JP6321631B2 - ケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素及び使用方法 - Google Patents

ケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素及び使用方法 Download PDF

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Description

政府ライセンス権
本発明は、米国エネルギー省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ）により交付された契約第ＤＥ−ＡＲ００００００６号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を含むポリペプチド、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチド及びポリペプチドを含む宿主細胞、及びかかる組成物の使用方法に関する。
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年５月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／６４５，８３２号明細書及び２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７８７，４８０号明細書に関し、且つその優先権の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願はいずれも全体として参照により本明細書に援用される。
ＥＦＳ−ＷＥＢから電子的に提出された配列表に関する記載
本明細書と共に電子的に提出された配列表の内容（名称：２０１３０５１０＿ＣＬ５６３１ＷＯＰＣＴ＿ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ；サイズ：１，３１９，６１３バイト；作成日：２０１３年５月１０日）は、全体として参照により本明細書に援用される。
ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素は、バリン及びイソロイシンの生物学的生成に関与する。ＫＡＲＩ酵素はまた、操作された微生物を使用したイソブタノールの生成経路に有用であることも示されている（特許文献１及び２）。かかる微生物は、植物由来基質からのイソブタノールの生成に使用することができる。
イソブタノールの化学合成方法は公知であり（オキソ合成、一酸化炭素の接触水素化（非特許文献１）及びメタノールとｎ−プロパノールとのゲルベ縮合（非特許文献２）、しかし一方で、これらのプロセスは石油化学製品に由来する出発物質を使用し、概して高価である。さらに、イソブタノールの化学合成は、温室効果ガス排出を最小限に抑えるなどの環境上の利点が見込まれない。植物由来原材料からのイソブタノールの生成は、当該技術分野の進歩に相当し得る。
米国特許第７，８５１，１８８号明細書 米国特許第７，９９３，８８９号明細書
Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．７１６−７１９ Ｃａｒｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｔａｌ．Ａ．Ｃｈｅｍ．２２０：２１５−２２０，２００４
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を利用することのできるＫＡＲＩ酵素は、一般に使用される微生物細胞の既存の解糖経路及び他の代謝経路によって産生されるＮＡＤＨを生かすことができ、イソブタノール生成の向上をもたらし得る。米国特許第８，１２９，１６２号明細書及び米国特許出願公開第２０１０／０１９７５１９Ａ１号明細書は、様々な補因子（ＮＡＤＨ）利用能を有するＫＡＲＩ酵素の産生について記載している。しかしながら、当該技術分野では、イソブタノール生合成経路などの生成経路に好適なＫＡＲＩ活性を有する代替的ポリペプチドが、依然として必要とされている。
本明細書には、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが提供され、ここで配列番号２の５２位に対応する位置のアミノ酸はＤ又はＥであり、及びポリペプチドは、以下の領域のうちの１つ、すなわち、分子間二量体界面領域、ドメイン間界面領域、Ｎ−ドメイン表面ヘリックス領域、疎水性架橋領域、又はＣ末端テール領域の少なくとも１つに少なくとも１つの置換を含み、この少なくとも１つの置換は、配列番号２のＩ１３、Ｖ５３、Ａ６８、Ａ６９、Ａ７１、Ｇ７２、Ｖ７６、Ｓ８６、Ｌ８８、Ｋ９９、Ｙ１１３、Ｎ１１４、Ｖ１１７、Ｉ１２７、Ｉ１５２、Ｓ１５７、Ｖ１７１、Ｍ２３８、Ｙ２３９、Ｅ２６４、Ｎ２６７、Ａ２６８、Ｑ２７２、Ｒ２７５、Ａ２７７、Ｒ２８０、Ｙ２８６、Ｉ２９１、Ｓ２９２、Ａ２９５、Ｍ３０１、Ｒ３０６、Ｓ３２２、Ａ３２９、Ｋ３３５、又はＡ３３６に対応する位置にある。実施形態において、ポリペプチドは、位置Ｌ３３、Ｐ４７、Ｆ５０、Ｆ６１、Ｉ８０、又はＶ１５６の少なくとも１つに置換をさらに含む。実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％の同一性を含む。
本明細書には、配列番号１又は配列番号２との少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の同一性と、以下の位置：Ｙ２８６、Ｉ１５２、Ｓ３２２、Ｓ２９２、Ｉ２９１、Ｉ１３、Ｐ４７、Ｆ５０、Ｖ５３、Ａ２６８、Ｖ７６、Ａ３３６、Ｌ８８、Ａ７１、Ｇ７２、Ｍ３０１、Ｙ２３９、Ｙ１１３、Ｎ１１４、Ａ３２９、Ａ６９、Ａ２９５、Ｅ２６４、Ｒ２８０、Ｓ１５７、Ｍ２３８、Ｑ２７２、Ｋ３３５、Ｋ９９、Ｒ２７５、又はＲ３０６の少なくとも１つにおける置換とを含むポリペプチド変異体が提供される。実施形態において、ポリペプチドはケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有する。
従って、本明細書には、（ａ）配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１６、１１８、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１５９、１６０、１６１、３４６、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、又は３８２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｂ）配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１６、１１８、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１５９、１６０、１６１、３４６、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、又は３８２との少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の同一性を含むポリペプチド；又は（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の活性断片を含むポリペプチドが提供される。一部の実施形態では、微生物宿主細胞がかかるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、かかる微生物宿主細胞はイソブタノールを生成する。
本明細書に提供されるポリペプチドは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有し、且つ配列番号２との少なくとも約８５％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の同一性と、以下の置換：Ｙ２８６Ｆ、Ａ３３６Ｒ、Ｉ１５２Ｖ、Ｓ３２２Ａ、Ｓ２９２Ａ、Ｉ２９１Ｖの少なくとも１つ、又はそれらの組み合わせとを含むポリペプチド；又はかかるポリペプチドの活性断片を含む。実施形態において、ポリペプチドは、以下の置換：Ｉ１３Ｌ、Ｐ４７Ｙ、Ｆ５０Ａ、Ｖ５３Ａ、Ａ２６８Ｅ、Ｖ７６Ｉ、Ａ３３６Ｇ、Ｌ８８Ｖの少なくとも１つ、又はそれらの組み合わせをさらに含む。実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９と９５％又は少なくとも約９９％の同一性を含む。
本明細書に提供されるポリペプチドは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有し、且つ配列番号２との少なくとも約８５％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の同一性と、以下の置換：Ｙ２８６Ｆ、Ａ７１Ｋ、Ｇ７２Ｗ、Ａ３３６Ｒ、Ｉ１５２Ｖ、Ａ２６８Ｔ、Ａ３２９Ｅの少なくとも１つ、又はそれらの組み合わせとを含むポリペプチド；又はかかるポリペプチドの活性断片を含む。実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４と少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の同一性を含む。
本明細書に提供されるポリペプチドは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有し、且つ配列番号４１との少なくとも約８５％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の同一性と：以下の置換Ｍ３０１Ｉ、Ｙ２３９Ｈ、Ｙ１１３Ｆ、Ｓ３２２Ａ、Ａ７１Ｋ、Ｎ１１４Ｇ、Ａ３２９Ｒ、Ａ６９Ｔ、Ｎ１１４Ｓ、Ｇ７２Ｗ、Ａ２９５Ｖ、Ｅ２６４Ｋ、Ｒ２８０Ｄ、Ａ３２９Ｅ、Ｓ１５７Ｔ、Ｍ２３８Ｉ、Ｑ２７２Ｔ、Ｋ３３５Ｍ、Ｒ２８０Ｈの少なくとも１つ、又はそれらの組み合わせとを含むポリペプチド；又はかかるポリペプチドの活性断片を含む。実施形態において、ポリペプチドは、配列番号９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１６、１１８、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１５９、１６０、又は１６１と少なくとも約９５％又は少なくとも約９９％の同一性を含む。実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３６５、３６６、１５７、１５９、１５４、３７７、３６７、１２３、４２、又は４１のアミノ酸配列を含む。
本明細書に提供されるポリペプチドは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有し、且つ配列番号３４６との少なくとも約８５％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の同一性と、以下の置換：Ａ６８Ｅ、Ｉ１５２Ｖ、Ｙ２８６Ｆ、及びＡ３３６Ｒの少なくとも１つとを含むポリペプチドを含む。
本明細書に提供されるポリペプチドはまた、配列番号２又は野生型ケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素と比較したとき生合成経路生産性も増加し得る。生産性の増加には、ケトール酸レダクトイソメラーゼによって触媒される反応の速度など、経路のあるステップのパフォーマンスの増加、及び／又は阻害若しくは基質競合に対する感受性の低下が含まれ得る。生産性の増加はまた、配列番号２などの本明細書に記載される修飾を含まないポリペプチドと比較したときのイソブタノール生成の増加など、生成物収率の増加にも現れ得る。生産性の増加は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％乃至約１００％程度であり得る。
実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドにおいて、配列番号２の５２位に対応する位置のアミノ酸がＤ又はＥである。実施形態では、配列番号２の２４位に対応する位置のアミノ酸がＦであり；配列番号２の３３位に対応する位置のアミノ酸がＬであり；配列番号２の４７位に対応する位置のアミノ酸がＰであり；配列番号２の５０位に対応する位置のアミノ酸がＦであり；配列番号２の６１位に対応する位置のアミノ酸がＦであり；配列番号２の８０位に対応する位置のアミノ酸がＩであり；及び配列番号２の１５６位に対応する位置のアミノ酸がＶである。
また、本明細書には、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。また、かかるポリヌクレオチドを含む組換え微生物宿主細胞も提供される。また、本明細書には、かかるポリペプチドを含む組換え微生物宿主細胞も提供される。
本明細書には、３９４、３９６、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４１０、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０６、５０８、５１０、５１１、５１３、５１４、５１８、５１９、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４７、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７９、５８０、５８１、５８２、又は５８３の配列を含むポリヌクレオチドが提供される。実施形態において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、配列番号３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、又は５８４の配列を含む。実施形態において、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、配列番号５６７、５６８、５４９、５４４、５７９、５６９、５１３、４３２、又は４３１の配列を含む。また、本明細書に提供されるポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞も提供される。
一部の実施形態では、微生物宿主細胞は、低下又は消失したアセト乳酸レダクターゼ活性をさらに含む。実施形態において、宿主細胞は、ｆｒａ２における少なくとも１つの欠失、突然変異、及び／又は置換をさらに含む。実施形態において、宿主細胞は、以下の基質から生成物への変換：ピルベートからアセトラクテート；アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート；２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレート；α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド；及びイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換をさらに含む。実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１１、４１、及び４２からなる群から選択される。実施形態において、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３６５、３６６、１５７、１５９、１５４、３７７、３６７、１２３、４２、又は４１のアミノ酸配列を含む。実施形態において、宿主細胞は酵母宿主細胞である。実施形態において、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
また、本明細書には、提供されるポリペプチドを含む、アセトラクテートからジヒドロキシイソバレレートへの変換方法も提供される。また、提供されるポリペプチドを含む微生物宿主細胞を提供するステップと；このポリペプチドをアセトラクテートに接触させるステップとを含む、アセトラクテートからジヒドロキシイソバレレートへの変換方法も提供され、ここではジヒドロキシイソバレレートが生成される。また、イソブタノール、パントテネート、バリン、ロイシン、イソロイシン、３，３−ジメチルマレート、及び２−メチル−１−ブタノールからなる群から選択される生成物の生成方法も提供され、この方法は、本明細書に提供される組換え宿主細胞を提供するステップであって、組換え宿主細胞が生成物生合成経路を含む、ステップと；生成物が生成される条件下で微生物宿主細胞を炭素基質に接触させるステップとを含む。実施形態において、接触させるステップの少なくとも一部は嫌気的条件下で行われる。
４つの異なるイソブタノール生合成経路を示す。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、「ｆ」、「ｇ」、「ｈ」、「ｉ」、「ｊ」及び「ｋ」と表示されるステップは、以下に記載する基質から生成物への変換を表す。 蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（「ＰＦ５」；配列番号１）由来のＫＡＲＩと、その変異体（「ＪＥＡ１」；配列番号２；参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０／０１９７５１９号明細書に記載される）とのアミノ酸配列のアラインメントを示す。 ｐＬＨ５５６（ｐＨＲ８１−ＰＩｌｖ５−Ｐｆ５．ＫＡＲＩ）（配列番号１６２）のプラスミドマップである。プラスミドｐＬＨ５５６は、酵母用の２ミクロン複製起点、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用のｐＢＲ３２２起点、酵母における維持用のＬｅｕ２及びＵｒａ３栄養要求マーカー遺伝子、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における維持用のアンピシリン耐性マーカー遺伝子、並びにＰｍｅＩ及びＳｆｉＩ制限部位間にクローニングされたＫＡＲＩオープンリーディングフレームを含む。ＫＡＲＩプロモーターはｉｌｖ５ｐであり、ＫＡＲＩターミネーターはｉｌｖ５ｔである。 ｐＢＰ９１５（配列番号１６３）のプラスミドマップである。プラスミドｐＢＰ９１５は、酵母用の２ミクロン複製起点、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用のｐＭＢ１起点、及びファージＦ１用のＦ１起点を含む。このプラスミドｐＢＰ９１５は、酵母における維持用のＨｉｓ３栄養要求マーカー遺伝子、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における維持用のアンピシリン耐性マーカー遺伝子を含む。Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）株ＵＡ１５９由来のＩｌｖＤ（ＤＨＡＤ）遺伝子が、ＡｆｌＩＩ及びＮｏｔＩ制限部位間にクローニングされる。ｉｌｖＤプロモーターはＦＢＡｐであり、ｉｌｖＤターミネーターはＦＢＡｔである。ウマアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子もまた、ＧＰＭｐプロモーター及びＡＤＨｔターミネーターと共に存在する。 ｐＢＰ２０９０（ｐＨＲ８１−ＰＩｌｖ５ｐ．Ｋ９Ｄ３．ＴＥＦ１（Ｍ４）ｐ．ｉｌｖＤ）ベクター（配列番号１６４）のプラスミドマップである。プラスミドｐＢＰ２０９０は、酵母用の２ミクロン複製起点、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用のｐＢＲ３２２起点、酵母における維持用のＬｅｕ２及びＵｒａ３栄養要求マーカー遺伝子、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における維持用のアンピシリン耐性マーカー遺伝子、並びにＰｍｅＩ及びＳｆｉＩ制限部位間にクローニングされたＫＡＲＩ ＯＲＦを含む。ＫＡＲＩプロモーターはｉｌｖ５ｐであり、ＫＡＲＩターミネーターはｉｌｖ５ｔである。プラスミドはまた、ＡｆｌＩＩ及びＮｏｔＩ制限部位間にクローニングされたＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）株ＵＡ１５９由来のＩｌｖＤ（ＤＨＡＤ）遺伝子も含む。ｉｌｖＤプロモーターは修飾されたＴＥＦ１プロモーター（ＴＥＦ１（Ｍ４）ｐ）であり、ｉｌｖＤターミネーターはＦＢＡｔである。 イソブタノール生合成経路を示す。ステップ「ａ」は、ピルベートからアセトラクテートへの変換を表す。ステップ「ｂ」は、アセトラクテートからＤＨＩＶへの変換を表す。ステップ「ｃ」は、ジヒドロキシイソバレレート（ＤＨＩＶ）からケトイソバレレート（ＫＩＶ）への変換を表す。ステップ「ｄ」は、ＫＩＶからイソブチルアルデヒドへの変換を表す。ステップ「ｅ」は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を表す。ステップ「ｆ」は、アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシ−２−メチルブチレート（ＤＨＭＢ）への変換を表す。 指示される場合に実施例で配列番号１６３として提供されるプラスミドと組み合わせて使用されるベクターの一例（配列番号３４７；ＫＡＲＩ変異体６５１３９のコード配列を含む）のプラスミドマップである。このプラスミドは、図３に示すプラスミドと同様であるが、中のＢｓｍＢＩ部位を除去するため、Ｕｒａ３遺伝子がサイレント突然変異で修飾されている。 指示される場合に実施例で使用されるベクターの一例（配列番号３４９；ＫＡＲＩ変異体７６４３７「Ｒ９Ｅ８」のコード配列を含む）のプラスミドマップである。このプラスミドは図５に示すプラスミドと同様であるが、中のＢｓｍＢＩ部位を除去するため、Ｕｒａ３遺伝子がサイレント突然変異で修飾されている。 Ｐｆ５ ＫＡＲＩ二量体のホモロジーモデルを示す。単量体の一方において位置Ｉ１３、Ｉ１５２及びＳ１５７を指示する（矢印）。 Ｐｆ５ ＫＡＲＩのホモロジーモデル、単量体Ａのみを示す。Ｎ−ドメイン（残基１〜１８１）及びＣ−ドメイン（残基１８２〜３２７）を示す。図１０Ａでは、分子間二量体界面における位置Ｍ２３８、Ｙ２３９、Ｅ２６４、Ｎ２６７、Ａ２６８、Ｑ２７２、Ａ２７７、Ｒ２８０、Ｙ２８６、Ｉ２９１、Ｓ２９２、Ｍ３０１、Ｓ３２２の場所を示す。図１０Ｂでは、ドメイン間界面領域における位置Ｙ１１３、Ｎ１１４、Ｎ１１４、Ｉ２９１、Ｓ２９２、及びＡ２９５の場所を示す。 図１１Ａは、モデル化したヌクレオチド結合領域の一部であるＰ４７、Ｐ５０、Ｖ５３、Ｔ８０、及びＬ８８の位置を示す。 図１１Ｂは、Ｎ−ドメインの表面にある２つの短いターンのαヘリックス（位置６４〜７３）における位置６８、６９、７１及び７２を示す。このモデルの残基７６は疎水性相互作用で残基７０の側鎖と相互作用する。この短いヘリックスのＮ末端部分はモデル化したヌクレオチド結合領域の残基４７部分の主鎖に詰め込まれる。 Ｎ−ドメイン疎水性架橋領域における位置Ｃ３３、Ｌ６１、Ｉ１２７、Ｉ１５２、及びＶ１７１を示す。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。矛盾がある場合、それらの定義を含む本願に従う。同様に、文脈上特に必要でない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。本明細書で言及される全て刊行物、特許及び他の参考文献が、特許又は特許公開の特定の節のみを参照によって援用することが指示されない限り、個別の各刊行物又は特許出願が参照によって援用されると具体的且つ個別的に指示されたものとして、あらゆる目的から全体として参照により援用される。
本発明の実施又は試験では、本明細書に開示されるものと同様の又は等価な方法及び材料を用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に開示する。材料、方法及び例は、あくまでも例示に過ぎず、限定する意図はない。本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明から、及び特許請求の範囲から、明らかとなるであろう。
本発明をさらに定義するため、以下の用語、略語及び定義を提供する。
本明細書に開示されるポリペプチドに関連して「〜に由来する」は、示される生物中に存在するＫＡＲＩのアミノ酸配列に基づき合成される配列、並びにその生物の遺伝物質から直接クローニングされる配列を包含することは理解されるであろう。
本明細書で使用されるとき、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「〜を包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｓ）」、「〜を有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」又は「〜を含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又はこれらの任意の他の変化形は、挙げられる完全体又は完全体群の包含を意味するが、しかし任意の他の完全体又は完全体群の排除を意味するものではないことが理解され、非排他的又は開放型であるものと意図される。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限られず、明示的には列挙されない、又はかかる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に固有の他の要素を包含し得る。さらに、反する旨が明記されない限り、「又は」は包含的な「又は」を指し、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢでは、以下のいずれか一つが満たされる：Ａが真であり（又は存在し）且つＢが偽である（又は存在しない）、Ａが偽であり（又は存在せず）且つＢが真である（又は存在する）、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）。
本明細書で使用されるとき、本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して用いられるとおりの用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」、又は「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」若しくは「〜からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」などの変化形は、任意の記載される完全体又は完全体群の包含を示し、しかし特定される方法、構造、又は組成物にさらなる完全体又は完全体群を加えることはできないことを示す。
本明細書で使用されるとき、本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して用いられるとおりの用語「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、又は「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」若しくは「〜から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの変化形は、任意の記載される完全体又は完全体群の包含、及び特定される方法、構造又は組成物の基本的な又は新規の特性を実質的に変化させることのない任意の記載される完全体又は完全体群の任意の包含を示す。特許審査便覧（Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．）第２１１１．０３章を参照のこと。
また、本発明のエレメント又は構成要素に先行する不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、インスタンスの数に関して、すなわちエレメント又は構成要素の出現に関して、非制限的なものであることが意図される。従って「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は少なくとも１つを含むものとして読まれなければならず、単数形の語形のエレメント又は構成要素はまた、数値が明らかに単数であることを意味しない限り、その複数形も含む。
用語「発明」又は「本発明」は、本明細書で使用されるとき、非制限的な用語であり、特定の発明のいかなる単一の実施形態も参照することを意図せず、しかし、提示されるとおりの、又は後に補正及び補足されるとおりの特許請求の範囲に記載され、又は本明細書に記載されるとおりの、あらゆる可能な実施形態を包含する。
本明細書で使用されるとき、用いられる本発明の成分又は反応物の量を修飾する用語「約」は、例えば、現実の世界で濃縮物の作製又は溶液のために用いられる典型的な計測及び液体操作の手順；それらの手順における不注意による誤り；組成物の作製又は方法の実行のために用いられる成分の製造、供給源、又は純度の違いなどを通じて生じ得る数量のばらつきを指す。用語「約」はまた、特定の初期混合物によってもたらされる組成物の平衡条件の違いに起因して異なる量も包含する。用語「約」によって修飾されるか否かにかかわらず、特許請求の範囲はそれらの量と等価な量を含む。一実施形態において、用語「約」は、報告される数値の１０％以内、又は報告される数値の５％以内を意味する。
用語「イソブタノール生合成経路」は、イソブタノールを生成する酵素経路を指す。例えば、特定のイソブタノール生合成経路が米国特許第７，８５１，１８８号明細書（これは本明細書に全体として参照により援用される）に開示される。特定のイソブタノール生合成経路を図１に例示し、本明細書で説明する。時に「イソブタノール生合成経路」は、「イソブタノール生成経路」と同義語として使用される。
用語「ブタノール」は、本明細書で使用されるとき、２−ブタノール、１−ブタノール、イソブタノール又はそれらの混合物を指す。イソブタノールは２−メチル−１−プロパノールとしても知られる。
「操作されたアルコール生成経路」（操作されたブタノール又はイソブタノール生成経路など）を含む組換え宿主細胞は、宿主細胞に通常存在するものとは違う方法でアルコールを生成する修飾された経路を含む宿主細胞を指す。かかる違いには、その宿主細胞による生成が典型的でないアルコールの生成、又は増加した若しくはより効率的な生成が含まれる。
用語「異種生合成経路」は、本明細書で使用されるとき、生成物を生成する酵素経路であって、酵素の少なくとも１つが、その生合成経路を含む宿主細胞にとって内因性でない酵素経路を指す。
用語「抽出剤」は、本明細書で使用されるとき、発酵ブロスからブタノールを抽出するために用いることのできる１つ以上の溶媒を指す。
用語「有効力価」は、本明細書で使用されるとき、発酵培地１リットルあたりの発酵によって生成される特定のアルコール（例えばブタノール）の総量を指す。ブタノールの総量には、以下が含まれる：（ｉ）発酵培地中のブタノールの量；（ｉｉ）有機抽出剤から回収されるブタノールの量；及び（ｉｉｉ）気相から回収されるブタノールの量（ガスストリッピングが用いられる場合）。
用語「有効速度」は、本明細書で使用されるとき、発酵１時間につき発酵培地１リットルあたりの発酵によって生成されるブタノールの総量を指す。
用語「有効収率」は、本明細書で使用されるとき、生体触媒によって消費される発酵性炭素基質１単位あたりに生成されるブタノールの量を指す。
用語「分離」は、本明細書で使用されるとき、「回収」と同義語であり、初期混合物から化学的化合物を除去して、初期混合物中の化合物の純度又は濃度と比べてより高純度で、又はより高濃度で化合物を得ることを指す。
用語「水相」は、本明細書で使用されるとき、発酵ブロスを水不混和性有機抽出剤と接触させることにより得られる二相混合物の水相を指す。本明細書に記載される方法の実施形態で発酵抽出を含むものでは、このとき用語「発酵ブロス」が、具体的には二相発酵抽出における水相を指す。
用語「有機相」は、本明細書で使用されるとき、発酵ブロスを水不混和性有機抽出剤と接触させることにより得られる二相混合物の非水相を指す。
用語「ＰＤＣ−」、「ＰＤＣノックアウト」、又は「ＰＤＣ−ＫＯ」は、本明細書で使用されるとき、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）をコードする遺伝子の発現を不活性化又は低下させて細胞からピルビン酸デカルボキシラーゼ酵素活性を実質的に又は完全に欠損させる遺伝子修飾を有する細胞を指す。細胞が２つ以上の発現した（活性な）ＰＤＣ遺伝子を有する場合、活性なＰＤＣ遺伝子の各々が不活性化されるか、又は最小限の発現を有し、これによりＰＤＣ−細胞が生じ得る。
用語「ポリヌクレオチド」は、単数の核酸並びに複数の核酸を包含することが意図され、核酸分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、完全長ｃＤＮＡ配列、又は非翻訳５’及び３’配列及びコード配列を含むその断片のヌクレオチド配列を含むことができる。ポリヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖であるか、又はより典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、又は代謝的に修飾された形態を包含する。
ポリヌクレオチド配列は「単離されている」と称されることもあり、そこではポリヌクレオチド配列は、その天然環境から取り出されている。例えば、ベクターに含まれるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチド又はポリペプチド断片をコードする異種ポリヌクレオチドは、本発明の目的上、単離されていると考えられる。単離されているポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中に維持される組換えポリヌクレオチド又は溶液中の（部分的又は実質的に）精製されているポリヌクレオチドが含まれる。本発明に係る単離されているポリヌクレオチド又は核酸には、合成的に生成されるかかる分子がさらに含まれる。ＤＮＡポリマーの形態の単離されているポリヌクレオチド断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから構成され得る。
用語「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消費アッセイ」は、ＫＡＲＩ酵素の比活性を測定する酵素アッセイを指し、酵素反応からのＫＡＲＩ補因子ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消失の計測を伴う。かかるアッセイは、全体として参照により本明細書に援用されるＡｕｌａｂａｕｇｈ ａｎｄ Ｓｃｈｌｏｓｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：２８２４−２８３０，１９９０に記載されている。
用語「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨのいずれかを指す。
「ＫＡＲＩ」は、酵素ケトール酸レダクトイソメラーゼの略記である。
ＮＡＤＰＨのアデノシル２’−リン酸に関連してＫＡＲＩ酵素の様々なアミノ酸残基の位置を参照するときの用語「近接性」は、酵素構造の三次元モデルにおいて、酵素に結合したＮＡＤＰＨのアデノシル２’−リン酸のリン原子の約４．５Å以内にあるアミノ酸を意味する。
用語「ケトール酸レダクトイソメラーゼ」（略記「ＫＡＲＩ」）、及び「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」は、同義的に使用され、ＥＣ番号ＥＣ １．１．１．８６（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）に分類される（Ｓ）−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの反応の触媒能を有する酵素を指す。ＫＡＲＩは様々な生物に見られ、種間のアミノ酸配列の比較では、この酵素に２種類あることが明らかになっている：真菌及び多くの細菌に見られる短い形態（クラスＩ）、及び植物に典型的な長い形態（クラスＩＩ）。クラスＩ ＫＡＲＩは、典型的には３３０〜３４０アミノ酸残基を有する。長い形態のＫＡＲＩ酵素は約４９０アミノ酸残基を有する。しかしながら、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの一部の細菌は、そのアミノ酸配列が植物に見られるものと認識可能な程度に異なる長い形態を有する。ＫＡＲＩはｉｌｖＣ遺伝子によりコードされ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の細菌が最少培地で成長するのに必須の酵素である。クラスＩＩ ＫＡＲＩは、概して、２２５残基のＮ末端ドメインと２８７残基のＣ末端ドメインとからなる。補因子結合部位が含まれるＮ末端ドメインはαβ構造を有し、他のピリジンヌクレオチド依存性オキシドレダクターゼに見られるドメインに似ている。Ｃ末端ドメインは、ほぼ全体がα−ヘリックスからなる。
