CN110734887A

CN110734887A - 产n-乙酰谷氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN110734887A
Application number: CN201810789222.4A
Authority: CN
Inventors: 林白雪; 张莎莎; 杨巍; 王鹏超; 陶勇
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2018-07-18
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2020-01-31
Anticipated expiration: 2038-07-18
Also published as: CN110734887B

Abstract

本发明公开了一种产N‑乙酰谷氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明所提供的产N‑乙酰谷氨酸的基因工程菌的构建方法包括：将N‑乙酰谷氨酸合成酶基因导入宿主菌得到产N‑乙酰谷氨酸(NAG)的重组菌，通过阻断N‑乙酰谷氨酸分解代谢途径，以及改善前体乙酰辅酶A的供应提高NAG的产量。利用本发明所构建的产NAG的基因工程菌生产NAG，具有以下优点：通过导入优良性状的N‑乙酰谷氨酸合成酶得到能够产NAG的工程菌；通过阻断N‑乙酰谷氨酸分解代谢途径使NAG得以高效积累；通过前体乙酰辅酶A供应的改善，提高了NAG的合成效率。实验证明，本发明所制备的产N‑乙酰谷氨酸的重组菌可以高效地合成N‑乙酰谷氨酸。

Description

产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

自十九世纪50年代作为大肠杆菌精氨酸生物合成的中间体被鉴定以来，N-乙酰谷氨酸的多种生理功能被不断发现。N-乙酰谷氨酸是L-谷氨酸的氨基被乙酰化的产物，作为一种氨基酸衍生物，其存在于很多食物包括水果、蔬菜、谷物、牛奶、咖啡、肉等中。

N-乙酰谷氨酸有两个主要的生理功能，首先N-乙酰谷氨酸是微生物及植物精氨酸生物合成的第一个中间体，对L-鸟氨酸和瓜氨酸的合成也是必须的。精氨酸是一种重要的功能性氨基酸，在动物细胞信息传递和应用代谢中起重要作用，但受其价格高且与赖氨酸、色氨酸和组氨酸有拮抗作用等未能作为饲料添加剂在动物生产中大量推广使用，而N-乙酰谷氨酸作为精氨酸的替代品添加在饲料中能够促进动物内源精氨酸的合成。其次，N-乙酰谷氨酸是尿素循环的第一个酶——氨基甲酰磷酸合成酶CPSI的变构激活剂，能够促进尿素循环，防止氨中毒。此外，大脑中的N-乙酰谷氨酸是神经肽乙酰天冬酰胺谷氨酸转换的中间体；在根瘤菌固氮期间，N-乙酰谷氨酸作为一种从细菌释放的胞外信号，也能够影响根毛发育和其后的结节发育。

目前的研究发现，有很多不同来源的基因都能够编码合成N-乙酰谷氨酸的酶。研究最多的是典型的细菌来源的N-乙酰谷氨酸合成酶NAGS，它是一种双功能的酶，同时具有N-乙酰谷氨酸合成酶和N-乙酰谷氨酸激酶活性，也即精氨酸合成的前两个步骤，这种酶由argA单基因编码，包含两个结构域，C端的N-乙酰转移酶(NAT)结构域和N端的氨基酸激酶(AAK)结构域。另一个研究较多的基因是argJ，能够编码单功能或者双功能的乙酰转移酶，催化乙酰鸟氨酸和谷氨酸(单功能)及乙酰辅酶A和谷氨酸(双功能)合成N-乙酰谷氨酸。细菌中还存在一些其它的非典型的N-乙酰谷氨酸合成酶NAGS，包括短链的只具有乙酰转移酶活性的S-NAGS，N端与argH融合的H-NAGS，以及2013年发现的来源于谷氨酸棒杆菌的C-NAGS。

合成N-乙酰谷氨酸的另一个前体——乙酰辅酶A，是中心碳代谢的重要中间物，参与多个生物反应。在大肠杆菌中，乙酰辅酶A主要来源于丙酮酸的脱羧反应，在有氧的条件下由PDH催化，厌氧条件下由PFL催化脱羧。乙酰辅酶A也可以从乙酸或者脂肪酸获得。在氧气充足的情况下，乙酰辅酶A主要经过TCA循环产能，也可以合成乙酸、乙醇等，当然也可以用于脂肪酸的合成。

发明内容

本发明的目的是提供一种产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

第一方面，本发明要求保护一种构建产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌的方法。

本发明所提供的构建产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌的方法，可包括如下步骤：将N-乙酰谷氨酸合成酶基因导入宿主菌得到产N-乙酰谷氨酸的重组菌；通过阻断N-乙酰谷氨酸分解代谢途径以及改善前体乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)的供应等策略提高NAG的合成；所述宿主菌为突变型大肠杆菌或者野生型大肠杆菌；所述突变型大肠杆菌为下述A1)至A5)的任一种：

A1)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行下述a1)-a5)的全部改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(在本发明中，该突变型大肠杆菌具体为NAG05)：

a1)用葡糖激酶基因(glk)替换所述野生型大肠杆菌基因组中的D-葡萄糖PTS通透酶基因(ptsG)，用D-乳糖转运蛋白基因(zglf)(优选运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)来源的zglf)替换所述野生型大肠杆菌基因组中的半乳糖操纵子的调节子基因(galR)，用乙酰辅酶A合成酶基因(acs)替换所述野生型大肠杆菌基因组中的丙酮酸氧化酶基因(poxB)。本发明中，将该突变型大肠杆菌SG104，其基因型为E.coli BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acs。

a2)将所述野生型大肠杆菌基因组中的N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)敲除。该改造以“ΔargB”表示。

a3)将所述野生型大肠杆菌基因组中的N-乙酰谷氨酸合成酶基因(argA)敲除。该改造以“ΔargA”表示。

a4)将所述野生型大肠杆菌基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldhA)敲除。该改造以“ΔldhA”表示。

a5)将所述野生型大肠杆菌基因组中的乙酰磷酸转移酶基因(pta)敲除。该改造以“Δpta”表示。

A2)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(在本发明中，该突变型大肠杆菌具体为SG104)。

A3)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1)和所述a2)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(在本发明中，该突变型大肠杆菌具体为NAG01)。

A4)所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1)所述a2)和所述a3)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(在本发明中，该突变型大肠杆菌具体为NAG02)。

A5)所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1)所述a2)所述a3)和所述a4)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体(在本发明中，该突变型大肠杆菌具体为NAG03)。

上述敲除和替换均可通过同源重组实现。

进一步地，被导入所述宿主菌的所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因所编码的蛋白质可为如b1)至b2)中任一所示：

b1)氨基酸序列如序列表中序列1所示的蛋白质；

b2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰谷氨酸合成酶活性的由b1)衍生的蛋白质。

进一步地，所述葡糖激酶基因可编码下述c1)或c2)所示的蛋白质：

c1)由Acession号NP_416889所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c2)由Acession号NP_416889所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有葡萄糖激酶活性的由c1)衍生的蛋白质。

进一步地，所述D-乳糖转运蛋白基因可为来源于运动发酵单胞菌来源的D-乳糖转运蛋白基因，可编码下述d1)或d2)所示的蛋白质：

d1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

d2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有D-乳糖转运蛋白活性的由d1)衍生的蛋白质。

进一步地，所述乙酰辅酶A合成酶基因可编码下述e1)或e2)所示的蛋白质：

e1)由Acession号NP_418493所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

e2)由Acession号NP_418493所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有乙酰辅酶A合成酶活性的由e1)衍生的蛋白质。

进一步地，所述D-葡萄糖PTS通透酶基因可编码下述f1)或f2)所示的蛋白质：

f1)由Acession号NP_415619所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

f2)由Acession号NP_415619所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有D-葡萄糖PTS通透酶活性的由f1)衍生的蛋白质。

进一步地，所述半乳糖操纵子的调节子基因可编码下述g1)或g2)所示的蛋白质：

g1)由Acession号NP_417314所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

g2)由Acession号NP_417314所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有半乳糖操纵子的调节子活性的由g1)衍生的蛋白质。

进一步地，所述丙酮酸氧化酶基因可编码下述h1)或h2)所示的蛋白质：

h1)由Acession号NP_415392所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

h2)由Acession号NP_415392所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有丙酮酸氧化酶活性的由h1)衍生的蛋白质。

进一步地，所述N-乙酰谷氨酶激酶基因可编码下述i1)或i2)所示的蛋白质：

i1)由Accession号NP_418394所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

i2)由Accession号NP_418394所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有N-乙酰谷氨酶激酶活性的由i1)衍生的蛋白质。

