BR112014016067A2

BR112014016067A2 - processo para a produção de butanol, composição e micro-organismo

Info

Publication number: BR112014016067A2
Application number: BR112014016067-8A
Authority: BR
Inventors: Bhaskar Bhadra; Arthur Leo Kruckeberg; Ranjan Patnaik; Ritu Bhalla; Vasantha Nagarajan; Wonchul Suh
Original assignee: Butamax Advanced Biofuels Llc
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2020-10-27

Abstract

  PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BUTANOL, COMPOSIÇÃO E MICRO-ORGANISMO. A presente invenção refere-se ao campo da microbiologia industrial e produção de álcool. A invenção refere-se também ao desenvolvimento de um micro-organismo capaz de produzir produtos da fermentação por uma via geneticamente manipulada por engenharia genética, e o uso do micro-organismo. A invenção também está relacionada aos métodos para melhorar a viabilidade celular e a produtividade e o uso da reciclagem e a lavagem ácida para aumentar o rendimento de produto s da fermentação.

Description

“PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BUTANOL, COMPOSIÇÃO E MICRO-ORGANISMO”

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 61/581.877, depositado em 30 de dezembro de 2011; Pedido de Patente Indiano 1423/DELNP/2012, depositado em 9 de maio de 2012; e Pedido Provisório US 61/681.230, depositado em 9 de agosto de 2012; cujos conteúdos são integralmente incorporados pela referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] As sequências fornecidas na listagem de sequências depositadas em anexo (CL5196WOPCT SequencelListing.txt) e incorporadas ao presente pela referência, estão em conformidade com o Título 37 do CFR $1.821—1.825 ("Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules”) e são consistentes com a Organização Mundial da Propriedade Intelectual (OMPIWIPO), Standard ST.25 (2009) e os requisitos de listagem de sequências da EPO e PCT (Regras 5.2 e 49,5 (a-bis), e seção 208 e no Anexo C das Instruções Administrativas). Os símbolos e formatos utilizados para os dados de sequências de nucleotídeos e aminoácidos obedecem as regras estabelecidas no Título 37 do CFR $ 1,822.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção refere-se ao campo da microbiologia industrial e produção de álcool. A invenção refere-se também ao desenvolvimento de um micro-organismo capaz de produzir produtos da fermentação por uma via geneticamente manipulada por engenharia genética, e o uso do micro-organismo. A invenção também está relacionada aos métodos para melhorar a viabilidade celular e a produtividade e o uso da reciclagem e a lavagem ácida para aumentar o rendimento de produtos da fermentação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] O butanol é um importante produto químico industrial útil como aditivo combustível, como matéria-prima de químicos na indústria de plásticos, e como um extrator grau alimentício na indústria de alimentos e condimentos. A cada ano, 10 a 12 bilhões de libras de butanol são produzidos por sínteses químicas que utiizam matérias-primas derivadas de petroquímicos. Os métodos para a síntese química do isômero de butanol, isobutanol, são conhecidos, tais como a síntese oxo, a hidrogenação catalítica de monóxido de carbono (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6a edição, 2003, Wiley-VCH Verlag GmbH e Co., Weinheim, Alemanha, vol. 5, págs. 716-719) e a condensação de Guerbet do metanol com n-propanol (Carlini et al, J. Moles. Catal. A: Chem. 220:215-220, 2004). Estes processos utilizam materiais de partida derivados de petroquímicos. A produção de isobutanol a partir de matérias-primas de origem vegetal pode minimizar o consumo de combustíveis fósseis e representaria um avanço no estado da técnica. Além disso, a produção de produtos químicos e combustíveis utilizando materiais derivados de plantas ou de outras fontes de biomassa seria oferecer alternativas ecoamigáveis e sustentáveis para processos petroquímicos.

[0005] O isobutanol pode ser produzido biologicamente como um subproduto da fermentação de leveduras. É um componente de “óleo fúsel” que se forma como um resultado do metabolismo incompleto de aminoácidos por este grupo de fungos. O isobutano! é especificamente produzido a partir do catabolismo da L-valina. Após o grupo amino da L-valina ser coletado como fonte de nitrogênio, o ácido a-aceto resultante é descarboxilado e reduzido a isobutanol por enzimas da então chamada via de Ehrlich (Dickinson et al. J. Biol. Chem. 273 :25752-25756, 1998).

[0006] Técnicas, como a engenharia genética e engenharia metabólica podem ser utilizadas para modificar um micro-organismo para a produção de um determinado produto a partir de materiais derivados de vegetais ou outras fontes de biomassa. O micro-organismo pode ser modificado, por exemplo, pela inserção de genes, tal como a inserção de genes que codificam uma via biossintética, a deleção de genes ou a modificações em elementos reguladores, tais como promotores. Um micro-organismo também pode ser manipulado para aumentar a produtividade e o rendimento celular, para eliminar subprodutos de vias biossintéticas, e/ou para melhorar cepas. Exemplos de micro-organismos que expressam vias biossintéticas modificadas para a produção de isômeros do butanol, incluindo o isobutanol, estão descritos nas Patentes US 7.851.188 e US 7.993.889.

[0007] No entanto, a exposição a alcoóis tais como etanol e butanol, durante a fermentação pode ter um impacto negativo sobre a viabilidade celular, produtividade das células, e sobre o rendimento do produto. O acúmulo destes alcoóis pode inibir o crescimento celular e, eventualmente, afetar a produção fermentativa destes alcoóis. Assim, existe a necessidade do desenvolvimento de micro-organismos que exibem produção e crescimento celular melhorados na presença destes alcoóis, bem como métodos para manter e/ou melhorar a viabilidade celular e a produtividade das células.

[0008] A presente invenção é direcionada para o desenvolvimento de tais métodos, bem como o desenvolvimento de micro-organismos capazes de produzir os produtos da fermentação, através de uma via modificada em micro-organismos e com melhoria da viabilidade celular e produtividade das células.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção é direcionada a um processo para a produção de um álcool! caracterizada por compreender: (a) fornecimento de um micro-organismo, em que o micro-organismo produz um álcool; (b) colocando o micro-organismo em contato com uma ou mais fontes de carbono sob condições em que o álcool é produzido; (c) coletando o micro-organismo; (d) recuperando o álcool; (e) colocando o micro-organismo coletado na etapa (c) em contato com uma ou mais fontes de carbono, sob condições em que o álcool é produzido; (F) repetindo as etapas (c)-(e); e, opcionalmente, expondo o micro-organismo da etapa (c) em condições de pH baixo. Em alguns exemplos de realização, as etapas (c) - (e) são repetidas por pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, ou mais.