ＫＡＲＩ酵素は、例えば、米国特許第７，９１０，３４２号明細書及び同第８，１２９，１６２号明細書及び米国特許出願公開第２０１０／０１９７５１９号明細書（これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される）に記載される。
ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素は、操作された微生物を使用したイソブタノールの生成経路において有用である（本明細書に全体として参照により援用される米国特許第７，８５１，１８８号明細書及び同第７，９９３，８８９号明細書）。
ＮＡＤＨを利用することができるＫＡＲＩは、最も一般的に用いられる微生物細胞における既存の解糖経路及び他の代謝経路により生成されるＮＡＤＨを活用することができ、イソブタノール生成の改善をもたらし得る。Ｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３３８：８３−８９，１９９７）が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離されたケトール酸レダクトイソメラーゼの補因子スイッチングを考察している。米国特許出願公開第２００９／０１６３３７６号明細書及び同第２０１０／０１９７５１９号明細書（これらの各々は、全体として参照により本明細書に援用される）は、ＮＡＤＨを用いることができるＫＡＲＩ酵素の変異体について記載している。米国特許出願公開第２０１０／０１４３９９７号明細書（これは全体として参照により本明細書に援用される）は、ＮＡＤＨに対するＫＭ値が改善された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異体について記載している。
用語「ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性」及び「ＫＡＲＩ活性」は、（Ｓ）−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒する能力を指す。
用語「アセト乳酸シンターゼ」は、ピルベートからアセトラクテート及びＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。アセトラクテートは２つの立体異性体（（Ｒ）及び（Ｓ））を有する；この酵素は、生体系によって作られる（Ｓ）−異性体を選好する。特定のアセト乳酸シンターゼは、ＥＣ番号２．２．１．６（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）により知られる。これらの酵素は数多くの供給源から入手可能であり、限定はされないが、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号１６５）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（配列番号１６６）及びラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。
用語「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」は、２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換を触媒する酵素を指す。特定のアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼはＥＣ番号４．２．１．９により知られる。これらの酵素は無数の微生物から入手可能であり、限定はされないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｍ．マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（配列番号１６７）、及びミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（配列番号１６８）が挙げられる。
用語「分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ」は、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド及びＣＯ２への変換を触媒する酵素を指す。特定の分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼはＥＣ番号４．１．１．７２により知られ、数多くの供給源から入手可能であり、限定はされないが、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（配列番号１６９）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、マクロコッカス・カセオリチクス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（配列番号１７１）、及びリステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）（配列番号１７０）が挙げられる。
用語「分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素を指す。特定の分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼはＥＣ番号１．１．１．２６５により知られるが、他のアルコールデヒドロゲナーゼ（具体的には、ＥＣ １．１．１．１又は１．１．１．２）に分類されることもある。これらの酵素はＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）及び／又はＮＡＤＰＨを電子供与体として利用し、数多くの供給源から入手可能であり、限定はされないが、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｂ．インディカ（Ｂ．ｉｎｄｉｃａ）（配列番号１７３）、Ａ．キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）（配列番号１７２）が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「ＤＨＭＢ」は、２，３−ジヒドロキシ−２−メチルブチレートを指す。ＤＨＭＢには、２Ｓ，３Ｓ配置を有する「ファストＤＨＭＢ」と、２Ｓ，３Ｒ配置を有する「スローＤＨＭＢ」とが含まれる。全体として参照により本明細書に援用されるＫａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１１５−１２０（１９９５）を参照されたく、ファストＤＨＭＢはアングリセリン酸（ａｎｇｌｉｃｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、及びスローＤＨＭＢはチグリセリン酸（ｔｉｇｌｉｃｅｒｉｃ ａｃｉｄ）と称される。
本明細書で使用されるとき、「低下した活性」は、その活性の低下をもたらす変化が起こる以前のポリペプチドの同じ生物活性と比較したときの、ポリペプチドの既知の生物活性における任意の計測可能な減少を指す。かかる変化には、本明細書に記載されるとおりのポリペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾が含まれ得る。本明細書に開示されるポリペプチドの活性の低下は、当該技術分野において公知の及び／又は本明細書に開示される方法により決定することができる。
本明細書で使用されるとき、「消失した活性」は、その活性の消失をもたらす変化が起こる以前のポリペプチドの同じ生物活性と比較したときの、ポリペプチドの既知の生物活性が完全に消えることを指す。かかる変化には、本明細書に記載されるとおりのポリペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾が含まれ得る。消失した活性には、その活性の消失をもたらす変化が起こる以前のポリペプチドの同じ生物活性と比較したときに計測できないポリペプチドの生物活性が含まれる。本明細書に開示されるポリペプチドの活性の消失は、当該技術分野において公知の及び／又は本明細書に開示される方法により決定することができる。
用語「炭素基質」又は「発酵性炭素基質」は、本発明の宿主生物により代謝されることが可能な炭素源、特に、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、及び一炭素基質からなる群から選択される炭素源又はこれらの混合物を指す。炭素基質の非限定的な例は本明細書に提供され、限定はされないが、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、エタノール、ラクテート、スクシネート、グリセロール、二酸化炭素、メタノール、グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、アラビノース、デキストロース、又はこれらの混合物が挙げられる。他の炭素基質としては、エタノール、ラクテート、スクシネート、又はグリセロールを挙げることができる。
「発酵ブロス」は、本明細書で使用されるとき、水、糖類（発酵性炭素源）、溶解固形物（存在する場合）、アルコールを生成する微生物、生成物アルコール、及び存在する微生物により糖類がアルコール、水及び二酸化炭素（ＣＯ２）になる反応によって生成物アルコールが作られる発酵槽中に保持される材料の他のあらゆる構成要素の混合物を意味する。時に、本明細書で使用されるとき用語「発酵培地」及び「発酵混合物」が、「発酵ブロス」と同義語として用いられ得る。
「バイオマス」は、本明細書で使用されるとき、発酵性糖を提供する加水分解性デンプンを含有する天然生成物を指し、これには、セルロースを含み、場合によりヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類、二糖類、及び／又は単糖類をさらに含む任意の１つ又は複数のセルロース系又はリグノセルロース系材料が含まれる。バイオマスはまた、タンパク質及び／又は脂質などのさらなる成分も含むことができる。バイオマスは単一の供給源に由来してもよく、又はバイオマスは、２つ以上の供給源に由来する混合物を含んでもよい。例えばバイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎葉との混合物、又は草と葉との混合物を含み得る。バイオマスとしては、限定はされないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙スラッジ、庭ごみ、木材、及び林業廃棄物が挙げられる。バイオマスの例としては、限定はされないが、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ皮などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、草類、小麦、ライ麦、小麦わら、大麦、大麦わら、乾草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀粒の製粉から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木及び潅木、野菜、果実、花、家畜糞尿、及びこれらの混合物が挙げられる。
用語「好気的条件」は、本明細書で使用されるとき、酸素の存在下における成長条件を意味する。典型的には、大気とのガス交換が起こるように培地を撹拌することによって酸素が補充される。
用語「微好気的条件」は、本明細書で使用されるとき、低い酸素濃度（すなわち、通常の大気中酸素濃度未満）での成長条件を意味する。「微好気的条件」には、微生物の接種時に培地は必ずしも酸素不含というわけではないものの、培地中に存在する酸素が消費され、且つガス交換によるその補充が、例えば限定的な撹拌及び／又は大気からの容器の遮断により制限される条件が含まれる。
用語「嫌気的条件」は、本明細書で使用されるとき、酸素の非存在下における成長条件を意味する。
用語「単離核酸分子」、「単離核酸断片」及び「遺伝子コンストラクト」は同義的に使用され、場合により合成の、非天然の又は改変されたヌクレオチド塩基が含まれる、一本鎖又は二本鎖であるＲＮＡ又はＤＮＡの重合体を意味し得る。ＤＮＡの重合体の形態の単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから構成され得る。
用語「アミノ酸」は、タンパク質又はポリペプチドの基本的な化学構造単位を指す。本明細書では、以下の略記法を使用して特定のアミノ酸を識別する。
Figure 0006321631
用語「遺伝子」は、特定のタンパク質として発現する能力を有する核酸断片を指し、場合によりそのコード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）及びその後続の調節配列（３’非コード配列）を含む。「天然遺伝子」は、その独自の調節配列を有して天然で見出されるとおりの遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子でない任意の遺伝子を指し、天然で同時に見出されることのない調節配列及びコード配列を含む。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来するが、天然で見出されるものとは異なる形で並んだ調節配列及びコード配列を含み得る。「内因性遺伝子」は、微生物のゲノムにおいてその天然の位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、通常は宿主微生物に見出されないが、遺伝子移入によって宿主微生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然微生物に挿入された天然遺伝子、又はキメラ遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。
本明細書で使用されるとき、「天然」は、自然の中で、存在する場合にはその独自の調節配列を備えて見出されるとおりの、ポリヌクレオチド、遺伝子、又はポリペプチドの形態を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「コード配列」又は「コード領域」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、その範囲内、又はその下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステム−ループ構造が含まれ得る。
本明細書で使用されるとき、「内因性」は、生物又は生物のゲノムにおいてその自然の位置にあるポリヌクレオチド、遺伝子又はポリペプチドの天然形態を指す。「内因性ポリヌクレオチド」は、生物のゲノムにおいてその自然の位置にある天然ポリヌクレオチドを含む。「内因性遺伝子」は、生物のゲノムにおいてその自然の位置にある天然遺伝子を含む。「内因性ポリペプチド」は、生物のゲノムにおいてその自然の位置にある天然ポリヌクレオチド又は遺伝子から転写及び翻訳される、生物においてその自然の位置にある天然ポリペプチドを含む。
用語「異種」は、ポリヌクレオチド、遺伝子、又はポリペプチドに関連して使用されるとき、通常は宿主生物に見出されないポリヌクレオチド、遺伝子、又はポリペプチドを指す。「異種」はまた、対応する天然遺伝子と異なる形態で、例えば生物のゲノムにおけるその自然の位置以外で供給源生物に再導入される天然コード領域、又はその一部も含む。異種ポリヌクレオチド又は遺伝子は宿主生物に、例えば遺伝子移入によって導入することができる。異種遺伝子は、天然宿主に再導入される非天然調節領域を有する天然コード領域を含むことができる。例えば、異種遺伝子は、天然宿主に再導入される非天然調節領域を含むキメラ遺伝子の一部である天然コード領域を含むことができる。「異種ポリペプチド」は、対応する天然ポリペプチドと異なる形態で供給源生物に再導入される天然ポリペプチドを含む。
「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。
本明細書で使用されるとき、用語「修飾」は、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの活性の低下又は消失をもたらす本明細書に開示されるポリヌクレオチドの変化、並びにポリペプチドの活性の低下又は消失をもたらす本明細書に開示されるポリペプチドの変化を指す。かかる変化は、当該技術分野において公知の方法により生じさせることができ、限定はされないが、欠失、突然変異（例えば、自発的突然変異生成、ランダム突然変異生成、ミューテーター遺伝子により引き起こされる突然変異生成、又はトランスポゾン突然変異生成）、置換、挿入、下方制御、細胞位置の改変、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの状態の改変（例えば、メチル化、リン酸化又はユビキチン化）、補因子の除去、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡの導入、干渉ＲＮＡ／ＤＮＡの導入、化学修飾、共有結合修飾、紫外線又はＸ線の照射、相同組換え、有糸分裂組換え、プロモーター交換法、及び／又はこれらの組み合わせが挙げられる。どのヌクレオチド又はアミノ酸残基を修飾することができるかを決定する際の指針は、特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列を、例えば酵母又は細菌の、相同ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列と比較し、且つ高度な相同性の領域（保存領域）又はコンセンサス配列に設ける修飾の数を最大化することにより見出すことができる。
「調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、その範囲内、又はその下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列には、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、転写終結シグナル、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステム−ループ構造が含まれ得る。
用語「プロモーター」は、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御する能力を有する核酸配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは全体として天然遺伝子に由来してもよく、又は天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてもよく、又はさらには合成核酸セグメントを含んでもよい。当業者は、異なるプロモーターが遺伝子の発現を、異なる組織又は細胞型で、又は異なる発生段階で、又は異なる環境条件若しくは生理学的条件に応答して誘導し得ることを理解する。ほとんどの細胞型でほとんどの場合に遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。他方で「誘導性プロモーター」は、そのプロモーターがプロモーター特異的シグナル又は分子により誘導又は惹起されると、遺伝子の発現を生じさせる。さらに、ほとんどの場合に調節配列の正確な境界は完全には定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有し得ることが認識される。例えば、「ＦＢＡ１プロモーター」は、ＦＢＡ１遺伝子のプロモーター領域に由来する断片を指して使用され得ることは理解されるであろう。
用語「ターミネーター」は、本明細書で使用されるとき、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ポリアデニル化認識配列及びｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に作用することが可能な調節シグナルをコードする他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常は、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に作用することによって特徴付けられる。３’領域は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼし得る。ほとんどの場合に調節配列の正確な境界は完全には定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同じターミネーター活性を有し得ることが認識される。例えば、「ＣＹＣ１ターミネーター」は、ＣＹＣ１遺伝子のターミネーター領域に由来する断片を指して使用され得ることは理解されるであろう。
用語「作動可能に連結された」は、単一の核酸断片上の核酸配列が、一方の機能が他方によって影響を受けるように関係付けられていることを指す。例えばプロモーターは、コード配列の発現が生じることが可能な場合、当該のコード配列と作動可能に連結されている（すなわち、そのコード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センス方向又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結される。
用語「発現」は、本明細書で使用されるとき、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指し得る。
用語「過剰発現」は、本明細書で使用されるとき、同じ又は関連する遺伝子の内因性発現より高度な発現を指す。異種遺伝子は、その発現が同等の内因性遺伝子の発現より高度である場合、過剰発現する。用語の過剰発現は、宿主細胞における核酸又はタンパク質レベルの増加を指す。従って、過剰発現は、宿主細胞における内因性配列の転写又は翻訳レベルの増加によって生じ得るか、又は宿主細胞への異種配列の導入によって生じ得る。過剰発現はまた、核酸又はタンパク質配列の安定性の増加によっても生じ得る。
本明細書で使用されるとき、用語「形質転換」は、核酸断片の宿主微生物のゲノムへの導入を指し、これにより遺伝的に安定な遺伝形質がもたらされる。形質転換された核酸断片を含む宿主微生物は、「トランスジェニック」又は「組換え」又は「形質転換」微生物と称される。
用語「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を運び、且つ通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。かかるエレメントは、任意の供給源に由来する、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの、線状又は環状の、自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であって、多数のヌクレオチド配列がつなぎ合わされ、又は組み換えられることにより、選択された遺伝子産物のプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入する能力を有する固有の構築物となった配列であり得る。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、且つその外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、且つその外来遺伝子に加えて、外来宿主における当該遺伝子の発現の亢進を可能にするエレメントを有する特定のベクターを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「コドン縮重」は、コードされるポリペプチド中のアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変動を許容する遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの利用において特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」を十分に理解している。従って、宿主細胞における発現を改良するために遺伝子を合成する場合、遺伝子のコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。
用語「コドンが最適化された」は、それが様々な宿主を形質転換するための核酸分子の遺伝子又はコード領域に関連するとき、そのＤＮＡによりコードされるポリペプチドを改変することなく宿主生物の典型的なコドン使用を反映させるための、核酸分子の遺伝子又はコード領域におけるコドンの改変を指す。かかる最適化は、コドンのうちの少なくとも１つ、又は２つ以上、又は多数を、当該生物の遺伝子でより頻繁に使用される１つ又は複数のコドンに置き換えることを含む。
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列の逸脱により、遺伝子をコードする配列の変化が可能となる。各コドンは３つのヌクレオチドからなり、且つＤＮＡを構成するヌクレオチドは４つの特定の塩基に限られるため、ヌクレオチドには６４通りの可能な組み合わせがあり、そのうちの６１通りがアミノ酸をコードする（残りの３つのコドンは、翻訳を終結させるシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝子コード」を、本明細書では表１に再掲する。結果として、多くのアミノ酸が２つ以上のコドンによって指定される。例えば、アミノ酸アラニン及びプロリンは４つ、セリン及びアルギニンは６つのトリプレットによりコードされるが、一方トリプトファン及びメチオニンはただ１つのトリプレットによりコードされる。この縮重により、ＤＮＡベースの組成が、ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変することなく、広い範囲にわたって変化を有することが可能となる。
Figure 0006321631
多くの生物が、成長するペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードするための特定のコドン使用に偏りを示す。コドン選択、又はコドンバイアスは、生物間でのコドン使用の違いであり、遺伝子コードの縮重により得られるもので、多くの生物間で十分に裏付けられている。コドンバイアスは、多くの場合にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、この効率が次には、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存するものと考えられる。細胞において選択的ｔＲＮＡが優勢であることは、概して、ペプチド合成で最も高頻度に使用されるコドンの反映である。従って遺伝子は、コドン最適化に基づき、所与の生物において最適な遺伝子発現となるよう適合させることができる。
幅広い動物種、植物種及び微生物種に利用可能な多数の遺伝子配列を所与として、相対的なコドン使用頻度を計算することが可能である。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００８年３月２０日アクセス）で利用可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に入手可能であり、これらの表は、多くの方法で応用することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照のこと。ＧｅｎＢａｎｋ リリース１２８．０［２００２年２月１５日］から計算した酵母についてのコドン使用頻度表を、以下に表２Ｂとして再掲する。この表はｍＲＮＡ命名法を使用し、従ってこの表では、ＤＮＡに見られるチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡに見られるウラシル（Ｕ）を使用する。表２は、全６４個のコドンについてではなく、各アミノ酸についての頻度を計算するように編集している。
Figure 0006321631
Figure 0006321631
この又は同様の表を利用することにより、当業者は、任意の所与のポリペプチド配列にこれらの頻度を適用して、ポリペプチドをコードしながらも所与の種に最適なコドンを使用するコドン最適化コード領域の核酸断片を作製することができる。
所与のポリペプチド配列をコードするための最適化された頻度でのコドンのランダムな割り当ては、アミノ酸毎にコドン頻度を計算し、次にポリペプチド配列にコドンをランダムに割り当てることにより、手動で行うことができる。加えて、様々なアルゴリズム及びコンピュータソフトウェアプログラムが、当業者には容易に利用可能である。例えば、ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能なＬａｓｅｒｇｅｎｅパッケージの「ＥｄｉｔＳｅｑ」機能、ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手可能なＶｅｃｔｏｒＮＴＩスイートのバックトランスレーション機能、及びＡｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能なＧＣＧ−Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージの「バックトランスレート」機能。加えて、コード領域配列のコドン最適化のために様々なリソース、例えば、ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｅｎｇ（２００８年４月１５日アクセス）の「バックトランスレーション」機能及びｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｐｂｉ．ｎｒｃ．ｃａ：８０９０／ＥＭＢＯＳＳ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ（２００２年７月９日アクセス）で利用可能な「ｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ」機能が、公的に利用可能である。所与の頻度に基づきコドンを割り当てる基本的なアルゴリズムの構築は、当業者により基礎的な数学関数を用いて容易に達成することもできる。
コドン最適化コード領域は、「合成遺伝子デザイナー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｄｅｓｉｇｎｅｒ）」（ｕｓｅｒｐａｇｅｓ．ｕｍｂｃ．ｅｄｕ／〜ｗｕｇ１／ｃｏｄｏｎ／ｓｇｄ／、２０１２年３月１９日アクセス）などのソフトウェアパッケージを含め、当業者に公知の様々な方法により設計することができる。
ポリヌクレオチド又は核酸断片は、適切な温度及び溶液イオン強度条件下で一本鎖形態の核酸断片を他の核酸断片にアニールすることができる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡ分子などの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特にそのなかのＣｈａｐｔｅｒ １１及びＴａｂｌｅ １１．１（全体として参照により本明細書に援用される）に例示されている。温度及びイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決まる。ストリンジェンシー条件を調整することで、適度な類似性を有する断片（遠縁の生物由来の相同配列など）乃至高度な類似性を有する断片（近縁の生物由来の、機能的酵素を複製する遺伝子など）をスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄により、ストリンジェンシー条件が決まる。ある一組の条件では、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温で１５分から開始し、次に２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃で３０分を繰り返し、次に０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃で３０分を２回繰り返す一連の洗浄が用いられる。別の一組のストリンジェントな条件では、より高温が用いられ、ここで洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分を２回の洗浄の温度を６０℃に上げることを除いては、上記と同じである。別の一組の高度にストリンジェントな条件では、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で２回の最終洗浄が用いられる。さらなる一組のストリンジェントな条件には、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳと、続く０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が含まれる。
ハイブリダイゼーションでは２つの核酸が相補配列を含む必要があるものの、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては、塩基間にミスマッチがあってもよい。核酸のハイブリダイゼーションに適切なストリンジェンシーは、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性又は相同性が高度であるほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍの値が高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順に低くなる：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長より大きいハイブリッドについては、Ｔｍの計算式が導出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前掲，９．５０〜９．５１を参照のこと）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置の重要性が高くなり、その特異性はオリゴヌクレオチドの長さによって決まる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前掲，１１．７−１１．８を参照のこと）。一実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、又は少なくとも約３０ヌクレオチドの長さである。さらに、当業者は、プローブ長などの要素に従い必要に応じて温度及び洗浄溶液の塩濃度が調整され得ることを認識するであろう。
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」並びに複数の「ポリペプチド」を包含することを意図し、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結された単量体（アミノ酸）で構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つ又は複数の鎖を指し、生成物の特定の長さを指すものではない。従って、２つ以上のアミノ酸の１つ又は複数の鎖を指して用いられるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、及び用語「ポリペプチド」を、これらの用語のいずれかの代わりに、又はそのいずれかと同義的に使用することができる。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来しても、又は組換え技術によって生成されてもよいが、必ずしも示される核酸配列から翻訳されるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成によることを含め、任意の方法で生成することができる。ポリペプチド合成に好適な方法は、当該技術分野において公知である。
「単離されている」ポリペプチド又はその断片、変異体、若しくは誘導体とは、その自然環境にないポリペプチドが意図される。特定の精製レベルが必要とされるものではない。例えば、単離されているポリペプチドは、その天然の又は自然の環境から取り出すことができる。宿主細胞で発現する組換え産生されたポリペプチド及びタンパク質は、本発明の目的上、任意の好適な技法によって分離され、分画され、又は部分的若しくは実質的に精製されている天然又は組換えのポリペプチドと同様に、単離されていると考えられる。
