CN113667686B

CN113667686B - 一种高效利用葡萄糖合成肌醇的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN113667686B
Application number: CN202010407618.5A
Authority: CN
Inventors: 胡美荣; 王雷; 尤然; 张莎莎; 陶勇
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2020-05-14
Filing date: 2020-05-14
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2040-05-14
Also published as: CN113667686A

Abstract

本发明公开了一种高效利用葡萄糖合成肌醇的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。本发明所提供的产肌醇的大肠杆菌重组菌构建方法包括：将肌醇‑3‑磷酸合成酶基因和肌醇单磷酸酶基因导入宿主菌，得到产肌醇的大肠杆菌重组菌；所述宿主菌为野生型大肠杆菌或突变型大肠杆菌；所述突变型大肠杆菌为将突变型大肠杆菌SG104基因组中的葡萄糖‑6‑磷酸异构酶基因或磷酸葡萄糖变位酶基因或葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶基因敲除后得到的突变型大肠杆菌。利用本发明所构建的产肌醇的大肠杆菌重组菌可以高效利用葡萄糖合成肌醇，肌醇产量最高可达375mM(67.5g/L)。本发明对于肌醇生产来说，将产生巨大的经济效益，具有重大的推广应用价值。

Description

一种高效利用葡萄糖合成肌醇的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效利用葡萄糖合成肌醇的大肠杆菌重组菌及其构建方法，以及该菌株在生产肌醇中的应用。

背景技术

肌醇(inositol)又叫环己六醇，是一种饱和环状多元醇。肌醇是多种细胞生命活动必需的物质，广泛存在于植物、动物及微生物中。肌醇属于水溶性的B组维生素，在食品、医药、化妆品、饲料等行业具有十分广泛的应用。(1)作为动物和人体内新陈代谢活动的营养剂，肌醇已经被添加在很多食品中，例如功能性饮料、婴幼儿奶粉等；(2)肌醇参与体内的新陈代谢，相关实验证明，肌醇可用于治疗糖尿病、脂肪肝、胆固醇等多种疾病；(3)在化妆品中添加肌醇，能够提高脂肪的消耗速率，起到减肥降脂的效果；(4)肌醇也是动物体内所必需的物质，作为饲料添加剂，肌醇能够明显促进甲壳类或鱼类等水产动物的生长速度。

目前，肌醇的生产方法主要包括植酸盐水解法、化学合成法。水解法通常以米糠或玉米糠为原料，从中提取植酸盐(肌醇六磷酸)，然后酸水解得到肌醇。该方法存在反应条件苛刻、原料利用率低、副产物多、对设备要求严格、环境污染等缺点。而化学合成法也存在底物和催化剂成本高、产率低、分离纯化困难、产品性能差等缺陷。因此，本领域迫切需要开发一种新的高效生产肌醇的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效利用葡萄糖合成肌醇的大肠杆菌重组菌及其应用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种构建产肌醇的大肠杆菌重组菌的方法。

本发明提供的构建产肌醇的大肠杆菌重组菌的方法包括如下步骤：将肌醇-3-磷酸合成酶基因和肌醇单磷酸酶基因导入宿主菌，得到产肌醇的大肠杆菌重组菌；

所述宿主菌为突变型大肠杆菌或者野生型大肠杆菌；

所述突变型大肠杆菌为下述A1)至A4)的任一种：

A1)突变型大肠杆菌SG104；突变型大肠杆菌SG104基因型为E.coli BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acs；

A2)将A1)所述突变型大肠杆菌SG104基因组中的葡萄糖-6-磷酸异构酶基因(pgi)敲除后得到的突变型大肠杆菌INS01；

A3)将A1)所述突变型大肠杆菌SG104基因组中的磷酸葡萄糖变位酶基因(pgm)敲除后得到的突变型大肠杆菌INS02；

A4)将A1)所述突变型大肠杆菌SG104基因组中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(zwf)敲除后得到的突变型大肠杆菌INS03。