[0010] A presente invenção também é direcionada a um processo para a produção de butanol, compreendendo: (a) o fornecimento de um butanologênico; (b) a colocação do butanologênico em contato com uma ou mais fontes de carbono, sob condições em que o butanol é produzido em um rendimento eficaz; (c) a coleta do butanologênico; (d) a recuperação do butanol; (e) a coloção do butanologênico coletado na etapa (c) em contato com uma ou mais fontes de carbono, sob condições em que o butanol é produzido a um rendimento eficaz e em que o rendimento é eficaz é de cerca de, pelo menos, 90% do rendimento eficaz da etapa (b); (f) a repetição das etapas (c)- (e); e, opcionalmente, expondo o butanologênico coletado da etapa (c) em condições de pH baixo. Em alguns exemplos de realização, o butanologênico coletado na etapa (c) é exposto em condições de pH inferiores ou iguais a cerca de 2,0 por pelo menos cerca de 1 hora na presença pelo menos de cerca de 0,3% de butanol. Em alguns exemplos de realização, o butano! da etapa (d) é recuperado com uma concentração de pelo menos cerca de 6 g/L. Em alguns exemplos de realização, o butano! é produzido em um rendimento eficiente na etapa (e), que é pelo menos cerca de 99% do rendimento eficaz da etapa (b). Em alguns exemplos de realização, as etapas (c) - (e) são repetidas por pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, ou mais.

[0011] A presente invenção é também direcionada a um método para melhorar a viabilidade e a produtividade celular, compreendendo (a) a coleta de um micro-organismo a partir de uma fermentação de álcool; e (b) o contato do micro-organismo com um meio rico em nutrientes. A presente invenção é direcionada a um método para melhorar a viabilidade e a produtividade celular, compreendendo (a) a coleta de um micro-organismo a partir de uma fermentação de álcool; e (b) a exposição do micro-organismo às condições de pH baixo; (c) a coleta do micro-organismo; e (e) o contato do micro-organismo coletado com um meio rico em nutrientes.

[0012] Outro processo da invenção descrito no presente é um processo para a produção de um álcool que compreende (a) o fornecimento de um micro-organismo, em que o micro-organismo produz um álcool; (b) o contato do micro-organismo com um ou mais substratos de carbono em condições nas quais o álcool é produzido; (c) a coleta do micro-organismo; (d) a recuperação do álcool; (e) o contato do micro-organismo da etapa (c) com um meio rico em nutrientes; (f) a coleta do micro-organismo da etapa (e); (9) o contato do micro-organismo da etapa (f) com um ou mais substratos de carbono, em condições nas quais o álcool é produzido; e (h) opcionalmente, a repetição das etapas (c)-(g).

[0013] A presente invenção também é direcionada a um processo para a produção de um álcool, compreendendo (a) o fornecimento de um micro-organismo, em que o micro-organismo produz um álcool; (b) o contato do micro-organismo com um ou mais substratos de carbono em condições nas quais o álcool é produzido; (c) a coleta do micro-organismo; (d) a recuperação do álcool; (e) a exposição do micro-organismo da etapa (c) a condições de baixo pH; (f) a coleta do micro-organismo da etapa (e); (g) o contato do micro- organismo da etapa (f) com um meio rico em nutrientes; (h) a coleta do micro-

organismo da etapa (g); (i) o contato do micro-organismo com um ou mais substratos de carbono em condições nas quais o álcool é produzido; e (j) opcionalmente a repetição das etapas (c)-(i).

[0014] Em alguns exemplos de realização dos processos e métodos descritos na presente invenção, a etapa de contato do micro- organismo com o meio rico em nutrientes pode ser conduzida sob condições aeróbicas. Em alguns exemplos de realização dos processos e métodos descritos na presente invenção, o pH é inferior ou igual a cerca de 2. Em alguns exemplos de realização dos processos e métodos descritos na presente invenção, as condições de pH podem ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 4. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser exposto a condições de pH inferiores ou iguais a cerca de 2,0 por cerca de pelo menos uma hora.

[0015] Em alguns exemplos de realização o álcool produzido pelos métodos e processos descritos na presente invenção é o metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol e hexanol. Em alguns exemplos de realização, o butanol pode ser 1-butanol, 2-butanol, 2-butanona, isobutanol, ou misturas dos mesmos.

[0016] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser submetido à reciclagem de células. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser reciclado por pelo menos 5 vezes. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser reciclado por pelo menos 10 vezes. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser lavado com ácido durante a etapa de reciclagem. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser lavado com ácido após a etapa de reciclagem.

[0017] EM alguns exemplos de realização dos processos e métodos descritos na presente invenção, a etapa de contato com o substrato de carbono pode ocorrer na presença de um agente de extração. Em alguns exemplos de realização, a etapa de contato com o substrato de carbono pode ocorrer em condições anaeróbias. Em alguns exemplos de realização, a etapa de contato com o substrato de carbono pode ocorrer em condições microaeróbias. Em alguns exemplos de realização, a etapa de contato pode ser o primeiro contato. Em alguns exemplos de realização, a reciclagem pode ocorrer em condições anaeróbicas. Em alguns exemplos de realização, a reciclagem pode ocorrer em condições microaeróbicas.

[0018] Em alguns exemplos de realização, o substrato de carbono pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de oligossacarídeos, polissacarídeos, monossacarídeos, e misturas dos mesmos. Em alguns exemplos de realização, o substrato de carbono pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de frutose, glicose, lactose, maltose, galactose, sacarose, amido, celulose, matérias primas, etanol, lactato, succinato, glicerol, mosto de milho, cana-de-açúcar, biomassa, um açúcar C5, tal como a xilose e arabinose, e misturas dos mesmos.

[0019] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser uma célula hospedeira recombinante. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser um butanologênico. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser um isobutanologênico. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode compreender uma via biossintética do butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do butanol pode ser uma via biossintética de isobutanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética de isobutanol pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de um substrato em produto, selecionado a partir do grupo consistindo de (a), piruvato em acetolactato; (b) acetolactato em 2,3-di-hidroxi- isovalerato; (c) 2,3-di-hidroxi-isovalerato em 2-cetoisovalerato; (d) 2-

cetoisovalerato em isobutiraldeído; e (e) isobutiraldeído em isobutanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do isobutanol compreende polinucleotídeos que codificam polipeptídeos possuindo atividade de acetolactato sintase, cetoácido redutoisomerase, ácido dihidroxi desidratase, cetoisovalerato descarboxilase e/ou atividade de álcool desidrogenase.