本明細書で使用されるとき、用語「変異体」及び「突然変異体」は同義語であり、具体的に記載されるポリペプチドと、例えば突然変異生成などの組換えＤＮＡ技法を用いて作られた１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、突然変異、及び置換だけ異なるポリペプチドを指す。目的の活性を失うことなしにどのアミノ酸残基を置換、付加、又は欠失させることができるかを決定する際の指針は、特定のポリペプチドの配列を、例えば酵母又は細菌の、相同ポリペプチド配列と比較し、高度な相同性の領域（保存領域）に生じるアミノ酸配列変化の数を最小限とすることによるか、又はアミノ酸をコンセンサス配列に置き換えることにより、見出すことができる。
「操作されたポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、合成の、すなわち自然の中に見られるポリペプチドと何らかの形で異なるポリペプチドを指す。
或いは、これらの同じ又は同様のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド変異体を、遺伝子コードの「冗長性」を利用して合成又は選択することができる。様々な制限部位を作り出すサイレントな変化など、様々なコドン置換を導入して、発現用のプラスミド又はウイルスベクターへのクローニングを最適化することができる。ポリヌクレオチド配列の突然変異をポリペプチド又はそのポリペプチドに加えられる他のペプチドのドメインに反映させて、ポリペプチドの任意の部分の特性を修飾することができる。例えば突然変異は、標的タンパク質の発現を低下又は消失させるために用いることができ、限定はされないが、遺伝子全体又は遺伝子の一部分の欠失、タンパク質を発現させないか、又はより低度に発現させるための遺伝子への（プロモーター又はコード領域のいずれかにおける）ＤＮＡ断片の挿入、機能タンパク質を発現させないための、終止コドン又はフレームシフトを加える突然変異のコード領域への導入、及び非機能性の又は酵素活性がより低いタンパク質が発現するようにアミノ酸を改変する１つ以上の突然変異のコード領域への導入が挙げられる。
アミノ酸「置換」は、あるアミノ酸を、同様の構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸に置き換えた結果、すなわち保存的アミノ酸置換であってもよく、又はアミノ酸「置換」は、あるアミノ酸を、異なる構造的及び／又は化学的特性を有するアミノ酸に置き換えた結果、すなわち非保存的アミノ酸置換であってもよい。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、又は両親媒性の性質の類似性に基づき作ることができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれ；正電荷（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれ；及び負電荷（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。或いは、これらのアミノ酸のいずれかの極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、又は両親媒性の性質の違いを選択して、「非保存的」アミノ酸置換を作ることができる。「挿入」又は「欠失」は、組換えタンパク質によって構造的又は機能的に許容されるものとしての変化の範囲内であり得る。許容される変化は、組換えＤＮＡ技法を用いてポリペプチド分子にアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を体系的に生じさせ、得られた組換え変異体を活性についてアッセイすることにより、実験的に決定することができる。
アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者が配列を手作業で評価することによるか、或いはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））などのアルゴリズムを用いた、コンピュータによって自動化された配列比較及び同定より、ポリペプチド又は遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列又は遺伝子のヌクレオチド配列が含まれる部分である。一般に、ポリペプチド又は核酸配列を既知のタンパク質又は遺伝子と相同であると推定的に同定するには、１０個以上の連続したアミノ酸又は３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、配列依存的な遺伝子同定方法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）及び単離方法（例えば、細菌コロニー又はバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーション）において、２０〜３０個の連続するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが使用され得る。加えて、プライマーを含む特定の核酸断片を得るため、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドがＰＣＲの増幅プライマーとして使用され得る。従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、その配列を含む核酸断片を特異的に同定及び／又は単離するのに十分な配列を含む。本明細書は、特定のタンパク質をコードする完全なアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を教示する。ここで当業者は、本明細書に報告されるとおりの配列の有益性により、開示される配列の全て又は実質的な部分を当業者に公知の目的のために使用し得る。従って、本発明は、添付の配列表に報告されるとおりの完全な配列、並びに上記に定義するとおりのそれらの配列の実質的な部分を含む。
用語「相補的」は、互いにハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記載するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデニンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的であり、及びＲＮＡに関して、アデニンはウラシルと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。
用語「同一性パーセント」は、当該技術分野において公知のとおり、２つ以上のポリペプチド配列間又は２つ以上のポリヌクレオチド配列間における、それらの配列を比較して決定されるとおりの関係である。当該技術分野では、「同一性」はまた、ポリペプチド配列間又はポリヌクレオチド配列間における、場合によってはかかる配列のストリング間のマッチにより決定されるとおりの、配列の関連性の程度も意味する。「同一性」及び「類似度」は、限定はされないが、１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；及び５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されるものを含め、公知の方法によって容易に計算することができる。
同一性の好ましい方法は、試験する配列間のベストマッチをもたらすように設計される。同一性及び類似度の決定方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにコードとして体系化されている。配列アラインメント及び同一性パーセント計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを用いて実行されてもよい。配列の多重アラインメントは、数種類のアルゴリズムを包含する「Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法」を用いて実行され、そのアルゴリズムには、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖという名称のアラインメント方法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３，（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１，（１９９２）により記載される）に対応し、且つＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムに含まれるＣｌｕｓｔａｌ Ｖアラインメント法」が含まれる。多重アラインメントについて、デフォルト値はギャップペナルティ＝１０及びギャップ長ペナルティ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いたタンパク質配列のペアワイズアラインメント及び同一性パーセント計算のためのデフォルトパラメータは、Ｋタプル＝１、ギャップペナルティ＝３、ウィンドウ＝５及びダイアゴナル・セーブド＝５である。核酸についてのこれらのパラメータは、Ｋタプル＝２、ギャップペナルティ＝５、ウィンドウ＝４及びダイアゴナル・セーブド＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを用いた配列アラインメントの後、同じプログラムの「配列距離」テーブルを見ることにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。加えて、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法」が利用可能であり、これはＣｌｕｓｔａｌ Ｗという名称のアラインメント方法に対応し（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）により記載される）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラムに含まれる。多重アラインメントのデフォルトパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、ディレイディバージェント配列（Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ）（％）＝３０、ＤＮＡトランジションウェイト＝０．５、タンパク質ウェイト行列＝Ｇｏｎｎｅｔシリーズ、ＤＮＡウェイト行列＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いた配列アラインメントの後、同じプログラムの「配列距離」テーブルを見ることにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。
当業者には、ポリペプチド（かかるポリペプチドは同じ又は同様の機能又は活性を有する）の同定、又は対応するポリヌクレオチドの記載において、多くの配列同一性レベルが有用であることが十分に理解される。パーセント同一性の有用な例としては、限定はされないが、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％が挙げられ、又は本発明の記載においては５５％〜１００％の任意の整数百分率、例えば、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が有用であり得る。好適なポリヌクレオチド断片は上記の相同性を有するのみならず、典型的には少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも１５０ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、又は少なくとも２５０ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。さらに、上記の相同性を有する好適なポリヌクレオチド断片は、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、又は少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。ポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知の方法を用いてクローニング又は合成することができる。
用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズム又はソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものであっても、又は独自に開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、限定はされないが：１．）ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；及び５．）スミス−ウォーターマンアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を挙げることができる。本願の文脈の範囲内で、分析に配列分析ソフトウェアが使用される場合、特記されない限り、分析の結果は参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づき得ることは理解されるであろう。本明細書で使用されるとき「デフォルト値」は、初回の初期化時に最初にソフトウェアにロードされる任意の一組の値又はパラメータを意味するものとする。
標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当該技術分野において公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）（以下、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）により；及びＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）により；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，刊行元Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）により記載されている。本明細書で用いられるさらなる方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｇｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ（Ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にある。他の分子ツール及び技法が当該技術分野において公知であり、それには、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるスプライシング（Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．４１：９７３−９８１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵＲＡ３遺伝子座における突然変異のポジティブ選択（Ｂｏｅｋｅ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９７，３４５−３４６；Ｍ Ａ Ｒｏｍａｎｏｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９１ Ｊａｎｕａｒｙ １１；１９（１）：１８７）、ｃｒｅ−ｌｏｘ部位特異的組換え系並びに突然変異体ｌｏｘ部位及びＦＬＰ基質突然変異（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．（１９８７）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：２０８７−２０９６；Ｓｅｎｅｃｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０１，Ｉｓｓｕｅ ２，Ｐａｇｅｓ ４０５−４２１；Ａｌｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ．Ｖｏｌｕｍｅ ７，Ｉｓｓｕｅ ４，６４９−６５９頁）、「シームレス」遺伝子欠失（Ａｋａｄａ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｙｅａｓｔ；２３（５）：３９９−４０５）、及びギャップ修復方法論（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５８：２０１−２１６；１９８１）が含まれる。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の遺伝子操作は、標準的な遺伝学的技法及びスクリーニングを用いて実施することができ、且つ遺伝子操作に好適な任意の宿主細胞で行うことができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐｐ．２０１−２０２）。
実施形態において、本明細書に開示される組換え宿主細胞は、本明細書の他の部分で言及される酵母を含め、遺伝子修飾及び組換え遺伝子発現に有用な任意の酵母又は真菌宿主であってよい。他の実施形態において、組換え宿主細胞は、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、ザイゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ブレタノミセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、トルラスポラ属（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、ハンセニアスポラ属（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、及び一部のカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の種のメンバーであってもよい。
生合成経路に適したＫＡＲＩ活性を有するポリペプチド
米国特許出願公開第２０１０／０１９７５１９Ａ１号明細書は、野生型酵素と比べて補因子ＮＡＤＨに対するＫＭが低いことが実証された変異体「ＪＥＡ１」（配列番号２）を含め、イソブタノール生成に好適な蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＫＡＲＩ酵素の変異体を記載している。
本明細書の実施例に示すとおり、ＪＥＡ１の変異体が提供されており、これは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母細胞を含めた、イソブタノール生合成経路を含む組換え微生物宿主細胞における使用、及びかかる宿主細胞を嫌気的条件下で利用する方法における使用に特に好適であると考えられる。従って、本明細書に提供される変異体はまた、ＫＡＲＩ活性によって触媒される基質から生成物への変換を含む他の生合成経路においても有用であり得る。
実施例に提供される結果に基づけば、配列番号２の以下の位置の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、又は８つ以上における置換が、イソブタノール生合成経路を含む組換え宿主細胞における使用に適したポリペプチドを生じさせる：Ｙ２８６、Ｉ１５２、Ｓ３２２、Ｓ２９２、Ｉ２９１、Ｉ１３、Ｐ４７、Ｆ５０、Ｖ５３、Ａ２６８、Ｖ７６、Ａ３３６、Ｌ８８、Ａ７１、Ｇ７２、Ｍ３０１、Ｙ２３９、Ｙ１１３、Ｎ１１４、Ａ３２９、Ａ６９、Ａ２９５、Ｅ２６４、Ｒ２８０、Ｓ１５７、Ｍ２３８、Ｑ２７２、Ｋ３３５、Ｋ９９、Ｒ２７５、Ｒ３０６。
実施形態において、これらの位置における置換としては、限定はされないが、実施例に示すものが挙げられる：Ｙ２８６Ｆ、Ａ３３６Ｒ、Ｉ１５２Ｖ、Ｓ３２２Ａ、Ｓ２９２Ａ、Ｉ２９１Ｖ、Ｉ１３Ｌ、Ｐ４７Ｙ、Ｆ５０Ａ、Ｖ５３Ａ、Ａ２６８Ｅ、Ｖ７６Ｉ、Ａ３３６Ｇ、Ｌ８８Ｖ、Ａ７１Ｋ、Ｇ７２Ｗ、Ｉ１５２Ｖ、Ａ２６８Ｔ、Ａ３２９Ｅ、Ｍ３０１Ｉ、Ｙ２３９Ｈ、Ｙ１１３Ｆ、Ｓ３２２Ａ、Ｎ１１４Ｇ、Ａ３２９Ｒ、Ａ６９Ｔ、Ｎ１１４Ｓ、Ａ２９５Ｖ、Ｅ２６４Ｋ、Ｒ２８０Ｄ、Ｓ１５７Ｔ、Ｍ２３８Ｉ、Ｑ２７２Ｔ、Ｋ３３５Ｍ、Ｒ２８０Ｈ、Ｋ９９Ｎ、Ｒ２７５Ｋ、Ｒ３０６Ｋ又はこれらの組み合わせ。
置換の組み合わせとしては、限定はされないが、実施例１〜５、表９、表１１、表１３、表１５、及び表１７に示すものを挙げることができる。示されるとおり、置換の組み合わせのうちあるものは、イソブタノール生合成経路を含む組換え微生物宿主細胞における使用に好適である。
例えば、実施例２に示すとおり、好適な組み合わせは、Ｙ２８６、Ａ３３６、及びＩ１５２である。これらの位置に置換を有する例示的な変異体を実施例に示す。実施形態において、これらの位置における置換は、Ｙ２８６Ｆ、Ａ３３６Ｒ、及びＩ１５２Ｖである。別の好適な組み合わせは、Ａ６８、Ｉ１５２、Ｙ２８６及びＡ３３６である。実施形態において、これらの位置における置換は、Ａ６８Ｅ、Ｉ１５２Ｖ、Ｙ２８６Ｆ、及びＡ３３６Ｒである。これらの置換を含む例示的な変異体が、配列番号３４６（「Ｒ８−ＳＯＧ１＿ｙ２」）として提供される。
他の組み合わせは、以下の部位の１つ以上に置換を含む：Ａ６９、Ａ７１、Ｙ１１３、Ｍ２３８、Ｙ２３９、Ｍ３０１、Ａ３２２、又はＡ３２９。かかる組み合わせの例を実施例５に示す。
実施形態において、Ｉ１５２、Ｙ２８６及びＡ３３６及び場合によりＡ６８に置換を含む変異体を含めた、本明細書に提供される変異体について、置換は、表３の中で指示される位置について「Ｘ」を付して示すものから選択され得る。
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本開示の提供により、当業者は、指示される部位（Ｙ２８６、Ｉ１５２、Ｓ３２２、Ｓ２９２、Ｉ２９１、Ｉ１３、Ｐ４７、Ｆ５０、Ｖ５３、Ａ２６８、Ｖ７６、Ａ３３６、Ｌ８８、Ａ７１、Ｇ７２、Ｍ３０１、Ｙ２３９、Ｙ１１３、Ｎ１１４、Ａ３２９、Ａ６９、Ａ２９５、Ｅ２６４、Ｒ２８０、Ｓ１５７、Ｍ２３８、Ｑ２７２、Ｋ３３５、Ｋ９９、Ｒ２７５、及びＲ３０６）のいずれかにさらなる置換を容易に作製及び使用し、さらなる変異体を生じさせることができる。かかる変異体の作成方法は本明細書に示され（実施例６を参照）、及び／又は以下に記載するとおり当該技術分野において公知である。一実施形態では、本明細書に例示される配列に基づき保存的置換が作製される。別の実施形態では、所与の部位でアミノ酸の全て又は一部が置換され、活性についてスクリーニングされる。
実施形態では、本明細書に提供されるポリペプチドにおいて：配列番号２の２４位に対応する位置のアミノ酸がＦであり；配列番号２の３３位に対応する位置のアミノ酸がＬであり；配列番号２の４７位に対応する位置のアミノ酸がＰであり；配列番号２の５０位に対応する位置のアミノ酸がＦであり；配列番号２の６１位に対応する位置のアミノ酸がＦであり；配列番号２の８０位に対応する位置のアミノ酸がＩであり；及び配列番号２の１５６位に対応する位置のアミノ酸がＶである。
当該技術分野で利用可能な構造及び配列情報の組み合わせを使用して、イソブタノール又は他の生合成経路で用いるための、ＫＡＲＩ活性及び例示される配列と１００％未満の同一性を含むポリペプチドを構築し得ることは理解されるであろう。例えば、２．６Å分解能での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＡＲＩ酵素の結晶構造が、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＫＡＲＩ（Ａｈｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２８：５０５−５１５，２００３）及びホウレンソウ由来のＫＡＲＩ酵素（Ｂｉｏｕ Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１６：３４０５−３４１５，１９９７）の構造を有するものとして解かれている（Ｔｙａｇｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，１４：３０８９−３１００，２００５）。さらに、実験的に検証された機能を有する２５個のＫＡＲＩタンパク質のアミノ酸配列を使用して調製したＫＡＲＩプロファイルＨＭＭが、米国特許第８，１２９，１６２号明細書に記載されている。ＫＡＲＩは、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｐｆ−５、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）Ｐ２、ピロバキュラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）株ＩＭ２、ナトロノモナス・ファラオニス（Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ ｐｈａｒａｏｎｉｓ）ＤＳＭ ２１６０、バチルス・スブチリス亜種スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ １３０３２、フェオスピリルム・モリスキアヌム（Ｐｈａｅｏｓｐｒｉｒｉｌｕｍ ｍｏｌｉｓｃｈｉａｎｕｍ）、ラルストニア・ソラナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）ＧＭＩ１０００、ザイモモナス・モビリス亜種モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＭ４、アルカリリムニコラ・エールリケイ（Ａｌｋａｌｉｌｉｍｎｉｃｏｌａ ｅｈｒｌｉｃｈｅｉ）ＭＬＨＥ−、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）ＲＭ２１００、マリノバクター・アクアエオレイ（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｅｏｌｅｉ）ＶＴ８、サイクロバクター・アルクチクス（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｒｃｔｉｃｕｓ）２７３−４、ハヘラ・チェジュエンシス（Ｈａｈｅｌｌａ ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ）ＫＣＴＣ ２３９６、チオバチルス・デニトリフィカンス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ ２５２５９、アゾトバクター・ビネランジイ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）ＡｖＯＰ、シュードモナス・シリンゲ病原型シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）Ｂ７２８ａ、シュードモナス・シリンゲ病原型トマト（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔｏｍａｔｏ）株ＤＣ３０００、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０、シュードモナス・エントモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）Ｌ４８、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）ｙｍｐ、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ １０９８７、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ １０９８７、及びホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ）由来であった。ＨＭＭＥＲパッケージのｈｍｍｓｅａｒｃｈプログラムを使用してＥ値が＜１０−３のＫＡＲＩプロファイルＨＭＭ（米国特許第８，１２９，１６２号明細書に記載され、本明細書に全体として参照により援用される）にマッチする任意のタンパク質が、機能性ＫＡＲＩであると予想される。
図９〜図１２に示すとおり、本明細書に開示される置換位置は、米国特許第８，１２９，１６２号明細書に開示されるとおりのＰＦ５ ＫＡＲＩのホモロジーモデリングを使用して、その構造位置に従いグループ化することができる。この明細書に開示されるとおり、ＮＡＤＰＨ、アセトラクテート及びマグネシウムイオンが結合したＰＦ５−ＫＡＲＩの構造を、ＰＦ５ ＫＡＲＩと９２％のアミノ酸配列同一性を有する緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１−ＫＡＲＩの結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ １ＮＰ３，Ａｈｎ Ｈ．Ｊ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２８，５０５−５１５，２００３）に基づき構築した。ＰＡＯ１−ＫＡＲＩ構造はホモ十二量体であり、各十二量体は、広範囲の二量体界面を有する６つのホモ二量体からなる。ＫＡＲＩの活性部位はこの二量体界面に位置する。この生物学的構築物は、四面体の辺に位置する６つのホモ二量体によって形成され、２３点群対称の高度に対称な十二量体をもたらす。簡単にするため、ＰＦ５−ＫＡＲＩのホモロジーモデルについては、活性部位がホモ二量体界面にあるという理由で二量体単位（単量体Ａ及び単量体Ｂ）のみを構築した。
ＰＡＯ１−ＫＡＲＩの単量体Ａ及び単量体Ｂの座標並びにＰＦ５−ＫＡＲＩの配列に基づき、ＤｅｅｐＶｉｅｗ／Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢビューワを使用してＰＦ５−ＫＡＲＩ二量体のモデルを構築した（Ｇｕｅｘ，Ｎ．ａｎｄ Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：２７１４−２７２３，１９９７）。次にこのモデルを、さらなる改良のため、Ｓｉｌｉｃｏｎ ＧｒａｐｈｉｃｓシステムのプログラムＯにインポートした（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ ４７，１１０−１１９，１９９１）。
ＰＡＯ１−ＫＡＲＩの構造は、活性部位に補因子、基質又は阻害剤又はマグネシウムを有しない。従って、アセトラクテート結合部位にマグネシウムイオン、ＮＡＤＰＨ及び阻害剤（Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−イソプロピルオキサメート）を有するホウレンソウＫＡＲＩ構造（ＰＤＢ ＩＤ １ｙｖｅ，Ｂｉｏｕ Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１６：３４０５−３４１５，１９９７）を使用して、活性部位におけるこれらの分子をモデル化した。植物ＫＡＲＩは、ＰＦ５−ＫＡＲＩとも、又はＰＡＯ１ ＫＡＲＩとも、ほとんど配列同一性を有しない（＜２０％アミノ酸同一性）が、しかしながらこれらの２つのＫＡＲＩ酵素の活性部位領域における構造は、極めて類似している。これらの２つのＫＡＲＩ構造の活性部位を重ね合わせるため、プログラムＯのコマンドＬＳＱ＿ｅｘｔ、ＬＳＱ＿ｉｍｐｒｏｖｅ、ＬＳＱ＿ｍｏｌを使用して、ホウレンソウＫＡＲＩの単量体Ａの活性部位をＰＦ５ ＫＡＲＩモデルの単量体Ａと整列させた。ホウレンソウＫＡＲＩの活性部位に結合するＮＡＤＰＨ、２個のマグネシウムイオン及び阻害剤の座標を抽出し、ＰＦ５ ＫＡＲＩの分子Ａに組み込んだ。ＰＦ５ ＫＡＲＩの単量体Ｂについて、プログラムによって計算される単量体Ａから単量体Ｂへの変換演算子を適用することにより、これらの分子の座標セットを作成した。
ＰＡＯ１ ＫＡＲＩ結晶構造の活性部位には補因子がないため、補因子結合部位のリン酸結合ループ領域（ＰＡＯ１ ＫＡＲＩの残基４４〜４５、ホウレンソウＫＡＲＩの１５７〜１７０）の構造は、両者間で極めて異なる。補因子結合形態をモデル化するため、ＰＦ５−ＫＡＲＩリン酸結合ループ（４４〜５５）のモデルを１ｙｖｅのそれ（１５７〜１７０）のモデルに置き換えた。これらの両者間における側鎖の不一致はいずれも、プログラムＯのｍｕｔａｔｅ＿ｒｅｐｌａｃｅコマンドを使用してＰＦ５−ＫＡＲＩ配列の側鎖に変換し、置き換えられた側鎖の立体構造を手動で調整した。ＮＡＤＰＨ／Ｍｇ／阻害剤が結合した二量体ＰＦ５−ＫＡＲＩモデルの全体を、プログラムＣＮＸ（ＡＣＣＥＬＲＹＳ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ，Ｂｕｒｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．ａｎｄ Ｗａｒｒｅｎ，Ｇ．Ｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｄ ５４，９０５−９２１，１９９８）を使用して１ラウンドのエネルギー最小化にかけ、その後モデルにおいて阻害剤を基質のアセトラクテート（ＡＬ）に置き換えた。ＡＬの立体構造は、ＮＡＤＰＨのニコチンアミドのＣ４と基質との間でのヒドリド移動に有利になるよう手動で調整した。このモデルに関してさらなるエネルギー最小化は実施しなかった。
Ｃ末端テール（３２８〜３３８）はこのモデルに見られず、Ｐｆ５−ＫＡＲＩのホモロジーモデルの構築に使用した結晶構造ＰＤＢコード１ｎｐ３では無秩序化する。Ｃ末端テールは、触媒作用における補因子及び基質の結合に重要であることが分かっている（ＪＭＢ（２００９）３８９，１６７−１８２ Ｌｅｕｎｇ ＆ Ｇｕｄｄａｔ）。以下の位置がＣ末端テール領域にある：Ａ３２９、Ｋ３３５、Ａ３３６。
図１０に示すとおり、位置Ｍ２３８、Ｙ２３９、Ｅ２６４、Ｎ２６７、Ａ２６８、Ｑ２７２、Ａ２７７、Ｒ２８０、Ｙ２８６、Ｉ２９１、Ｓ２９２、Ｍ３０１、Ｓ３２２が分子間二量体界面領域に関連し、位置Ｙ１１３、Ｎ１１４、Ｉ２９１、Ｓ２９２、及びＡ２９５がドメイン間界面領域に関連する。
Ｐ４７、Ｐ５０、Ｖ５３、Ｔ８０、及びＬ８８の位置は、モデル化されたヌクレオチド結合領域の一部である（図１１Ａ）。位置６８、６９、７１及び７２はＮ−ドメイン表面ヘリックスに関連する（位置６４〜７３；図１１Ｂ）。
位置Ｃ３３、Ｌ６１、Ｉ１２７、Ｉ１５２、及びＶ１７１はＮ−ドメイン疎水性架橋領域にあり、図１２に示される。
従って、本明細書には、分子間二量体界面領域、ドメイン間界面領域、ヌクレオチド結合領域、Ｎ−ドメイン表面ヘリックス領域、疎水性架橋領域、及びＣ末端テール領域の少なくとも１つに置換を含む変異体が提供される。実施形態において、本明細書に提供される変異体は、ヌクレオチド結合領域における置換と、以下の領域、すなわち、分子間二量体界面領域、ドメイン間界面領域、Ｎ−ドメイン表面ヘリックス領域、疎水性架橋領域、又はＣ末端テール領域のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つにおける置換とを含む。
他のポリヌクレオチド、遺伝子及び／又はポリペプチドの配列は、本明細書に開示される配列及び当該技術分野で利用可能な配列を使用して、当業者に周知の文献及びバイオインフォマティクスデータベースで同定することができる。例えば、かかる配列は、本明細書に提供されるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列による公的に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ検索によって同定することができる。かかる方法では、同一性は、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、及びＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを使用したＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法に基づき得る。
加えて、本明細書に開示されるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を使用して、天然の他のＫＡＲＩ相同体を同定することができる。例えば、本明細書に開示されるＫＡＲＩをコードする核酸断片の各々を使用して、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。配列依存性プロトコルを使用した相同遺伝子の単離は、当該技術分野において周知されている。配列依存性プロトコルの例としては、限定はされないが、（１）核酸ハイブリダイゼーションの方法；（２）核酸増幅技術［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１０７４（１９８５）；又は鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２）］の様々な使用により例示されるとおりの、ＤＮＡ及びＲＮＡ増幅の方法；及び（３）ライブラリ作成及び相補性によるスクリーニングの方法が挙げられる。