进一步地，所述野生型大肠杆菌基因组中的所述N-乙酰谷氨酶合成酶基因可编码下述j1)或j2)所示的蛋白质：

j1)由Accession号NP_417295所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

j2)由Accession号NP_417295所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有N-乙酰谷氨酶合成酶活性的由j1)衍生的蛋白质。

进一步地，所述乳酸脱氢酶基因可编码下述k1)或k2)所示的蛋白质：

k1)由Accession号NP_415898所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

k2)由Accession号NP_415898所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有乳酸脱氢酶活性的由k1)衍生的蛋白质。

进一步地，所述乙酰磷酸转移酶基因可编码下述l1)或l2)所示的蛋白质：

l1)由Accession号NP_416800所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

l2)由Accession号NP_416800所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有乙酰磷酸转移酶活性的由l1)衍生的蛋白质。

更进一步地，被导入所述宿主菌的所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因可为下述b11)-b12)中的任一种DNA分子：

b11)所述N-乙酰谷氨酸合成酶的编码基因为序列表中序列2所示的DNA分子；

b12)所述N-乙酰谷氨酸合成酶的编码基因为与序列表中序列2所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述N-乙酰谷氨酸合成酶的DNA分子。

更进一步地，所述葡糖激酶基因可为下述c11)或c12)所示的DNA分子：

c11)其编码序列是Gene ID:946858所示的DNA分子；

c12)与c11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述葡糖激酶的DNA分子。

所述运动发酵单胞菌来源的D-乳糖转运蛋白基因可为下述d11)或d12)所示的DNA分子：

d11)其编码序列是序列表中序列5所示的DNA分子；

d12)与d11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述D-乳糖转运蛋白的DNA分子。

更进一步地，所述乙酰辅酶A合成酶基因可为下述e11)或e12)所示的DNA分子：

e11)其编码序列是Gene ID:948572所示的DNA分子；

e12)与e11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述乙酰辅酶A合成酶的DNA分子。

更进一步地，所述D-葡萄糖PTS通透酶基因可为下述f11)或f12)所示的DNA分子：

f11)其编码序列是Gene ID:945651所示的DNA分子；

f12)与f11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述D-葡萄糖PTS通透酶的DNA分子。

更进一步地，所述半乳糖操纵子的调节子基因可为下述g11)或g12)所示的DNA分子：

g11)其编码序列是Gene ID:947314所示的DNA分子；

g12)与g11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述半乳糖操纵子的调节子的DNA分子。

更进一步地，所述丙酮酸氧化酶基因可为下述h11)或h12)所示的DNA分子：

h11)其编码序列是Gene ID:946132所示的DNA分子；

h12)与h11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述丙酮酸氧化酶的DNA分子。

更进一步地，所述N-乙酰谷氨酶激酶基因可为下述i11)或i12)所示的DNA分子：

i11)其编码序列是Gene ID：948464所示的DNA分子；

i12)与i11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述N-乙酰谷氨酶激酶的DNA分子。

更进一步地，所述野生型大肠杆菌基因组中的所述N-乙酰谷氨酶合成酶基因可为下述j11)或j12)所示的DNA分子：

j11)其编码序列是Gene ID：947289所示的DNA分子；

j12)与j11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述N-乙酰谷氨酶合成酶的DNA分子。

更进一步地，所述乳酸脱氢酶基因可为下述k11)或k12)所示的DNA分子：

k11)其编码序列是Gene ID：946315所示的DNA分子；

k12)与k11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述乳酸脱氢酶的DNA分子。

更进一步地，所述乙酰磷酸转移酶基因可为下述l1)或l2)所示的DNA分子：

l11)其编码序列是Gene ID：946778所示的DNA分子；

l12)与l11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述乙酰磷酸转移酶的DNA分子。

上述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

进一步地，所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因可通过含有N-乙酰谷氨酸合成酶基因表达盒的重组表达载体导入所述宿主菌中。在所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因表达盒中，启动所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因转录的启动子是pBAD启动子。

更进一步地，所述pBAD启动子如序列表中序列3的994-1266位所示。

在本发明中，所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因表达盒可含有所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因和启动所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因转录的启动子(pBAD启动子)。本发明中所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因表达盒指能够在宿主细胞中表达序列表中序列2所示的所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因的DNA，该DNA不但可包括启动所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因转录的启动子(pBAD启动子)，还可包括终止所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因转录的终止子。进一步，所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因表达盒还可包括增强子序列。

在本发明的具体实施方式中，所述含有N-乙酰谷氨酸合成酶基因表达盒的重组表达载体是将序列表中序列3所示的pRB1s载体的NcoI和EcoRI位点间的片段替换为序列表中序列2所示的N-乙酰谷氨酸合成酶基因得到的重组载体，命名为pNAG06。

进一步地，所述野生型大肠杆菌可为大肠杆菌K12。

在本发明的具体实施方式中，所述突变型大肠杆菌具体可为大肠杆菌突变体SG104、大肠杆菌突变体NAG01、大肠杆菌突变体NAG02、大肠杆菌突变体NAG03或大肠杆菌突变体NAG05。

所述大肠杆菌突变体SG104是将大肠杆菌K12的D-葡萄糖PTS通透酶基因(ptsG)替换为Gene ID:946858所示的葡糖激酶基因(glk)，半乳糖操纵子的调节子基因(galR)替换为序列表中序列5所示的运动发酵单胞菌来源的转运蛋白基因(zglf)，丙酮酸氧化酶基因(poxB)替换为Gene ID:948572所示的乙酰辅酶A合成酶基因(acs)得到的大肠杆菌突变体(简称SG104)。

所述大肠杆菌突变体NAG01是将所述大肠杆菌突变体SG104的N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因，再利用pCP20载体将FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除卡那霉素抗性从而将所述大肠杆菌突变体SG104的N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)敲除(缺失)的大肠杆菌K12突变体(简称NAG01)。

所述大肠杆菌突变体NAG02是将所述大肠杆菌突变体NAG01的N-乙酰谷氨酸合成酶基因(argA)替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因，再利用pCP20载体将FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除卡那霉素抗性从而将所述大肠杆菌突变体NAG01的N-乙酰谷氨酸合成酶基因(argA)敲除(缺失)的大肠杆菌K12突变体(简称NAG02)。

所述大肠杆菌突变体NAG03是将所述大肠杆菌突变体NAG02的乳酸脱氢酶基因(ldhA)替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因，再利用pCP20载体将FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除卡那霉素抗性从而将所述大肠杆菌突变体NAG02的乳酸脱氢酶基因(ldhA)敲除(缺失)的大肠杆菌K12突变体(简称NAG03)。

所述大肠杆菌突变体NAG05是将所述大肠杆菌突变体NAG03的乙酰磷酸转移酶基因(pta)替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因，再利用pCP20将FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除卡那霉素抗性从而将所述大肠杆菌突变体NAG03的乙酰磷酸转移酶基因(pta)敲除(缺失)的大肠杆菌K12突变体(简称NAG05)。

第二方面，本发明要求保护由前文所述的方法构建得到的产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌。

在本发明的具体实施方式中，上述方法制备的产N-乙酰谷氨酸重组菌具体为如下任一：将所述pNAG06载体转化大肠杆菌K12得到的重组菌BW06；将所述pNAG06载体转化所述大肠杆菌突变体SG104得到的重组菌SG10406；将所述pNAG06载体转化所述大肠杆菌突变体NAG01得到的重组菌0106；将所述pNAG06载体转化所述大肠杆菌突变体NAG02得到的重组菌0206；将所述pNAG06载体转化所述大肠杆菌突变体NAG03得到的重组菌0306；将所述pNAG06载体转化所述大肠杆菌突变体NAG05得到的重组菌0506。

第三方面，本发明要求保护前文所述的产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌在制备N-乙酰谷氨酸或精氨酸或其衍生物中的应用。

第四方面，本发明要求保护一种制备N-乙酰谷氨酸的方法。

本发明所提供的制备N-乙酰谷氨酸的方法，具体可包括如下步骤：将前文所述的产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后重组菌，用所述诱导后重组菌催化葡萄糖和谷氨酸反应，得到N-乙酰谷氨酸(全细胞催化法)。

进一步地，上述制备N-乙酰谷氨酸的方法中，所述阿拉伯糖诱导培养是在含有阿拉伯糖且其终浓度为0.2g/100mL的培养基中进行的，所述诱导培养的温度为37℃，所述诱导培养的时间为12-16小时(如12小时)。