[0020] Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do butanol pode ser uma via biossintética de isobutanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do isobutanol pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de um substrato em produto, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) de piruvato em acetolactato, (b) de acetolactato em 2,3-dihidroxiisovalerato, (c) de 2,3-dihidroxiisovalerato em a-cetoisovalerato; (d) a-cetoisovalerato em isobutiril CoA; (e) isobutiril CoA em isobutirilaldeído; e (f) isobutirilaldeído em isobutanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do isobutanol pode compreender polinucleotídeos que codificam polipeptídeos possuindo atividade de acetolactato sintase; atividade de ácido acetohidróxi redutoisomerase; atividade de ácido acetohidróxi desidratase; atividade de desidrogenase de cetoácido de cadeia ramificada, atividade de aldeído desidrogenase; e/ou atividade de álcool desidrogenase de cadeia ramiíficada.

[0021] Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do butanol pode ser uma via biossintética de 1-butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do 1-butanol pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de um substrato em produto, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) acetil- CoA em acetoacetil-CoA; (b) acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA; (c) 3- hidroxibutiril-CoA em crotonil-CoA; (d) crotonil-CoA em butiril-CoA; (e) butiril- CoA em butiraldeído, e (f) butiraldeído em 1-butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética de 1-butanol pode compreender polinucleotídeos que codificam polipeptideos possuindo atividade de aceti-CoA- acetiltransferase; atividade de 3-hidroxibutiril-CoA-desidrogenase; atividade de crotonase; atividade de butiril-CoA desidrogenase; atividade de butiraldeído desidrogenase e/ou butanol desidrogenase.

[0022] Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do butanol pode ser uma via biossintética de 2-butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do 2-butanol pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de um substrato em produto, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) piruvato em alfa-acetolactato; (b) alfa-acetolactato em acetoína; (c) acetoína em 3- amino-2-butanol; (d) 3-amino-2-butanol em fosfato de 3-amino-2-butanol; (e) fosfato de 3-amino-2-butanol em 2-butanona; e (f) -butanona em 2-butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintitética de 2-butanol pode compreender polinucleotídeos que codificam polipeptídeos possuindo atividade de acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase, atividade de acetonina aminase, atividade de aminobutanol quinase, atividade de fosfato de aminobutano!l fosforilase, e/ou atividade de butanol desidrogenase.

[0023] Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do 2- butanol pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de um substrato em produto, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) de piruvato em alfa-acetolactato, (b) de alfa- acetolactato em acetoína, (c) acetoína em 2,3-butanodiol; (d) de 2,3-butanodiol em 2-butanona; e (e) de 2-butanona em 2-butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintitéica de 2-butanol pode compreender polinucleotídeos que codificam polipeptídeos possuindo atividade de acetolactato sintase, atividade de acetolactato descarboxilase, atividade de butanodiol desidrogenase; atividade de diol desidratase; e/ou atividade de butanol! desidrogenase.

[0024] Em alguns exemplos de realização, um ou mais substratos para as conversões de produto podem utilizar NADH ou NADPH como cofator. Em alguns exemplos de realização, o NADH é o cofator.

[0025] Em alguns exemplos de realização, a via do butanol do micro-organismo pode compreender pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de enzimas que têm os seguintes Números da Comissão de Enzimas: EC 2.2.1.6, EC 1.1.1.86, EC 4.2.1.9, EC 4.1.1.72, EC 1.1.1.1, EC

1.1.1.265, EC 1.1.1.2, EC 1.2.4.4, EC 1.3.99.2, EC 1.2.1.57, EC 1.2.1.10, EC

2.6.1.66, EC 2.6.1.42, EC 1.4.1.9, EC 1.4.1.8, EC 4.1.1.14, EC 2.6.1.18, EC

2.3.1.9, EC 2.3.1.16, EC 1.1.130, EC 1.1.1.35, EC 1.1.1.157, EC 1.1.1.36, EC

4.2.1.17, EC 4.2.1.55, EC 1.3.1.44, EC 1.3.1.38, EC 5.4.99.13, EC 4.1.1.5, EC

2.7.1.29, EC 1.1.1.76, EC 1.2.1.57 e EC 4.2.1.28.

[0026] Em alguns exemplos de realização, a via do butanol modificada do micro-organismo pode compreender pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do seguinte grupo de enzimas: acetolactato sintase, ácido acetohidroxi isomeroredutase, ácido ácido acetohidroxi desidratase, descarboxilase de ácido alfaceto de cadeia ramificada, desidrogenase de álcool de cadeia ramificada, aldeído desidrogenase acilante, desidrogenase de ácido ceto de cadeia ramificada, butiril-CoA-desidrogenase, butiraldeído — desidrogenase, transaminase, valina desidrogenase, valina descarboxilase, transaminase ômega, acetil-CoA-acetiltransferase, 3- hidroxibutiril-CoA-desidrogenase, crotonase, butiri-CoA-desidrogenase, isobutiril-CoA-mutase, acetolactato-descarboxilase, acetonina aminase, butanol! desidrogenase, butiraldeído desidrogenase, acetoína quinase, acetoína fosfato aminase, fosfato aminobutanol fosfoliase, aminobutanol quinase, butanodiol- desidrogenase, e butanodio! desidratase.

[0027] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo ou butanologênico pode compreender uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de um ou mais componentes da via de transdução de sinal cAMP. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo ou butanologênico pode compreender uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de uma ou mais fosfodiesterases. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo ou butanologênico pode compreender uma fosfodiesterase e/ou atividade de fosfodiesterase reduzida ou eliminada. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo ou butanologênico pode compreender uma modificação em um polinucleotídeo codificante de um polipeptídeo possuindo atividade de fosfodiesterase. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo ou butanologênico pode compreende uma inserção, deleção, mutação, e/ou substituição em um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo possuindo atividade de fosfodiesterase. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo possuindo a atividade de fosfodiesterase pode corresponder à enzima com o Número da Comissão de Enzimas: EC 3.1.4.17. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo possuindo a atividade da fosfodiesterase pode ser PDE1.

