧菌表达用于合成羟基酪醇的酶的步骤。
优选地，所述应用包括使需钠弧菌表达用于合成羟基酪醇的酶和用于催化NAD+合成NADH的酶的步骤。
上述用于合成羟基酪醇的酶包括但不限于催化酪醇合成羟基酪醇的酶、催化酪氨酸合成羟基酪醇的酶等。
其中，所述催化酪醇合成羟基酪醇的酶包括4-羟基苯乙酸3-单加氧酶。
上述催化NAD+合成NADH的酶包括但不限于甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶等。
进一步优选地，所述应用包括：将包含4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶的编码基因的核酸分子导入需钠弧菌中，得到重组需钠弧菌，利用所述重组需钠弧菌生产羟基酪醇。
对于4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶，本发明发现，对于需钠弧菌而言，来源于大肠杆菌的4-羟基苯乙酸3-单加氧酶、来源于胞内分枝杆菌的甲酸脱氢酶能够更好地在需钠弧菌中表达，有利于促进羟基酪醇的高效合成。
优选地，以上所述的4-羟基苯乙酸3-单加氧酶来源于大肠杆菌。所述甲酸脱氢酶来源于胞内分枝杆菌。
在本发明的一些实施方式中，4-羟基苯乙酸3-单加氧酶为登录号为WP_000801472.1和WP_001175451.1的蛋白，甲酸脱氢酶为登录号为WP_009957650.1的蛋白。
对于4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶的编码基因，本领域技术人员可根据4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶的氨基酸序列获得。基于密码子规则，编码上述蛋白的基因的核苷酸序列并不唯一，但所有能够编码4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶的基因均在本发明的保护范围内。
以上所述的应用中，利用所述重组需钠弧菌生产羟基酪醇具体为以酪醇为底物，利用所述重组需钠弧菌进行全细胞催化。
优选地，所述应用包括：将所述重组需钠弧菌培养并诱导4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶的表达，收集菌体后，以酪醇为底物进行全细胞催化。
第二方面，本发明提供一种重组需钠弧菌，所述重组需钠弧菌表达4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶。
优选地，所述4-羟基苯乙酸3-单加氧酶来源于大肠杆菌，和/或，所述甲酸脱氢酶来源于胞内分枝杆菌。
进一步优选地，所述4-羟基苯乙酸3-单加氧酶为WP_000801472.1和WP_001175451.1，和/或，所述甲酸脱氢酶为WP_009957650.1。
本发明发现，对于4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶的表达优选采用诱导表达的方式，而且，采用阿拉伯糖进行诱导更有利于需钠弧菌表达上述4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶。
优选地，所述4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶的表达以阿拉伯糖启动子启动转录。
进一步优选地，通过在需钠弧菌中导入含有4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶的编码基因的表达质粒，使得需钠弧菌表达4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶。
在本发明的一些实施方式中，导入需钠弧菌的表达质粒包含阿拉伯糖启动子以及4-羟基苯乙酸3-单加氧酶编码基因和甲酸脱氢酶的编码基因。
在本发明的一些实施方式中，所述表达质粒以pETDuet质粒为骨架。
在本发明的一些实施方式中，在所述表达质粒中，阿拉伯糖启动子、4-羟基苯乙酸3-单加氧酶编码基因、甲酸脱氢酶编码基因顺次连接。
在本发明的一些实施方式中，所述阿拉伯糖启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一些实施方式中，重组需钠弧菌构建的出发菌株为需钠弧菌Vmax。
第三方面，本发明提供以上所述的重组需钠弧菌在生产羟基酪醇中的应用。
第四方面，本发明提供一种生产羟基酪醇的方法，所述方法包括培养以上所述的重组需钠弧菌的步骤。
具体地，所述方法包括：培养以上所述的重组需钠弧菌，以诱导剂诱导4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶的表达，收集菌体并利用收集的菌体以酪醇为底物全细胞催化生产羟基酪醇。