进一步的，所述肌醇-3-磷酸合成酶基因来源于布鲁氏锥虫(Trypanosomabrucei)，编码下述B1)或B2)所示的蛋白质：

B1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

B2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有肌醇-3-磷酸合成酶活性的由B1)衍生的蛋白质。

所述肌醇-3-磷酸合成酶基因为下述b1)或b2)所示的DNA分子：

b1)序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)与b1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述肌醇-3-磷酸合成酶的DNA分子。

所述肌醇单磷酸酶基因来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，编码下述C1)或C2)所示的蛋白质：

C1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

C2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有肌醇单磷酸酶活性的由C1)衍生的蛋白质。

所述肌醇单磷酸酶基因为下述c1)或c2)所示的DNA分子：

c1)序列表中序列4所示的DNA分子；

c2)与c1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述肌醇单磷酸酶的DNA分子。

所述葡萄糖-6-磷酸异构酶基因编码下述D1)或D2)所示的蛋白质：

D1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

D2)由序列表中序列5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有葡萄糖-6-磷酸异构酶活性的由D1)衍生的蛋白质；

所述葡萄糖-6-磷酸异构酶基因为下述d1)或d2)所示的DNA分子：

d1)序列表中序列6所示的DNA分子；

d2)与d1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述葡萄糖-6-磷酸异构酶的DNA分子。

所述磷酸葡萄糖变位酶基因编码下述E1)或E2)所示的蛋白质：

E1)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

E2)由序列表中序列7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有磷酸葡萄糖变位酶活性的由E1)衍生的蛋白质；

所述磷酸葡萄糖变位酶基因为下述e1)或e2)所示的DNA分子：

e1)序列表中序列8所示的DNA分子；

e2)与e1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述磷酸葡萄糖变位酶的DNA分子。

所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因编码下述F1)或F2)所示的蛋白质：

F1)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

F2)由序列表中序列9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的由F1)衍生的蛋白质；

所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因为下述f1)或f2)所示的DNA分子：

f1)序列表中序列10所示的DNA分子；

f2)与f1)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的DNA分子。

更进一步的，所述大肠杆菌重组菌为下述X1)至X5)的任一种：

X1)所述大肠杆菌重组菌为将重组载体pINS导入野生型大肠杆菌BW25113所得的重组菌；

X2)所述大肠杆菌重组菌为将重组载体pINS导入A1)所述突变型大肠杆菌所得的重组菌；

X3)所述大肠杆菌重组菌为将重组载体pINS导入A2)所述突变型大肠杆菌所得的重组菌；

X4)所述大肠杆菌重组菌为将重组载体pINS导入A3)所述突变型大肠杆菌所得的重组菌；

X5)所述大肠杆菌重组菌为将重组载体pINS导入A4)所述突变型大肠杆菌所得的重组菌；

所述重组载体pINS为将肌醇-3-磷酸合成酶基因和肌醇单磷酸酶基因插入表达载体后得到的载体。

在本发明的具体实施例中，所述表达载体具体为pBAD/HisB。所述野生型大肠杆菌具体为大肠杆菌BW25113。

为了实现上述目的，本发明还提供了按照上述方法构建得到的产肌醇的大肠杆菌重组菌。

上述产肌醇的大肠杆菌重组菌在生产肌醇中的应用也属于本发明的保护范围。

为了实现上述目的，本发明最后提供了一种生产肌醇的方法。

本发明提供的生产肌醇包括如下步骤：将上述产肌醇的大肠杆菌重组菌经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后重组菌，用所述诱导后重组菌催化葡萄糖反应，得到肌醇。

进一步的，所述阿拉伯糖诱导培养是在含有L-阿拉伯糖且其终浓度为0.2g/100mL的培养基中进行的，所述诱导培养的温度为37℃，所述诱导培养的时间为12-16小时(如12小时)。

更进一步地，用所述诱导后重组菌催化葡萄糖反应是在含有葡糖糖的转化底物液中进行生物转化反应。所述葡萄糖在所述转化底物液中的浓度为50-200mM。所述生物转化反应的温度为37℃，所述生物转化反应的时间为12-25小时。

在本发明的一个具体实施例中，所述生物转化反应在试管中进行，所述葡萄糖在所述转化底物液中的浓度为50mM；所述生物转化反应的条件为37℃，220rpm反应12小时。