[0028] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo ou butanologênico não expressa ou possui expressão reduzida da piruvato descarboxilase. Em alguns exemplos de realização, a redução na expressão é resultado de uma inserção, deleção, mutação e/ou substituição de um gene que codifica a piruvato descarboxilase. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo ou butanologênico pode compreender uma modificação em um polinucleotídeo codificante de um polipeptídeo possuindo atividade de descarboxilase. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo ou butanologênico pode compreende uma inserção, deleção, mutação, e/ou substituição em um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo possuindo atividade de piruvato descarboxilase. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo possuindo a atividade de piruvato descarboxilase pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de: PDC1, PDC5, PDC6, e combinações das mesmas. Em alguns exemplos de realização, o polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo possuindo a atividade da piruvato descarboxilase pode ser selecionado a partir do grupo consistindo de: PDC1, PDC5, PDC6, e combinações das mesmas.

[0029] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo ou butanologênico não expressa ou possui expressão reduzida da gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase. Em alguns exemplos de realização, a redução na expressão é resultado de uma inserção, deleção, mutação e/ou substituição de um gene que codifica a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo ou butanologênico não expressa ou possui expressão reduzida de BDH1. Em alguns exemplos de realização, a redução na expressão é resultado de uma inserção, deleção, mutação e/ou substituição de um gene que codifica BDH1. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo ou butanologênico não expressa ou possui expressão reduzida de um gene codificante de acetolactato redutase. Em alguns exemplos de realização, a redução na expressão é resultado de uma inserção, deleção, mutação e/ou substituição de um gene que codifica YMR226c.

[0030] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo ou butanologênico pode ser uma célula de levedura. Em alguns exemplos de realização, a célula de levedura pode ser um membro de um gênero de leveduras selecionado a partir do grupo consistindo de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia e Pichia. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser Saccharomyces cerevisiae.

[0031] A presente invenção também é direcionada às composições "compreendendo um micro-organismo ou butanologênico conforme descrito no presente. Em alguns exemplos de realização, a composição também compreende um meio rico em nutrientes. Em alguns exemplos de realização, a composição pode ter um pH inferior ou igual a cerca de 2. Em alguns exemplos de realização, a composição pode ter um pH de cerca de 2 a cerca de 4.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0032] A Figura 1 mostra uma placa de dissecação de tétrades para a cepa PNY860. A viabilidade de esporos é como se segue: 4+:0-, n=15; 3+:1-, n= 2; 2+:2-, n= 1; 1+:3-, n= 0; 0+:4-, n= O. A vitalidade e o tamanho de colônia eram pouco variáveis, mas não houve microcolônias.

[0033] A Figura 2 ilustra um gel de agarose com produtos da PCR a partir de uma análise do tipo acasalamento (mating type) de 4 colônias a partir de 2 tétrades que são esporos da progênie PNY860. A pista 1 é PNY860. A pista 2 é PNY860-1A. A pista 3 é PNY860-1B. A pista 4 é PNY860-1C. À pista 5 é PNY860-1D. A pista 6 é PNY860-2A. A pista 7 é PNY860-2B. A pista 8 é PNY860-2C. A pista 9 é PNY860-2D.

[0034] A Figura 3 descreve diferentes vias biossintéticas do isobutanol. As etapas marcadas “a”, “b”, “c”, “d”, “e”, P, “q”, “nW, Pv, TT ex representam as conversões de substratos em produtos descritas abaixo. Por exemplo, “a” pode ser catalisada pela acetolactato sintase; “b” pode ser catalisada, por exemplo, pela acetohidroxiácido redutoisomerase; “c” pode ser catalisada, por exemplo, pela ácido acetohidroxi desidratase; “d” pode ser catalisada, por exemplo, pela descarboxilase de cetoácido de cadeia ramificada; “e” pode ser catalisada, por exemplo, pela desidrogenase de álcool! de cadeia ramiíficada; “Ff” pode ser catalisada, por exemplo, pela desidrogenase de cetoácido de cadeia ramificada; “g” pode ser catalisada, por exemplo, pela aldeído desidrogenase acetilante; “h” pode ser catalisada, por exemplo, pela valina transaminase ou desidrogenase; “i” pode ser catalisada, por exemplo,

pela valina descarboxilase; “j” pode ser catalisada, por exemplo, pela omega transaminase; e “k” pode ser catalisada, por exemplo, pela isobutiril-CoA- mutase.

[0035] A Figura 4 ilustra a via biossintética do 1-butanol. As etapas marcadas “a”, “bp”, “c”, “d”, “e” e “FPrepresentam as conversões de substratos em produtos descritas abaixo. Por exemplo, “a” pode ser catalisada pela acetil-CoA acetiltransferase; “b” pode ser catalisada, por exemplo, pela 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase; “c” pode ser catalisada, por exemplo, pela crotonase; “d” pode ser catalisada, por exemplo, pela butiri-CoA desidrogenase; “e” pode ser catalisada, por exemplo, pela butiraldeído desidrogenase; e “f' pode ser catalisada, por exemplo, pela butanol! desidrogenase.

[0036] A Figura 5 descreve as vias biossintéticas de 2-butanol e 2- butanona.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0037] A presente invenção é direcionada aos micro-organismos que produzem produtos da fermentação e otimizações para produzir produtos da fermentação, tal como o butanol em alta velocidade e título com condições de processo vantajosamente econômicas.

[0038] Durante a produção fermentativa de alcoóis, os micro- organismos podem ser submetidos a diversas condições de estresse, incluindo, por exemplo, a toxicidade do álcool, estresse oxidativo, estresse osmótico, e flutuações do pH, temperatura, e disponibilidade de nutrientes. O impacto destas condições de estresse pode causar uma inibição do crescimento celular e diminuição da viabilidade celular, que em última instância pode levar a uma redução na produtividade da fermentação e no rendimento do produto. À capacidade de se adaptar a essas condições de estresse, ajustando os processos metabólicos do micro-organismo é vantajosa para manter a produção eficiente de álcool. Por exemplo, quando exposto a um agente estressor específico, um micro-organismo pode responder a essas condições de estresse, modificando certos processos metabólicos, como o crescimento, transdução de sinal, transcrição e/ou atividades de pós-traducionais.