本開示並びに本明細書及び／又は当該技術分野で利用可能な配列及び構造情報の提供により、当業者がまた本明細書に提供されるポリペプチドの活性断片を、例えば本明細書に提供されるポリペプチドをＮ末端又はＣ末端でトランケートしてＫＡＲＩ活性を確認することによって作成し得ることは理解されるであろう。
従って、本明細書には、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１６、１１８、１１９、１２０、１２１、１２３、１２４、１２８、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１５９、１６０、１６１、又は３４６と少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９９％の同一性を有するか、又はそのアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその活性断片が提供される。
変異体の作成
本明細書に記載される変異体は、当該技術分野において公知の任意の方法により作成することができる。当該技術分野において公知の部位特異的突然変異誘発方法としては、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）及びＣｈａｎｇｅ−ＩＴ（登録商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ＵＳＢ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）が挙げられる。当該技術分野において公知のランダム点突然変異誘発方法としては、例えば、エラープローンＰＣＲ（例えば、Ｂｌｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｌ．２００７，５：２９，ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４１−７００７−５−２９）又はＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、化学的突然変異原（例えばメタンスルホン酸エチル）又は紫外線への曝露、ＰＣＲにおける修飾ヌクレオチドの使用（例えば、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４，３２：３，ｅ２６）、及び特別な突然変異誘発株の使用が挙げられる。当該技術分野において公知のＤＮＡ組換え又は「シャッフリング」方法としては、例えば、ランダム断片化及び再構成（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ １９９４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２２，１０７４７−１０７５１）、ヘテロ二本鎖修復（例えば、Ｖｏｌｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９ ２７：１８，ｅ１８）、付着伸長（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）（例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８，１６：３，２５８−２６１）、不対プライマーシャッフリング（例えば、Ｍｉｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，米国特許第７，８７９，５８２号明細書）、部位特異的組換え（例えば、Ｈｉｒａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３３０：２，２８７−２９６）、及び合成シャッフリング（例えば、Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０，１２５１−１２５５）が挙げられる。他のタンパク質変異体ライブラリ作成方法としては、例えば、円順列変異（例えば、Ｇｕｎｔａｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２，７（４）：ｅ３５９９８）、及び化学的ＤＮＡ合成が挙げられる。
本開示の提供により、当業者は、本明細書に提供される変異体並びにそれと（上記に記載したとおり）１００％未満の同一性の変異体を容易に作製及び使用することができる。
ＫＡＲＩ活性
本明細書に記載されるポリペプチドには、ＫＡＲＩ活性を有するものが含まれる。ＫＡＲＩ活性は、当該技術分野で（例えば参照により本明細書に援用される米国特許第８，１２９，１６２号明細書に）記載される方法を用いてアセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの酵素変換をアッセイすることにより確認し得る。例えば、この変換は、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆ．製など）を使用した３４０ｎｍにおける反応から、補因子、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの消失を計測することにより追跡し得る。
ＫＡＲＩ活性はまた、本明細書において説明及び実証するとおり（実施例を参照）、図１のステップａ、ｃ、ｄ、及びｅに提供される基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞において所与のＫＡＲＩを発現させ、イソブタノールの生成を計測することによっても確認し得る。或いは、ＫＡＲＩ活性は、ＫＡＲＩにより触媒される基質から生成物への変換の下流の生合成経路おける中間生成物の生成を計測することにより確認し得る。同様に、他の生合成経路についての基質から生成物への変換を含む宿主細胞を使用してもまた、同様の戦略を用いて、且つＫＡＲＩにより触媒される基質から生成物への変換の下流の生合成経路生成物又は中間生成物の生成を確認して、ＫＡＲＩ活性を確認することができる。
イソブタノール生成の確認
培養培地におけるイソブタノールの存在及び／又は濃度は、当該技術分野において公知の数多くの方法により決定することができる（例えば、全体として参照により援用される米国特許第７，８５１，１８８号明細書を参照のこと）。例えば、特定の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）方法は、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨＧガードカラムを備えるＳｈｏｄｅｘ ＳＨ−１０１１カラム（両方ともにＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）から購入し得る）を、屈折率（ＲＩ）検出と共に利用する。クロマトグラフ分離は、０．０１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を移動相として使用して、流量０．５ｍＬ／分及びカラム温度５０℃で達成される。イソブタノールは、用いられる条件下で４６．６分の保持時間を有する。
或いは、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）方法が利用可能である。例えば、特定のＧＣ方法は、ＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（３０ｍ×０．５３ｍｍ内径、１μｍ膜厚、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）と共に利用する。キャリアガスは、一定のヘッド圧力下１５０℃で計測するとき流量４．５ｍＬ／分のヘリウムであり；注入器スプリットは２００℃で１：２５であり；オーブン温度は４５℃１分間、１０℃／分で４５〜２２０℃、及び２２０℃５分間であり；及びＦＩＤ検出は２６ｍＬ／分ヘリウムメークアップガスにより２４０℃で用いられる。イソブタノールの保持時間は４．５分である。
ＤＨＭＢの低減
イソブタノール生合成経路を含む宿主細胞におけるＤＨＭＢの生成は、経路基質の全てが所望の生成物に変換されていないことを示している。従って、収率は低くなる。加えて、ＤＨＭＢは生成物の生成に対して阻害効果を有し得る。例えば、ＤＨＭＢは生合成経路における酵素の活性を減少させ、又は発酵中の酵母の成長及び／又は生成能力に対して他の阻害効果を有し得る。従って、本明細書に記載される方法は、発酵中におけるＤＨＭＢの低減方法を提供する。このような方法には、ＤＨＭＢの生成を減少させる方法及び発酵組成物からＤＨＭＢを除去する方法の双方が含まれる。
ＤＨＭＢ生成を減少させる
本明細書に記載される一部の実施形態において、組換え宿主細胞は、アセトラクテートからＤＨＭＢに変換する能力の低下又は消失を含むことができる。アセトラクテートからＤＨＭＢに変換する宿主細胞の能力は、例えば、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくは遺伝子の修飾若しくは破壊、又はアセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドの修飾若しくは破壊により、低下又は消失させることができる。他の実施形態において、組換え宿主細胞は、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチド若しくは遺伝子に、又はアセト乳酸レダクターゼを有する内因性ポリペプチドに、欠失、突然変異、及び／又は置換を含むことができる。かかる修飾、破壊、欠失、突然変異、及び／又は置換により、低下した、実質的に消失した、又は消失したアセト乳酸レダクターゼ活性がもたらされ得る。本発明の一部の実施形態では、生合成経路の生成物は、アセトラクテートからＤＨＭＢに変換する能力の低下又は消失を含まない組換え宿主細胞における同じ生成物の生成と比較してより高収率で又はより多量に生成される。
従って、生成物は、ＤＨＭＢを実質的に含まない、又はＤＨＭＢを含まないイソブタノールを含む組成物であってよい。一部の実施形態では、ブタノールを含む組成物は、約５ｍＭ、約４ｍＭ、約３ｍＭ、約２ｍＭ、約１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．３ｍＭ以下のＤＨＭＢ、又は約０．２ｍＭのＤＨＭＢを含有する。
アセト乳酸レダクターゼ活性の記載される修飾を有する本明細書に開示される組換え宿主細胞においては、アセトラクテートからＤＨＭＢ以外の基質への変換が関与する生合成経路の任意の生成物がより高い有効性で生成され得る。かかる生成物としては、限定はされないが、ブタノール、例えば、イソブタノール、２−ブタノール、及びＢＤＯ、並びに分枝鎖アミノ酸が挙げられる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの内因性ポリヌクレオチドに、少なくとも１つの欠失、突然変異、及び／又は置換を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも２つの内因性ポリヌクレオチドの各々に、少なくとも１つの欠失、突然変異、及び／又は置換を含む。
一部の実施形態では、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、アセトラクテートからＤＨＭＢへの変換を触媒することができる。一部の実施形態では、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、アセトラクテートから２Ｓ，３Ｓ−ＤＨＭＢ（ファストＤＨＭＢ）及び／又は２Ｓ，３Ｒ−ＤＨＭＢ（スローＤＨＭＢ）への還元の触媒能を有する。
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一部の実施形態では、組換え宿主細胞におけるアセトラクテートからＤＨＭＢへの変換は低下し、実質的に消失し、又は消失する。一部の実施形態では、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、ＹＭＲ２２６Ｃ、ＹＥＲ０８１Ｗ、ＹＩＬ０７４Ｃ、ＹＢＲ００６Ｗ、ＹＰＬ２７５Ｗ、ＹＯＬ０５９Ｗ、ＹＩＲ０３６Ｃ、ＹＰＬ０６１Ｗ、ＹＰＬ０８８Ｗ、ＹＣＲ１０５Ｗ、ＹＯＲ３７５Ｃ、及びＹＤＲ５４１Ｃからなる群から選択される。一部の実施形態では、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、表４に掲載される配列又は表４に掲載されるポリペプチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％同一である配列を含むポリペプチドである。一部の実施形態では、アセト乳酸レダクターゼ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｒｅｄｕｃａｔａｓｅ）活性を有するポリペプチドは、表４に掲載されるポリヌクレオチド配列、又は表４に掲載されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％同一である配列によりコードされるポリペプチドである。
Figure 0006321631
Figure 0006321631
一部の実施形態では、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、ＹＭＲ２２６Ｃ又はＹＭＲ２２６Ｃの相同体である。従って、一部の実施形態では、アセト乳酸レダクターゼ（ｒｅｄｕｃａｔａｓｅ）活性を有するポリペプチドは、表５に掲載される配列又は表５に掲載されるポリペプチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％同一の配列を含むポリペプチドである。一部の実施形態では、アセト乳酸レダクターゼ（ｒｅｄｕｃａｔａｓｅ）活性を有するポリペプチドは、表５に掲載されるポリヌクレオチド配列又は表５に掲載されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％同一の配列によりコードされるポリペプチドである。アセトラクテートからＤＨＭＢへの変換能を有するアセト乳酸レダクターゼは、例えば遺伝子改変された酵母を、アセトラクテート消費の変化、ＤＨＭＢ生成の変化、ＤＨＩＶ生成の変化、又は他の下流生成物（例えば、ブタノール）の生成の変化についてスクリーニングすることにより、同定することができる。
ＤＨＭＢ生成に関与する遺伝子を同定する一つの方法は、酵母ノックアウトライブラリの個々の酵母株が生成するＤＨＭＢの量を計測することを含む。ノックアウトライブラリは、例えばＯｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡの一部門）から入手可能である。この方法では、ＤＨＭＢ生成が減少すると、そのノックアウトされている遺伝子がＤＨＭＢ生成を増加させるように機能することを示し、及びＤＨＭＢ生成が増加すると、そのノックアウトされている遺伝子がＤＨＭＢ生成を減少させるように機能することを示す。
ノックアウト（「ＫＯ」）ライブラリを使用して、ＤＨＭＢ合成への関与についての候補遺伝子を同定し得る２つの方法として、以下が挙げられる：（１）内因性基質（アセトラクテート及びＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ）から成長中に培養物に蓄積するＤＨＭＢ及びＤＨＩＶを、培養物からの試料において分析することができる。これらの試料を熱湯浴（８０〜１００℃）中に１０〜２０分間置くか、又は細胞を死滅させて透過処理し得る２％ギ酸などの溶液中に希釈することができる。いずれかの処理の後、遠心（５分、１１００×ｇ）すると、上清に小分子が認められ得る。対照株（例えばＢＹ４７４３）のＤＨＭＢ／ＤＨＩＶ比を種々のＫＯ誘導体と比較することができ、ＤＨＭＢ／ＤＨＩＶ比が非常に低い任意の１つ又は複数の株に欠損している１つ又は複数の遺伝子が、アセト乳酸レダクターゼ（ＡＬＲ）をコードし得る。（２）外因性基質（アセトラクテート及びＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨ）からのインビトロでのＤＨＭＢ及び／又はＤＨＩＶ形成速度を、透過処理した細胞の懸濁液から取り、且つ上記に記載される方法のいずれかで不活性化した所定時間の試料において計測することができる。ＤＨＭＢ及びＤＨＩＶ合成の基質は同じであるため、これにより試料のＡＬＲ及びＫＡＲＩ活性の相対レベルを計測することが可能である。
ＤＨＭＢ生成に関与する遺伝子を同定する別の方法は、酵母過剰発現ライブラリの個々の酵母株が生成するＤＨＭＢの量を計測することを含む。過剰発現ライブラリは、例えば、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡの一部門）から入手可能である。この方法では、ＤＨＭＢ生成が減少すると、その過剰発現した遺伝子がＤＨＭＢ生成を減少させるように機能することを示し、及びＤＨＭＢ生成が増加すると、その過剰発現した遺伝子がＤＨＭＢ生成を増加させるように機能することを示す。
ＤＨＭＢ生成に関与する遺伝子を同定する別の方法は、ＤＨＭＢ生成酵母株を生化学的に分析することである。例えば、ＤＨＭＢ生成細胞を破壊することができる。この破壊は、低ｐＨ及び低温で実施することができる。細胞溶解物を、例えば硫酸アンモニウムを添加するか、又は当業者に公知の他の技法により画分に分離することができ、得られた画分を酵素活性についてアッセイすることができる。例えば、画分は、アセトラクテートをＤＨＭＢに変換する能力についてアッセイすることができる。酵素活性を含む画分を当該技術分野において公知の方法により処理し、酵素を精製及び濃縮することができる（例えば、透析及びクロマトグラフ分離）。十分な純度及び濃度が達成されると、酵素を配列決定することができ、アセトラクテートからＤＨＭＢへの変換能を有する対応するアセト乳酸レダクターゼコード遺伝子を同定することができる。
さらに、酵母ではアセトラクテートからＤＨＭＢへの還元が起こるものの、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で同程度に起こることはないため、酵母では発現するが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では発現しないアセト乳酸レダクターゼをスクリーニング用に選択することができる。選択された酵素は、酵母又は他のタンパク質発現系で発現させて、アセトラクテートをＤＨＭＢに変換する能力についてスクリーニングすることができる。
アセトラクテートからＤＨＭＢへの変換の触媒能を有する酵素は、アセトラクテートレベルをアッセイすることによるか、ＤＨＭＢレベルをアッセイすることによるか、ＤＨＩＶレベルをアッセイすることによるか、又はイソブタノールを含め、ＤＨＩＶからブタノールへの変換における下流生成物のいずれかをアッセイすることにより、スクリーニングすることができる。
ＤＨＭＢは、当業者に公知の任意の技法を用いて計測することができる。例えば、当業者に公知の方法及び本明細書に提供される実施例に記載される技法により、ＤＨＭＢを分離して定量化することができる。例えば、液体クロマトグラフィー質量分析、液体クロマトグラフィー核磁気共鳴（ＮＭＲ）、薄層クロマトグラフィー、及び／又はＵＶ／Ｖｉｓ検出を伴うＨＰＬＣを用いて、ＤＨＭＢを分離して定量化することができる。
実施形態において、本明細書に開示される選択されたアセト乳酸レダクターゼポリヌクレオチド、遺伝子及び／又はポリペプチドは、修飾又は破壊することができる。多くの好適な方法が当業者に公知であり、アルデヒドデヒドロゲナーゼについて記載される方法（上記）が含まれる。
アセト乳酸レダクターゼ活性を低下又は消失させるための本明細書に開示される組換え宿主細胞におけるアセト乳酸レダクターゼの修飾は、当該技術分野において公知の方法を用いて確認することができる。例えば、アセト乳酸レダクターゼをコードするポリヌクレオチド配列の存在又は非存在を、ＰＣＲスクリーニングを用いて決定することができる。アセト乳酸レダクターゼ活性の減少もまた、アセトラクテートからＤＨＭＢへの変換の低下に基づき決定することができる。アセト乳酸レダクターゼ活性の減少はまた、ＤＨＭＢ生成の低下に基づき決定することもできる。アセト乳酸レダクターゼ活性の減少はまた、ブタノール生成の増加に基づき決定することもできる。
従って、一部の実施形態では、ブタノール生成能を有する酵母は、約５ｍＭ、約４ｍＭ、約３ｍＭ、約２ｍＭ、約１ｍＭ、約０．９ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．４ｍＭ又は約０．３ｍＭ以下のＤＨＭＢを生成する。一部の実施形態では、ブタノールを生成する酵母は、約５ｍＭ、約４ｍＭ、約３ｍＭ、約２ｍＭ、約１ｍＭ、約０．９ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．４ｍＭ又は約０．３ｍＭ以下のＤＨＭＢを生成する。一部の実施形態では、ブタノールを生成する酵母は、約０．２ｍＭ以下又は０．２ｍＭのＤＨＭＢを生成する。
一部の実施形態では、ブタノールの生成能を有する酵母は、少なくとも約５０時間にわたり発酵条件下で培養したとき約１０ｍＭ以下のＤＨＭＢを生成する。一部の実施形態では、ブタノールの生成能を有する酵母は、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、又は少なくとも約５０時間にわたり発酵条件下で培養したとき、約５ｍＭ以下のＤＨＭＢを生成する。一部の実施形態では、ブタノールの生成能を有する酵母は、少なくとも約５時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、又は少なくとも約５０時間にわたり発酵条件下で培養したとき、約３ｍＭ以下のＤＨＭＢを生成した。一部の実施形態では、ブタノールの生成能を有する酵母は、少なくとも約１時間、少なくとも約５時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、又は少なくとも約５０時間にわたり発酵条件下で培養したとき、約１ｍＭ以下のＤＨＭＢを生成した。一部の実施形態では、ブタノールの生成能を有する酵母は、少なくとも約１時間、少なくとも約５時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４５時間、又は少なくとも約５０時間にわたり発酵条件下で培養したとき、約０．５ｍＭ以下のＤＨＭＢを生成した。
一部の実施形態では、アセト乳酸レダクターゼをコードする内因性ポリヌクレオチドに少なくとも１つの欠失、突然変異、及び／又は置換を含む酵母は、同じ時間にわたり発酵条件下で培養したとき、アセト乳酸レダクターゼ（ａｃｅｌｏｔａｃａｔａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする内因性ポリヌクレオチドを含む酵母により生成されるＤＨＭＢの量の約０．５倍、約０．４倍、約０．３倍、約０．２倍、約０．１倍、約０．０５倍以下を生成する。一部の実施形態では、ブタノール生成能を有する酵母は、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約６ｍＭ、少なくとも約７ｍＭ、少なくとも約８ｍＭ、少なくとも約９ｍＭ、又は少なくとも約１０ｍＭの量のＤＨＩＶを生成する。
一部の実施形態では、ブタノール生成能を有する酵母は、少なくともほぼＤＨＭＢの生成量である量のＤＨＩＶを生成する。一部の実施形態では、ブタノール生成能を有する酵母は、ＤＨＭＢの生成量の少なくとも約２倍、約３倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、又は約５０倍の量のＤＨＩＶを生成する。一部の実施形態では、ブタノール生成能を有する酵母は、ＤＨＭＢの生成速度と少なくともほぼ等しい速度でＤＨＩＶを生成する。一部の実施形態では、ブタノール生成能を有する酵母は、ＤＨＭＢの生成速度の少なくとも約２倍、約３倍、約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、又は約５０倍の速度でＤＨＩＶを生成する。
一部の実施形態では、ブタノール生成能を有する酵母は、消費されるグルコース１モルあたり０．０１０モル未満のＤＨＭＢを生成する。一部の実施形態では、酵母は、消費されるグルコース１モルあたり約０．００９モル未満、約０．００８モル未満、約０．００７モル未満、約０．００６モル未満、又は約０．００５モル未満のＤＨＭＢを生成する。一部の実施形態では、酵母は、消費されるグルコース１モルあたり約０．００４モル未満、約０．００３モル未満、約０．００２モル未満、又は約０．００１モル未満のＤＨＭＢを生成する。
一部の実施形態では、アセト乳酸レダクターゼ活性は化学的手段により阻害される。例えば、アセト乳酸レダクターゼは、Ｌ−セリン、Ｄ−セリン、２−メチル−ＤＬ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｌ−アロスレオニン、Ｌ−３−ヒドロキシイソブチレート、Ｄ−３−ヒドロキシイソブチレート、３−ヒドロキシプロピオネート、Ｌ−３−ヒドロキシブチレート、及びＤ−３−ヒドロキシブチレートを含むＦｕｊｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．が列挙するものなどの、他の公知の基質を使用して阻害することができる。Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６４５：８９−９４（２００３）、これは全体として参照により本明細書に援用される。
ＤＨＭＢの除去
本明細書に記載される他の実施形態において、発酵からＤＨＭＢを除去することにより、ＤＨＭＢの低減を実現することができる。従って、ＤＨＭＢ濃度が低下した発酵もまた、本明細書に記載される。ＤＨＭＢの除去により、例えば、より高純度の生成物、又は所望の純度を達成するのに必要な処理がより少ない生成物を得ることができる。従って、高い純度を有するエタノール又はブタノールなどの生合成経路の生成物を含む組成物もまた、提供される。
ＤＨＭＢは、発酵プロセスの最中又はその後に除去することができ、当該技術分野において公知の任意の手段により除去することができる。ＤＨＭＢは、例えば、有機相中への抽出又は反応抽出により除去することができる。
一部の実施形態では、発酵ブロスは、約０．５ｍＭ未満のＤＨＭＢを含む。一部の実施形態では、発酵ブロスは、約５時間、約１０時間、約１５時間、約２０時間、約２５時間、約３０時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間、又は約５０時間の発酵後に約１．０ｍＭ未満のＤＨＭＢを含む。一部の実施形態では、発酵ブロスは、約２０時間、約２５時間、約３０時間、約３５時間、約４０時間、約４５時間、又は約５０時間の発酵後に約５．０ｍＭ未満のＤＨＭＢを含む。
生合成経路
本明細書に提供されるＫＡＲＩ変異体はイソブタノールの生成に好適であると考えられるが、本明細書に開示されるＫＡＲＩは、アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレート又は２−アセト−２−ヒドロキシブタノエートから２，３−ジヒドロキシ−３−メチルペンタノエートなど、ＫＡＲＩ活性により触媒される基質から生成物への変換を用いる任意の生合成経路で有用であり得ることが想定される。かかる経路としては、限定はされないが、パントテン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン又は３，３−ジメチルマレートを生成する経路が挙げられる。
特定の好適なイソブタノール生合成経路が、米国特許第７，８５１，１８８号明細書及び同第７，９９３，８８９号明細書（その各々が全体として参照により本明細書に援用される）に開示される。開示されるイソブタノール生合成経路の図を、図１に提供する。米国特許第７，８５１，１８８号明細書に記載されるとおり、例示的なイソブタノール生合成経路のステップには、以下の変換が含まれる：
−例えばアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）により触媒されるとおりの、ピルベートからアセトラクテートへの変換（図１を参照、そのなかの経路ステップａ）；
−例えばアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（ＫＡＲＩ）により触媒されるとおりのアセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換（図１を参照、そのなかの経路ステップｂ）；
−例えばジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）とも称されるアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒されるとおりの、２，３−ジヒドロキシイソバレレートから２−ケトイソバレレートへの変換（図１を参照、そのなかの経路ステップｃ）；
−例えば分枝鎖２−ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒されるとおりの２−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換（図１を参照、そのなかの経路ステップｄ）；及び
−例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒されるとおりのイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換（図１を参照、そのなかの経路ステップｅ）。
別の実施形態において、イソブタノール生合成経路は、以下の基質から生成物への変換を含む：
−ピルベートからアセトラクテートへの変換、これは例えば、アセト乳酸シンターゼにより触媒され得る；
−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、これは例えば、ケトール酸レダクトイソメラーゼにより触媒され得る（ＫＡＲＩ）；
−２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、これは例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒され得る；
−α−ケトイソバレレートからバリンへの変換、これは例えば、トランスアミナーゼ又はバリンデヒドロゲナーゼにより触媒され得る；
−バリンからイソブチルアミンへの変換、これは例えば、バリンデカルボキシラーゼにより触媒され得る；
−イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの変換、これは例えば、ωトランスアミナーゼにより触媒され得る；及び、
−イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換、これは例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒され得る。
別の実施形態において、イソブタノール生合成経路は、以下の基質から生成物への変換を含む：
−ピルベートからアセトラクテートへの変換、これは例えば、アセト乳酸シンターゼにより触媒され得る；
−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、これは例えば、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼにより触媒され得る；
−２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、これは例えば、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒され得る；
−α−ケトイソバレレートからイソブチリル−ＣｏＡへの変換、これは例えば、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼにより触媒され得る；
−イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの変換、これは例えば、アセチル化（ａｃｅｌｙｌａｔｉｎｇ）アルデヒドデヒドロゲナーゼにより触媒され得る；及び、
−イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換、これは例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼにより触媒され得る。
別の実施形態において、イソブタノール生合成経路は、図１にステップｋ、ｇ、及びｅとして示される基質から生成物への変換を含む。
別の実施形態において、ＫＡＲＩにより触媒される基質から生成物への変換を含む経路は、以下の基質から生成物への変換を含むパントテン酸生合成経路である：
−ピルベートからアセトラクテートへの変換、これは例えば、アセト乳酸シンターゼにより触媒され得る；
−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、これは例えば、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）により触媒され得る；
−２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、これは例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）により触媒され得る；
−α−ケトイソバレレートから２−デヒドロパントエートへの変換、これは例えば、３−メチル−２−オキソブタン酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｐａｎＢ；これはＥＣ ２．１．２．１１に分類され得る）により触媒され得る；
−２−デヒドロパントエートから（Ｒ）−パントエートへの変換、これは例えば、２−デヒドロパントイン酸２−レダクターゼ（ｐａｎＥ；これはＥＣ １．１．１．１６９に分類され得る）により触媒され得る；
−（Ｒ）−パントエートから（Ｒ）−パントテネートへの変換。これは例えば、パントエート−β−アラニンリガーゼ（ｐａｎＣ；これはＥＣ ６．３．２．１に分類され得る）により触媒され得る。
別の実施形態において、ＫＡＲＩにより触媒される基質から生成物への変換を含む経路は、以下の基質から生成物への変換を含むバリン生合成経路である：
−ピルベートからアセトラクテートへの変換、これは例えば、アセト乳酸シンターゼにより触媒され得る；
−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、これは例えば、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）により触媒され得る；
−２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、これは例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）により触媒され得る；
−α−ケトイソバレレートからバリンへの変換、これは例えば、分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ｉｌｖＥ（ＢＡＴ）；これはＥＣ ２．６．１．４２に分類され得る）により触媒され得る。
別の実施形態において、ＫＡＲＩにより触媒される基質から生成物への変換を含む経路は、以下の基質から生成物への変換を含むイソロイシン生合成経路である：
−ピルベート及びα−ケトブチレートから２−アセト−２−ヒドロキシブタノエートへの変換、これは例えば、アセト乳酸シンターゼにより触媒され得る；
−２−アセト−２−ヒドロキシブタノエートから２，３−ジヒドロキシ−３−メチルペンタノエートへの変換、これは例えば、ＫＡＲＩにより触媒され得る；
−２，３−ジヒドロキシ−３−メチルペンタノエートから３−メチル−２−オキソ−ペンタノエートへの変換、これは例えば、ＤＨＡＤにより触媒され得る；
−３−メチル−２−オキソ−ペンタノエートからイソロイシンへの変換、これは例えば、分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ｉｌｖＥ（ＢＡＴ）；これはＥＣ ２．６．１．４２に分類され得る）により触媒され得る。
別の実施形態において、ＫＡＲＩにより触媒される基質から生成物への変換を含む経路は、以下の基質から生成物への変換を含むロイシン生合成経路である：
−ピルベートからアセトラクテートへの変換、これは例えば、アセト乳酸シンターゼにより触媒され得る；
−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、これは例えば、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）により触媒され得る；
−２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、これは例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）により触媒され得る；
−α−ケトイソバレレートから２−イソプロピルマレートへの変換、これは例えば、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ｌｅｕＡ、これはＥＣ ２．３．３．１３に分類され得る）により触媒され得る；