在本发明的另一个具体实施例中，所述生物转化反应在2L发酵罐中进行，所述葡萄糖在初始转化底物液中的浓度为200mM，且在反应4.5h和11h时分别补加葡萄糖，使葡萄糖在转化浓度为200mM；所述生物转化反应的条件为37℃，转速500rpm～1100rpm，溶解氧30～50％反应25小时。

本发明通过在大肠杆菌突变体中引入外源的肌醇合成相关酶的基因：肌醇-3-磷酸合成酶基因和肌醇单磷酸酶基因，构建得到产肌醇的大肠杆菌重组菌。实验证明，本发明所构建的产肌醇的大肠杆菌重组菌的肌醇产量最高可达375mM(67.5g/L)。

附图说明

图1为肌醇的结构示意图。

图2为肌醇、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸的液相图谱。注：葡萄糖-6-磷酸(G-6P)的保留时间为7.621min，葡萄糖(glucose)的保留时间为10.633min，肌醇(inositol)的保留时间为11.188min。

图3为大肠杆菌重组菌MI03利用葡萄糖合成肌醇的时间曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中，对于同一条件参数下的色谱图来说，待测样本中与标准品保留时间相同(±0.1min)的峰可认定为目标峰。

下述实施例中的大肠杆菌BW25113是NBRP E.coli strain(https://shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/resource/strainGeneMutant/list)的产品，产品目录号为ME9062。

下述实施例中的Trans1-T1感受态细胞是北京全式金生物的产品，产品目录号为CD501。

下述实施例中的载体pBAD/HisB是Invitrogen公司的产品，产品目录号为V430-01。

下述实施例中的肌醇是Aladdin公司的产品，产品目录号为I108336。

下述实施例中的葡萄糖-6-磷酸是Aladdin公司的产品，产品目录号为G111871。

下述实施例中的葡萄糖是Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为G8270。

下述实施例中的供体菌BW25113Δpgi::Kan(编号为JW8935)、BW25113Δpgm::Kan(编号为JW0675)和BW25113Δzwf::Kan(NIG编号为JW1841)均来源于国立遗传学研究所(NIG，Japan)，并记载于文献“Baba T,Ara T,Hasegawa M,Takai Y,Okumura Y,Baba M,Datsenko KA,Tomita M,Wanner BL,Mori H:Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Mol Syst Biol2006,2:2006.0008.”中，公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的大肠杆菌突变体SG104记载于本实验室已发表专利“申请公布号CN110734887A”中，公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。大肠杆菌突变体SG104是利用CRISPR技术(JiangY,Chen B,Duan C,Sun B,Yang J,Yang S:Multigene editing in the Escherichia coligenome via the CRISPR-Cas9 system.Appl Environ Microbiol 2015,81:2506-2514.)将大肠杆菌BW25113的D-葡萄糖PTS通透酶基因(ptsG)替换为葡糖激酶基因(glk)，且将丙酮酸氧化酶基因(poxB)替换为乙酰辅酶A合成酶基因(acs)，且将半乳糖操纵子的调节子基因(galR)替换为运动单胞菌来源的D-乳糖转运蛋白基因(zglf)后得到的大肠杆菌突变体，其基因型为BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acs。

下述实施例中的野生型P1噬菌体菌种记载于文献“Thomason LC,Costantino N,Court DL:E.coli genome manipulation by P1 transduction.Curr Protoc Mol Biol2007,Chapter 1:Unit 1.17.”中，公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的大肠杆菌突变体的基因型如表1所示。

表1

菌株	基因型	来源
			BW25113	rrnBT14ΔlacZWJ16 hsdR514ΔaraBAD_AH33ΔrhaBAD_LD78	购买
SG104	BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acs	实验室保存
			INS01	SG104Δpgi	本发明构建
INS02	SG104Δpgm	本发明构建
			INS03	SG104Δzwf	本发明构建

实施例1、共表达TbIPS和EcIMP的重组载体pINS的构建

1、pIPS基因片段的获得

以包含序列1的人工合成序列(由南京金斯瑞生物科技公司合成)为模板，采用引物P1和P2进行PCR扩增，得到PCR产物，即肌醇-3-磷酸合成酶TbIPS的编码基因序列(序列表中序列1所示)。引物序列如下：