[0039] Em leveduras, a via de transdução de sinal adenosina 3' - 5' -monofosfato cíclico (CAMP) é um regulador chave do crescimento e proliferação celular, resposta à disponibilidade de nutrientes, progressão do ciclo celular, metabolismo e morfogênese, defesa celular, respostas ao estresse. Sob condições normais, os agonistas, tal como a adenilato ciclase ativada por glicose através das vias de receptores acoplados à proteína G que conduz ao aumento dos níveis de CAMP, que por sua vez, ativa a proteína quinase A (PKA) (ou seja, o CAMP se liga as subunidades reguladoras da PKA) e, finalmente, resulta na inibição de respostas ao estresse mediada, por exemplo, por Msn2p/Msn4p e Yap1p. Sob condições de estresse, os níveis de CAMP são regulados negativamente por meio das vias Ras/cAMP e estes baixos níveis de CAMP levam a uma liberação da inibição de respostas ao estresse. Por isso, o controle dos níveis de cAMP é importante para a tolerância ao estresse celular em leveduras.

[0040] A via Ras/cAMP está envolvida em uma série de respostas ao estresse e, portanto, é um dos principais determinantes da resistência ao estresse nas leveduras. Como um exemplo, a via Ras/cAMP está envolvida na regulação da resposta celular ao estresse osmótico, estresse hiperosmótico, e congelamento e descongelamento (Park, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 327: 311-319, 2005).

[0041] Os níveis de CAMP são regulados por sua síntese através da atividade da adenilato ciclase e a sua degradação é regulada pela hidrólise por fosfodiesterases nucleotídicas cíclicas (PDE). Duas fosfodiesterases, PDE1 e PDE2, foram identificadas em Saccharomyces cerevisiae (Nikawa et al. Mol. Cell. Biol. 7 (10): 3629-3636, 1987). A PDE1 é uma fosfodiesterase de baixa afinidade para CAMP e PDE2 é uma fosfodiesterase de alta afinidade para CAMP. Foi demonstrado que a PDE1 tem um papel na diminuição da regulação da sinalização do cAMP induzida por agonista (por exemplo, condições de adaptação, transitórias) pela hidrolização do CAMP que resulta na inibição da atividade de PKA. A atividade de PDE1 é regulada pela fosforilação mediada por PKA, isto é, a fosforilação de PDE1 pela PKA que conduz a um aumento na atividade da fosfodiesterase (Ma et al. Mol. Biol. Cell 10: 91-104, 1999). Assim, a modulação dos níveis de cAMP e atividade PKA pelo inter-rompimento de PDE1 pode ser um meio eficiente para controlar a tolerância ao estresse em leveduras.

[0042] Com o interesse renovado em biocombustíveis sustentáveis como fonte de energia alternativa e o desejo para o desenvolvimento de métodos de produção mais eficientes e ecológicos, a produção de álcool por meio de processos de fermentação é uma opção viável para os processos de síntese atuais. No entanto, alguns micro-organismos que produzem álcool (por exemplo, etanol, butanol) em certos rendimentos também têm limites de baixa toxicidade ao álcool. Assim, o desenvolvimento de processos de fermentação para a produção comercial de alcoóis tem sido limitado pela toxicidade ao álcool. Conforme descrito acima, a toxicidade do álcool pode produzir uma resposta de estresse ao micro-organismo levando, por exemplo, a uma inibição do crescimento celular e diminuição da viabilidade celular.

[0043] A presente invenção é direcionada aos micro-organismos que exibem melhora da viabilidade celular e/ou aumento da tolerância ao álcool. Em alguns exemplos de realização, os micro-organismos podem ser modificados para exibir melhora da viabilidade celular e/ou aumento da tolerância ao álcool por meio de uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de um ou mais componentes da via de transdução de sinal CAMP. Em alguns exemplos de realização, o um ou mais componentes da via de transdução de sinal CAMP pode ser uma fosfodiesterase. Em alguns exemplos de realização, a fosfodiesterase pode ser PDE1.

[0044] Em alguns exemplos de realização, a uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade pode ser uma eliminação ou redução da expressão de um ou mais genes endógenos codificantes de um ou mais componentes da via de transdução de sinal CAMP. Em alguns exemplos de realização, a modificação que altera a expressão e/ou atividade pode ser uma eliminação ou redução da expressão de um gene endógeno que codifica uma fosfodiesterase. Em alguns exemplos de realização, a modificação que altera a expressão e/ou atividade pode ser uma eliminação ou redução da expressão de um gene endógeno que codifica uma PDE1.

[0045] Em alguns exemplos de realização, um micro-organismo pode compreender uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de um ou mais componentes da via de transdução de sinal CAMP. Em alguns exemplos de realização, um micro-organismo pode compreender uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de uma ou mais fosfodiesterases. Em alguns exemplos de realização, um micro-organismo pode compreender uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de PDE1.

[0046] Em alguns exemplos de realização, um micro-organismo pode compreender uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a expressão de um ou mais genes endógenos codificantes de um ou mais componentes da via de transdução de sinal CAMP. Em alguns exemplos de realização, um micro-organismo pode compreender uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a expressão de um gene endógeno que codifica uma fosfodiesterase. Em alguns exemplos de realização, um micro-organismo pode compreender uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a expressão de um gene endógeno que codifica a PDE1. Em alguns exemplos de realização, um micro-organismo pode compreender uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a atividade da fosfodiesterase. Em alguns exemplos de realização, um micro-organismo pode compreender uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a atividade da PDE1.

[0047] Em alguns exemplos de realização, um micro-organismo pode compreender uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de um ou mais componentes da via de transdução de sinal CAMP e uma via biossintética de butanol. Em alguns exemplos de realização, um micro- organismo pode compreender uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de uma ou mais fosfodiesterases e uma via biossintética de butanol. Em alguns exemplos de realização, um micro- organismo pode compreender uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de PDE1 e uma via biossintética de butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética de butanol pode ser via biossintética de 1-butanol, via biossintética de 2-butanol, via biossintética de 2- butanona, ou via biossintética de isobutanol.

[0048] Em alguns exemplos de realização, um micro-organismo pode compreender uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a expressão de um ou mais genes endógenos codificantes de um ou mais componentes da via de transdução de sinal CAMP e uma via biossintética de butanol. Em alguns exemplos de realização, um micro-organismo pode compreender uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a expressão de um gene endógeno que codifica uma fosfodiesterase uma via biossintética de butanol. Em alguns exemplos de realização, um micro- organismo pode compreender uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a expressão de um gene endógeno que codifica uma PDE1 e uma via biossintética de butanol. Em alguns exemplos de realização, um micro-

organismo pode compreender uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a atividade da fosfodiesterase e uma via biossintética de butanol. Em alguns exemplos de realização, um micro-organismo pode compreender uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a atividade da PDE1 e uma via biossintética de butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética de butanol pode ser via biossintética de 1-butanol, via biossintética de 2- butanol, via biossintética de 2-butanona, ou via biossintética de isobutanol.