−２−イソプロピルマレートから２−イソプロピルマレエートへの変換、これは例えば、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ（ｌｅｕ１；これはＥＣ ４．２．１．３３に分類され得る）により触媒され得る；
−２−イソプロピルマレエートから３−イソプロピルマレートへの変換、これは例えば、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ（ｌｅｕ１；これはＥＣ ４．２．１．３３に分類され得る）により触媒され得る；
−３−イソプロピルマレートから２−イソプロピル−３−オキソスクシネートへの変換、これは例えば、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｌｅｕＢ；これはＥＣ １．１．１．８５に分類され得る）により触媒され得る；
−２−イソプロピル−３−オキソスクシネートから４−メチル−２−オキソペンタノエートへの変換（自発反応）；及び
−４−メチル−２−オキソペンタノエートからロイシンへの変換、これは例えば、分枝鎖アミノトランスフェラーゼ（ｉｌｖＥ（ＢＡＴ）；これはＥＣ ２．６．１．４２に分類され得る）により触媒され得る。
別の実施形態において、ＫＡＲＩにより触媒される基質から生成物への変換を含む経路は、以下の基質から生成物への変換を含む３，３−ジメチルマレート生合成経路である：−ピルベートからアセトラクテートへの変換、これは例えば、アセト乳酸シンターゼにより触媒され得る；
−アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、これは例えば、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）により触媒され得る；
−２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、これは例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）により触媒され得る；
−α−ケトイソバレレートから（Ｒ）−３，３ジメチルマレートへの変換、これは例えば、ジメチルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＤＭＭＤ；これは１．１．１．８４に分類され得る）により触媒され得る。
上記に記載する基質から生成物への変換並びに別のイソブタノール経路のそのような変換のある種のものに用いることのできる遺伝子及びポリペプチドは、当該技術分野において利用可能である。例えば、米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書及び国際公開第２０１１／０１９８９４号パンフレット（両方とも全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。米国特許出願公開第２０１１／０１９８９４号明細書、同第２００７／００９２９５７号明細書、同第２０１０／００８１１５４号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）は、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）及びストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）由来のものを含めた、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼについて記載している。ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼには、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、マクロコッカス・カセオリチクス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（配列番号１７１）及びリステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）（配列番号１７０）に由来するものが含まれる。米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書及び米国特許出願公開第２０１１／０２６９１９９号明細書（全体として参照により援用される）は、ＮＡＤＨを補因子として利用するものを含め、アルコールデヒドロゲナーゼについて記載している。アルコールデヒドロゲナーゼには、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のＳａｄＢが含まれる。さらなるアルコールデヒドロゲナーゼには、ウマ肝ＡＤＨ及びベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｋｉａ ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨが含まれる。アルコールデヒドロゲナーゼには、ＮＡＤＨを補因子として利用するものが含まれる。一実施形態において、イソブタノール生合成経路は、ａ）ＮＡＤＨに対するＫＭが約３００μＭ未満、約１００μＭ未満、約５０μＭ未満、約２０μＭ未満又は約１０μＭ未満であるケトール酸レダクトイソメラーゼ；ｂ）ＮＡＤＨを補因子として利用するアルコールデヒドロゲナーゼ；又はｃ）ａ）及びｂ）の両方を含む。
国際公開第２０１１／０１９８９４号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１１／０１９８９４号明細書、同第２００７／００９２９５７号明細書、同第２０１０／００８１１５４号明細書（これらは全体として参照により本明細書に援用される）が、好適なジヒドロキシ酸デヒドラターゼについて記載している。ＤＨＡＤ活性を増加させる方法が、例えば、米国特許出願公開第２０１０／００８１１７３号明細書及び同第２０１２／００６４５６１Ａ１号明細書（これらは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
使用できるさらなる遺伝子は、当業者によりバイオインフォマティクスによるか又は当該技術分野で周知の方法を用いて同定され得る。
さらに、米国特許出願公開第２００７／００９２９５７ Ａ１号明細書（これは全体として参照により本明細書に援用される）には、開示されるイソブタノール生合成経路を使用したイソブタノール生成用のキメラ遺伝子の構築並びに細菌及び酵母の遺伝子操作が記載される。かかる構築及び操作方法は、ＫＡＲＩ活性により触媒される基質から生成物への変換を含む本明細書に開示される及び／又は当該技術分野において公知の他の経路の構築のため、当業者によって容易に用いられ得る。
好適なケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素が、本明細書の他の部分に記載される。一部の実施形態では、ＫＡＲＩ酵素は、少なくとも約０．１マイクロモル／分／ｍｇ、少なくとも約０．２マイクロモル／分／ｍｇ、少なくとも約０．３マイクロモル／分／ｍｇ、少なくとも約０．４マイクロモル／分／ｍｇ、少なくとも約０．５マイクロモル／分／ｍｇ、少なくとも約０．６マイクロモル／分／ｍｇ、少なくとも約０．７マイクロモル／分／ｍｇ、少なくとも約０．８マイクロモル／分／ｍｇ、少なくとも約０．９マイクロモル／分／ｍｇ、少なくとも約１．０マイクロモル／分／ｍｇ、又は少なくとも約１．１マイクロモル／分／ｍｇの比活性を有する。アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するのに好適なポリペプチドとしては、ＮＡＤＨに対するＫＭが約３００μＭ未満、約１００μＭ未満、約５０μＭ未満、約２５μＭ未満又は約１０μＭ未満のものが含まれる。
修飾
ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の機能欠失を用いることで、生合成生成物経路に利用されるピルベートの利用可能性が高められている。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３１９５０ Ａ１号明細書（これは全体として参照により本明細書に援用される）は、１つ以上のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の破壊及びＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を含む酵母株を開示し、この酵母株はＤ−乳酸の生成に用いられる。米国特許出願公開第２００５／００５９１３６ Ａ１号明細書（これは全体として参照により本明細書に援用される）は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有しないグルコース耐性二炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株を開示し、この酵母株は外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有し得る。Ｎｅｖｏｉｇｔ ａｎｄ Ｓｔａｈｌ（Ｙｅａｓｔ １２：１３３１−１３３７（１９９６））は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるピルビン酸デカルボキシラーゼの減少及びＮＡＤ依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの増加がグリセロール収率に及ぼす影響について記載している。米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（これは全体として参照により本明細書に援用される）は、サイトゾルに局在するアセト乳酸シンターゼが発現し、且つピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が実質的に消失するように酵母を操作することによるピルベートからアセトラクテートへの変換の増加を開示している。
本発明の実施形態において、本明細書に開示される組換え宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける修飾又はＰＤＣ活性を有する内因性ポリペプチドにおける修飾を含むことができる。実施形態において、本明細書に開示される組換え宿主細胞は、ＰＤＣをコードするポリヌクレオチド、遺伝子及び／又はポリペプチドの修飾又は破壊を有することができる。実施形態において、組換え宿主細胞は、ＰＤＣ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチド若しくは遺伝子、又はＰＤＣ活性を有する内因性ポリペプチドに、欠失、突然変異、及び／又は置換を含む。かかる修飾、破壊、欠失、突然変異、及び／又は置換により、低下又は消失したＰＤＣ活性がもたらされ、それにより例えば、ＰＤＣノックアウト（ＰＤＣ−ＫＯ）表現型が引き起こされ得る。
本発明の実施形態において、本明細書に開示される組換え宿主細胞の内因性ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、ピルベートをアセトアルデヒドに変換し、アセトアルデヒドは次に、アセテートを経てエタノール又はアセチル−ＣｏＡに変換され得る。他の実施形態において、組換え宿主細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする１つの遺伝子を含むクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする１つの遺伝子を含むカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、又はピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする１つの遺伝子を含むシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）である。
他の実施形態において、組換え宿主細胞は、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、及びＰＤＣ６遺伝子によりコードされるピルビン酸デカルボキシラーゼの３つのアイソザイム、並びにピルビン酸デカルボキシラーゼ調節遺伝子ＰＤＣ２を含むサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における非限定的な例では、ＰＤＣ１及びＰＤＣ５遺伝子、又はＰＤＣ１、ＰＤＣ５、及びＰＤＣ６遺伝子が、破壊される。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における別の非限定的な例では、ＰＤＣ２調節遺伝子を破壊することによりピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を低下させ得る。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における別の非限定的な例では、ＰＤＣ１、ＰＤＣ２、ＰＤＣ５及び／又はＰＤＣ６と約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列同一性を有するものなどのピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド又は遺伝子を破壊することができる。
実施形態において、ＰＤＣ活性を有するポリペプチド、又はＰＤＣ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド若しくは遺伝子は、ＥＣ番号ＥＣ ４．１．１．１に対応する。他の実施形態において、本明細書に開示される組換え宿主細胞のＰＤＣ遺伝子は、用いられる発酵条件下で不活性であり、従ってかかる遺伝子は修飾又は不活性化する必要がない。
ピルビン酸デカルボキシラーゼコード遺伝子の破壊によってピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低下した組換え宿主細胞の例が、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）についてＦｌｉｋｗｅｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（Ｙｅａｓｔ（１９９６）１２：２４７−２５７）に、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）についてＢｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９６）１９（１）：２７−３６）に、及び調節遺伝子の破壊がＨｏｈｍａｎｎ（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９３）２４１：６５７−６６６）に報告されている。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有しないサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の株は、ＡＴＣＣから受託番号２０００２７及び２０００２８により入手可能である。本明細書に開示される組換え宿主細胞における修飾又は不活性化の標的とし得るＰＤＣポリヌクレオチド、遺伝子及び／又はポリペプチドの例としては、限定はされないが、以下の表６のものが挙げられる。
Figure 0006321631
本明細書に開示される組換え宿主細胞における修飾又は不活性化の標的とし得るＰＤＣポリヌクレオチド、遺伝子及びポリペプチドの他の例としては、限定はされないが、表６の配列のいずれか一つと少なくとも約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列同一性を有するＰＤＣポリヌクレオチド、遺伝子及び／又はポリペプチドが挙げられ、ここでかかるポリヌクレオチド又は遺伝子はＰＤＣ活性をコードし、又はかかるポリペプチドはＰＤＣ活性を有する。本明細書に開示される組換え宿主細胞における修飾又は不活性化の標的とし得るＰＤＣポリヌクレオチド、遺伝子及びポリペプチドのさらに他の例としては、限定はされないが、表６の配列のいずれか一つの活性変異体、断片又は誘導体が挙げられ、ここでかかるポリヌクレオチド又は遺伝子はＰＤＣ活性をコードし、又はかかるポリペプチドはＰＤＣ活性を有する。
実施形態において、本明細書に開示される又は当該技術分野において公知のＰＤＣ配列をコードするポリヌクレオチド、遺伝子及び／又はポリペプチドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼについて上記に開示されるとおり修飾することができる。他の実施形態において、ＰＤＣをコードするポリヌクレオチド、遺伝子及び／又はポリペプチドを使用して、アセト乳酸デヒドロゲナーゼについて上記に開示されるとおり、別のＰＤＣポリヌクレオチド、遺伝子及び／又はポリペプチド配列を同定し、又は他の細胞におけるＰＤＣ相同体を同定することができる。かかるＰＤＣコード配列は、例えば、文献及び／又は当業者に公知のバイオインフォマティクスデータベースにおいて同定することができる。例えば、バイオインフォマティクスを用いた他の細胞型におけるＰＤＣコード配列の同定は、本明細書に提供されるものなどの、既知のＰＤＣコードＤＮＡ及びポリペプチド配列による公的に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上記に記載したとおり）検索によって達成することができる。同一性は、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、及びＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを使用するＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法に基づく。
ＰＤＣ活性を低下又は消失させるための本明細書に開示される組換え宿主細胞におけるＰＤＣの修飾は、当該技術分野において公知の方法を用いて確認することができる。例えば、特定のピルビン酸デカルボキシラーゼの破壊は、遺伝子配列に対して外部のプライマーを使用するＰＣＲスクリーニングで、又はピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子配列に対して設計されたプローブを使用するサザンブロットにより、確認してもよい。或いは、ガスクロマトグラフィー又はＨＰＬＣなどの分析方法を利用して、アセトアルデヒド及び／又はエタノール生成の減少又は消失について株をスクリーニングすることもできる。
ヘキソキナーゼ２遺伝子の機能欠失を用いることで、グルコース抑制が低減し、生合成経路に利用されるピルベートの利用可能性が高められている。例えば、国際公開第２０００／０６１７２２ Ａ１号パンフレット（これは全体として参照により本明細書に援用される）は、１つ以上の機能を欠失させたヘキソキナーゼ２遺伝子又は類似体を有する好気的に成長する酵母による酵母バイオマスの生成を開示している。加えて、Ｒｏｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：１５５−１６４（２００８））は、ヘキソキナーゼ２遺伝子が欠失したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が、糖過剰及び嫌気性条件下における二酸化炭素生成の比速度として定義される発酵能の７５％の低下を示したことを見出した。飢餓後、発酵能はヘキソキナーゼ２遺伝子欠失を有しない株と同様であった。Ｄｉｄｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６７：１５８７−１５９３（２００１））は、ヘキソキナーゼ２遺伝子が欠失したＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ではピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低下したことを見出した。
実施形態において、本明細書に開示される組換え宿主細胞は、ヘキソキナーゼ２活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの修飾及び／又はヘキソキナーゼ２活性を有するポリペプチドの修飾を含むことができる。実施形態において、本明細書に開示される組換え宿主細胞は、ヘキソキナーゼ２をコードするポリヌクレオチド、遺伝子又はポリペプチドの修飾又は破壊を有し得る。実施形態において、組換え宿主細胞は、ヘキソキナーゼ２活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチド又は遺伝子に、又はヘキソキナーゼ２活性を有する内因性ポリペプチドに、欠失、突然変異、及び／又は置換を含む。かかる修飾、破壊、欠失、突然変異、及び／又は置換により、低下又は消失したヘキソキナーゼ２活性がもたらされ、それにより例えば、ヘキソキナーゼ２ノックアウト（ＨＸＫ２−ＫＯ）表現型もたらされ得る。実施形態において、宿主細胞は、米国特許出願公開第２０１１／０１２４０６０ Ａ１号明細書又は同第２０１２／００１５４１６ Ａ１号明細書（これらは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの修飾を含む。
実施形態において、ヘキソキナーゼ２活性を有するポリペプチドは、ヘキソースからヘキソース−６−ホスフェートへの変換を触媒することができ、及び／又はＤ−グルコースからＤ−グルコース６−ホスフェート、Ｄ−フルクトースからＤ−フルクトース６−ホスフェート、及び／又はＤ−マンノースからＤ−マンノース６−ホスフェートへの変換を触媒することができる。他の実施形態において、ヘキソキナーゼ２活性を有するポリヌクレオチド、遺伝子又はポリペプチドは、ＥＣ番号ＥＣ ２．７．１．１に対応し得る。
本発明の実施形態において、組換え宿主細胞はＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であってよく、ヘキソキナーゼ２活性を有するポリヌクレオチド、遺伝子又はポリペプチドはＨＸＫ２であり得る。他の実施形態において、組換え宿主細胞はＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）であってよく、ヘキソキナーゼ２活性を有するポリヌクレオチド、遺伝子又はポリペプチドはＲＡＧ５であり得る。他の実施形態において、組換え宿主細胞はＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）であってよく、ヘキソキナーゼ２活性を有するポリヌクレオチド、遺伝子又はポリペプチドはＨＰＧＬＫ１であり得る。他の実施形態において、組換え宿主細胞はＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）であってよく、ヘキソキナーゼ２活性を有するポリヌクレオチド、遺伝子又はポリペプチドはＨＸＫ２であり得る。
本明細書に開示される組換え宿主細胞における修飾又は不活性化の標的とし得るヘキソキナーゼ２ポリヌクレオチド、遺伝子及びポリペプチドの例としては、限定はされないが、以下の表７のものが挙げられる。
Figure 0006321631
本明細書に開示される組換え宿主細胞における修飾又は不活性化の標的とし得るヘキソキナーゼ２ポリヌクレオチド、遺伝子及びポリペプチドの他の例としては、限定はされないが、表９の配列のいずれか一つと少なくとも約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列同一性を有するヘキソキナーゼ２ポリヌクレオチド、遺伝子及び／又はポリペプチドが挙げられ、ここでかかるポリヌクレオチド又は遺伝子はヘキソキナーゼ２活性をコードし、又はかかるポリペプチドはヘキソキナーゼ２活性を有する。本明細書に開示される組換え宿主細胞における修飾又は不活性化の標的とし得るヘキソキナーゼ２ポリヌクレオチド、遺伝子及びポリペプチドのさらに他の例としては、限定はされないが、表７の配列のいずれか一つの活性変異体、断片又は誘導体が挙げられ、ここでかかるポリヌクレオチド又は遺伝子はヘキソキナーゼ２活性をコードし、又はかかるポリペプチドはヘキソキナーゼ２活性を有する。
実施形態において、本明細書に開示される又は当該技術分野において公知のヘキソキナーゼ２配列をコードするポリヌクレオチド、遺伝子及び／又はポリペプチドは、アルデヒドデヒドロゲナーゼについて上記に開示されるとおり、修飾又は破壊することができる。他の実施形態において、ヘキソキナーゼ２をコードするポリヌクレオチド、遺伝子及び／又はポリペプチドを使用して、アルデヒドデヒドロゲナーゼについて上記に開示されるとおり、別のヘキソキナーゼ２ポリヌクレオチド、遺伝子及び／又はポリペプチド配列を同定し、又は他の細胞におけるヘキソキナーゼ２相同体を同定することができる。かかるヘキソキナーゼ２コード配列は、例えば、文献及び／又は当業者に公知のバイオインフォマティクスデータベースにおいて同定することができる。例えば、バイオインフォマティクスを用いた他の細胞型におけるヘキソキナーゼ２コード配列の同定は、本明細書に提供されるものなどの、既知のヘキソキナーゼ２コードＤＮＡ及びポリペプチド配列により公的に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上記に記載したとおり）検索によって達成することができる。同一性は、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．１、及びＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズのタンパク質重み行列のデフォルトパラメータを使用するＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法に基づく。
ヘキソキナーゼ２活性を低下又は消失させるための本明細書に開示される組換え宿主細胞におけるヘキソキナーゼ２の修飾は、当該技術分野において公知の方法を用いて確認することができる。例えば、ヘキソキナーゼ２の破壊は、ヘキソキナーゼ２遺伝子に対して外部のプライマーを使用するＰＣＲスクリーニングで、又はヘキソキナーゼ２遺伝子配列に対して設計されたプローブを使用するサザンブロットにより、確認してもよい。或いは、推定ヘキソキナーゼ２ノックアウト株を、グルコース含有培地でのバイオマス収率の増加について調べることもできる。
本明細書に提供される細胞において有用であり得るさらなる修飾の例には、米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる修飾及び／又はピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子における破壊若しくはピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を制御する調節エレメントをコードする少なくとも１つの遺伝子における破壊、米国特許出願公開第２０１０／０１２０１０５号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの、エントナー−ドウドロフ経路を通る炭素フラックスの増加又は還元当量バランスを提供する宿主細胞に対する修飾が含まれる。他の修飾には、国際公開第２０１２／０３３８３２号パンフレット（これは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるピルベート利用生合成経路におけるステップを触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの組み込みが含まれる。酵母生成宿主細胞がｐｄｃ−であるグルコース抑制の低減効果を有する遺伝子修飾が、米国特許出願公開第２０１１／０１２４０６０号明細書（これは全体として参照により本明細書に援用される）に記載される。
米国特許出願公開第２０１２００６４５６１Ａ１号明細書（これは全体として参照により本明細書に援用される）は、（ａ）ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド；及び（ｂ）（ｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子における少なくとも１つの欠失、突然変異、及び／又は置換；及び／又は（ｉｉ）Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を開示している。実施形態において、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、ＡＦＴ１、ＡＦＴ２、ＦＲＡ２、ＧＲＸ３、又はＣＣＣ１によりコードされる。実施形態において、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドは、構成的突然変異体ＡＦＴ１ Ｌ９９Ａ、ＡＦＴ１ Ｌ１０２Ａ、ＡＦＴ１ Ｃ２９１Ｆ、又はＡＦＴ１ Ｃ２９３Ｆである。
加えて、宿主細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド及び／又はホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド、例えば、配列番号２６２及び２６３によりコードされる異種ポリペプチド、及び国際公開第２０１１／１５９８５３号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１２０１５６７３５Ａ１号明細書（これらは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの異種ポリペプチドなどを含むことができる。
イソブタノール生成用の微生物宿主
イソブタノール生成用の微生物宿主は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌及び酵母から選択することができる。ブタノール生成に用いられる微生物宿主は、収率がブタノール毒性によって制限されることのないように、イソブタノールに耐性を有しなければならない。ブタノール耐性突然変異体がソルベント生成クロストリジウムから単離されているが、他の潜在的に有用な細菌株のブタノール耐性に関しては、利用可能な情報はほとんどない。細菌におけるアルコール耐性の比較に関する研究の多くが、ブタノールの毒性がエタノールより高いことを示唆しており（ｄｅ Ｃａｖａｌｈｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．，６４：２１５−２２，２００４）及び（Ｋａｂｅｌｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２２０：２２３−２２７，２００３、Ｔｏｍａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８６：２００６−２０１８，２００４）は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）における発酵中の１−ブタノールの収率が１−ブタノールの毒性によって制限され得ることを報告している。クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）に対する１−ブタノールの一次的な効果は、膜機能の破壊である（Ｈｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０：１２３８−１２４３，１９８５）。
イソブタノールの生成用に選択する微生物宿主は、イソブタノールに耐性を有しなければならず、且つ炭水化物をイソブタノールに変換する能力を有しなければならない。好適な微生物宿主の選択基準としては、以下が挙げられる：イソブタノールに対する固有の耐性、高いグルコース利用率、遺伝子操作用の遺伝学的ツールの利用可能性、及び安定な染色体改変を生じる能力。
イソブタノール耐性を有する好適な宿主株は、株の固有の耐性に基づきスクリーニングすることによって同定することができる。イソブタノールに対する微生物の固有の耐性は、最少培地で成長させたとき成長速度の５０％の阻害をもたらすイソブタノールの濃度（ＩＣ５０）を決定することによって計測できる。ＩＣ５０値は、当該技術分野において公知の方法を用いて決定することができる。例えば、目的の微生物を様々な量のイソブタノールの存在下で成長させ、６００ナノメートルでの光学濃度を計測して成長速度をモニタしてもよい。成長曲線の対数期部分から倍加時間を計算し、それを成長速度の尺度として用いることができる。イソブタノール濃度に対する成長阻害率のグラフから、５０％の成長阻害を生じるイソブタノールの濃度を決定することができる。一実施形態において、宿主株は約０．５％より高いイソブタノールに対するＩＣ５０を有する。
イソブタノール生成用の微生物宿主はまた、グルコースを高率で利用しなければならない。多くの微生物が炭水化物の代謝能を有する。しかしながら、特定の環境微生物は炭水化物を高い効率まで代謝することができず、従って好適な宿主ではない。
宿主を遺伝子修飾する能力は、任意の組換え微生物の産生に必須である。遺伝子移入技術の方式は、電気穿孔、接合、形質導入又は自然形質転換によってもよい。広範な宿主接合性プラスミド及び薬剤耐性マーカーが利用可能である。クローニングベクターは、宿主微生物に対して、当該の宿主で機能し得る抗生物質耐性マーカーの性質に基づき適合される。
微生物宿主はまた、炭素フローが競合する経路を不活性化するために、様々な遺伝子を欠失させて操作される必要がある。これには、不活性化を誘導するためのトランスポゾン又は染色体組込みベクターのいずれかを利用可能であることが必要である。加えて、生成宿主は、固有のイソブタノール耐性を改良する突然変異を達成することができるように、化学的突然変異生成を起こし易いものでなければならない。
上記に記載される基準に基づけば、イソブタノールの生成に好適な微生物宿主としては、限定はされないが、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、及びサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーが挙げられる。好適な宿主としては、以下が挙げられる：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）。一部の実施形態では、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母は、当該技術分野において周知されており、限定はされないが、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ、Ｇｅｒｔ Ｓｔｒａｎｄ ＡＢ、Ｆｅｒｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍａｒｔｒｅｘ、及びＬａｌｌｅｍａｎｄを含む様々なソースから利用可能である。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）としては、限定はされないが、ＢＹ４７４１、ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ、Ｅｔｈａｎｏｌ Ｒｅｄ（登録商標）酵母、Ｆｅｒｍ Ｐｒｏ（商標）酵母、Ｂｉｏ−Ｆｅｒｍ（登録商標）ＸＲ酵母、Ｇｅｒｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｐｒｅｓｔｉｇｅ Ｂａｔｃｈ Ｔｕｒｂｏアルコール酵母、Ｇｅｒｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｐｏｔ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ酵母、Ｇｅｒｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ Ｔｕｒｂｏ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｒｅｅｎ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｏｌｄ酵母、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）酵母、ＢＧ−１、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、及びＣＢＳ７９６１が挙げられる。
生成宿主の構築
発酵性炭素基質をブタノールに変換する酵素経路をコードし得る必要な遺伝子を含む組換え微生物を、当該技術分野において公知の技法を用いて構築することができる。本発明では、本発明のイソブタノール生合成経路の一つの酵素、例えば、アセト乳酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ、及び分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、上記に記載したとおり、様々な供給源から単離することができる。