P1：5’-GCGCGGCAGCCTCGAGATGCCGGCAGTGCGTACGAA-3’；

P2：5’-CCGAGCTCACCACTAGTTTAGCTGCCTACGCCACGC-3’。

通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，PCR产物大小约为1600bp，与目的片段相符，命名为pIPS。将pIPS基因片段进行胶回收。

2、pBAD/HisB-TbIPS重组载体的构建

将载体pBAD/HisB用XhoI和SpeI双酶切后，回收载体片段(约3500bp)；将步骤1回收的pIPS基因片段与回收的载体片段用Gibson方法(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,3rd,Smith HO:Enzymatic assembly of DNA molecules up toseveral hundred kilobases.Nat Methods 2009,6:343-345.)进行连接，得到连接产物。将连接产物转化Trans1-T1感受态细胞，涂布含链霉素的LB固体平板。37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，进行测序验证，测序正确的载体命名为pBAD/HisB-TbIPS。

3、pIMP基因片段

以包含序列4的人工合成序列(由南京金斯瑞生物科技公司合成)为模板，采用引物P3和P4进行PCR扩增，得到PCR产物，即肌醇单磷酸酶EcIMP的编码基因序列(序列表中序列4所示)。引物序列如下：

P3：5’-GCGCGGCAGCCTCGAGATGCATCCGATGCTGAACATCGCC-3’；

P4：5’-CCGAGCTCACCACTAGTTTAACGCTTCAGAGCGTCGC-3’。

通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，PCR产物大小约为850bp，与目的片段相符，命名为pIMP。将pIMP基因片段进行胶回收。

4、pINS重组载体的构建

将步骤2获得的pBAD/HisB-TbIPS载体用SpeI和PstI双酶切后，回收载体片段(约5000bp)；将步骤3回收的pIMP基因片段与回收的载体片段用Gibson方法进行连接，得到连接产物。将连接产物转化Trans1-T1感受态细胞，涂布含链霉素的LB固体平板。37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，进行测序验证，将测序正确的载体命名为pINS。

实施例2、大肠杆菌突变体INS01、INS02和INS03的构建

大肠杆菌突变体INS01、INS02和INS03具体采用P1噬菌体介导的转染法进行构建。以INS01为例，具体构建步骤如下：

1、供体菌的P1转染液的获得

将供体菌BW25113Δpgi::Kan接种于LB培养基(溶剂为水，溶质及其浓度如下：10mM MgCl₂、5mM CaCl₂和0.1g/100mL葡萄糖)中，培养大约1h，加入野生型P1噬菌体，培养1～3h。加几滴氯仿再摇几分钟，离心取上清得到噬菌体P1virΔpgi。

2、利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除菌INS01::Kan。

取过夜培养SG104(受体菌)1.5mL，6000rpm离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液(溶剂为水，溶质及其浓度如下：10mM CaCl₂，5mM MgSO₄)重悬，然后将100μl噬菌体P1virΔpgi与100μl SG104细胞悬浮液混合，室温孵育30分钟，添加200μl1M的柠檬酸钠和1mL LB培养基，37℃继续培养大约1h，离心收集菌体，用100μl LB培养基重悬后，涂布在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上，筛选阳性克隆，即得到SG104Δpgi::Kan。

3、消除卡那霉素抗性

利用FIp重组酶的质粒pCP20(CIontech)化学转化SG104Δpgi::Kan，将SG104Δpgi::Kan的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，得到大肠杆菌突变体SG104Δpgi(简称INS01)。

按照步骤1-3中的方法，以BW25113Δpgm::Kan(编号为JW0675)为供体菌，SG104为受体菌，得到大肠杆菌突变体SG104Δpgm(简称INS02)。

按照步骤1-3中的方法，以BW25113Δzwf::Kan(NIG编号为JW1841)为供体菌，SG104为受体菌，得到大肠杆菌突变体SG104Δzwf(简称INS03)。