[0049] A presente invenção é direcionada às composições compreendendo um micro-organismo aqui fornecido. Por exemplo, em alguns exemplos de realização, uma composição pode compreender um micro- organismo compreendendo uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de um ou mais componentes da via de transdução de sinal cAMP. Em alguns exemplos de realização, uma composição pode compreender um micro-organismo compreendendo uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de uma ou mais fosfodiesterases. Em alguns exemplos de realização, uma composição pode compreender um micro- organismo compreendendo uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de PDE1.

[0050] Em alguns exemplos de realização, uma composição pode compreender um micro-organismo compreendendo uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de um ou mais componentes da via de transdução de sinal cAMP e uma via biossintética de butanol. Em alguns exemplos de realização, uma composição pode compreender um micro- organismo compreendendo uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de uma ou mais fosfodiesterases e uma via biossintética de butanol. Em alguns exemplos de realização, uma composição pode compreender um micro-organismo compreendendo uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade da PDE1 e uma via biossintética de butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética de butanol pode ser via biossintética de 1-butanol, via biossintética de 2- butanol, via biossintética de 2-butanona, ou via biossintética de isobutanol.

[0051] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo exibe produção de álcool aumentada, em comparação com a célula parental. Em alguns exemplos de realização, a produção de álcool pode ser determinada pela medição, por exemplo: titulação do caldo (gramas de álcool produzido por litro de caldo), rendimento de álcool (gramas de álcool produzido por grama de substrato consumido), produtividade volumétrica (gramas de álcool produzido por litro por hora), produtividade específica (gramas de álcool produzido por gramas de biomassa celular recombinante por hora), ou combinações dos mesmos.

[0052] A presente invenção também é direcionada aos métodos para o aprimoramento e/ou manutenção do crescimento de células e da viabilidade celular em um micro-organismo em uma fermentação de álcool. Em alguns exemplos de realização, o método compreende a obtenção de um micro-organismo (por exemplo, uma célula parental) e a introdução de uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de um ou mais componentes da via de transdução de sinal CAMP. Em alguns exemplos de realização, o método compreende a obtenção de um micro-organismo e a introdução de uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a expressão de um ou mais genes endógenos codificantes de um ou mais componentes da via de transdução de sinal CAMP. Em alguns exemplos de realização, o método compreende a obtenção de um micro-organismo e a introdução de uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a expressão de um ou mais genes endógenos codificantes de uma fosfodiesterase. Em alguns exemplos de realização, o método compreende a obtenção de um micro-organismo e a introdução de uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a expressão de um gene endógeno codificante de PDE1. Em alguns exemplos de realização, o método compreende a obtenção de um micro-organismo e a introdução de uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a atividade de uma fosfodiesterase. Em alguns exemplos de realização, o método compreende a obtenção de um micro-organismo e a introdução de uma ou mais modificações que eliminam ou reduzem a atividade de PDE1.

[0053] A presente invenção é também direcionada aos métodos de produção de um álcool por um processo de fermentação. Em alguns exemplos de realização, o método compreende o cultivo de um micro- organismo fornecido na presente invenção sob condições em que o álcool é produzido e a recuperação do álcool. Em alguns exemplos de realização, o álcool pode ser butanol. Em alguns exemplos de realização, o álcool pode ser 1-butanol, 2-butanol, 2-butanona, isobutanol ou terc-butanol.

[0054] A contaminação microbiana pode ser problemática durante o processo de fermentação. Por exemplo, as bactérias podem ser introduzidas ao processo de fermentação através da matéria-prima. Como as bactérias tendem a se dividir mais rapidamente do que as leveduras, isto pode levar a níveis significativos de contaminação microbiana. Além disso, a reciclagem de células pode ser utilizada para melhorar a eficiência dos processos de fermentação. Por exemplo, pela reintrodução da levedura ao recipiente de fermentação (ou fermentador), a concentração da levedura no recipiente de fermentação é continuamente mantida em um nível elevado, sem um desvio significativo dos açúcares para o crescimento celular e distante da produção do produto da fermentação desejado. Reciclagem de células pode ser utilizada para aumentar as taxas de conversão volumétricas. Aumentos na taxa de conversão volumétrica de açúcar fermentável para butanol podem ser conseguidos pela separação contínua da levedura a partir do caldo de fermentação coletado, por exemplo, por centrifugação, e em seguida, recirculando a levedura de volta ao fermentador. No entanto, como resultado de tal recirculação repetida da levedura, micróbios indesejados, tais como bactérias, pode também ser reciclados juntamente com a levedura. Estes contaminantes microbianos podem competir por nutrientes e uma depleção de nutrientes pode suprimir o crescimento de células de levedura. Além disso, os contaminantes microbianos pode inibir o metabolismo da levedura. Por exemplo, os micróbios podem produzir metabólitos que têm um impacto negativo sobre a viabilidade das células e podem resultar na diminuição da produção de produtos da fermentação.

[0055] O controle da contaminação microbiana em processos de fermentação pode ser realizado pela lavagem das suspensões de células com ácido. Um dos objetivos do tratamento com ácido é o de destruir micro- organismos contaminantes que não podem resistir a condições de pH baixo, sem uma redução substancial na viabilidade celular ou capacidade fermentativa. Entretanto, alterações nas condições de pH podem produzir uma resposta de estresse no micro-organismo levando a uma inibição do crescimento celular e diminuição da viabilidade celular. A presente invenção é direcionada aos micro-organismos com viabilidade celular melhorada na presença de condições de pH baixo, assim como métodos de produção de um álcool por processos de fermentação em que o método inclui as etapas de reciclagem dos micro-organismos e de lavagem ácida das suspensões de micro-organismos. Por exemplo, o método pode compreender o (a) fornecimento de um micro-organismo, (b) o contato do micro-organismo com um ou mais substratos de carbono sob condições nas quais um álcool é produzido; (C) a coleta do micro-organismo; (d) a recuperação do álcool; (E) o contato do micro-organismo coletado com um ou mais substratos de carbono, em condições nas quais o álcool é produzido; e (f) a exposição do micro-

organismo a condições de pH baixo. Em alguns exemplos de realização, as etapas (c) - (e) podem ser repetidas.