ゲノムから所望の遺伝子を得る方法は、分子生物学分野において一般的で、周知されている。例えば、遺伝子の配列が分かっている場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により好適なゲノムライブラリを作成することができ、所望の遺伝子配列と相補的なプローブでスクリーニングすることができる。配列が単離されると、ポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）などの標準的なプライマー誘導増幅法を用いてＤＮＡを増幅することにより、適切なベクターを使用する形質転換に好適な量のＤＮＡを得ることができる。異種宿主における発現のためのコドン最適化ツールは、容易に利用可能である。一部のコドン最適化ツールは、宿主微生物のＧＣ含量に基づき利用可能である。
関連する経路遺伝子が同定され、単離された後、それらの遺伝子は、当該技術分野において公知の手段によって好適な発現宿主に形質転換することができる。様々な宿主細胞の形質転換に有用なベクター又はカセットは一般的であり、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）などの会社から市販されている。典型的にはベクター又はカセットは、関連する遺伝子の転写及び翻訳を誘導する配列、選択可能なマーカー、及び自己複製又は染色体への組込みを可能にする配列を含む。好適なベクターは、転写開始制御を含む遺伝子の領域５’及び転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’を含む。いずれの制御領域も形質転換宿主細胞と相同の遺伝子に由来し得るが、かかる制御領域はまた、生成宿主として選択される特定の種にとって天然でない遺伝子に由来してもよいことが理解されるべきである。
所望の宿主細胞において関連する経路コード領域の発現を駆動するのに有用な開始制御領域又はプロモーターは多数あり、当業者は精通している。事実上、これらの遺伝エレメントを駆動することが可能な任意のプロモーターが、本実施例で用いるものを含め、本発明に好適であり、限定はされないが、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）；ＡＯＸ１（ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）；及びｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、及びｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）における発現に有用）並びに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、及びパエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーター及び様々なファージプロモーターが挙げられる。酵母組換え宿主細胞には、遺伝子用の発現カセットの構築に数多くのプロモーターを使用することができ、限定はされないが、酵母における使用に好適な以下の構成的プロモーター：ＦＢＡ１、ＴＤＨ３（ＧＰＤ）、ＡＤＨ１、ＩＬＶ５、及びＧＰＭ１；及び酵母における使用に好適な以下の誘導性プロモーター：ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＯＬＥ１、及びＣＵＰ１が挙げられる。他の酵母プロモーターとしては、ハイブリッドプロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＦＢＡ１ｐ（配列番号２６４）、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＥＮＯ２ｐ（配列番号２６５）、ＵＡＳ（ＦＢＡ１）−ＰＤＣ１ｐ（配列番号２６６）、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＤＣ１ｐ（配列番号２６７）、及びＵＡＳ（ＰＧＫ）−ＯＬＥ１ｐ（配列番号２６８）が挙げられる。
プロモーター、転写ターミネーター、及びコード領域は、酵母２ミクロンプラスミドにクローニングし、酵母細胞に形質転換することができる（Ｌｕｄｗｉｇ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ，１３２：３３−４０，１９９３；米国特許出願公開第２００８０２６１８６１ Ａ１号明細書）。
所与の宿主における遺伝子発現量の調整は、天然又は人工プロモーターの選択によるなど、転写レベルを変化させることで達成し得る。加えて、プロモーターライブラリを使用して所望の遺伝子転写レベルを達成するなどの技法が、当該技術分野において公知である。かかるライブラリは、当該技術分野において公知の技法を用いて、例えば、遺伝子カセットの前にランダムなｃＤＮＡ断片をクローニングすることによるか（Ｇｏｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＡＥＭ ９９，１７０２５）、プロモーター内に存在する調節配列を調節することによるか（Ｌｉｇｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７２，２１１３）、又は既知のプロモーター配列の突然変異生成により（Ａｌｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＰＮＡＳ，１２６７８；Ｎｅｖｏｉｇｔ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＡＥＭ ７２，５２６６）、作成することができる。
終結制御領域もまた、宿主にとって天然の様々な遺伝子に由来し得る。場合により、終結部位は不要であることもあり、又は含まれることもある。
特定のベクターは、広範な宿主細菌における複製能を有し、且つ接合によって移すことができる。ｐＲＫ４０４の完全なアノテートされた配列並びに３つの関連するベクターｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、及びｐＲＫ４４２（Ｈ）が利用可能である。これらの誘導体は、グラム陰性菌における遺伝子操作に有益なツールであることが分かっている（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，５０：７４−７９，２００３）。広宿主域のＩｎｃ Ｐ４プラスミドＲＳＦ１０１０のいくつかのプラスミド誘導体もまた、様々なグラム陰性菌において機能し得るプロモーターを伴い利用可能である。プラスミドｐＡＹＣ３６及びｐＡＹＣ３７は、グラム陰性菌における異種遺伝子発現を可能にする多重クローニング部位と共に活性プロモーターを有する。
染色体遺伝子置換ツールもまた広く利用可能である。例えば、広宿主域レプリコンｐＷＶ１０１の温度感受性変異体を修飾することによりプラスミドｐＶＥ６００２が構築されており、これを用いると、様々なグラム陽性菌に遺伝子置換を生じさせることができる（Ｍａｇｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：５６３３−５６３８，１９９２）。加えて、インビトロのトランスポソーム（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ）が、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）などの商業的供給元から様々なゲノムにおけるランダム突然変異の作成に利用可能である。
様々な微生物宿主におけるブタノール生合成経路の発現を、以下にさらに詳細に記載する。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるブタノール生合成経路の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換に有用なベクター又はカセットは一般的であり、上記に列挙した会社から市販されている。例えば、イソブタノール生合成経路の遺伝子は、様々な供給源から単離し、修飾ｐＵＣ１９ベクターにクローニングして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＭ５２２に形質転換することができる。
ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）におけるブタノール生合成経路の発現
一連の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）シャトルベクターが、Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）における発現に利用可能であり、限定はされないが、ｐＲｈＢＲ１７及びｐＤＡ７１（Ｋｏｓｔｉｃｈｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６２：６１−６８，２００３）が挙げられる。加えて、一連のプロモーターが、Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）における異種遺伝子発現に利用可能である（Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７０：５５５７−５５６８，２００４及びＴａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６８：３４６−３５４，２００５）。Ｒ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）における染色体遺伝子の標的遺伝子破壊を、Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，、前掲、及びＢｒａｎｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６：２０２９−２０３６，２０００）により記載される方法を用いて作成することができる。
上記に記載したとおりの、イソブタノールの生成に必要な異種遺伝子を、最初にｐＤＡ７１又はｐＲｈＢＲ７１にクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換することができる。次にこのベクターを、Ｋｏｓｔｉｃｈｋａ ｅｔ ａｌ．，、前掲により記載されるとおり、電気穿孔によってＲ．エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）に形質転換することができる。組換え体を、グルコースを含有する合成培地で成長させることができ、当該技術分野において公知の方法を用いてイソブタノールの生成を追跡することができる。
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるブタノール生合成経路の発現
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における遺伝子発現及び突然変異の作成の方法もまた、当該技術分野において公知である。例えば、イソブタノール生合成経路の遺伝子を様々な供給源から単離し、修飾ｐＵＣ１９ベクターにクローニングして、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０に形質転換することができる。加えて、イソブタノール生合成経路の５つの遺伝子を、発現用に２つのオペロンに分割することができる。経路の３つの遺伝子（ｂｕｂＢ、ｉｌｖＤ、及びｋｉｖＤ）は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＥ１０１０の染色体に組み込むことができる（Ｐａｙｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３，２２７８−２２８２，１９９１）。残りの２つの遺伝子（ｉｌｖＣ及びｂｄｈＢ）は発現ベクターにクローニングして、組み込まれたイソブタノール遺伝子を有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株に形質転換することができる。
Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）におけるブタノール生合成経路の発現
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で複製するプラスミド及びシャトルベクターの多くは、プロトプラスト形質転換又は電気穿孔のいずれかによるＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の形質転換に用いることができる。イソブタノールの生成に必要な遺伝子を、プラスミドｐＢＥ２０又はｐＢＥ６０誘導体にクローニングすることができる（Ｎａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１１４：１２１−１２６，１９９２）。Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）を形質転換する方法は、当該技術分野において公知である（Ｆｌｅｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１：３７７５−３７８０，１９９５）。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での発現用に構築されたプラスミドをＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に形質転換することにより、イソブタノールを生成する組換え微生物宿主を作製することができる。
パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）におけるブタノール生合成経路の発現
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における発現について上記に記載したとおりプラスミドを構築し、それを使用してプロトプラスト形質転換によりパエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）を形質転換することにより、イソブタノールを生成する組換え微生物宿主を作製することができる。
アルカリゲネス（ラルストニア）・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ） ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）におけるブタノール生合成経路の発現
アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）における遺伝子発現及び突然変異の作成の方法は、当該技術分野において公知である（Ｔａｇｈａｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６０：３５８５−３５９１，１９９４）。イソブタノール生合成経路の遺伝子を上記に記載される広宿主域ベクターのいずれかにクローニングし、電気穿孔により、イソブタノールを生成する組換え体を生じさせることができる。アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）におけるポリ（ヒドロキシブチレート）経路については詳細な記載がなされており、アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）ゲノムを修飾する様々な遺伝学的技法が公知であり、それらのツールをイソブタノール生合成経路の操作に適用することができる。
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）におけるブタノール生合成経路の発現
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）における遺伝子発現方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，５８６，２２９号明細書（これは参照により本明細書に援用される）を参照）。ブタノール経路遺伝子をｐＰＣＵ１８に挿入することができ、このライゲートされたＤＮＡをエレクトロコンピテントなシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＤＯＴ−Ｔ１ Ｃ５ａＡＲ１細胞に電気穿孔することにより、イソブタノールを生成する組換え体を生じさせることができる。
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるブタノール生合成経路の発現
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における遺伝子発現方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｒｔ Ａ，２００４，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｇｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。酵母における遺伝子の発現には、典型的にはプロモーターが必要であり、続いて目的の遺伝子、及び転写ターミネーターが必要である。本明細書の実施例で使用されるものを含めて、数多くの酵母プロモーターを、イソブタノール生合成経路をコードする遺伝子用の発現カセットの構築に使用することができ、限定はされないが、構成的プロモーターＦＢＡ、ＧＰＤ、ＡＤＨ１、及びＧＰＭ、並びに誘導性プロモーターＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、及びＣＵＰ１が挙げられる。好適な転写ターミネーターとしては、限定はされないが、ＦＢＡｔ、ＧＰＤｔ、ＧＰＭｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１、及びＡＤＨ１が挙げられる。例えば、イソブタノール生合成経路の好適なプロモーター、転写ターミネーター、及び遺伝子を、米国特許出願公開第２０１００１２９８８６号明細書に記載されるとおり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクターにクローニングし、酵母細胞に形質転換することができる。これらのベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株及び酵母株のいずれにおける株増殖も可能にする。典型的には、ベクターは、選択可能なマーカーと、所望の宿主における自己複製又は染色体への組込みを可能にする配列とを含む。酵母で典型的に用いられるプラスミドは、シャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、及びｐＲＳ４２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）であり、これらは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点（例えば、ｐＭＢ１）、酵母２μ複製起点、及び栄養選択用マーカーを含む。これらの４つのベクターの選択マーカーは、Ｈｉｓ３（ベクターｐＲＳ４２３）、Ｔｒｐ１（ベクターｐＲＳ４２４）、Ｌｅｕ２（ベクターｐＲＳ４２５）及びＵｒａ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。対象のポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターの構築は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における標準的な分子クローニング技術によるか、或いは酵母におけるギャップ修復組換え法により行うことができる。
ギャップ修復クローニング手法は、酵母における高度に効率的な相同組換えを利用する。典型的には、酵母ベクターＤＮＡが消化され（例えばその多重クローニング部位において）、その配列に「ギャップ」が作り出される。目的のインサートＤＮＡが複数産生され、これらのインサートＤＮＡは、５’末端及び３’末端の両方に、互いに及びベクターＤＮＡの５’末端及び３’末端と連続的に重複する≧２１ｂｐ配列を含む。例えば、「遺伝子Ｘ」の酵母発現ベクターを構築するには、発現カセット用に酵母プロモーター及び酵母ターミネーターが選択される。このプロモーター及びターミネーターは酵母ゲノムＤＮＡから増幅され、及び遺伝子Ｘは、その供給源生物からＰＣＲ増幅されるか、或いは遺伝子Ｘ配列を含むクローニングベクターから得られるかのいずれかである。直鎖化されたベクターの５’末端とプロモーター配列との間、プロモーターと遺伝子Ｘとの間、遺伝子Ｘとターミネーター配列との間、及びターミネーターと直鎖化されたベクターの３’末端との間に、少なくとも２１ｂｐの重複配列が存在する。次に「ギャップ含有（ｇａｐｐｅｄ）」ベクター及びインサートＤＮＡが酵母株に同時形質転換され、プラスミド上の栄養選択マーカーの相補性を許容する適切な化合物混合物を含有する培地に播かれる。正しいインサートの組み合わせの存在は、ＰＣＲマッピングにより、選択した細胞から調製されたプラスミドＤＮＡを用いて確認することができる。次に、酵母から単離されたプラスミドＤＮＡ（通常は濃度が低い）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、例えばＴＯＰ１０に形質転換し、続いてミニプレップ及び制限マッピングによってプラスミドコンストラクトをさらに確認することができる。最後にコンストラクトを配列分析によって確認することができる。
ギャップ修復技法と同様に、酵母ゲノムへの組込みもまた、酵母の相同組換えシステムを利用する。典型的には、コード領域と、さらに制御エレメント（プロモーター及びターミネーター）及び栄養要求マーカーを含むカセットが、カセットとハイブリダイズし、且つ挿入が所望されるゲノム範囲の５’側及び３’側領域と配列相同性を有する４０〜７０塩基対を含むプライマーを使用して、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲ増幅される。次にＰＣＲ産物が酵母に形質転換され、組み込まれた栄養要求マーカーの選択を可能にする適切な化合物混合物を含有する培地に播かれる。例えば、「遺伝子Ｘ」を染色体位置「Ｙ」に組み込むため、プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーターコンストラクトがプラスミドＤＮＡコンストラクトからＰＣＲ増幅され、ＳＯＥ ＰＣＲによるか、或いは一般的な制限消化及びクローニングによって、独立栄養マーカー（ＵＲＡ３など）とつなぎ合わされる。プロモーター−コード領域Ｘ−ターミネーター−ＵＲＡ３領域を含む完全なカセットが、酵母染色体上の位置「Ｙ」の５’側及び３’側領域と相同性を有する４０〜７０ｂｐを含むプライマー配列と共にＰＣＲ増幅される。ＰＣＲ産物は酵母に形質転換され、ウラシル不含の成長培地で選択される。形質転換体は、コロニーＰＣＲによるか、或いは染色体ＤＮＡのダイレクトシーケンシングによって確認することができる。
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）におけるブタノール生合成経路の発現
ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）はラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）のファミリーに属し、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の形質転換に用いられる多くのプラスミド及びベクターをラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に使用することができる。好適なベクターの非限定的な例としては、ｐＡＭβ１及びその誘導体（Ｒｅｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８３：１７５−１８２，１９９６）；及び（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３７：２２７−２３１，１９９３）；ｐＭＢＢ１、及びｐＭＢＢ１の誘導体であるｐＨＷ８００（Ｗｙｃｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２：１４８１−１４８６，１９９６）；接合性プラスミドであるｐＭＧ１（Ｔａｎｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：５８００−５８０４，２００２）；ｐＮＺ９５２０（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３：４５８１−４５８４，１９９７）；ｐＡＭ４０１（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６７：１２６２−１２６７，２００１）；及びｐＡＴ３９２（Ａｒｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３８：１８９９−１９０３，１９９４）が挙げられる。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のいくつかのプラスミドもまた報告されている（ｖａｎ Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇ Ｒ，ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７１：１２２３−１２３０，２００５）。
様々なエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の種（Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．ガリナルム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）、及びＥ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ））におけるブタノール生合成経路の発現
エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）はラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）のファミリーに属し、乳酸菌種、桿菌種及びレンサ球菌種の形質転換に用いられる多くのプラスミド及びベクターを、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の種に使用することができる。好適なベクターの非限定的な例としては、ｐＡＭβ１及びその誘導体（Ｒｅｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１８３：１７５−１８２，１９９６）；及び（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３７：２２７−２３１，１９９３）；ｐＭＢＢ１、及びｐＭＢＢ１の誘導体であるｐＨＷ８００（Ｗｙｃｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２：１４８１−１４８６，１９９６）；接合性プラスミドであるｐＭＧ１（Ｔａｎｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：５８００−５８０４，２００２）；ｐＮＺ９５２０（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３：４５８１−４５８４，１９９７）；ｐＡＭ４０１（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６７：１２６２−１２６７，２００１）；及びｐＡＴ３９２（Ａｒｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３８：，１８９９−１９０３，１９９４）が挙げられる。ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のｎｉｓＡ遺伝子を使用するＥ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）の発現ベクターもまた、使用することができる（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：２７６３−２７６９，１９９８）。加えて、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）染色体における遺伝子置換用のベクターを使用することができる（Ｎａｌｌａａｐａｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７２：３３４−３４５，２００６）。
発酵培地
本発明における発酵培地は、好適な炭素基質を含有しなければならない。好適な基質としては、限定はされないが、グルコース及びフルクトースなどの単糖類、ラクトース、マルトース、ガラクトース、スクロースなどのオリゴ糖類、デンプン又はセルロースなどの多糖類又はこれらの混合物、並びにチーズホエー透過液、コーンスティープリカー、シュガービート廃糖蜜、及び大麦モルトなどの再生可能原料からの未精製混合物を挙げることができる。さらに、炭素基質はまた、二酸化炭素、又は主要な生化学的中間体への代謝変換が実証されているメタノールなどの、一炭素基質であってもよい。一炭素及び二炭素基質に加え、メチロトローフ微生物はまた、メチルアミン、グルコサミン及び様々なアミノ酸などの数多くの他の炭素含有化合物を代謝活性に利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を利用してトレハロース又はグリセロールを形成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃ１ Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３），４１５−３２．（ｅｄｓ）： Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ： Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，英国）。同様に、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の様々な種が、アラニン又はオレイン酸を代謝し得る（Ｓｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５３：４８５−４８９，１９９０）。従って、本発明において利用される炭素供給源は多種多様な炭素含有基質を包含し、微生物の選択によってのみ制限されることが企図される。
上述の炭素基質及びそれらの混合物は全て、本発明に好適であると考えられるが、一部の実施形態では、炭素基質は、グルコース、フルクトース、及びスクロースであり、又はＣ５糖類を使用するように修飾された酵母細胞に対して、これらとキシロース及び／又はアラビノースなどのＣ５糖類との混合物である。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、スイートソルガム、及びこれらの混合物などの再生可能な糖類供給源に由来することができる。グルコース及びデキストロースは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、燕麦、及びこれらの混合物などの穀粒を含むデンプンベースの供給原料の糖化を介して、再生可能な穀粒供給源から誘導することができる。加えて発酵性糖類は、例えば米国特許出願公開第２００７／００３１９１８ Ａ１号明細書（これは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり、前処理及び糖化の過程を介して再生可能なセルロース系又はリグノセルロース系バイオマスから誘導することができる。バイオマスは、任意のセルロース系又はリグノセルロース系材料を指し、セルロースを含み、場合によりヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類及び／又は単糖類をさらに含む材料を含む。バイオマスはまた、タンパク質及び／又は脂質などのさらなる成分も含み得る。バイオマスは単一供給源に由来してもよく、又はバイオマスは、２つ以上の供給源に由来する混合物を含んでもよい；例えばバイオマスは、トウモロコシ穂軸とトウモロコシ茎葉との混合物、又は草と葉との混合物を含み得る。バイオマスとしては、限定はされないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙スラッジ、庭ごみ、木材及び林業廃棄物が挙げられる。バイオマスの例としては、限定はされないが、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ皮などの作物残渣、トウモロコシ茎葉、草類、小麦、小麦わら、大麦、大麦わら、乾草、稲わら、スイッチグラス、古紙、サトウキビバガス、モロコシ、大豆、穀粒の製粉から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木材チップ、おがくず、低木及び潅木、野菜、果実、花、家畜糞尿、及びこれらの混合物が挙げられる。
適切な炭素源に加え、発酵培地は、好適なミネラル、塩、補因子、緩衝剤、並びに当業者に公知の、本明細書に記載されるブタノール生成に必要な培養物の成長及び酵素経路の促進に好適な他の成分を含有しなければならない。
培養条件
典型的には細胞は、適切な培地において約２０℃〜約４０℃の範囲の温度で成長させる。本発明における好適な成長培地は、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス、サブローデキストロース（ＳＤ）ブロス若しくは酵母培地（ＹＭ）ブロス、又は酵母窒素原基礎培地、硫酸アンモニウム、及びデキストロース（炭素／エネルギー源として）又はＹＰＤ培地、ほとんどのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株の成長に最適な比率のペプトン、酵母エキス、及びデキストロースの配合物を含むブロスなどの、一般的な商業的に調製された培地である。他の限定又は合成成長培地もまた使用することができ、特定の微生物の成長に適切な培地は、微生物学又は発酵科学分野の当業者に周知されている。カタボライト抑制を直接的又は間接的に調節することが知られる薬剤、例えば、環状アデノシン２’，３’−一リン酸（ｃＡＭＰ）の使用もまた、発酵培地に取り入れることができる。
発酵に好適なｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、初期条件にはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が好ましい。酵母の発酵に好適なｐＨ範囲は、典型的には約ｐＨ３．０〜約ｐＨ９．０である。一実施形態において、初期条件には約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８．０が用いられる。他の微生物の発酵に好適なｐＨ範囲は、約ｐＨ３．０〜約ｐＨ７．５である。一実施形態において、初期条件には約ｐＨ４．５〜約ｐＨ６．５が用いられる。
発酵は、好気性条件下又は嫌気性条件下で実施することができる。一実施形態において、嫌気性条件又は微好気性条件が発酵に用いられる。
工業用バッチ及び連続発酵
本方法は、バッチ発酵方法を用い得る。古典的なバッチ発酵は、培地の組成が発酵開始時に設定され、発酵中に人為的な改変を受けない閉鎖系である。従って、発酵開始時、培地に所望の１つ又は複数の微生物を接種し、その系に何も加えることなく発酵を生じさせる。しかしながら、典型的には「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関するバッチであり、多くの場合にｐＨ及び酸素濃度などの要素の制御が試みられる。バッチ系では、その系の代謝産物及びバイオマス組成物が、発酵の停止時まで絶えず変化する。バッチ培養物内では、細胞は静止遅滞期を通じて調節され、高成長の対数期に至り、最終的に定常期に至って、そこで成長速度が低下し又は停止する。処理されない場合、定常期の細胞は最終的には死滅し得る。対数期の細胞は、概して最終生成物又は中間体の生成のバルクに関与する。