进一步地，上述制备N-乙酰谷氨酸的方法中，用所述诱导后重组菌催化葡萄糖和谷氨酸反应的温度为37℃，时间为10小时。

所述阿拉伯糖为L-阿拉伯糖。

另外，本发明所提供的制备N-乙酰谷氨酸的方法，除了前文所述的全细胞催化法，也可采用体外酶催化法，包括如下步骤：首先，从前文所述的产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌中提取所需的N-乙酰谷氨酸合成酶；然后，将N-乙酰谷氨酸合成酶与相应的辅因子共同催化底物生成N-乙酰谷氨酸。

本发明通过在大肠杆菌中引入外源的N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)将L-谷氨酸高效地转化为N-乙酰谷氨酸。同时，通过阻断N-乙酰谷氨酸的分解代谢途径，使N-乙酰谷氨酸得以高效积累；并进一步改善乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)的供应，进而提高葡萄糖的转化效率。通过上述方法实现利用大肠杆菌从低廉原料葡萄糖和谷氨酸生产N-乙酰谷氨酸的合成在国内外尚属首次。实验证明，本发明所制备的产N-乙酰谷氨酸的重组菌的N-乙酰谷氨酸的产量可达19.98mM。

附图说明

图1为pRB1s的物理图谱。

图2为大肠杆菌突变体SG104和野生型大肠杆菌K12生长速率和利用葡萄糖速率的对比图。(a)为生长速率的对比图；(b)为利用葡萄糖速率的对比图。

图3为各大肠杆菌突变体的PCR验证结果。(a)为NAG01的PCR验证；M：marker；1：SG104；2：NAG01。(b)为NAG02的PCR验证；M：marker；1，3：SG104；2，4：NAG02。(c)为NAG03的PCR验证；M：marker；1，3，5：SG104；2，4，6：NAG03。(d)为NAG05的PCR验证；M：marker；1，3，5，7：SG104；2，4，6，8：NAG05。

图4为各工程菌中N-乙酰谷氨酸合成酶蛋白表达的电泳检测结果。M：蛋白质分子量标注；其余为细胞破碎上清液，1:BW06；2:SG10406；3:0106；4:0206；5:0306；6:0506。

图5为N-乙酰谷氨酸标准品的HPLC图谱。

图6为工程菌0506的全细胞催化转化产物的HPLC图谱。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中大肠杆菌K12记载于文献“Baba T，Ara T，Hasegawa M，Takai Y，Okumura Y,Baba M,Datsenko KA,Tomita M,Wanner BL,Mori H:Construction ofEscherichia coli K-12 in-frame,single-gene knockout mutants:the Keiocollection.Mol Syst Biol 2006,2:2006.0008.”中，是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短，容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌K12的全基因组序列的GenBankAccession为U00096.3(GI：545778205，update date是AUG 01，2014，version是3)。公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的野生型P1噬菌体菌种记载于文献“Thomason LC,Costantino N,Court DL:E.coli genome manipulation by P1 transduction.Curr Protoc Mol Biol2007,Chapter 1:Unit 1.17.”中，公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的供体菌BW25113 ΔargB::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW5553)，BW25113 ΔargA::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW2786)，BW25113 ΔldhA::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW1375)和BW25113 Δpta::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW2294)均记载于文献“Baba T,Ara T,Hasegawa M,Takai Y,Okumura Y,Baba M,Datsenko KA,Tomita M,WannerBL,Mori H:Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockoutmutants:the Keio collection.Mol Syst Biol 2006,2:2006.0008.”中，公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中，N-乙酰谷氨酸合成酶基因的编码序列如序列表中序列2所示，编码序列表中序列1所示的N-乙酰谷氨酸合成酶；葡糖激酶基因(glk)的编码序列如Gene ID:946858(由966个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_416889(由321个氨基酸残基组成)所示的葡糖激酶；运动发酵单胞菌来源的乳糖转运蛋白基因(zglf)的编码序列如序列表中序列5(由1422个核苷酸组成)所示，编码序列表中序列4(由473个氨基酸残基组成)所示的运动发酵单胞菌来源的乳糖转运蛋白；乙酰辅酶A合成酶基因(acs)的编码序列如Gene ID:948572(由1959个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_418493(由652个氨基酸残基组成)所示的乙酰辅酶A合成酶；D-葡萄糖PTS通透酶基因(ptsG)的编码序列如Gene ID:945651(由1434个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_415619(由477个氨基酸残基组成)所示的D-葡萄糖PTS通透酶；半乳糖操纵子的调节子基因(galR)的编码序列如Gene ID:947314(由1032个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_417314(由343个氨基酸残基组成)所示的半乳糖操纵子的调节子；丙酮酸氧化酶基因(poxB)的编码序列如Gene ID:946132(由1719个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_415392(由572个氨基酸残基组成)所示的丙酮酸氧化酶；N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB)的编码序列如Gene ID:948464(由777个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_418394(由258个氨基酸残基组成)所示的N-乙酰谷氨酸激酶；N-乙酰谷氨酸合成酶基因(argA)的编码序列如Gene ID:947289(由1332个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_417295(由443个氨基酸残基组成)所示的N-乙酰谷氨酸合成酶；乳酸脱氢酶基因(ldhA)的编码序列如Gene ID:946315(由990个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_415898(由329个氨基酸残基组成)所示的乳酸脱氢酶；乙酰磷酸转移酶基因(pta)的编码序列如Gene ID:946778(由2145个核苷酸组成)所示，编码Acession号NP_416800(由714个氨基酸残基组成)所示的乙酰磷酸转移酶。

下述实施例中pRB1s载体的核苷酸序列如序列表中序列3所示，包括如下片段：(1)araC-araBAD-MCS片段(含阿拉伯糖诱导启动子、多克隆位点)；(2)MCS-TrrnB片段(含多克隆位点、终止子TrrnB)；(3)RSF1030复制起始位点片段；(4)链霉素抗性基因Str片段。pRB1s载体图谱如图1所示。

下述实施例中的大肠杆菌突变体的基因型如表1所示：

表1大肠杆菌突变体的基因型

菌株	基因型	来源
			BW25113	rrnBT14ΔlacZWJ16 hsdR514 ΔaraBAD<sub>AH33</sub>ΔrhaBAD<sub>LD78</sub>	实验室保存
SG104	BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acs	实验室保存
			NAG01	SG104ΔargB	本发明构建
NAG02	NAG01ΔargA	本发明构建
			NAG03	NAG02ΔldhA	本发明构建
NAG05	NAG03Δpta	本发明构建

实施例1、构建表达N-乙酰谷氨酸合成酶的重组质粒pNAG06

设计一对引物P1和P2，以天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)基因组为模板，经PCR扩增N-乙酰谷氨酸合成酶的编码基因。PCR条件如下：98℃，2min；98℃，20sec，55℃，20sec，72℃，30sec(30循环)；72℃，5min。通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小为510bp，与目的片段相符，命名为ScoargA。将ScoargA基因片段回收。

将pRB1s载体用NcoI和EcoRI双酶切后，回收载体大片段，约3500bp；将回收的ScoargA基因片段与载体大片段用Gibson方法(Gibson DG,Young L,Chuang RY,VenterJC,Hutchison CA,3rd,Smith HO:Enzymatic assembly of DNA molecules up toseveral hundred kilobases.Nat Methods 2009,6:343-345.)进行连接，连接产物转化Trans1-T1感受态细胞(北京全式金生物，产品目录号为CD501)，涂布含链霉素的LB固体平板。37℃过夜，挑取单克隆提取质粒，设计一对引物(P3和P4)进行PCR验证，正确的克隆送测序。将pRB1s载体的NcoI和EcoRI位点间的片段替换为序列表中序列2所示的N-乙酰谷氨酸合成酶基因得到的重组载体命名为pNAG06。序列2所示的N-乙酰谷氨酸合成酶基因编码序列1所示的N-乙酰谷氨酶合成酶。在pNAG06中，启动N-乙酰谷氨酸合成酶基因转录的启动子的核苷酸序列如序列3的第994-1266位所示的pBAD启动子。

引物序列如下：

P1：5’-gctaacaggaggaattaaccatgtcaaatgccatcagcgt-3’；

P2：5’-gctgcagaccgagctcaccgaattctcacagatgcagaagcatcc-3’；

P3：5’-cggcgtcacactttgctatg-3’；

P4：5’-gtttcacttctgagttcggc-3’；

实施例2、大肠杆菌突变体SG104的构建

大肠杆菌突变体SG104(实验室保存)是利用CRISPR技术(Jiang Y,Chen B,DuanC,Sun B,Yang J,Yang S:Multigene editing in the Escherichia coli genome viathe CRISPR-Cas9system.Appl Environ Microbiol 2015,81:2506-2514.)将大肠杆菌K12的D-葡萄糖PTS通透酶基因(ptsG)替换为葡糖激酶基因(glk)，半乳糖操纵子的调节子基因(galR)替换为运动发酵单胞菌来源的D-乳糖转运蛋白基因(zglf)，丙酮酸氧化酶基因(poxB)替换为乙酰辅酶A合成酶基因(acs)，从而获得的大肠杆菌K12的突变体，在本申请中简称SG104。SG104的基因型为BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acs。