大肠杆菌突变体SG104Δpgi(简称INS01)为将突变型大肠杆菌SG104基因组中葡萄糖-6-磷酸异构酶基因(pgi基因)敲除后得到的突变型大肠杆菌。

大肠杆菌突变体SG104Δpgm(简称INS02)为将突变型大肠杆菌SG104基因组中磷酸葡萄糖变位酶基因(pgm基因)敲除后得到的突变型大肠杆菌。

大肠杆菌突变体SG104Δzwf(简称INS03)为将突变型大肠杆菌SG104基因组中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(zwf基因)敲除后得到的突变型大肠杆菌INS03。

实施例3、大肠杆菌重组菌MI01，MI02，MI03，MI04，MI05的构建

将实施例1构建的表达载体pINS用化学转化法转化大肠杆菌BW25113及大肠杆菌突变体SG104、INS01、INS02和INS03，在含链霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选阳性克隆，即得到相应的重组菌株。其中，将表达载体pINS转化大肠杆菌BW25113得到的重组菌株命名为MI01；将表达载体pINS转化大肠杆菌突变体SG104得到的重组菌株命名为MI02；将表达载体pINS转化大肠杆菌突变体INS01得到的重组菌株命名为MI03；将表达载体pINS转化大肠杆菌突变体INS02得到的重组菌株命名为MI04；将表达载体pINS转化大肠杆菌突变体INS03得到的重组菌株命名为MI05。

实施例4、大肠杆菌重组菌的自诱导培养及全细胞催化生成肌醇

一、大肠杆菌重组菌的自诱导培养

以实施例3中获得的5株大肠杆菌重组菌：MI01、MI02、MI03、MI04和MI05中的任一菌株单独为重组菌，均同时进行如下实验：将重组菌(产肌醇的基因工程菌)划线到含有质量百分比浓度为1.5g/100mL的琼脂LB平板上(含50μg/mL的链霉素)，37℃培养12h。挑取单克隆，接种到含有50μg/mL的链霉素的液体LB培养基中，37℃振荡培养10～12h，转速为220rpm，得到过夜培养物；将过夜培养物以体积百分比为1％的接种量接种至自诱导培养基ZYM中，37℃振荡培养，转速220rpm，培养时间为12h，得到自诱导培养后的大肠杆菌重组菌。

自诱导培养基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E(以下均为质量百分比浓度，即％表示g/100mL)：

A.ZY(溶剂为水)：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；

B.50×M(溶剂为水)：1.25M Na₂HPO₄，1.25M KH₂PO₄，2.5M NH₄Cl和0.25M Na₂SO₄；

C.50×5052(溶剂为水)：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％L-阿拉伯糖；

D.500×MgSO₄(溶剂为水)：1M MgSO₄；

E.1000×微量元素(溶剂为水)：50mM FeCl₃，20mM CaCl₂，10mM MnCl₂，10mMZnSO₄，2mM CoCl₂、2mM NiCl₂、2mM Na₂MoO₄、2mM Na₂SeO₃和2mM H₃BO₃。

二、全细胞催化生成肌醇

将步骤一获得的自诱导培养后的大肠杆菌重组菌在4℃，4000rpm条件下离心10min后，重悬于5mL转化底物液(转化底物液由1×M9盐缓冲液和葡萄糖组成。1×M9盐缓冲液由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度如下：12.8g/L Na₂HPO₄·7H₂O，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/L NH₄Cl。葡萄糖在转化底物液中的浓度为50mM)中，使其最终OD_600nm值为30，然后置于25×200(mm)(外径×长度)规格的试管中，于37℃，220rpm反应12h，得到转化液。将转化液用蒸馏水稀释10倍，用HPLC检测肌醇浓度和残余的葡萄糖浓度，根据如下公式(公式1)计算转化率。

色谱条件：Bio-Rad Aminex HPX-87H Column(300×7.8mm，9μm)；流动相：5mMH₂SO₄，流速：0.5mL/min，柱温45℃；进样量10μL；示差折光检测器(RID)。葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸和肌醇标准品的HPLC图谱如图2所示。

大肠杆菌重组菌转化液中的肌醇含量及转化率如表2所示。

表2

重组菌	肌醇产量(mM)	转化率(％)
			MI01	7.5mM	15％
MI02	9.8mM	19.6％
			MI03	33.5mM	67％
MI04	12.5mM	25％
			MI05	15.4mM	30.8％