標準的なバッチ系の変種がフェドバッチ系である。フェドバッチ発酵プロセスもまた本発明に好適であり、発酵の進行に伴い基質が徐々に添加される点を除いては、典型的なバッチ系を含む。フェドバッチ系は、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があるとき、及び培地中に限られた量の基質を有することが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系における実際の基質濃度の計測は困難であり、従ってｐＨ、溶存酸素及びＣＯ２などの廃ガスの分圧など、計測可能な因子の変化に基づき推定される。バッチ発酵及びフェドバッチ発酵は一般的で、当該技術分野において公知であり、参照により本明細書に援用されるＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．、又はＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ（Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７，１９９２）に例を見ることができる。
本発明はバッチ式で実施されるが、本方法を連続発酵法に適合させ得ることが企図される。連続発酵は開放系であり、ここでは限定発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に等量の馴化培地が処理のため取り除かれる。概して連続発酵は培養物を、細胞が主に対数期で成長している一定の高密度に維持する。
連続発酵により、細胞成長又は最終生成物濃度に影響を及ぼす１つの要因又は任意の数の要因を調節することが可能となる。例えば、一つの方法では、炭素源又は窒素レベルなどの制限栄養素が一定の率に維持され、且つ他のパラメータは全て調節可能とされる。他の系では、培地の濁度により計測される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響を及ぼす多数の要因を連続的に変更することができる。連続系は定常状態の成長条件の維持を図り、従って培地の抜き取りによる細胞損失が、発酵における細胞成長速度と釣り合わなければならない。連続発酵プロセスの栄養素及び成長因子を調節する方法、並びに生成物形成速度を最大化する技法は、工業微生物学の技術分野において公知であり、様々な方法が、Ｂｒｏｃｋ，前掲により詳述されている。
本発明は、バッチ、フェドバッチ又は連続プロセスのいずれを用いても実施することができ、任意の公知の発酵方式が好適であり得ることが企図される。加えて、細胞が全細胞触媒として基板上に固定化され、イソブタノール生成用の発酵条件に供され得ることが企図される。
発酵培地からのブタノール単離方法
生物学的に生成されたブタノールは、ＡＢＥ発酵の技術分野において公知の方法を用いて発酵培地から単離することができる（例えば、Ｄｕｒｒｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８（１９９８）、Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５（１９９２）、及びこれらの中の参考文献を参照）。例えば、発酵培地から遠心、ろ過、デカンテーションなどによって固形物を取り除くことができる。次に、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、又はパーベーパレイションなどの方法を用いて、ブタノールを発酵培地から単離することができる。
ブタノールは、低沸点の、水との共沸混合物を形成するため、蒸留を用いて、当該の混合物をその共沸組成まで分離し得る。蒸留を別の分離方法と組み合わせて用いると、共沸近傍の分離を達成することができる。ブタノールの単離及び精製のために蒸留と組み合わせて用いることのできる方法としては、限定はされないが、デカンテーション、液液抽出、吸着、及び膜ベースの技法が挙げられる。加えて、ブタノールは、共留剤を使用する共沸蒸留を用いて単離することができる（例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｍａｌｏｎｅ，Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１を参照のこと）。
ブタノール−水混合物は不均一な共沸混合物を形成するため、蒸留をデカンテーションと組み合わせて用いることで、ブタノールを単離及び精製することができる。この方法では、ブタノールを含有する発酵ブロスが、共沸組成近くまで蒸留される。次に、共沸混合物が凝縮され、ブタノールがデカンテーションによって発酵培地から分離される。デカントされた水相は、還流として最初の蒸留カラムに戻されてもよい。デカントされたブタノールリッチな有機相は、第２の蒸留カラムで蒸留によりさらに精製され得る。
ブタノールはまた、液液抽出を蒸留との組み合わせで用いても、発酵培地から単離することができる。この方法では、ブタノールは、好適な溶媒による液液抽出を用いて発酵ブロスから抽出される。次にブタノール含有有機相を蒸留して、溶媒からブタノールが分離される。
また、蒸留を吸着と組み合わせて用いてもまた、発酵培地からブタノールを単離することができる。この方法では、ブタノールを含有する発酵ブロスが共沸組成近くまで蒸留され、次に分子篩などの吸着剤を使用することにより、残りの水が除去される（Ａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ Ｂｉｏｍａｓｓ ｔｏ Ｅｔｈａｎｏｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｉｌｕｔｅ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｃｏｒｎ Ｓｔｏｖｅｒ，Ｒｅｐｏｒｔ ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｊｕｎｅ ２００２）。
加えて、蒸留をパーベーパレイションと組み合わせて用いて、ブタノールなどの生成物を発酵培地から単離及び精製することができる。この方法では、ブタノールを含有する発酵ブロスが共沸組成近くまで蒸留され、次に、親水性の膜によるパーベーパレイションにより、残りの水が除去される（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５：１９９−２１０（２００４））。
原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）（抽出発酵とも称される）を用いてブタノール（又は他の発酵アルコール）を、それが生成される発酵槽から除去することができ、これにより微生物は、ブタノールを高収率で生成することが可能となる。当該技術分野で記載がなされている、発酵アルコールを除去するための一つのＩＳＰＲ方法は、液液抽出である。一般にブタノール発酵に関しては、例えば、ブタノール濃度が毒性レベルに達するより前の時点で、微生物を含む発酵培地を有機抽出剤と接触させる。有機抽出剤及び発酵培地は二相混合物を形成する。ブタノールは有機抽出剤相に分配され、微生物を含有する水相の濃度が低下するため、阻害性のブタノールに対する微生物の曝露が制限される。
液液抽出は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書（この開示は全体として本明細書により援用される）に記載される方法に従い実施することができる。米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書は、液液抽出を用いた発酵ブロスからのブタノールの生成及び回収方法について記載し、これらの方法は、発酵ブロスを水不混和性抽出剤と接触させて、水相と有機相とを含む二相混合物を形成するステップを含む。典型的には、抽出剤は、飽和、一不飽和、多価不飽和（及びこれらの混合の）Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、及びこれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であってもよい。ＩＳＰＲ用の１つ又は複数の抽出剤は、非アルコール抽出剤であってもよい。ＩＳＰＲ抽出剤は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、１−ウンデカノール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリンアルデヒド、２０−メチルウンデカナール、及びこれらの混合物などの外因性の有機抽出剤であってもよい。
一部の実施形態では、エステルは、国際公開第２０１１／１５９９９８号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１２０１５６７３８号明細書（これらは全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり、発酵培地中のアルコールを、カルボン酸（例えば脂肪酸）及びアルコールをカルボン酸とエステル化させる能力を有する触媒と接触させることにより形成することができる。かかる実施形態において、カルボン酸はＩＳＰＲ抽出剤として働くことができ、そこにアルコールエステルが分配される。カルボン酸は発酵槽に供給されてもよく、及び／又は発酵槽に送り込まれるバイオマスが供給する発酵性炭素に由来してもよい。供給原料中に存在する脂質はカルボン酸に触媒的に加水分解されることができ、同じ触媒（例えば酵素）がカルボン酸をアルコールとエステル化することができる。触媒は発酵前に供給原料に供給してもよく、又は供給原料の供給前若しくはその供給と同時に発酵槽に供給してもよい。触媒が発酵槽に供給されると、脂質のカルボン酸への加水分解及び実質的に同時の、カルボン酸と発酵槽に存在するブタノールとのエステル化により、アルコールエステルが得られ得る。供給原料に由来しないカルボン酸及び／又は天然の油もまた発酵槽に送り込むことができ、天然の油はカルボン酸に加水分解される。アルコールとエステル化されないカルボン酸は全て、ＩＳＰＲ抽出剤の一部として働き得る。アルコールエステルを含有する抽出剤は、発酵培地から分離することができ、その抽出剤からアルコールを回収することができる。抽出剤は発酵槽に再循環され得る。従って、ブタノール生成の場合、例えば、ブタノールからエステルへの変換は、発酵培地中の遊離ブタノール濃度を低下させることができ、増加するブタノール濃度の毒性作用から微生物を遮蔽する。加えて、脂質はカルボン酸に触媒的に加水分解され、それによりＩＳＰＲ抽出剤における脂質の蓄積速度を減少させることができるため、未分画の穀粒を、その脂質を分離することなしに供給原料として使用することができる。
原位置生成物除去は、バッチ式又は連続式で実行することができる。連続式の原位置生成物除去では、生成物は反応器から連続的に除去される。バッチ式の原位置生成物除去では、ある容積の有機抽出剤が発酵槽に加えられ、その抽出剤はプロセス中には除去されない。原位置生成物除去について、有機抽出剤は発酵の開始時に発酵培地と接触させることで、二相性発酵培地が形成される。或いは、有機抽出剤は、微生物が所望の量の成長（これは培養物の光学濃度を計測して決定することができる）を達成した後に、発酵培地に接触させることができる。さらに、有機抽出剤は、発酵培地の生成物アルコールレベルが所定レベルに達した時点で、発酵培地に接触させることができる。本発明の一部の実施形態に係るブタノール生成の場合、ブタノール濃度が毒性レベルに達するより前の時点でカルボン酸抽出剤を発酵培地に接触させることができ、それによりブタノールをカルボン酸とエステル化させてブタノールエステルを生成し、結果的に発酵槽のブタノール濃度を低下させてもよい。次に、所望の有効ブタノールエステル力価に達した後、エステル含有有機相を発酵槽から除去する（及び水相を構成する発酵ブロスから分離する）ことができる。一部の実施形態では、発酵槽中の利用可能な発酵性糖の発酵が実質的に完了した後、エステル含有有機相が水相から分離される。
株の構築
Figure 0006321631
ＰＮＹ１５２８の構築（ＰＮＹ２２１１におけるｈＡＤＨ組込み）
欠失／組込みは、標的領域の上流及び下流相同領域を含み、且つ形質転換体の選択用のＵＲＡ３遺伝子を含むＰＣＲ産物による相同組換えによって作成した。ＵＲＡ３遺伝子を相同組換えにより取り除き、スカーレスな欠失／組み込みを作成した。
ＹＰＲＣΔ１５欠失及びウマ肝臓ａｄｈ組込み
ＹＰＲＣΔ１５遺伝子座を欠失させ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＰＤＣ５プロモーター領域（５３８ｂｐ）及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＡＤＨ１ターミネーター領域（３１６ｂｐ）と共に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現用にコドン最適化したウマ肝臓ａｄｈ遺伝子によって置換した。ＹＰＲＣΔ１５欠失−Ｐ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ組込み用のスカーレスなカセットを、初めにプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローニングした。
断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用し、且つ鋳型として、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製したＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡを使用して増幅した。ＹＰＲＣΔ１５断片Ａは、ゲノムＤＮＡから、ＫｐｎＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６２２（配列番号２６９）、及びＹＰＲＣΔ１５断片Ｂの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ６２３（配列番号２７０）で増幅した。ＹＰＲＣΔ１５断片Ｂは、ゲノムＤＮＡから、ＹＰＲＣΔ１５断片Ａの３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ６２４（配列番号２７１）、及びＦｓｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６２５（配列番号２７２）で増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ＹＰＲＣΔ１５断片ＡとＹＰＲＣΔ１５断片Ｂ ＰＣＲ産物とを混合し、且つプライマーｏＢＰ６２２（配列番号２６９）及びｏＢＰ６２５（配列番号２７２）で増幅して、ＹＰＲＣΔ１５断片Ａ−ＹＰＲＣΔ１５断片Ｂを作成した。得られたＰＣＲ産物をＫｐｎＩ及びＦｓｅＩで消化し、適切な酵素で消化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによってｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。ＹＰＲＣΔ１５断片Ｃを、ゲノムＤＮＡから、ＮｏｔＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６２６（配列番号２７３）、及びＰａｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６２７（配列番号２７４）で増幅した。ＹＰＲＣΔ１５断片Ｃ ＰＣＲ産物をＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、ＹＰＲＣΔ１５断片ＡＢを含むプラスミドの対応する部位にライゲートした。ＰＤＣ５プロモーター領域を、ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーＨＹ２１（配列番号２７５）、及びａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）の５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーＨＹ２４（配列番号２７６）で増幅した。ａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを、ｐＢＰ９１５（配列番号２７９）から、Ｐ［ＰＤＣ５］の３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーＨＹ２５（配列番号２７７）、及びＰｍｅＩ制限部位を含むＨＹ４（配列番号２７８）で増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、Ｐ［ＰＤＣ５］とａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ ＰＣＲ産物とを混合し、且つプライマーＨＹ２１（配列番号２７５）及びＨＹ４（配列番号２７８）で増幅して、Ｐ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを作成した。得られたＰＣＲ産物をＡｓｃＩ及びＰｍｅＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、ＹＰＲＣΔ１５断片ＡＢＣを含むプラスミドの対応する部位にライゲートした。組込みカセット全体を、得られたプラスミドから、プライマーｏＢＰ６２２（配列番号２６９）及びｏＢＰ６２７（配列番号２７４）で増幅した。
ＰＮＹ２２１１のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＹＰＲＣΔ１５欠失−Ｐ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ組込みカセットＰＣＲ産物で形質転換した。形質転換混合物を、３０℃の１％エタノール添加ウラシル不含合成完全培地に播いた。形質転換体を、プライマーＵＲＡ３−ｅｎｄ Ｆ（配列番号２８０）及びｏＢＰ６３７（配列番号２８３）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（１％エタノール）で成長させて、１％ＥｔＯＨを補足した、且つ５−フルオロオロチン酸（０．１％）を含有する３０℃の合成完全培地に播き、ＵＲＡ３マーカーが欠損した単離物を選択した。ＹＰＲＣΔ１５の欠失及びＰ［ＰＤＣ５］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔの組込みを、ＹｅａＳｔａｒゲノムＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で調製したゲノムＤＮＡを使用して、外部プライマーｏＢＰ６３６（配列番号２８１）及びｏＢＰ６３７（配列番号２８２）によるＰＣＲによって確認した。以下の遺伝子型の正しい単離物を、さらなる修飾用に選択した：ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ ＭＡＴａ ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ ｈｉｓ３Δ ｐｄｃ６Δ ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ ｆｒａ２Δ ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ ｙｐｒｃΔ１５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ。
ｆｒａ２Δにおけるウマ肝臓ａｄｈ組込み
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現用にコドン最適化したウマ肝臓ａｄｈ遺伝子を、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＰＤＣ１プロモーター領域（８７０ｂｐ）及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＡＤＨ１ターミネーター領域（３１６ｂｐ）と共に、ｆｒａ２欠失部位に組み込んだ。ｆｒａ２Δ−Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ組込み用のスカーレスなカセットを、初めにプラスミドｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳにクローニングした。
断片Ａ−Ｂ−Ｕ−Ｃを、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用し、且つ鋳型として、Ｇｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｙｅａｓｔ／Ｂａｃｔキット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製したＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡを使用して増幅した。ｆｒａ２Δ断片Ｃは、ゲノムＤＮＡから、ＮｏｔＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６９５（配列番号２８７）、及びＰａｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６９６（配列番号２８８）で増幅した。ｆｒａ２Δ断片Ｃ ＰＣＲ産物をＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にライゲートした。ｆｒａ２Δ断片Ｂは、ゲノムＤＮＡから、ＰｍｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６９３（配列番号２８５）、及びＦｓｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６９４（配列番号２８６）で増幅した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩ及びＦｓｅＩで消化し、適切な酵素で消化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、ｆｒａ２Δ断片Ｃを含むプラスミドの対応する部位にライゲートした。ｆｒａ２Δ断片Ａは、ゲノムＤＮＡから、ＢａｍＨＩ及びＡｓｉＳＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６９１（配列番号２８３）、並びにＡｓｃＩ及びＳｗａＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６９２（配列番号２８４）で増幅した。ｆｒａ２Δ断片Ａ ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＡｓｃＩで消化し、適切な酵素で消化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、ｆｒａ２Δ断片ＢＣを含むプラスミドの対応する部位にライゲートした。ＰＤＣ１プロモーター領域を、ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーＨＹ１６（配列番号２８９）、及びａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）の５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーＨＹ１９（配列番号２９０）で増幅した。ａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔは、ｐＢＰ９１５から、Ｐ［ＰＤＣ１］の３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーＨＹ２０（配列番号２９１）、及びＰｍｅＩ制限部位を含むＨＹ４（配列番号２７８）で増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、Ｐ［ＰＤＣ１］とａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ ＰＣＲ産物とを混合し、且つプライマーＨＹ１６（配列番号２８９）及びＨＹ４（配列番号２７８）で増幅して、Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔを作成した。得られたＰＣＲ産物をＡｓｃＩ及びＰｍｅＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、ｆｒａ２Δ断片ＡＢＣを含むプラスミドの対応する部位にライゲートした。組込みカセット全体を、得られたプラスミドからプライマーｏＢＰ６９１（配列番号２８３）及びｏＢＰ６９６（配列番号２８８）で増幅した。
ＹＰＲＣΔ１５にａｄｈ＿Ｈｌ（ｙ）を組み込んだＰＮＹ２２１１変異体のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ｆｒａ２Δ−Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ組込みカセットＰＣＲ産物で形質転換した。形質転換混合物を、３０℃の１％エタノール添加ウラシル不含合成完全培地に播いた。形質転換体を、プライマーＵＲＡ３−ｅｎｄ Ｆ（配列番号２８０）及びｏＢＰ７３１（配列番号２９３）によるＰＣＲによってスクリーニングした。正しい形質転換体をＹＰＥ（１％エタノール）で成長させて、１％ＥｔＯＨを補足した、且つ５−フルオロオロチン酸（０．１％）を含有する３０℃の合成完全培地に播き、ＵＲＡ３マーカーが欠損した単離物を選択した。Ｐ［ＰＤＣ１］−ａｄｈ＿ＨＬ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔの組込みを、ＹｅａＳｔａｒゲノムＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で調製したゲノムＤＮＡを使用して、内部プライマーＨＹ３１（配列番号２９４）及び外部プライマーｏＢＰ７３１（配列番号２９３）によるコロニーＰＣＲ、並びに外部プライマーｏＢＰ７３０（配列番号２９２）及びｏＢＰ７３１（配列番号２９３）によるＰＣＲによって確認した。以下の遺伝子型の正しい単離物を、ＰＮＹ１５２８と命名した：ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７Ｄ ＭＡＴａ ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ ｈｉｓ３Δ ｐｄｃ６Δ ｐｄｃ１Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＤＨＡＤ｜ｉｌｖＤ＿Ｓｍ−ＰＤＣ１ｔ−Ｐ［ＦＢＡ１］−ＡＬＳ｜ａｌｓＳ＿Ｂｓ−ＣＹＣ１ｔ ｐｄｃ５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ｓａｄＢ＿Ａｘ−ＰＤＣ５ｔ ｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ ｆｒａ２Δ：：Ｐ［ＰＤＣ１］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ ａｄｈ１Δ：：ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１ｔ ｙｐｒｃΔ１５Δ：：Ｐ［ＰＤＣ５］−ＡＤＨ｜ａｄｈ＿Ｈｌ−ＡＤＨ１ｔ。
ＰＮＹ２２３７（スカーレスなＹＭＲ２２６ｃ欠失）
遺伝子ＹＭＲ２２６ｃを、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＰＮＹ１５２８から、ＰＣＲ増幅した２．０ｋｂの線状のスカーレス欠失カセットを使用する相同組換えにより欠失させた。カセットは、ＵＲＡ３遺伝子で構成されるスプライスされたＰＣＲ増幅断片から、選択可能なマーカーとしてのその天然のプロモーター及びターミネーター、欠失カセットの組込み及び天然の介在配列の除去を促進するＹＭＲ２２６ｃ遺伝子染色体遺伝子座に隣接する上流及び下流の相同性配列、並びにＵＲＡ３マーカーの組換え及び除去を促進する反復配列と共に構築した。フォワード及びリバースＰＣＲプライマー（それぞれＮ１２５１及びＮ１２５２、配列番号２９５及び２９６）が、ｐＬＡ３３（ｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ（配列番号３０３））に由来する１，２０８ｂｐのＵＲＡ３発現カセットを増幅した。フォワード及びリバースプライマー（それぞれＮ１２５３及びＮ１２５４、配列番号２９７及び２９８）が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＰＮＹ２２１１（上記）のゲノムＤＮＡ調製物に由来する３’ＵＲＡ３重複配列タグを有する２５０ｂｐの下流相同性配列を増幅した。フォワード及びリバースＰＣＲプライマー（それぞれＮ１２５５及びＮ１２５６、配列番号２９９及び３００）が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＰＮＹ２２１１のゲノムＤＮＡ調製物由来の５’ＵＲＡ３重複配列タグを有する２５０ｂｐの反復配列を増幅した。フォワード及びリバースＰＣＲプライマー（それぞれＮ１２５７及びＮ１２５８、配列番号３０１及び３０２）が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＰＮＹ２２１１のゲノムＤＮＡ調製物由来の５’反復重複配列タグを有する２５０ｂｐの上流相同性配列を増幅した。
約１．５μｇのＰＣＲ増幅カセットを、ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｒｏｚｅｎ酵母形質転換キットを使用してコンピテントにした株ＰＮＹ１５２８（上記）に形質転換し、ｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＵＲＡ３カセットが組み込まれた細胞を選択するため、形質転換混合物をＳＥ １．０％ −ウラシルに播いて３０℃でインキュベートした。７２〜９６時間後に出現する形質転換体を、続いて同じ培地に短くストリークし、３０℃で２４〜４８時間インキュベートする。短いストリークを、隣接する内向き染色体特異的プライマー（Ｎ１２３９、配列番号３１０）と対を形成する５’の外向きＵＲＡ３欠失カセット特異的内部プライマー（Ｎ１２４９、配列番号３１２）及び隣接する内向き染色体特異的プライマー（Ｎ１２４２、配列番号３１１）と対を形成する３’の外向きＵＲＡ３欠失カセット特異的プライマー（Ｎ１２５０、配列番号３１３）によるＰＣＲにより、ｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＵＲＡ３についてスクリーニングする。ポジティブＰＮＹ１５２８ ｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＵＲＡ３ ＰＣＲスクリーニングから、それぞれ５９８ｂｐ及び７２６ｂｐの５’及び３’ＰＣＲ産物が得られた。
３つの陽性ＰＮＹ１５２８ ｙｍｒ２２６ｃΔ：：ＵＲＡ３クローンを選び取り、ＹＰＥ １％培地で一晩培養して、そのうち１００μＬを、マーカー除去のためＹＰＥ １％＋５−ＦＯＡに播いた。２４〜４８時間後に出現するコロニーを、５’及び３’染色体特異的プライマー（Ｎ１２３９及びＮ１２４２）により、マーカー欠損についてＰＣＲスクリーニングした。ポジティブＰＮＹ１５２８ ｙｍｒ２２６ｃΔマーカーレスＰＣＲスクリーニングから、８０１ｂｐのＰＣＲ産物が得られた。複数のクローンが得られ、１つをＰＮＹ２２３７と命名した。
ＰＮＹ２２３８及びＰＮＹ２２４３（ＡＬＤ６欠失株）
ベクターを、ＡＬＤ６コード配列がＣｒｅ−ｌｏｘ再利用可能ＵＲＡ３選択マーカーに置換されるように設計した。ＡＬＤ６の配列５’及び３’を、ＰＣＲ（それぞれプライマー対Ｎ１１７９及びＮ１１８０並びにＮ１１８１及びＮ１１８２；それぞれ配列番号３０４、３０５、３０６、及び３０７）によって増幅した。これらの断片をＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号Ｋ２８７５−Ｊ１０）にクローニングして配列決定（Ｍ１３フォワードプライマー（配列番号３１４）及びリバースプライマー（配列番号３１５））した後、５’及び３’隣接配列を、ｐＬＡ３３（ｐＵＣ１９：：ｌｏｘＰ：：ＵＲＡ３：：ｌｏｘＰ）（配列番号３０３）にそれぞれＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩ部位でクローニングした。各ライゲーション反応物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換し、これをＬＢ Ａｍｐプレートでインキュベートして形質転換体を選択した。配列の正しい挿入を、ＰＣＲ（それぞれプライマーＭ１３フォワード（配列番号３１４）及びＮ１１８０（配列番号３０５）並びにＭ１３リバース（配列番号３１５）及びＮ１１８１（配列番号３０６））によって確認した。
上記に記載されるベクター（ｐＵＣ１９：：ａｌｄ６Δ：：ｌｏｘＰ−ＵＲＡ３−ｌｏｘＰ）をＡｈｄＩで線状化し、標準的な酢酸リチウム法を用いてＰＮＹ１５２８及びＰＮＹ２２３７に形質転換した（但し、細胞とＤＮＡとのインキュベーションは２．５時間に延長した）。１％エタノールを炭素源として供給したウラシル不含合成完全培地に播くことにより、形質転換体を得た。パッチした形質転換体を、プライマーＮ１２１２（配列番号３０８）及びＮ１１８０（５’末端）（配列番号３０５）並びにＮ１１８１（配列番号３０６）及びＮ１２１３（配列番号３０９）（３’末端）を使用して、ＰＣＲによるスクリーニングにより欠失／組込みを確認した。Ｃｒｅリコンビナーゼを有するプラスミド（ｐＲＳ４２３：：ＧＡＬ１ｐ−Ｃｒｅ＝配列番号３２４）を、ヒスチジンマーカー選択を用いて株に形質転換した。形質転換体を０．５％ガラクトース添加ＹＰＥにおいて継代した。コロニーを、５−ＦＯＡに対する耐性（ＵＲＡ３マーカーの欠損）及びヒスチジン栄養要求性（Ｃｒｅプラスミドの欠損）についてスクリーニングした。隣接ｌｏｘＰ部位を介してＵＲＡ３遺伝子が正しく除去されたことを、ＰＣＲ（それぞれプライマーＮ１２６２及びＮ１２６３、配列番号３１６及び３１７）によって確認した。加えて、ＡＬＤ６遺伝子に対して内部のプライマー（それぞれＮ１２３０及びＮ１２３１；配列番号３２２及び３２３）を使用して、部分二倍体が存在しないことを確実にした。最後に、ａｌｄ６Δ：：ｌｏｘＰクローンをＰＣＲによりスクリーニングして、ｕｒａ３Δ：：ｌｏｘＰ（Ｎ１２２８とＮ１２２９、配列番号３２０及び３２１）及びｇｐｄ２Δ：：ｌｏｘＰ（Ｎ１２２３及びＮ１２２５、配列番号３１８及び３１９）との間の転座が起こっていないことを確認した。ＰＮＹ１５２８の形質転換体のスクリーニングから２つの陽性クローンを同定した。クローンＢはＰＮＹ２２４３と命名された。ＰＮＹ２２３７の形質転換体のスクリーニングから３つの陽性クローンを同定した。クローンＥ及びＫは、いずれも小規模でのイソブタノール生成についてアッセイした（下記）。ほとんどのパラメータが統計的に同一であったが、さらなる展開用にはクローンＥを選択した（ＰＮＹ２２３８）。
株ＰＮＹ２２５９の構築
本例の目的は、ＰＮＹ２２３８におけるａｄｈ１Δ遺伝子座のｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の染色体コピーをｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）に置換するために用いられるコンストラクトの構築について記載することである。
標的領域の上流及び下流の相同性領域と形質転換体選択用のＵＲＡ３遺伝子とを含むＰＣＲ産物による相同組換えにより、欠失／組込みを作成した。ＵＲＡ３遺伝子を相同組換えにより除去し、スカーレスな欠失／組込みを作成した。ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を組み込むためのプラスミドは、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＤＨ１遺伝子座に組み込むように構築されたプラスミドから得た。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）をＡＤＨ１遺伝子座に組み込むために使用されるプラスミドの構築を以下に記載する。このプラスミドはｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳに構築した。
ＡＤＨ１欠失／ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組込みプラスミドの構築