大肠杆菌突变体SG104的具体构建步骤如下：

(1)制备电转感受态细胞：将pCas质粒(Jiang Y,Chen B,Duan C,Sun B,Yang J,Yang S:Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9system.Appl Environ Microbiol 2015,81:2506-2514.)利用化学转化法转化大肠杆菌K12，在含卡那霉素的LB平板(卡那霉素浓度为50μg/ml)上30℃培养筛选阳性克隆，阳性克隆接种在含2g/L阿拉伯糖的LB液体培养基中30℃培养至OD600约为0.6后，制备电转感受态细胞。

(2)构建pTarget质粒：利用网站https://crispy.secondarymetabolites.org选取敲除位点的N20，设计引物构建pTarget质粒。以pTargetF(Jiang Y,Chen B,Duan C,SunB,Yang J,Yang S:Multigene editing in the Escherichia coli genome via theCRISPR-Cas9system.Appl Environ Microbiol 2015,81:2506-2514.)为模板，分别用引物对pTarget-ptsG-F和pTarget-ptsG-R，pTarget-galR-F和pTarget-galR-R，pTarget-poxB-F和pTarget-poxB-R进行PCR扩增，分别扩增得到大小约2100bp的片段。用DpnI甲基化酶消化约3h后，直接利用化学转化法转化大肠杆菌DH5α感受态，在含链霉素的LB平板(链霉素浓度为50μg/ml)上筛选阳性克隆，并用引物pTarget-cexu-F测序验证。测序正确后分别命名为pTarget-ptsG，pTarget-galR和pTarget-poxB。

所用引物序列如下(下划线所示为N20的序列)：

pTarget-ptsG-F:5’-tccttcatttggccgccgatgttttagagctagaaatagc-3’；

pTarget-ptsG-R:5’-atcggcggccaaatgaaggaactagtattatacctaggac-3’；

pTarget-galR-F:5’-cagcaaggtcatacccgcatgttttagagctagaaatagc-3’；

pTarget-galR-R:5’-atgcgggtatgaccttgctgactagtattatacctaggac-3’；

pTarget-poxB-F:5’-gggttaatcggcttctcgtcgttttagagctagaaatagc-3’；

pTarget-poxB-R:5’-gacgagaagccgattaacccactagtattatacctaggac-3’；

pTarget-cexu-F:5’-ctttcctgcgttatcccctg-3’。

(3)扩增打靶片段：分别用引物对ptsG-up500-F和ptsG-up500-R，glk-F和glk-R，ptsG-down500-F和ptsG-down500-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp，1000bp和500bp的片段。以三个片段的混合物为模板，用引物对ptsG-up500-F和ptsG-down500-R进行PCR扩增，得到大小约为2000bp的ptsG::glk打靶片段。分别用引物对galR-up500-F和galR-up500-R，zglf-F和zglf-R，galR-down500-F和galR-down500-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp，1500bp和500bp的片段。以三个片段的混合物为模板，用引物对galR-up500-F和galR-down500-R进行PCR扩增，得到大小约为2500bp的galR::zglf打靶片段。分别用引物对poxB-up500-F和poxB-up500-R，acs-F和acs-R，poxB-down500-F和poxB-down500-R进行PCR扩增，分别得到大小约为500bp，2000bp和500bp的片段。以三个片段的混合物为模板，用引物对poxB-up500-F和poxB-down500-R进行PCR扩增，得到大小约为3000bp的poxB::acs打靶片段。将打靶片段ptsG::glk，galR::zglf和poxB::acs回收。打靶片段从上游到下游依次包含500bp上游同源臂，替换基因和500bp下游同源臂。

所用引物序列如下：

ptsG-up500-F:5’-gcgttatgtccccctggatc-3’；

ptsG-up500-R:5’-aattgagagtgctcctgagt-3’；

ptsG-down500-F:5’-tccgtaagacgttggggaga-3’；

ptsG-down500-R:5’-cgcctataaagcggtggatg-3’；

glk-F:5’-actcaggagcactctcaattatgacaaagtatgcattagtc-3’；

glk-R:5’-tctccccaacgtcttacggattacagaatgtgacctaagg-3’；

galR-up500-F:5’-cgcgagcgacagtaaattag-3’；

galR-up500-R:5’-gaaaataccttagtgggtaa-3’；

galR-down500-F:5’-ccgcagttaaagcaattcca-3’；

galR-down500-R:5’-tttgggccaccctgtgaaac-3’；

zglf-F:5’-ttacccactaaggtattttcatgagttctgaaagtagtcag-3’；

zglf-R:5’-tggaattgctttaactgcggctacttctgggagcgccaca-3’；

poxB-up500-F:5’-ccggctccgtatatggattg-3’；

poxB-up500-R:5’-ggttctccatctcctgaatg-3’；

poxB-down500-F:5’-aaagggtggcatttcccgtc-3’；

poxB-down500-R:5’-aattcccatgcttctttcag-3’；

acs-F:5’-cattcaggagatggagaaccatgagccaaattcacaaacac-3’；

acs-R:5’-gacgggaaatgccaccctttttacgatggcatcgcgatag-3’。

(4)电转化：将200ng pTarget-ptsG质粒，400ng打靶片段ptsG::glk与100μl步骤(1)制备的电转化感受态细胞混合，置于2mm的电转杯中，2.5kV电击，加入1ml LB液体培养基30℃复苏后涂布在含卡那霉素和链霉素的LB平板上(卡那霉素浓度为50μg/ml，链霉素浓度为50μg/ml)，30℃培养，筛选阳性克隆。用引物对ptsG-up700-F和ptsG-down700-R进行PCR扩增，将扩增片段测序验证。

(5)消除pTarget质粒：将测序验证正确的阳性克隆接种在含有0.1mM IPTG和卡那霉素的LB液体培养基中30℃培养过夜以消除pTarget质粒。过夜培养后的菌株在含有卡那霉素的LB固体平板上划线，30℃培养过夜，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glk。

(6)从步骤(5)的平板上挑取单克隆，制备电转感受态细胞，与pTarget-galR质粒和galR::zglf打靶片段混合，重复步骤(4)-(5)的步骤，并用引物对galR-up700-F和galR-down700-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglf。

(7)将含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglf制备电转感受态细胞，与pTarget-poxB质粒和poxB::acs打靶片段混合，重复步骤(4)-(5)的步骤，并用引物对poxB-up700-F和poxB-down700-R测序验证，得到含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acs。

(8)消除pCas质粒：将测序验证正确的含有pCas质粒的大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acs接种在LB液体培养基中，37℃培养过夜以消除pCas质粒。将过夜培养后的菌株在LB固体平板上划线，37℃培养过夜培养，得到大肠杆菌突变体BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acs，简称SG104。

用于验证和测序的引物序列如下：

ptsG-up700-F:5’-actgaacaagccggttatcg-3’；

ptsG-down700-R:5’-acctacgccagctatacctc-3’；

galR-up700-R:5’-ggcgtaattagaacgcgctc-3’；

galR-down700-R:5’-acatgcacattggttctggc-3’；

poxB-up700-R:5’-attatgtcgatgcgtcgctg-3’；

poxB-down700-R:5’-tcccgccacctgtcattttc-3’。

相对于野生型大肠杆菌K12，突变型大肠杆菌SG104生长速率更快，对于葡萄糖有更高的利用速率(图2；此处生长速率以UV检测600nm处的吸光值表示，葡萄糖浓度采用HPLC检测)。故本发明中选取突变型大肠杆菌SG104为出发菌株。

实施例3、N-乙酰谷氨酸分解代谢途径的阻断及前体乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)供应的改造，即大肠杆菌突变体NAG01，NAG02，NAG03，NAG05的构建

1、大肠杆菌突变体NAG01的构建

NAG01具体采用P1噬菌体介导的转染法构建：

(1)获得供体菌的P1：将供体菌BW25113ΔargB::Kan接种于含10mM MgCl₂、5mMCaCl₂和0.1g/100ml葡萄糖的LB培养基中，培养1h，加入野生型P1噬菌体，培养1-3h。加几滴氯仿再摇几分钟，离心取上清即得噬菌体P1virΔargB。