[0056] Um micro-organismo submetido ao tratamento com ácido e/ou reciclagem de células pode ter uma perda de viabilidade celular e produtividade. Para manter a viabilidade celular e a produtividade do micro- organismo, o micro-organismo pode ser rejuvenescido pela adição de um meio rico em nutrientes e incubação do micro-organismo no meio rico em nutrientes por um período de tempo. Após a fase de rejuvenescimento, o micro-organismo pode ser coletado, por exemplo, por centrifugação, e resuspenso em meio de produção fresco para a fermentação continuar.

[0057] A presente invenção é também direcionada aos métodos de rejuvenescimento de um micro-organismo para utilizaçção em uma fermentação de álcool. Apos a etapa de rejuvenescimento, o micro-organismo pode ser reciclado para o processo de fermentação. Em alguns exemplos de realização, o método compreende (a) o fornecimento de um micro-organismo, (b) o contato de micro-organismo com um ou mais substratos de carbono em condições nas quais um álcool é produzido; (c) a coleta do micro-organismo; (d) a recuperação do álcool; (e) o contato do micro-organismo com um meio rico em nutrientes; (f) a coleta do micro-organismo a partir da etapa (e); e (gq) o contato do micro-organismo com um ou mais substratos de carbono sob condições nas quais o álcool é produzido. Em alguns exemplos de realização, as etapas (c) - (gq) podem ser repetidas. Em alguns exemplos de realização, o primeiro contato com o substrato de carbono ocorre na presença de um agente de extração (extrator). Em alguns exemplos de realização, um agente de extração pode ser incluído, por exemplo, nas etapas (b) e (g).

[0058] Em alguns exemplos de realização, o método compreende (a) o fornecimento de um micro-organismo, (b) o contato do micro-organismo com um ou mais substratos de carbono, em condições nas quais um álcool é produzido; (c) a coleta do micro-organismo; (d) a exposição do micro- organismo coletado em condições de baixo pH; (e) a coleta do micro- organismo da etapa (d); (f) o contato do micro-organismo da etapa (e) com um meio rico em nutrientes; (g) a coleta do micro-organismo da etapa (f); e (hn) o contato do micro-organismo da etapa (g) com um ou mais substratos de carbono sob condições em que o álcool é produzido. Em alguns exemplos de realização, as etapas (c) - (h) podem ser repetidas. Em alguns exemplos de realização, o método compreende ainda a etapa de recuperação do álcool. Em alguns exemplos de realização, o primeiro contato com o substrato de carbono ocorre na presença de um agente de extração (extrator).

[0059] A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e científicos utilizados no presente têm o mesmo significado que é comumente compreendido por um técnico hábil no assunto ao qual esta invenção pertence. Em caso de conílito, os significados no presente pedido incluindo as definições prevalecerão. Além disso, a menos que de outra forma exigido pelo contexto, os termos no singular devem também incluir as formas no plural e os termos no plural devem incluir as formas no singular. Todas as publicações, patentes, e outras referências mencionadas na presente invenção são integralmente incorporadas ao presente pela referência para todos os fins.

[0060] De modo a definir melhor a presente invenção, os seguintes termos e definições são fornecidos.

[0061] Tal como utilizado na presente invenção, os termos “compreende”, “compreendendo”, “incluir, “incluindo”, “tem”, “possuindo”, “contém” ou “contendo”, ou qualquer outra variação dos mesmos, serão compreendidos implicitamente como a inclusão de um inteiro ou grupo de inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros. Por exemplo, uma composição, uma mistura, um processo, um método, um artigo ou um aparelho que compreende uma lista de elementos não está necessariamente limitado a apenas tais elementos, mas pode incluir outros elementos que não estejam expressamente enumerados ou inerentes a tal composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho. Além disso, a menos que indicado expressamente de outra forma, “ou” refere-se a “inclusivo ou”, e não a “exclusivo ou”. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfatória por qualquer um dos seguintes: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente), A é falso (ou não presente) e B é verdadeiro (ou presente), e ambos A e B são verdadeiros (ou presentes).

[0062] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “consiste de”, ou variações como “que consiste em”, “consistindo de”, tal como utilizado ao longo do relatório descritivo e reivindicações, indica a inclusão de qualquer inteiro ou grupo de inteiros citado, mas que não um inteiro ou grupo de inteiros adicional possa ser adicionado ao método, estrutura ou composição específico.

[0063] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “consiste essencialmente de”, ou variações como “que consiste essencialmente em”, “consistindo essencialmente de”, tal como utilizado ao longo do relatório descritivo e reivindicações, indica a inclusão de qualquer inteiro ou grupo de inteiros citado, a inclusão opcional de qualquer inteiro ou grupo de inteiros citado que não altere significativamente as propriedades básicas ou novas do método, estrutura ou composição especificado (vide, por exemplo, MPEP & 2111,03).

[0064] Além disso, o artigo indefinido “um(uns)” e “uma(s)" que precede um elemento ou componente da presente invenção destina-se a ser não restritivo com relação ao número de casos, ou seja, ocorrências do elemento ou componente. Portanto, “um(uns)' ou “uma(s) devem ser interpretados por incluir um ou pelo menos um, e a forma singular da palavra do elemento ou componente também inclui o plural, a menos que queiramos que o número obviamente esteja no singular.

[0065] O termo “invenção” ou “presente invenção”, conforme utilizado no presente não tem a intenção de se referir a qualquer exemplo de realização único específico invenção, mas abrange todos os exemplos de realização possíveis conforme descrito no presente pedido.

[0066] Como usado no presente, o termo “cerca de” altera a quantidade de um ingrediente ou reagente empregado na invenção, referindo- se a variação na quantidade numérica que pode ocorrer, por exemplo, através da medição típica e procedimentos de manuseio de líquido usado para fazer concentrados ou soluções de uso no mundo real, através de erro involuntário nesses processos; através de diferenças na produção, origem, ou grau de pureza dos ingredientes utilizados para fazer as composições ou realizar os métodos, e similares. O termo “cerca de” também abrange valores que diferem devido a diferentes condições de equilíbrio para uma composição resultante de uma mistura inicial específica. Seja ou não modificadas pelo termo “cerca de”, as reivindicações incluem equivalentes para as quantidades. Em um exemplo de realização, o termo “cerca de” significa até 10% do valor numérico descrito, preferencialmente, dentro de 5% do valor numérico descrito.