优选地，所述诱导为在OD600为0.3～0.8时，以阿拉伯糖诱导4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶的表达。
进一步优选地，所述诱导为在32～37℃条件下进行；诱导剂为0.1～1％的L-阿拉伯糖。
优选地，在诱导4～24h(优选为4～8h)时收集菌体，将收集的菌体以催化反应液重悬，于16～37℃(优选为30～32℃)进行全细胞催化。
其中，所述催化反应液包括如下组分：磷酸氢二钠5～8g/L、磷酸二氢钾2～4g/L、氯化钠0.3～0.8g/L、氯化铵0.8～1.2g/L、甲酸钠2～2.5g/L、酪醇2～8g/L。
对于全细胞催化的时间，本发明没有特别限制，可通过监测羟基酪醇的产量确定结束催化的时间。
在本发明的一些实施方式中，全细胞催化2～48h。
本发明的有益效果在于：本发明提供了需钠弧菌在生产羟基酪醇中的新用途。经改造获得的需钠弧菌工程菌可用于全细胞催化合成羟基酪醇，并能够高效促进羟基酪醇的积累，也可作为底盘菌用于构建羟基酪醇生产菌株。此外，相比大肠杆菌，需钠弧菌的生长速度更快，可以缩短发酵周期，提高生产速率；其内毒素水平低，更适合用于生产医药、营养、食品领域的相关天然化合产物的生产。
本发明提供的基于需钠弧菌生产羟基酪醇的方法，在保证羟基酪醇产量的同时可以缩短羟基酪醇的生产周期，提高羟基酪醇的得率，降低下游内毒素的去除难度。
附图说明
图1为本发明实施例2中重组需钠弧菌Vmax-HT和重组大肠杆菌E.coli-HT的生长对比图。
图2为本发明实施例3中重组需钠弧菌Vmax-HT和重组大肠杆菌E.coli-HT的羟基酪醇降解能力对比图。
图3为本发明实施例4中重组需钠弧菌Vmax-HT和重组大肠杆菌E.coli-HT的羟基酪醇合成能力对比图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1构建重组需钠弧菌Vmax-HT和大肠杆菌E.coli-HT
1、从NCBI数据库中下载目标基因HpaB、HpaC、FDH的序列并进行基因合成，其中基因HpaB(NCBI登录号：WP_000801472.1)、HpaC(NCBI登录号：WP_001175451.1)来源于大肠杆菌，基因FDH(NCBI登录号：WP_009957650.1)来源于胞内分枝杆菌。
2、将合成基因克隆扩增，使用Gibson组装方法将片段插入质粒pETDuet中SacI和HindIII之间，得到质粒pETDuet-HpaB-HpaC-FDH。
3、将阿拉伯糖启动子序列(SEQ ID NO.1)克隆扩增，将质粒pETDuet-HpaB-HpaC-FDH中除T7启动子之外部分进行克隆扩增，将扩增得到的两个片通过Gibson组装方法进行拼接，得到质粒pETDuet-pBAD-HpaB-HpaC-FDH。
4、将重组质粒pETDuet-pBAD-HpaB-HpaC-FDH导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到相应的重组菌株E.coli-HT，其中用于转化的大肠杆菌BL21(DE3)的感受态为商用感受态(购自TransGen Biotech Co.,Ltd)。
5、将重组质粒pETDuet-pBAD-HpaB-HpaC-FDH导入需钠弧菌Vmax中，得到相应的重组菌株Vmax-HT，其中用于转化的需钠弧菌Vmax感受态为商用感受态(购自Codex DNA,Inc)。
实施例2重组需钠弧菌Vmax-HT和重组大肠杆菌E.coli-HT的生长情况分析
1、将实施例1构建的重组菌株Vmax-HT、E.coli-HT从-80℃甘油管取出，在LB固体平板进行划线，37℃过夜培养。随后从平板挑单克隆分别接至3ml LBv2(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠11.92g/L、氯化钾0.313g/L、氯化镁2.203g/L)和LB(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L)液体培养基中，37℃，220rpm培养活化。
2、将重组菌株Vmax-HT、E.coli-HT活化后的菌液分别接至20mL LBv2和LB培养基中，控制初始OD600为0.01，37℃，220rpm，150mL摇瓶中培养。随后在不同时间点取样，测定OD600值。
利用不同时间点获得的OD600值绘制生长曲线。
结果如图1所示：在生长初期(0～7小时)，重组需钠弧菌Vmax-HT相比菌株E.coli-HT有明显的生长优势，同时在整个24小时测定周期内始终有更高的生物量，表明相比菌株E.coli-HT，重组需钠弧菌Vmax-HT具有更快的生长速率和更高的生物量，在工业应用中可以缩短发酵周期。
实施例3重组需钠弧菌Vmax-HT和重组大肠杆菌E.coli-HT的羟基酪醇降解能力分析