(2)利用P1噬菌体转导技术构建大肠杆菌敲除菌NAG01::Kan。具体步骤如下：过夜培养SG104(受体菌)，取1.5mL菌体6000rpm离心2分钟后，用0.75mL的P1盐溶液(溶剂为水，溶质为10mM CaCl₂和5mM MgSO₄)重悬SG104细胞，将100μl噬菌体P1virΔargB与100μlSG104细胞悬浮液混合，室温孵育30分钟，添加200μl 1M的柠檬酸钠和1mL LB培养基，37℃继续培养1h，离心收集菌体，用100μl LB重悬后，涂布在含卡那霉素的LB平板(卡那霉素浓度为50μg/mL)上，筛选阳性克隆(能在含卡那霉素的平板上生长的克隆)即SG104ΔargB::Kan。

(3)消除卡那霉素抗性：利用FIp重组酶的质粒pCP20(CIontech)化学转化SG104ΔargB::Kan，将SG104ΔargB::Kan的FRT位点之间的卡那霉素抗性基因删除，消除SG104ΔargB::Kan的卡那霉素抗性，得到大肠杆菌突变体SG104ΔargB(简称NAG01)。

(4)以NAG01的基因组DNA为模板，用引物对argB-up200-F和argB-down200-R，进行PCR扩增，扩增得到大小约为500bp的片段。以大肠杆菌SG104的基因组DNA为模板，用引物对argB-up200-F和argB-down200-R进行PCR扩增，扩增得到大小约为1200bp的片段(图3中(a))。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的argB基因的上游和下游区域。结果表明：大肠杆菌突变体NAG01是将大肠杆菌突变体SG104的N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB，Gene ID：948464)敲除后的突变体(简称NAG01)，NAG01的基因型为BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acsΔargB。

2、大肠杆菌突变体NAG02的构建

(1)以NAG01为受体菌，BW25113ΔargA::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW2786)为供体菌，重复以上步骤1(1)-(3)，利用P1噬菌体转导构建大肠杆菌突变体SG104ΔargBΔargA(简称NAG02)。

(2)以NAG02的基因组DNA为模板，分别用引物对argB-up200-F和argB-down200-R，argA-up200-F和argA-down200-R进行PCR扩增，分别扩增得到大小约为500bp和600bp的片段。以大肠杆菌SG104的基因组DNA为模板，分别用引物对argB-up200-F和argB-down200-R，argA-up200-F和argA-down200-R进行PCR扩增，分别扩增得到大小约为1200bp和1800bp的片段(图3中(b))。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的argB和argA基因的上游和下游区域。结果表明：大肠杆菌突变体NAG02是将大肠杆菌突变体SG104的N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB，Gene ID：948464)和N-乙酰谷氨酸合成酶基因(argA，Gene ID：947289)敲除后的的突变体(简称NAG02)，NAG02的基因型为BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acsΔargBΔargA。

3、大肠杆菌突变体NAG03的构建

(1)以NAG02为受体菌，BW25113ΔldhA::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW1375)为供体菌，重复以上步骤1(1)-(3)，利用P1噬菌体转导构建大肠杆菌突变体SG104ΔargBΔargAΔldhA(简称NAG03)。

(2)以NAG03的基因组DNA为模板，分别用引物对argB-up200-F和argB-down200-R，argA-up200-F和argA-down200-R，ldhA-up100-F和ldhA-down100-R进行PCR扩增，分别扩增得到大小约为500bp、600bp和300bp的片段。以大肠杆菌SG104的基因组DNA为模板，分别用引物对argB-up200-F和argB-down200-R，argA-up200-F和argA-down200-R，ldhA-up100-F和ldhA-down100-R进行PCR扩增，分别扩增得到大小约为1200bp、1800bp和1500bp的片段(图3中(c))。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的argB、argA和ldhA基因的上游和下游区域。结果表明：大肠杆菌突变体NAG03是将大肠杆菌突变体SG104的N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB，Gene ID：948464)，N-乙酰谷氨酸合成酶基因(argA，Gene ID：947289)和乳酸脱氢酶基因(ldhA，Gene ID：946315)敲除后的的突变体(简称NAG03)，NAG03的基因型为BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acsΔargBΔargAΔldhA。

4、大肠杆菌突变体NAG05的构建

(1)以NAG03为受体菌，BW25113Δpta::Kan(国立遗传学研究所(NIG，Japan)，NIG编号为JW2294)为供体菌，重复以上步骤1(1)-(3)，利用P1噬菌体转导构建大肠杆菌突变体SG104ΔargBΔargAΔldhA Δpta(简称NAG05)。

(2)以NAG05的基因组DNA为模板，分别用引物对argB-up200-F和argB-down200-R，argA-up200-F和argA-down200-R，ldhA-up100-F和ldhA-down100-R，pta-up300-F和pta-down300-R进行PCR扩增，分别扩增得到大小约为500bp、600bp、300bp和700bp的片段。以大肠杆菌SG104的基因组DNA为模板，分别用引物对argB-up200-F和argB-down200-R，argA-up200-F和argA-down200-R，ldhA-up100-F和ldhA-down100-R，pta-up300-F和pta-down300-R进行PCR扩增，分别扩增得到大小约为1200bp、1800bp、1500bp和2700bp的片段(图3中(d))。其中，引物结合位置分别是大肠杆菌K12的argB、argA、ldhA和pta基因的上游和下游区域。结果表明：大肠杆菌突变体NAG05是将大肠杆菌突变体SG104的N-乙酰谷氨酸激酶基因(argB，Gene ID：948464)，N-乙酰谷氨酸合成酶基因(argA，Gene ID：947289)，乳酸脱氢酶基因(ldhA，Gene ID：946315)和乙酰磷酸转移酶基因(pta，Gene ID：946778)敲除后的的突变体(简称NAG05)，NAG05的基因型为BW25113ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acsΔargBΔargAΔldhAΔpta。

本实施例所用引物序列如下：

argB-up200-F：5’-tatgacaaaggcgttccggc-3’；

argB-down200-R：5’-gctcttctgcggttaacacg-3’；

argA-up200-F：5’-gttggatcctgacatgcctc-3’；

argA-down200-R：5’-tgattttgccgagccaacgc-3’；

ldhA-up100-F：5’-tgcgcctacactaagcatag-3’；

ldhA-down100-R：5’-caaacgcggctac tttcttc-3’；

pta-up300-F：5’-cgctgttgtattcactggtg-3’；

pta-down300-R：5’-ggaactacccaggtggcaag-3’。

实施例4、pNAG06转化大肠杆菌及其突变株构建工程菌株

将实施例1中构建的表达载体pNAG06用化学转化法转化大肠杆菌K12及大肠杆菌突变体SG104，NAG01，NAG02，NAG03和NAG05，在含链霉素的LB平板(链霉素的浓度为50μg/ml)上筛选阳性克隆(能在该含链霉素的平板是生长的克隆)。阳性克隆菌株诱导后进行SDS-PAGE电泳如图4所示。图4中，各阳性克隆菌株中均表达得到19.1kDa的N-乙酰谷氨酸合成酶。与预期结果一致。其中，将pNAG06转化大肠杆菌K12得到的阳性克隆菌株命名为BW06，pNAG06转化大肠杆菌突变体SG104得到的阳性克隆菌株命名为SG10406，pNAG06转化大肠杆菌突变体NAG01得到的阳性克隆菌株命名为0106，pNAG06转化大肠杆菌突变体NAG02得到的阳性克隆菌株命名为0206，pNAG06转化大肠杆菌突变体NAG03得到的阳性克隆菌株命名为0306，pNAG06转化大肠杆菌突变体NAG05得到的阳性克隆菌株命名为0506。

实施例5、工程菌的自诱导培养及全细胞催化生成N-乙酰谷氨酸

一、工程菌的自诱导培养

以BW06，SG10406，0106，0206，0306，0506这6株菌中的任一菌株单独为工程菌，均同时进行如下实验：将产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌划线到含有质量百分比浓度为1.5g/100ml的琼脂和含50μg/mL的链霉素LB平板上，37℃培养12h。挑取平板上所长的单克隆，接种到含有50μg/mL的链霉素的液体LB培养基中，37℃过夜振荡培养，转速为220rpm；将过夜培养物以体积百分比为1％的接种量接种至自诱导培养基ZYM-5052(含50μg/ml链霉素)中，37℃振荡培养，转速220rpm，培养时间为12h。诱导后细胞，根据菌液的生长情况，取一定量菌体，于4℃，8000rpm离心10min，离心收集得到的菌体采用超声波破碎，得到细胞破碎液，对细胞破碎液进行离心分别取上清液和沉淀进行SDS-PAGE分析，如图4所示。

自诱导培养基ZYM-5052配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E(以下％均表示g/100ml)；