结果表明：5株大肠杆菌重组菌中肌醇生产能力最好的是MI03，说明组合性状ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acsΔpgi有利于肌醇的生产，能够提高全细胞催化葡萄糖生产肌醇的效率。

实施例5、大肠杆菌重组菌MI03高效利用葡萄糖合成肌醇

将实施例4步骤一中得到的诱导后的大肠杆菌重组菌MI03于4℃，4000rpm离心10min，收集一定量的菌体，然后重悬于1L的1×M9盐缓冲液中，使其最终OD_600nm值为60，然后置于2L发酵罐(上海百伦生物科技有限公司，产品目录号BLBIO-2GC-2)，于37℃条件下反应25h，通过调节转速(500rpm～1100rpm)控制溶解氧范围在30～50％。底物葡萄糖通过分批补料的方式加入，具体的初始浓度为200mM，然后在反应4.5h和11h时分别加入200mM葡萄糖直至反应到25h，得到转化液。按照实施例4步骤二中的方法检测转化液中的肌醇含量及转化率，并绘制大肠杆菌重组菌MI03利用葡萄糖合成肌醇的时间曲线。

结果表明：大肠杆菌重组菌MI03最终消耗580mM葡萄糖，生成375mM(67.5g/L)肌醇，转化率为65％。生物转化反应中葡萄糖(glucose)和肌醇(inositol)的浓度(concentration)随时间(time)的变化曲线如图3所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种高效利用葡萄糖合成肌醇的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1587