1、将重组菌株Vmax-HT、E.coli-HT按照实施例2所述的方法进行活化。
2、将重组菌株Vmax-HT、E.coli-HT活化后的菌液按1％分别接种至40mL LBv2和LB培养基中，37℃，220rpm培养16小时，测定OD600值。
3、根据菌液OD600值进行计算，各取适量菌液4000rpm离心10min收集菌体，使两种菌株具有相等的菌体量，用20mL反应体系重悬菌体使最终OD600均等于4，以无细胞的反应体系作为对照，30℃220rpm进行孵育。上述反应体系包括：磷酸氢二钠6.8g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钠0.5g/L、氯化铵1g/L、羟基酪醇0.67g/L。
4、不同时间点取样测定其中羟基酪醇的剩余量。
结果如图2所示：随着孵育时间的延长，重组需钠弧菌、大肠杆菌以及无细胞实验组中羟基酪醇含量均表现出下降的情况，其中重组大肠杆菌实验组与无细胞条件下羟基酪醇降解水平相当，而重组需钠弧菌表现出明显更强的羟基酪醇降解能力。
实施例4重组需钠弧菌Vmax-HT和重组大肠杆菌E.coli-HT的羟基酪醇合成能力检测
1、将重组菌株Vmax-HT、E.coli-HT按照实施例2所述的方法进行活化。
2、将重组菌株Vmax-HT和E.coli-HT活化后的菌液按1％分别接种至20mL LBv2和LB培养基中，37℃，220rpm，250mL摇瓶中培养。待两个重组菌株OD600达到0.5时，向培养基中加入终浓度为0.5％的L-阿拉伯糖进行诱导。
3、取诱导6小时后的菌液4000rpm离心10min收集菌体，用20mL反应体系重悬菌体，于30℃、220rpm进行全细胞催化，其中，反应体系包括：磷酸氢二钠6.8g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钠0.5g/L、氯化铵1g/L、甲酸钠2.04g/L、酪醇4.145g/L。
4、全细胞催化4小时后取样测定羟基酪醇的产量。
结果如表1和图3所示：重组需钠弧菌Vmax-HT相比菌株E.coli-HT具有更高的羟基酪醇产量，同时所需的发酵周期更短，重组需钠弧菌Vmax-HT具有更高的羟基酪醇产率。
表1重组需钠弧菌Vmax-HT和重组大肠杆菌E.coli-HT合成羟基酪醇的产量、周期及产率比较
Figure BDA0003691418800000081
上述实施例的结果表明，重组需钠弧菌Vmax-HT相比现有重组大肠杆菌E.coli-HT虽然具有更强的羟基酪醇降解能力，但是，重组需钠弧菌Vmax-HT的羟基酪醇合成能力、产量和生产速率却明显强于大肠杆菌E.coli-HT，同时，重组需钠弧菌Vmax-HT具有更快的生长速度且内毒素水平低，因此，需钠弧菌具有潜力成为合成羟基酪醇的更优的底盘菌。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 深圳蓝晶生物科技有限公司
<120> 一种生产羟基酪醇的重组需钠弧菌及其应用
<130> KHP221116544.6
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1280
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttatgacaac ttgacggcta catcattcac tttttcttca caaccggcac ggaactcgct 60
cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac ccgcgagaaa tagagttgat cgtcaaaacc 120
aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca gcttcgcctg 180
gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct ggcggaaaag 240
atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga tatcaaaatt 300
gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg acaagcctcg cgtacccgat tatccatcgg 360
tggatggagc gactcgttaa tcgcttccat gcgccgcagt aacaattgct caagcagatt 420
tatcgccagc agctccgaat agcgcccttc cccttgcccg gcgttaatga tttgcccaaa 480
caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc atccgggcga aagaaccccg tattggcaaa 540
tattgacggc cagttaagcc attcatgcca gtaggcgcgc ggacgaaagt aaacccactg 600
gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg accgtagtga tgaatctctc ctggcgggaa 660
cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa ttctcgtccc tgatttttca ccaccccctg 720
accgcgaatg gtgagattga gaatataacc tttcattccc agcggtcggt cgataaaaaa 780
atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt taaacccgcc accagatggg cattaaacga 840
gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc ttcagccata cttttcatac tcccgccatt 900
cagagaagaa accaattgtc catattgcat cagacattgc cgtcactgcg tcttttactg 960
gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc gcttattaaa agcattctgt aacaaagcgg 1020
gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa aagtgtctat aatcacggca gaaaagtcca 1080
cattgattat ttgcacggcg tcacactttg ctatgccata gcatttttat ccataagatt 1140
agcggattct acctgacgct ttttatcgca actctctact gtttctccat agggagtcca 1200
caacggtttc cctctagaaa taattttgga attcaaaaga tcttttaaga aggagatata 1260
catatgggca gcagccatca 1280

Claims (7)

1.需钠弧菌在生产羟基酪醇中的应用，其特征在于，所述应用包括：将包含4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶的编码基因的核酸分子导入需钠弧菌中，得到重组需钠弧菌，利用所述重组需钠弧菌生产羟基酪醇；
所述4-羟基苯乙酸3-单加氧酶为WP_000801472.1和WP_001175451.1，所述甲酸脱氢酶为WP_009957650.1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生产为以酪醇为底物，利用所述重组需钠弧菌进行全细胞催化。
3.一种生产羟基酪醇的方法，其特征在于，所述方法包括培养重组需钠弧菌的步骤；
所述重组需钠弧菌表达4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶；
所述4-羟基苯乙酸3-单加氧酶为WP_000801472.1和WP_001175451.1，所述甲酸脱氢酶为WP_009957650.1。
4.根据权利要求3所述的生产羟基酪醇的方法，其特征在于，所述4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶的表达以阿拉伯糖启动子启动转录。
5.根据权利要求3或4所述的生产羟基酪醇的方法，其特征在于，所述方法包括：培养所述重组需钠弧菌，以诱导剂诱导4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶的表达，收集菌体并利用收集的菌体以酪醇为底物全细胞催化生产羟基酪醇。
6.根据权利要求5所述的生产羟基酪醇的方法，其特征在于，所述诱导为在OD600为0.3～0.8时，以阿拉伯糖诱导4-羟基苯乙酸3-单加氧酶和甲酸脱氢酶的表达。
7.根据权利要求6所述的生产羟基酪醇的方法，其特征在于，在诱导4～24h时收集菌体，将收集的菌体以催化反应液重悬，于16～37℃进行全细胞催化；
所述催化反应液包括如下组分：磷酸氢二钠5～8g/L，磷酸二氢钾2～4g/L，氯化钠0.3～0.8g/L，氯化铵0.8～1.2g/L，甲酸钠2～2.5g/L，酪醇2～8g/L。
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