A.ZY：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉；

B.50×M：1.25M Na₂HPO₄，1.25M KH₂PO₄，2.5M NH₄Cl和0.25M Na₂SO₄；

C.50×5052：25％甘油，2.5％葡萄糖，10％L-阿拉伯糖；

D.500×MgSO₄；1M MgSO₄

E.1000×微量元素：50mM FeCl₃，20mM CaCl₂，10mM MnCl₂，10mM ZnSO₄，CoCl₂、NiCl₂、Na₂MoO₄、Na₂SeO₃和H₃BO₃各2mM。

二、全细胞催化生成N-乙酰谷氨酸

以BW06，SG10406，0106，0206，0306，0506这6株菌中的任一菌株单独为工程菌，均同时进行如下实验：

配制转化底物液1：1×M9salts(12.8g/L Na₂HPO₄.7H₂O，3g/L KH₂PO₄，0.5g/LNaCl，1g/L NH₄Cl)，50mM L-谷氨酸钠，50mM葡萄糖，用0.22μm滤膜(MilLipore公司)过滤除菌。将步骤一工程菌诱导后的细胞，根据菌液的生长情况，取一定量菌体，于4℃，4000rpm离心10min后，用1mL生理盐水(0.85％氯化钠水溶液)洗涤一次，弃上清后，再次重悬于1mL转化底物液1中，使其最终OD600nm值为30。将重悬后的菌液置于25×200(mm)(外径×长度)规格的试管中，于37℃，220rpm的摇床中振荡培养10h，将转化反应液于12000rpm离心5min，取上清，得到转化液。将转化液用蒸馏水稀释10倍，再用0.22μm滤膜过滤后，用HPLC检测N-乙酰谷氨酸产量。HPLC采用Agilent 1200高效液相色谱仪(配四元泵、DAD检测器和工作站)。色谱条件：Bio-Rad Aminex HPX-87H Column,300×7.8mm,9μm；流动相：5mMH₂SO₄，流速：0.5mL min^-1，柱温65摄氏度；进样量10μL，检测波长210nm。以N-乙酰谷氨酸标准品(生工生物工程(上海)股份有限公司，产品货号A604089)保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析。实验设置三次重复，结果取平均值。N-乙酰谷氨酸标准品的HPLC图谱如图5所示，从图中可见，N-乙酰谷氨酸标准品的保留时间为13.8min。

结果表明，上述6株工程菌的转化物产物的HPLC图谱中均有保留时间为13.8min的N-乙酰谷氨酸的特征峰。其中，0506的转化产物的HPLC图谱如图6。

各个工程菌转化液中N-乙酰谷氨酸的含量如表2。

表2各个工程菌转化液中N-乙酰谷氨酸产量

工程菌	N-乙酰谷氨酸产量(mM)	N-乙酰谷氨酸产量(g/L)
			BW06	2.36	0.45
SG10406	2.80	0.53
			0106	8.12	1.54
0206	8.09	1.53
			0306	14.22	2.69
0506	19.98	3.78

结果表明：6株工程菌中表现最好的是0506，说明组合ΔptsG::glkΔgalR::zglfΔpoxB::acsΔargBΔargAΔldhAΔpta性状对产N-乙酰谷氨酸有利，能够大大提高全细胞催化葡萄糖和谷氨酸产N-乙酰谷氨酸的效率。

由上述数据可见，本发明通过在大肠杆菌中引入外源的N-乙酰谷氨酸合成酶，开发了一套全细胞催化合成N-乙酰谷氨酸的方法。通过N-乙酰谷氨酸分解代谢途径的阻断和前体乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)供应的改善，提高了N-乙酰谷氨酸的合成效率。通过上述方法实现利用大肠杆菌从低廉原料葡萄糖和谷氨酸生产N-乙酰谷氨酸的合成在国内外尚属首次。

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

<130> GNCLN180871

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 169

<212> PRT

<213> Streptomyces coelicolor

<400> 1

Met Ser Asn Ala Ile Ser Val Arg Arg Ala Arg Thr Arg Asp Val Pro

1 5 10 15

Asp Val Arg Arg Leu Leu Asp Ala Tyr Val Arg Asp Arg Ile Leu Leu

20 25 30

Asp Lys Ala Met Val Thr Leu Tyr Glu Ser Ile Gln Glu Phe Trp Val

35 40 45

Ala Glu Arg Asp Asp Asn Ala Glu Val Val Gly Cys Gly Ala Leu His

50 55 60

Val Met Trp Glu Asp Leu Ala Glu Val Arg Thr Leu Ala Val Lys Pro

65 70 75 80

Gly Leu Lys Gly Ala Gly Val Gly His Lys Val Leu Glu Lys Leu Leu

85 90 95

Asp Thr Ala Arg Trp Leu Gly Val Arg Arg Val Phe Cys Leu Thr Phe

100 105 110

Glu Val Asp Phe Phe Gly Lys His Gly Phe Val Glu Ile Gly Glu Thr

115 120 125

Pro Val Asp Thr Asp Val Tyr Ala Glu Leu Leu Arg Ser Tyr Asp Glu

130 135 140

Gly Val Ala Glu Phe Leu Gly Leu Glu Arg Val Lys Pro Asn Thr Leu

145 150 155 160

Gly Asn Ser Arg Met Leu Leu His Leu

165

<210> 2

<211> 510

<212> DNA

<213> Streptomyces coelicolor

<400> 2

atgtcaaatg ccatcagcgt ccggcgggcc cgcaccaggg atgtcccgga cgtacgccgg 60

ctgctcgacg cgtacgtccg tgaccgtatc ctgctcgaca aagcgatggt gacgctttac 120

gagagcatcc aggagttctg ggtcgcggaa cgggacgaca acgccgaggt ggtcggctgc 180

ggcgcgctgc acgtgatgtg ggaagacctc gcggaagtgc ggactctcgc ggtgaagccc 240

ggtctgaagg gcgcgggcgt cggccacaag gtgctggaga agttgctgga cacggcacgc 300

tggctcggtg ttcgccgcgt tttctgtctg accttcgaag tggacttctt cggcaagcac 360

ggcttcgtgg agatcgggga gacgccggtc gacaccgatg tgtacgcgga gctgctgcgt 420

tcctatgacg agggcgttgc ggagttcctg gggctcgaac gagtgaaacc gaacaccttg 480

ggcaacagcc ggatgcttct gcatctgtga 510

<210> 3

<211> 3528

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

aatgtgcctg tcaaatggac gaagcaggga ttctgcaaac cctatgctac tccgtcaagc 60

cgtcaattgt ctgattcgtt accaattatg acaacttgac ggctacatca ttcacttttt 120

cttcacaacc ggcacggaac tcgctcgggc tggccccggt gcatttttta aatacccgcg 180

agaaatagag ttgatcgtca aaaccaacat tgcgaccgac ggtggcgata ggcatccggg 240

tggtgctcaa aagcagcttc gcctggctga tacgttggtc ctcgcgccag cttaagacgc 300

taatccctaa ctgctggcgg aaaagatgtg acagacgcga cggcgacaag caaacatgct 360

gtgcgacgct ggcgatatca aaattgctgt ctgccaggtg atcgctgatg tactgacaag 420

cctcgcgtac ccgattatcc atcggtggat ggagcgactc gttaatcgct tccatgcgcc 480

gcagtaacaa ttgctcaagc agatttatcg ccagcagctc cgaatagcgc ccttcccctt 540

gcccggcgtt aatgatttgc ccaaacaggt cgctgaaatg cggctggtgc gcttcatccg 600

ggcgaaagaa ccccgtattg gcaaatattg acggccagtt aagccattca tgccagtagg 660

cgcgcggacg aaagtaaacc cactggtgat accattcgcg agcctccgga tgacgaccgt 720

agtgatgaat ctctcctggc gggaacagca aaatatcacc cggtcggcaa acaaattctc 780

gtccctgatt tttcaccacc ccctgaccgc gaatggtgag attgagaata taacctttca 840

ttcccagcgg tcggtcgata aaaaaatcga gataaccgtt ggcctcaatc ggcgttaaac 900

ccgccaccag atgggcatta aacgagtatc ccggcagcag gggatcattt tgcgcttcag 960

ccatactttt catactcccg ccattcagag aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac 1020

attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct tctcgctaac caaaccggta accccgctta 1080

ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg 1140

tctataatca cggcagaaaa gtccacattg attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg 1200

ccatagcatt tttatccata agattagcgg atcctacctg acgcttttta tcgcaactct 1260

ctactgtttc tccatacccg ttttttgggc taacaggagg aattaaccat gggtacctct 1320

catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagcctcga gggtagatct 1380

ggtactagtg gtgaattcgg tgagctcggt ctgcagctgg tgccgcgcgg cagccaccac 1440

caccaccacc actaatacag attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt 1500

tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac 1560

gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat 1620

caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gtcgaccatg cagcgctctt 1680

ccgcttcctc gctcactgac tcgctacgct cggtcgttcg actgcggcga gcggtgtcag 1740

ctcactcaaa agcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataaagcc ggaaagaaca 1800

tgtgagcaaa aagcaaagca ccggaagaag ccaacgccgc aggcgttttt ccataggctc 1860

cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagcc agaggtggcg aaacccgaca 1920

ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 1980

accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 2040

catagctcac gctgttggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 2100

gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 2160

tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccattggtaa ctgatttaga 2220

ggactttgtc ttgaagttat gcacctgtta aggctaaact gaaagaacag attttggtga 2280

gtgcggtcct ccaacccact taccttggtt caaagagttg gtagctcagc gaaccttgag 2340

aaaaccaccg ttggtagcgg tggtttttct ttatttatga gatgatgaat caatcggtct 2400

atcaagtcaa cgaacagcta ttccgttact ctagatttca gtgcaattta tctcttcgcg 2460

gccgcctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 2520

accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagggaag cggtgatcgc 2580

cgaagtatcg actcaactat cagaggtagt tggcgtcatc gagcgccatc tcgaaccgac 2640

gttgctggcc gtacatttgt acggctccgc agtggatggc ggcctgaagc cacacagtga 2700

tattgatttg ctggttacgg tgaccgtaag gcttgatgaa acaacgcggc gagctttgat 2760

caacgacctt ttggaaactt cggcttcccc tggagagagc gagattctcc gcgctgtaga 2820

agtcaccatt gttgtgcacg acgacatcat tccgtggcgt tatccagcta agcgcgaact 2880

gcaatttgga gaatggcagc gcaatgacat tcttgcaggt atcttcgagc cagccacgat 2940

cgacattgat ctggctatct tgctgacaaa agcaagagaa catagcgttg ccttggtagg 3000

tccagcggcg gaggaactct ttgatccggt tcctgaacag gatctatttg aggcgctaaa 3060

tgaaacctta acgctatgga actcgccgcc cgactgggct ggcgatgagc gaaatgtagt 3120

gcttacgttg tcccgcattt ggtacagcgc agtaaccggc aaaatcgcgc cgaaggatgt 3180

cgctgccgac tgggcaatgg agcgcctgcc ggcccagtat cagcccgtca tacttgaagc 3240

tagacaggct tatcttggac aagaagaaga tcgcttggcc tcgcgcgcag atcagttgga 3300

agaatttgtc cactacgtga aaggcgagat caccaaggta gtcggcaaat aatgtctaac 3360

aattcgttca agccgagggg ccgcaagatc cggccacgat gacccggtcg tcggttcagg 3420

gcagggtcgt taaatagccg cttatgtcta ttgctggttt accggtttat tgactaccgg 3480

aagcagtgtg accgtgtgct tctcaaatgc ctgaggtttc aggcatgc 3528

<210> 4

<211> 473

<212> PRT

<213> Zymomonas mobilis

<400> 4

Met Ser Ser Glu Ser Ser Gln Gly Leu Val Thr Arg Leu Ala Leu Ile

1 5 10 15

Ala Ala Ile Gly Gly Leu Leu Phe Gly Tyr Asp Ser Ala Val Ile Ala

20 25 30

Ala Ile Gly Thr Pro Val Asp Ile His Phe Ile Ala Pro Arg His Leu

35 40 45

Ser Ala Thr Ala Ala Ala Ser Leu Ser Gly Met Val Val Val Ala Val

50 55 60

Leu Val Gly Cys Val Thr Gly Ser Leu Leu Ser Gly Trp Ile Gly Ile

65 70 75 80

Arg Phe Gly Arg Arg Gly Gly Leu Leu Met Ser Ser Ile Cys Phe Val

85 90 95

Ala Ala Gly Phe Gly Ala Ala Leu Thr Glu Lys Leu Phe Gly Thr Gly

100 105 110

Gly Ser Ala Leu Gln Ile Phe Cys Phe Phe Arg Phe Leu Ala Gly Leu

115 120 125

Gly Ile Gly Val Val Ser Thr Leu Thr Pro Thr Tyr Ile Ala Glu Ile

130 135 140

Arg Pro Pro Asp Lys Arg Gly Gln Met Val Ser Gly Gln Gln Met Ala

145 150 155 160

Ile Val Thr Gly Ala Leu Thr Gly Tyr Ile Phe Thr Trp Leu Leu Ala

165 170 175

His Phe Gly Ser Ile Asp Trp Val Asn Ala Ser Gly Trp Cys Trp Ser

180 185 190

Pro Ala Ser Glu Gly Leu Ile Gly Ile Ala Phe Leu Leu Leu Leu Leu

195 200 205

Thr Ala Pro Asp Thr Pro His Trp Leu Val Met Lys Gly Arg His Ser

210 215 220

Glu Ala Ser Lys Ile Leu Ala Arg Leu Glu Pro Gln Ala Asp Pro Asn

225 230 235 240

Leu Thr Ile Gln Lys Ile Lys Ala Gly Phe Asp Lys Ala Met Asp Lys

245 250 255

Ser Ser Ala Gly Leu Phe Ala Phe Gly Ile Thr Val Val Phe Ala Gly

260 265 270

Val Ser Val Ala Ala Phe Gln Gln Leu Val Gly Ile Asn Ala Val Leu

275 280 285

Tyr Tyr Ala Pro Gln Met Phe Gln Asn Leu Gly Phe Gly Ala Asp Thr

290 295 300

Ala Leu Leu Gln Thr Ile Ser Ile Gly Val Val Asn Phe Ile Phe Thr

305 310 315 320

Met Ile Ala Ser Arg Val Val Asp Arg Phe Gly Arg Lys Pro Leu Leu

325 330 335

Ile Trp Gly Ala Leu Gly Met Ala Ala Met Met Ala Val Leu Gly Cys

340 345 350

Cys Phe Trp Phe Lys Val Gly Gly Val Leu Pro Leu Ala Ser Val Leu

355 360 365

Leu Tyr Ile Ala Val Phe Gly Met Ser Trp Gly Pro Val Cys Trp Val

370 375 380

Val Leu Ser Glu Met Phe Pro Ser Ser Ile Lys Gly Ala Ala Met Pro

385 390 395 400

Ile Ala Val Thr Gly Gln Trp Leu Ala Asn Ile Leu Val Asn Phe Leu

405 410 415

Phe Lys Val Ala Asp Gly Ser Pro Ala Leu Asn Gln Thr Phe Asn His

420 425 430

Gly Phe Ser Tyr Leu Val Phe Ala Ala Leu Ser Ile Leu Gly Gly Leu

435 440 445

Ile Val Ala Arg Phe Val Pro Glu Thr Lys Gly Arg Ser Leu Asp Glu

450 455 460

Ile Glu Glu Met Trp Arg Ser Gln Lys

465 470

<210> 5

<211> 1422

<212> DNA

<213> Zymomonas mobilis

<400> 5

atgagttctg aaagtagtca gggtctagtc acgcgactag ccctaatcgc tgctataggc 60

ggcttgcttt tcggttacga ttcagcggtt atcgctgcaa tcggtacacc ggttgatatc 120

cattttattg cccctcgtca cctgtctgct acggctgcgg cttccctttc tgggatggtc 180

gttgttgctg ttttggtcgg ttgtgttacc ggttctttgc tgtctggctg gattggtatt 240

cgcttcggtc gtcgcggcgg attgttgatg agttccattt gtttcgtcgc cgccggtttt 300

ggtgctgcgt taaccgaaaa attatttgga accggtggtt cggctttaca aattttttgc 360

tttttccggt ttcttgccgg tttaggtatc ggtgtcgttt caaccttgac cccaacctat 420

attgctgaaa ttcgtccgcc agacaaacgt ggtcagatgg tttctggtca gcagatggcc 480

attgtgacgg gtgctttaac cggttatatc tttacctggt tactggctca tttcggttct 540

atcgattggg ttaatgccag tggttggtgc tggtctccgg cttcagaagg cctgatcggt 600

attgccttct tattgctgct gttaaccgca ccggatacgc cgcattggtt ggtgatgaag 660

ggacgtcatt ccgaggctag caaaatcctt gctcgtctgg aaccgcaagc cgatcctaat 720