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現用にコドンを最適化したラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来のｋｉｖＤコード領域、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）を、ｐＬＨ４６８（配列番号３３５）を鋳型として使用して、ＰｍｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５６２（配列番号３２５）、及びＡＤＨ１断片Ｂの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５６３（配列番号３２６）で増幅した。ＡＤＨ１断片Ｂを、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５６４（配列番号３２７）、及びＦｓｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５６５（配列番号３２８）で増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）とＡＤＨ１断片Ｂ ＰＣＲ産物とを混合し、且つプライマーｏＢＰ５６２（配列番号３２５）及びｏＢＰ５６５（配列番号３２８）で増幅して、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを作成した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩ及びＦｓｅＩで消化し、適切な酵素で消化した後ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にＴ４ ＤＮＡリガーゼによってライゲートした。ＡＤＨ１断片Ａを、ゲノムＤＮＡから、ＳａｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０５（配列番号３２９）、及びＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０６（配列番号３３０）で増幅した。ＡＤＨ１断片Ａ ＰＣＲ産物をＳａｃＩ及びＡｓｃＩで消化し、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを含むプラスミドの対応する部位にＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートした。ＡＤＨ１断片Ｃを、ゲノムＤＮＡから、ＰａｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０７（配列番号３３１）、及びＳａｌＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０８（配列番号３３２）で増幅した。ＡＤＨ１断片Ｃ ＰＣＲ産物をＰａｃＩ及びＳａｌＩで消化し、ＡＤＨ１断片Ａ−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを含むプラスミドの対応する部位にＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートした。ハイブリッドプロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１（配列番号２６４）を、ベクターｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１−ＧＵＳから、ＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６７４（配列番号３３３）、及びＰｍｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６７５（配列番号３３４）で増幅した。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１ ＰＣＲ産物をＡｓｃＩ及びＰｍｅＩで消化し、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片ＡＢＣを含むプラスミドの対応する部位にＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートして、ｐＢＰ１１８１を作成した。
ｐＢＰ１７１６及びｐＢＰ１７１９の構築
ＡＤＨ１欠失／ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組込みプラスミドｐＢＰ１１８１から、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）を除去した。プラスミドをＰｍｅＩ及びＦｓｅＩで消化し、大きいＤＮＡ断片をアガロースゲルと、続くゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＡＤＨ１断片Ｂを、ｐＢＰ１１８１から、ＰｍｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ８２１（配列番号３３６）、及びＦｓｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ４８４（配列番号３３７）で増幅した。ＡＤＨ１断片Ｂ ＰＣＲ産物をＰｍｅＩ及びＦｓｅＩで消化し、ゲル精製した大きいＤＮＡ断片の対応する部位にＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートした。ＰＮＹ１５２８においてｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）を標的化して欠失させるため、得られたベクターにｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の３’５００ｂｐに対応するＰＣＲ断片をクローニングした。ｐＢＰ１１８１から、ＮｏｔＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ８２２（配列番号３３８）、及びＰａｃＩ制限部位を含むｏＢＰ８２３（配列番号３３９）で断片を増幅した。この断片をＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化し、適切な制限酵素で消化した後ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）欠失を有する上記のプラスミドにおけるＵＲＡ３の下流の対応する部位にＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートした。得られたプラスミドをｐＢＰ１７１６と命名した。
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現用にコドンを最適化したリステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）由来のｋｉｖＤコード領域（配列番号３４０）、ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）により合成した。ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）は、ＰｍｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ８２８（配列番号３４１）、及びＰｍｅＩ制限部位を含むｏＢＰ８２９（配列番号３４２）で増幅した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩで消化し、適切な酵素で消化した後ｐＢＰ１７１６の対応する部位にＴ４ ＤＮＡリガーゼによってライゲートした。クローニングした遺伝子の向きを、プライマーＦＢＡｐ−Ｆ（配列番号３４３）及びｏＢＰ８２９（配列番号３４２）によるＰＣＲによって確認した。正しい向きのｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を有する単離物をｐＢＰ１７１９と命名した。
株ＰＮＹ２２５９の構築
ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）欠失／ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）組込みカセット を、ｐＢＰ１７１９からプライマーｏＢＰ５０５（配列番号３２９）及びｏＢＰ８２３（配列番号３３９）で増幅した。ＰＮＹ２２３８のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用してＰＣＲ産物で形質転換した。形質転換混合物を、３０℃の１％エタノール添加ウラシル不含合成完全培地に播いた。形質転換体株を、プライマーＵｒａ３−ｅｎｄ Ｆ（配列番号２８０）及びＨＹ−５０（配列番号３４４）を使用するＰＣＲ（ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）ＲＥＤＴａｑ（著作権）ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標））によりスクリーニングした。形質転換体をＹＰＥ（１％エタノール）で成長させて、１％ＥｔＯＨを補足した、且つ５−フルオロオロチン酸（０．１％）を含有する３０℃の合成完全培地に播き、ＵＲＡ３マーカーが欠損した単離物を選択した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の欠失及びｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）の組込みを、プライマーＨＹ−５０及びｏＢＰ８３４（配列番号３４５）によるＰＣＲによって確認した。ＰＮＹ２２３８におけるｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）と同じ遺伝子座にｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を含み、且つ同じプロモーターから発現した一つの正しい単離物を、ＰＮＹ２２５９と命名した。
株ＰＮＹ１５５６の構築
ここでは、ＰＮＹ１５２８におけるａｄｈ１Δ遺伝子座のｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の染色体コピーをｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）に置換するために用いられるコンストラクトの構築及びｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）遺伝子を発現する株ＰＮＹ１５５６の構築について記載する。前節に記載したとおり、標的領域の上流及び下流の相同性領域と形質転換体選択用のＵＲＡ３遺伝子とを含むＰＣＲ産物による相同組換えにより、欠失／組込みを作成した。ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を組み込むためのプラスミドは、ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＤＨ１遺伝子座に組み込むように構築されたプラスミドから得た。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）をＡＤＨ１遺伝子座に組み込むために用いるプラスミドの構築を以下に記載する。このプラスミドはｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳに構築した。
ＡＤＨ１欠失／ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組込みプラスミドの構築
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現用にコドンを最適化したラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来のｋｉｖＤコード領域、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）を、ｐＬＨ４６８（配列番号１２９）を鋳型として使用して、ＰｍｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５６２（配列番号３８４）、及びＡＤＨ１断片Ｂの５’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５６３（配列番号３８５）で増幅した。ＡＤＨ１断片Ｂは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ １１３−７ＤゲノムＤＮＡから、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の３’末端と相同性を有する５’テールを含むプライマーｏＢＰ５６４（配列番号３８６）、及びＦｓｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５６５（配列番号３８７）で増幅した。ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製した。オーバーラップＰＣＲにより、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）とＡＤＨ１断片Ｂ ＰＣＲ産物とを混合し、プライマーｏＢＰ５６２（配列番号３８４）及びｏＢＰ５６５（配列番号３８７）で増幅して、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを作成した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩ及びＦｓｅＩで消化し、適切な酵素で消化した後ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ＭＣＳの対応する部位にＴ４ ＤＮＡリガーゼによってライゲートした。ＡＤＨ１断片Ａを、ゲノムＤＮＡから、ＳａｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０５（配列番号３２９）、及びＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０６（配列番号３３０）で増幅した。ＡＤＨ１断片Ａ ＰＣＲ産物をＳａｃＩ及びＡｓｃＩで消化し、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを含むプラスミドの対応する部位にＴ４ ＤＮＡリガーゼによってライゲートした。ＡＤＨ１断片Ｃを、ゲノムＤＮＡから、ＰａｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０７（配列番号３３１）、及びＳａｌＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ５０８（配列番号３３２）で増幅した。ＡＤＨ１断片Ｃ ＰＣＲ産物をＰａｃＩ及びＳａｌＩで消化し、ＡＤＨ１断片Ａ−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片Ｂを含むプラスミドの対応する部位にＴ４ ＤＮＡリガーゼによってライゲートした。ハイブリッドプロモーターＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１を、ベクターｐＲＳ３１６−ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１−ＧＵＳ（配列番号３８９）から、ＡｓｃＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６７４（配列番号３３３）、及びＰｍｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ６７５（配列番号３３４）で増幅した。ＵＡＳ（ＰＧＫ１）−ＰＦＢＡ１ ＰＣＲ産物をＡｓｃＩ及びＰｍｅＩで消化し、ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）−ＡＤＨ１断片ＡＢＣを含むプラスミドの対応する部位にＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートすることにより、ｐＢＰ１１８１を作成した。
ＡＤＨ１欠失／ＵＡＳ（ＰＧＫ１）Ｐ［ＦＢＡ１］−ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）組込みプラスミドｐＢＰ１１８１からｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）を除去した。このプラスミドをＰｍｅＩ及びＦｓｅＩで消化し、大きいＤＮＡ断片をアガロースゲルと、続くゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＡＤＨ１断片Ｂを、ｐＢＰ１１８１から、ＰｍｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ８２１（配列番号３３６）、及びＦｓｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ４８４（配列番号３３７）で増幅した。ＡＤＨ１断片Ｂ ＰＣＲ産物をＰｍｅＩ及びＦｓｅＩで消化し、ゲル精製した大きいＤＮＡ断片の対応する部位にＴ４ ＤＮＡリガーゼによってライゲートした。ＰＮＹ１５２８においてｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）を標的化して欠失させるため、得られたベクターにｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の３’５００ｂｐに対応するＰＣＲ断片をクローニングした。この断片を、ｐＢＰ１１８１から、ＮｏｔＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ８２２（配列番号３３８）、及びＰａｃＩ制限部位を含むｏＢＰ８２３（配列番号３３９）で増幅した。この断片をＮｏｔＩ及びＰａｃＩで消化し、適切な制限酵素で消化した後ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）欠失を有する上記のプラスミドにおけるＵＲＡ３の下流の対応する部位にＴ４ ＤＮＡリガーゼによってライゲートした。得られたプラスミドをｐＢＰ１７１６と命名した。
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現用にコドンを最適化したリステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｇｒａｙｉ）由来のｋｉｖＤコード領域（配列番号３９０）、ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）により合成した。ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を、ＰｍｅＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ８２８（配列番号３４１）、及びＰｍｅＩ制限部位を含むｏＢＰ８２９（配列番号３４２）で増幅した。得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩで消化し、適切な酵素で消化した後ｐＢＰ１７１６の対応する部位にＴ４ ＤＮＡリガーゼによってライゲートした。クローニングした遺伝子の向きを、プライマーＦＢＡｐ−Ｆ（配列番号３４３）及びｏＢＰ８２９（配列番号３４２）によるＰＣＲによって確認した。正しい向きのｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を有する単離物をｐＢＰ１７１９と命名した。
ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）欠失／ｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）組込みカセットを、ｐＢＰ１７１９から、プライマーｏＢＰ５０５（配列番号３２９）及びｏＢＰ８２３（配列番号３３９）で増幅した。ＰＮＹ１５２８のコンピテント細胞を作製し、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用してＰＣＲ産物で形質転換した。形質転換混合物を、３０℃の１％エタノール添加ウラシル不含合成完全培地に播いた。形質転換体をＹＰＥ（１％エタノール）で成長させて、１％ＥｔＯＨを補足した、且つ５−フルオロオロチン酸（０．１％）を含有する３０℃の合成完全培地に播き、ＵＲＡ３マーカーが欠損した単離物を選択した。ｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）の欠失及びｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）の組込みを、ＹｅａＳｔａｒゲノムＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で調製したゲノムＤＮＡを使用するプライマーｏＢＰ６７４（配列番号３３３）及びｏＢＰ８３０（配列番号３９１）によるＰＣＲによって確認した。ＰＮＹ１５２８におけるｋｉｖＤ＿Ｌｌ（ｙ）と同じ遺伝子座にｋｉｖＤ＿Ｌｇ（ｙ）を含み、且つ同じプロモーターから発現した正しい単離物を、ＰＮＹ１５５６と命名した。
実施例１〜４の一般的方法
プラスミドによる酵母形質転換：
ＫＡＲＩ含有プラスミドで形質転換する酵母株のコンピテント細胞の凍結アリコートを以下のとおり作製した。ＫＡＲＩ及びＤＨＡＤ遺伝子が別個のプラスミドにあった場合は、初めにＤＨＡＤ含有プラスミド（例えばｐＢＰ９１５）を有する細胞からコンピテント細胞を作製した。次にそれらのコンピテント細胞をＫＡＲＩ含有プラスミドで形質転換した。
１０ｍＬの成長培地（プラスミド不含酵母にはＹＰＥ、ｐＢＰ９１５などのＤＨＡＤ含有プラスミドを有する酵母にはＳＥ −Ｈｉｓ）に、新しくパッチしたプレートからの細胞ループを接種した。培養物を３０℃で一晩振盪した。一晩培養物のＯＤ６００ｎｍをキュベット分光光度計で計測し、計算された細胞量を使用して、続く３０ｍＬ培養液に０．２の初期ＯＤ６００ｎｍで接種した。成長培地は、プラスミド不含酵母に対してＹＰＥ、又はｐＢＰ９１５などのＤＨＡＤ含有プラスミドを有する酵母に対してＳＥ −Ｈｉｓであった。３０ｍＬ培養液が入ったフラスコを、ＯＤ６００ｎｍが約０．７〜１．０に達するまで３０℃で約８時間振盪した。２５ｍＬの培養物をスイングバケットローターにおいて４０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を廃棄し、１０ｍＬのＥＺ １溶液（Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット、カタログ番号Ｔ２００１、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａからのもの）にペレットを再懸濁した。細胞を再び上記のとおり遠心し、上清を廃棄した。１．７５ｍＬのＥＺ ２溶液（Ｚｙｍｏ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）にペレットを再懸濁し、凍結のため微量遠心管に分注した。コンピテント細胞のアリコートを２つの同心の発泡スチロール箱の中に入れ、凍結プロセスを延長した。この集合体を−８０℃のフリーザーに入れた。１２時間以上後に同心の発泡スチロール箱からアリコートを取り出し、標準的なフリーザーボックスに移した。
酵母細胞を以下のとおりプラスミドで形質転換した：形質転換する各プラスミドにつき８μＬ（３００〜４００ｎｇ）のプラスミドＤＮＡ溶液を１．５ｍＬ微量遠心管に分注した。凍結コンピテント酵母細胞のアリコートを氷上で解凍した。２０μＬの解凍したコンピテント酵母細胞を各管に加え、ピペットでＤＮＡと混合した。２００μＬのＥＺ ３溶液（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を各管に添加し、ピペッティングして混合した。混合物を３０℃で約２時間、３０〜４５分毎に断続的にボルテックス混合しながらインキュベートした。１５０μＬの各形質転換混合物を、ＳＥ −Ｕｒａ又はＳＥ −Ｕｒａ −Ｈｉｓプレート（実験のプラスミドに応じて）に広げた。プレートをジップトップ式プラスチック袋に密閉し、コロニーが現れるまで３０℃でインキュベートした。
酵母培養条件
好気培養培地：２ｇ／ｌエタノールを含むＳＥ −Ｕｒａ培地（又は２プラスミドシステム実験ではＳＥ −Ｕｒａ −Ｈｉｓ）。
嫌気培養培地：１０ｍｇ／ｌエルゴステロール、５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）、３０ｍｇ／ｌチアミン、及び３０ｍｇ／ｌニコチン酸を補足した、３０ｇ／ｌグルコース及び１ｇ／ｌエタノールを含むＳＥＧ −Ｕｒａ（又は２プラスミドシステム実験ではＳＥＧ −Ｕｒａ −Ｈｉｓ）。
４８ウェルプレート：Ａｘｙｇｅｎ カタログ番号Ｐ−５ＭＬ−４８−Ｃ−Ｓ、５ｍｌ／ウェル総容積、１．５ｍｌ／ウェルの培養容積。
好気培養は、プレートを透過性接着フィルムで被覆した。プレートを３０℃において２２５ｒｐｍで振盪した。嫌気培養は、透過性フィルムで被覆した新しく接種したプレートの酸素を、嫌気チャンバで２時間平衡化させることによりパージした。次にプレートの覆いを接着アルミニウムカバーに交換し、各プレートを新鮮な酸素捕捉剤パックと共に気密性プラスチックボックスの中に置いた。集合体全体（密閉された気密性プラスチックボックスの中のプレート及び酸素捕捉剤パック）を嫌気チャンバから取り出し、３０℃において２２５ｒｐｍで振盪した。
実験プロトコル
ＳＥ −Ｕｒａ又はＳＥ −Ｕｒａ −Ｈｉｓ寒天プレート（使用される株のプラスミドに応じて）にある単一の酵母コロニーを、同じタイプの新鮮な寒天プレートにストリークし、高密度の細胞パッチが成長するまで３０℃でインキュベートした。最初の好気培養のため、４８ウェルプレート中の前培養液にこれらの細胞のループを接種した。一晩振盪した後、各ウェルの０．１５ｍｌを平底９６ウェルプレートに移し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーで各ウェルの６００ｎｍの吸光度を計測することにより、各培養ウェルのＯＤ６００を計測した。実験的に決定された検量線に基づく線形形質転換をこれらのプレートリーダー計測光学濃度に適用することにより、それらの光学濃度をキュベットベースの分光光度計の比較可能な吸光度値に変換した。
各好気前培養ウェルの計算した部分量を、０．２の初期ＯＤ６００（キュベット分光光度計吸光度単位）に達するように１．５ｍｌの嫌気培養培地を含む新鮮な４８ウェルプレートの対応するウェルに接種した。新鮮なプレートの接種過程で好気前培養プレートを遠心し、各ウェルから上清を除去し、各ウェルの細胞を新鮮な嫌気培養培地に再懸濁することにより、ある培養から次の培養への代謝産物のキャリーオーバーを最小限に抑えた。この嫌気培養プレートを、実験に応じて２〜３日間振盪した。培養上清のイソブタノール濃度をＨＰＬＣにより（質量分析検出器又は屈折率検出器のいずれかで）計測した。
フォローアップの嫌気培養（「継代サイクル＃２」）を最初の嫌気培養から以下のとおり開始した：各嫌気培養ウェルの計算した部分量を、０．２の初期ＯＤ６００（キュベット分光光度計単位）に達するように１．５ｍｌの嫌気培養培地を含む新鮮な４８ウェルプレートの対応するウェルに接種した。新鮮なプレートの接種過程で成長プレートを遠心し、各ウェルから上清を除去し、各ウェルの細胞を新鮮な嫌気培養培地に再懸濁することにより、ある継代サイクルから次の継代サイクルへの代謝産物のキャリーオーバーを最小限に抑えた。フォローアップ（２回目のサイクル）の嫌気培養プレートを、実験に応じて２〜３日間振盪した。培養上清のイソブタノール濃度を上記のとおりＨＰＬＣにより計測した。
実施例１〜５について、株及び成長培地の詳細は以下のとおりであった：
実施例１：２つのプラスミド：１）配列番号１６２に基づくＫＡＲＩ変異体プラスミド、及び２）Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＤＨＡＤの発現用の配列番号１６３として提供されるプラスミドで形質転換したＰＮＹ２２０４、並びにウラシル及びヒスチジン不含成長培地。
実施例２：２つのプラスミド（配列番号１６３、及び配列番号１６２に基づくＫＡＲＩ変異体プラスミド）で形質転換したＰＮＹ２２３８、ウラシル及びヒスチジン不含成長培地。
実施例３：２つのプラスミド（実施例１のとおりの配列番号１６３、及び配列番号１６２に基づくＫＡＲＩ変異体プラスミド）で形質転換したＰＮＹ２２３８、ウラシル及びヒスチジン不含成長培地。
実施例４：単一のプラスミドで形質転換したＰＮＹ２２５９、ウラシル不含成長培地。
実施例５：単一のプラスミドで形質転換したＰＮＹ１５５６、ウラシル不含成長培地。
２つのプラスミド（上記）で形質転換する株用のＫＡＲＩ変異体プラスミドを作成するため、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）によりＫＡＲＩ変異体のコード配列を作成し、配列番号１６２に基づく修飾ベクターにサブクローニングした。例示的な得られたＫＡＲＩ変異体プラスミド（ＫＡＲＩ変異体６５１３９のコード配列を含む；図７）を、配列番号３４７として提供する。かかるＫＡＲＩ変異体プラスミドを、上記に記載したとおりの配列番号１６３として提供されるプラスミドと組み合わせて使用した。
単一のプラスミドを作成するため、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）によりＫＡＲＩ変異体のコード配列を作成し、修飾「シングルプラスミドベクター」（配列番号１６２、図３；配列番号３４８として提供される修飾プラスミド配列）にサブクローニングし、Ｋ９Ｄ３ ＫＡＲＩコード領域を置換した。得られるプラスミド（ＫＡＲＩ変異体配列番号１５９「７６４３７」（及び「Ｒ９Ｅ８」としても知られる）の発現用）の例を、配列番号３４９、図８として提供する。
実施例１
イソブタノール生成経路において作成及び試験した変異体
Figure 0006321631
Figure 0006321631
Figure 0006321631
実施例２
イソブタノール生成経路において作成及び試験した変異体
Figure 0006321631
Figure 0006321631
実施例３
イソブタノール生成経路において作成及び試験した変異体
Figure 0006321631
Figure 0006321631
実施例４
イソブタノール生成経路において作成及び試験した変異体
Figure 0006321631
Figure 0006321631
Figure 0006321631
Figure 0006321631
実施例５
イソブタノール生成用の変異体
表１７に提供する変異体を、実施例４について記載したとおり作成及び試験し、但し株はＰＮＹ１５５６（上記に記載したとおりのシングルプラスミドで形質転換した）であった。嫌気サイクル１及び２は３日間であり、サイクル３は２日間であった。結果を表１８に提供する。
Figure 0006321631
Figure 0006321631
Figure 0006321631
実施例６
残基１５２、２８６、３３６の部位飽和による好適な置換の同定
親変異体Ｒ８−ＳＯＧ１＿ｙ２（アミノ酸配列番号３４６；核酸配列番号３８３）の部位１５２、２８６、及び３３６における全２０個のアミノ酸を個々に構築して試験した。この親変異体は、置換Ａ６８Ｅ、Ｉ１５２Ｖ、Ｙ２８６Ｆ、及びＡ３３６Ｒを有するＪＥＡ１である。
一般的方法は実施例１〜４の適用と同じである。ｐＬＨ５５６ベースのプラスミド上のＫＡＲＩ、及びｐＢＰ９１５上のＤＨＡＤによる２プラスミドシステムを使用した。酵母株はＰＮＹ２２５９であった。
部位特異的突然変異誘発及びｐＬＨ５５６ベースのベクターへのサブクローニング：
突然変異誘発プライマーによるオーバーラップ伸長ＰＣＲにより、位置１５２を突然変異誘発した。ＫＡＲＩインサートを、酵母ギャップ修復クローニングによりｐＬＨ５５６（ＫＡＲＩが除去されている）にサブクローニングした。得られたプラスミドのＫＡＲＩ部分及びフランキング領域の配列をＤＮＡ配列決定により確認した（サンガー法、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７３０ｘｌ ＤＮＡアナライザー）。
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、位置２８６及び３３６を突然変異誘発した；ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における位置２８６及びＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における位置３３６。ＫＡＲＩ変異体をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎベクターで配列決定し、次に標準的なライゲーションによってｐＬＨ５５６のＰｍｅＩ及びＳｆｉＩ制限部位にサブクローニングした。ここでもまたｐＬＨ５５６ベクターで配列決定することによりＫＡＲＩインサートを確認した。
以下の表に、得られた６０個の変異体を、機能性（Ｆ、親の平均の少なくとも１０％の平均酵母イソブタノール生成を支持するものとして定義される）、又は非機能性（ＮＦ、親の平均の少なくとも１０％の平均酵母イソブタノール生成を支持しないものとして定義される）のいずれかとして特徴付ける。
２つ目の表に、定量データ（親のイソブタノール力価に対する割合）を提供する。データは初回の嫌気継代サイクルに基づく。
Figure 0006321631
Figure 0006321631

Claims (15)

  1. ａ．配列番号３６５のアミノ酸配列を含むポリペプチド又は
    ｂ．配列番号３６５と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素活性を有する、ポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のポリペプチドを含む組換え微生物宿主細胞。
  3. 前記宿主細胞が、低下又は消失したアセト乳酸レダクターゼ活性をさらに含む、請求項２に記載の組換え微生物宿主細胞。
  4. 前記宿主細胞が、ｆｒａ２における少なくとも１つの欠失、突然変異、及び／又は置換をさらに含む、請求項３に記載の組換え微生物宿主細胞。
  5. ａ．アセト乳酸シンターゼにより触媒されるピルベートからアセトラクテートへの変換
    ｂ．ジヒドロキシ酸デヒドラーゼによって触媒される２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換
    ｃ．分岐鎖２−ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されるα−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換；及び
    ｄ．分岐鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されるイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換
    を含む基質から生成物への変換からなる生合成経路をさらに含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の組換え微生物宿主細胞。
  6. 前記宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の組換え微生物宿主細胞。
  7. 前記宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項６に記載の組換え微生物宿主細胞。
  8. アセトラクテートからジヒドロキシイソバレレートへの変換方法において、
    ａ．請求項１に記載のポリペプチドを含む微生物宿主細胞を提供するステップ；
    ｂ．前記ポリペプチドをアセトラクテートに接触させるステップであって、ジヒドロキシイソバレレートが生成される、ステップ
    を含む方法。
  9. イソブタノール、パントテネート、バリン、ロイシン、イソロイシン、３，３−ジメチルマレート、及び２−メチル−１−ブタノール又はそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の生成物を生成する方法において、
    ａ．請求項２〜７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を提供するステップであって、前記組換え宿主細胞が生成物生合成経路を含む、ステップと；
    ｂ．前記生成物が生成される条件下で前記微生物宿主細胞を炭素基質に接触させるステップと
    を含む方法。
  10. 前記接触させるステップの少なくとも一部が嫌気的条件下で行われる、請求項９に記載の方法。
  11. 前記１つ以上の生成物がイソブタノール又はイソブタノール及び２−メチル−１−ブタノールである、請求項９に記載の方法。
  12. 前記生成物が炭化水素燃料とブレンドされるか、又は前記生成物が化学溶媒若しくは他の化学的用途の基剤である、請求項１１に記載の方法。
  13. 配列番号５６７の配列を含むポリヌクレオチド。
  14. 請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
  15. イソブタノールを生成する、請求項１４に記載の組換え宿主細胞。
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