<212> DNA

<213> Trypanosoma brucei

<400> 1

atgccggcag tgcgtacgaa aagcggtcac ggcgtggaat ataccgacga agctattact 60

gctacttaca gctataacac cacccgcgtc gaaaaggagg ctaacggcga tgtaactgta 120

caaccaatcc agctgcacct gaaatttcgt acccagcgta aggtgcaacg taccggtgta 180

atgctgatcg gctggggtgg taacaacggc accacagtta cggctgcgct gatggcacat 240

aagcacggcg tctcgtggcg tacaaaaacc ggtactaagc agccggacta tctggggtct 300

attactcagt cttcgactat gtctgtgggt ctgacctctg agatggaaga agtgttcgtg 360

ccgatgaaag cattagtgcc gatgattaac ccggctgaac tggtgattgg tggctgggat 420

tgttccggca tgaacattgc ggatgctatg cgccgtgctc aggttctgga tgtgaccctt 480

caggacgcac tgtacaacta cctgaaagac atgcacccac ttcctgccgc gtttgatctg 540

gatttcgtcg cagaaaacca gctgtcccgt gcggacaaca tcatgcagac gaaaaacaag 600

tgggaatcgg tagagcagct gcgtgccgat atccgcaact ttcgcgagaa aaactctctg 660

gaagaagtta tcgtactgtg gaccgcgaac acggaacgct tctcggagca catcaccggt 720

gtccacgaca ccgccgatca cctgatcgat gcgattcgcc gcaacgaaaa tgaaatcgct 780

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<400> 10

atggcggtaa cgcaaacagc ccaggcctgt gacctggtca ttttcggcgc gaaaggcgac 60

cttgcgcgtc gtaaattgct gccttccctg tatcaactgg aaaaagccgg tcagctcaac 120

ccggacaccc ggattatcgg cgtagggcgt gctgactggg ataaagcggc atataccaaa 180

gttgtccgcg aggcgctcga aactttcatg aaagaaacca ttgatgaagg tttatgggac 240

accctgagtg cacgtctgga tttttgtaat ctcgatgtca atgacactgc tgcattcagc 300

cgtctcggcg cgatgctgga tcaaaaaaat cgtatcacca ttaactactt tgccatgccg 360

cccagcactt ttggcgcaat ttgcaaaggg cttggcgagg caaaactgaa tgctaaaccg 420

gcacgcgtag tcatggagaa accgctgggg acgtcgctgg cgacctcgca ggaaatcaat 480

gatcaggttg gcgaatactt cgaggagtgc caggtttacc gtatcgacca ctatcttggt 540

aaagaaacgg tgctgaacct gttggcgctg cgttttgcta actccctgtt tgtgaataac 600

tgggacaatc gcaccattga tcatgttgag attaccgtgg cagaagaagt ggggatcgaa 660

gggcgctggg gctattttga taaagccggt cagatgcgcg acatgatcca gaaccacctg 720

ctgcaaattc tttgcatgat tgcgatgtct ccgccgtctg acctgagcgc agacagcatc 780

cgcgatgaaa aagtgaaagt actgaagtct ctgcgccgca tcgaccgctc caacgtacgc 840

gaaaaaaccg tacgcgggca atatactgcg ggcttcgccc agggcaaaaa agtgccggga 900

tatctggaag aagagggcgc gaacaagagc agcaatacag aaactttcgt ggcgatccgc 960

gtcgacattg ataactggcg ctgggccggt gtgccattct acctgcgtac tggtaaacgt 1020

ctgccgacca aatgttctga agtcgtggtc tatttcaaaa cacctgaact gaatctgttt 1080

aaagaatcgt ggcaggatct gccgcagaat aaactgacta tccgtctgca acctgatgaa 1140

ggcgtggata tccaggtact gaataaagtt cctggccttg accacaaaca taacctgcaa 1200

atcaccaagc tggatctgag ctattcagaa acctttaatc agacgcatct ggcggatgcc 1260

tatgaacgtt tgctgctgga aaccatgcgt ggtattcagg cactgtttgt acgtcgcgac 1320

gaagtggaag aagcctggaa atgggtagac tccattactg aggcgtgggc gatggacaat 1380

gatgcgccga aaccgtatca ggccggaacc tggggacccg ttgcctcggt ggcgatgatt 1440

acccgtgatg gtcgttcctg gaatgagttt gagtaa 1476

Claims

1.一种构建产肌醇的大肠杆菌重组菌的方法，包括如下步骤：将肌醇-3-磷酸合成酶基因和肌醇单磷酸酶基因导入宿主菌，得到产肌醇的大肠杆菌重组菌；所述宿主菌为将突变型大肠杆菌SG104基因组中的葡萄糖-6-磷酸异构酶基因敲除后得到的突变型大肠杆菌；

所述肌醇-3-磷酸合成酶基因编码序列表中序列2所示的蛋白质；

所述肌醇单磷酸酶基因编码序列表中序列3所示的蛋白质；

所述突变型大肠杆菌SG104为将大肠杆菌BW25113基因组中的D-葡萄糖PTS通透酶基因（ptsG）替换为葡糖激酶基因（glk），且将丙酮酸氧化酶基因（poxB）替换为乙酰辅酶A合成酶基因（acs），且将半乳糖操纵子的调节子基因（galR）替换为运动单胞菌来源的D-乳糖转运蛋白基因（zglf）后得到的大肠杆菌突变体，其基因型为BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acs。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述肌醇-3-磷酸合成酶基因为下述b1）或b2）所示的DNA分子：

b1）序列表中序列1所示的DNA分子；

b2）与b1）所示的DNA分子具有90%以上同一性且编码所述肌醇-3-磷酸合成酶的DNA分子。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述肌醇单磷酸酶基因为下述c1）或c2）所示的DNA分子：

c1）序列表中序列4所示的DNA分子；

c2）与c1）所示的DNA分子具有90%以上同一性且编码所述肌醇单磷酸酶的DNA分子。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖-6-磷酸异构酶基因编码序列表中序列5所示的蛋白质。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖-6-磷酸异构酶基因为下述d1）或d2）所示的DNA分子：

d1）序列表中序列6所示的DNA分子；

d2）与d1）所示的DNA分子具有90%以上同一性且编码所述葡萄糖-6-磷酸异构酶的DNA分子。

6.按照权利要求1-5任一所述的方法构建得到的产肌醇的大肠杆菌重组菌。

7.权利要求6所述的产肌醇的大肠杆菌重组菌在生产肌醇中的应用。

8.一种生产肌醇的方法，包括如下步骤：将权利要求6所述的产肌醇的大肠杆菌重组菌经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后重组菌，用所述诱导后重组菌催化葡萄糖反应，得到肌醇。