ctgacgattc aaaagattaa agctggcttt gataaagcca tggacaaaag cagcgcaggt 780

ttgtttgctt ttggtatcac cgttgttttt gccggtgtat ccgttgctgc cttccagcag 840

ttagtcggta ttaacgccgt gctgtattat gcaccgcaga tgttccagaa tttaggtttt 900

ggagctgata cggcattatt gcagaccatc tctatcggtg ttgtgaactt catcttcacc 960

atgattgctt cccgtgttgt tgaccgcttc ggccgtaaac ctctgcttat ttggggtgct 1020

ctcggtatgg ctgcaatgat ggctgtttta ggctgctgtt tctggttcaa agtcggtggt 1080

gttttgcctt tggcttctgt gcttctttat attgcagtct ttggtatgtc atggggccct 1140

gtctgctggg ttgttctgtc agaaatgttc ccgagttcca tcaagggcgc agctatgcct 1200

atcgctgtta ccggacaatg gttagctaat atcttggtta acttcctgtt taaggttgcc 1260

gatggttctc cagcattgaa tcagactttc aaccacggtt tctcctatct cgttttcgca 1320

gcattaagta tcttaggtgg cttgattgtt gctcgcttcg tgccggaaac caaaggtcgg 1380

agcctggatg aaatcgagga gatgtggcgc tcccagaagt ag 1422

Claims

1.一种构建产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌的方法，包括如下步骤：将N-乙酰谷氨酸合成酶基因导入宿主菌得到产N-乙酰谷氨酸的重组菌，即为所述工程菌；所述宿主菌为突变型大肠杆菌或者野生型大肠杆菌；所述突变型大肠杆菌为下述A1)至A5)的任一种：

A1)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行下述a1)-a5)全部的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体：

a1)用葡糖激酶基因替换所述野生型大肠杆菌基因组中的D-葡萄糖PTS通透酶基因，用D-乳糖转运蛋白基因替换所述野生型大肠杆菌基因组中的半乳糖操纵子的调节子基因，用乙酰辅酶A合成酶基因替换所述野生型大肠杆菌基因组中的丙酮酸氧化酶基因；

a2)将所述野生型大肠杆菌基因组中的N-乙酰谷氨酸激酶基因敲除；

a3)将所述野生型大肠杆菌基因组中的N-乙酰谷氨酸合成酶基因敲除；

a4)将所述野生型大肠杆菌基因组中的乳酸脱氢酶基因敲除；

a5)将所述野生型大肠杆菌基因组中的乙酰磷酸转移酶基因敲除；

A2)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；

A3)所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述a1)和所述a2)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；

A4)所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1)、所述a2)和所述a3)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体；

A5)所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行所述a1)、所述a2)、所述a3)和所述a4)的改造后得到的所述野生型大肠杆菌的突变体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：被导入所述宿主菌的所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因所编码的蛋白质为如b1)至b2)中任一所示：

b1)氨基酸序列如序列表中序列1所示的蛋白质；

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述葡糖激酶基因编码下述c1)或c2)所示的蛋白质：

c1)由Acession号NP_416889所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c2)由Acession号NP_416889所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有葡萄糖激酶活性的由c1)衍生的蛋白质；

所述D-乳糖转运蛋白基因为来源于运动发酵单胞菌来源的D-乳糖转运蛋白基因，编码下述d1)或d2)所示的蛋白质：

d1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

d2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有D-乳糖转运蛋白活性的由d1)衍生的蛋白质；

所述乙酰辅酶A合成酶基因编码下述e1)或e2)所示的蛋白质：

e1)由Acession号NP_418493所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

e2)由Acession号NP_418493所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有乙酰辅酶A合成酶活性的由e1)衍生的蛋白质；

所述D-葡萄糖PTS通透酶基因编码下述f1)或f2)所示的蛋白质：

f1)由Acession号NP_415619所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

f2)由Acession号NP_415619所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有D-葡萄糖PTS通透酶活性的由f1)衍生的蛋白质；

所述半乳糖操纵子的调节子基因编码下述g1)或g2)所示的蛋白质：

g1)由Acession号NP_417314所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

g2)由Acession号NP_417314所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有半乳糖操纵子的调节子活性的由g1)衍生的蛋白质；

所述丙酮酸氧化酶基因编码下述h1)或h2)所示的蛋白质：

h1)由Acession号NP_415392所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

h2)由Acession号NP_415392所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有丙酮酸氧化酶活性的由h1)衍生的蛋白质；

所述N-乙酰谷氨酶激酶基因编码下述i1)或i2)所示的蛋白质：

i1)由Accession号NP_418394所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

i2)由Accession号NP_418394所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有N-乙酰谷氨酶激酶活性的由i1)衍生的蛋白质；

所述野生型大肠杆菌基因组中的所述N-乙酰谷氨酶合成酶基因编码下述j1)或j2)所示的蛋白质：

j1)由Accession号NP_417295所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

j2)由Accession号NP_417295所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有N-乙酰谷氨酶合成酶活性的由j1)衍生的蛋白质；

所述乳酸脱氢酶基因编码下述k1)或k2)所示的蛋白质：

k1)由Accession号NP_415898所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

k2)由Accession号NP_415898所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有乳酸脱氢酶活性的由k1)衍生的蛋白质；

所述乙酰磷酸转移酶基因编码下述l1)或l2)所示的蛋白质：

l1)由Accession号NP_416800所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：被导入所述宿主菌的所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因为下述b11)-b12)中的任一种DNA分子：

b12)所述N-乙酰谷氨酸合成酶的编码基因为与序列表中序列2所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述N-乙酰谷氨酸合成酶的DNA分子；

所述葡糖激酶基因为下述c11)或c12)所示的DNA分子：

c11)其编码序列是Gene ID:946858所示的DNA分子；

c12)与c11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述葡糖激酶的DNA分子；

所述运动发酵单胞菌来源的D-乳糖转运蛋白基因为下述d11)或d12)所示的DNA分子：

d11)其编码序列是序列表中序列5所示的DNA分子；

d12)与d11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述D-乳糖转运蛋白的DNA分子；

所述乙酰辅酶A合成酶基因为下述e11)或e12)所示的DNA分子：

e11)其编码序列是Gene ID:948572所示的DNA分子；

e12)与e11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述乙酰辅酶A合成酶的DNA分子；

所述D-葡萄糖PTS通透酶基因为下述f11)或f12)所示的DNA分子：

f11)其编码序列是Gene ID:945651所示的DNA分子；

f12)与f11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述D-葡萄糖PTS通透酶的DNA分子；

所述半乳糖操纵子的调节子基因为下述g11)或g12)所示的DNA分子：

g11)其编码序列是Gene ID:947314所示的DNA分子；

g12)与g11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述半乳糖操纵子的调节子的DNA分子；

所述丙酮酸氧化酶基因为下述h11)或h12)所示的DNA分子：

h11)其编码序列是Gene ID:946132所示的DNA分子；

h12)与h11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述丙酮酸氧化酶的DNA分子；

所述N-乙酰谷氨酶激酶基因为下述i11)或i12)所示的DNA分子：

i11)其编码序列是Gene ID：948464所示的DNA分子；

i12)与i11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述N-乙酰谷氨酶激酶的DNA分子；

所述野生型大肠杆菌基因组中的所述N-乙酰谷氨酶合成酶基因为下述j11)或j12)所示的DNA分子：

j11)其编码序列是Gene ID：947289所示的DNA分子；

j12)与j11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述N-乙酰谷氨酶合成酶的DNA分子；

所述乳酸脱氢酶基因为下述k11)或k12)所示的DNA分子：

k11)其编码序列是Gene ID：946315所示的DNA分子；

k12)与k11)所示的DNA分子具有90％以上同一性且编码所述乳酸脱氢酶的DNA分子；

所述乙酰磷酸转移酶基因为下述l1)或l2)所示的DNA分子：

l11)其编码序列是Gene ID：946778所示的DNA分子；

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因是通过含有N-乙酰谷氨酸合成酶基因表达盒的重组表达载体导入所述宿主菌中的；在所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因表达盒中，启动所述N-乙酰谷氨酸合成酶基因转录的启动子是pBAD启动子。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述pBAD启动子的序列如序列表中序列3的994-1266位所示。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述野生型大肠杆菌为大肠杆菌K12。

8.由权利要求1-7中任一所述的方法构建得到的产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌。

9.权利要求8所述的产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌在制备N-乙酰谷氨酸或精氨酸或其衍生物中的应用。

10.一种制备N-乙酰谷氨酸的方法，包括如下步骤：将权利要求8所述的产N-乙酰谷氨酸的基因工程菌经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后重组菌，用所述诱导后重组菌催化葡萄糖和谷氨酸反应，得到N-乙酰谷氨酸。