[0067] Em alguns casos, “biomassa”, conforme utilizado no presente refere-se a biomassa celular do micro-organismo produtor do produto da fermentação, tipicamente fornecida em unidades de g/L de peso seco de células (dcw).

[0068] A expressão “produto da fermentação” inclui qualquer produto desejado de interesse incluindo, mas não se limitando a, alcoóis (por exemplo, alcoóis de alquila inferior), tais como etanol e butanol, ácido lático, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacônico, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, isobutirato, etc.

[0069] O termo “álcool” refere-se a qualquer tipo de álcool que possa ser produzido por um micro-organismo em um processo de fermentação. O álcool inclui qualguer molécula de álcool de cadeia linear ou ramiíficada, saturado ou insaturado, com 1 a 10 átomos de carbono (por exemplo, alcoóis alquílicos inferiores). Por exemplo, o álcool inclui metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol e hexanol.

[0070] O termo “butanol” refere-se a 1-butanol, 2-butanol, 2- butanona, isobutanol, terc-butanol ou misturas dos mesmos. O isobutanol também é conhecido como 2-metil-1- propanol.

[0071] O termo “via biossintética do butanol” conforme utilizado no presente refere-se a uma via enzimática para a produção de 1-butanol, 2- butanol, 2-butanona ou isobutanol. Por exemplo, vias biossintéticas de isobutanol são reveladas na Publicação do Pedido de Patente US 2007/0092957, que é incorporada ao presente pela referência.

[0072] O termo “via biossintética do isobutanol” refere-se à via enzimática para a produção de isobutanol. De tempos em tempos o termo “via biossintética do isobutanol” é usado como sinônimo de “via de produção do isobutanol”.

[0073] O termo “via biossintética do 1-butanol” conforme utilizado no presente, refere-se a uma via enzimática para produzir 1-butanol.

[0074] O termo “via biossintética do 2-butanol” conforme utilizado no presente, refere-se a uma via enzimática para produzir 2-butanol.

[0075] O termo “via biossintética de 2-butanona” conforme utilizado no presente, refere-se a uma via enzimática para produzir 2-butanona.

[0076]O termo “extratante/extratorr conforme utilizado no presente refere-se a um ou mais solventes que podem ser utilizados para extrair um álcool a partir de um caldo de fermentação. Em alguns exemplos de realização, o solvente pode ser um solvente orgânico.

[0077] Uma “célula hospedeira recombinante” é definida como uma célula hospedeira que foi geneticamente manipulada para expressar uma via de produção biossintética, em que a célula hospedeira produz um produto biossintético em quantidades maiores em relação a uma célula hospedeira não modificada ou produz um produto biossintético que não é normalmente produzido por uma célula hospedeira não modificada. O termo “célula hospedeira microbiana recombinante” pode ser utilizado alternadamente com o termo “célula hospedeira recombinante”.

[0078] O termo “substrato de carbono fermentável” refere-se a uma fonte de carbono capaz de ser metabolizada pelos micro-organismos divulgados na presente invenção. Fontes de carbono fermentáveis adequadas incluem, mas não estão limitadas a, monossacarídeos, como a glicose ou frutose; dissacarídeos, como a lactose ou sacarose; oligossacarídeos; polissacarídeos como o amido, celulose, lignocelulose ou hemicelulose; substratos de um carbono; ácidos graxos ou uma combinação dos mesmos.

[0079] O termo “Ifosfodiesterase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos), possuindo uma atividade enzimática que catalisa a hidrólise de uma ligação fosfodiéster. Por exemplo, fosfodiesterases hidrolisam os nucleotídeos cíclicos, Adenosina 3',5-Monofosfato Cíclico - (CAMP) e Guanosina 3'-5' Monofosfato Cíclico (CGMP). As enzimas são conhecidas como EC 3.1.4.17 e estão disponíveis, por exemplo, a partir da Saccharomyces cerevisiae (GenBank Nº: CAA64139, CAA96968), Saccharomyces paradoxus (GenBank ID AABYO01000014), Saccharomyces mikatae (AABZ01000018, AACHO1000636), Saccharomyces kurdriavzevii (AACI02000304), Saccharomyces bayanus (AACAO01000014), Vanderwaltozyma polyspora (XMO001642700, AAXNO1000222, NZ AAZNO1000222), Zygosaccharomyces rouxii (NC012994).

[0080] O termo “meio de fermentação”, conforme utilizado no presente significa uma mistura de qualquer um dos seguintes: água, açúcares

(substratos de carbono fermentável), sólidos dissolvidos, sólidos em suspensão, micro-organismos que produzem produtos da fermentação, produtos da fermentação, e todos os outros constituintes do material mantido no tanque de fermentação no qual o produto da fermentação está sendo feito pela reação dos substratos de carbono fermentáveis em produtos da fermentação, água e dióxido de carbono (CO) pelos micro-organismos presentes. De vez em quando, conforme utilizado no presente, os termos “caldo de fermentação” e “mistura de fermentação” podem ser usados como sinônimos de “meio de fermentação”.

[0081] O termo “condições aeróbias”, conforme usado na presente invenção, significa condições de crescimento na presença de oxigênio.

[0082] O termo “condições microaeróbicas”, conforme usado na presente invenção, significa condições de crescimento com baixos níveis de oxigênio dissolvido. Por exemplo, o nível de oxigênio pode ser inferior a cerca de 1% da saturação do ar.

[0083] O termo “condições anaeróbias”, conforme usado na presente invenção, significa condições de crescimento na ausência de oxigênio. Deve-se entender que, em muitos processos de fermentação, uma quantidade inicial de oxigênio está presente no início do processo, mas tal oxigênio é esgotado ao longo da fermentação de tal forma que a maior parte do processo é realizado na ausência de oxigênio detectável .

[0084] O termo “substrato de carbono” refere-se a uma fonte de carbono capaz de ser metabolizada pelos micro-organismos divulgados no presente. Exemplos não limitantes de fontes de carbono são fornecidos no presente e incluem, mas não estão limitados a, monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, etanol, lactato, succinato, glicerol, dióxido de carbono, metanol, glicose, frutose, sacarose, xilose, arabinose, dextrose e misturas dos mesmos.

[0085] Os termos “butanologênicor e “isobutanologênico” conforme utilizado no presente referem-se a um micro-organismo capaz de produzir butanol! ou isobutanol, respectivamente.

[0086]O termo “isobutanologênico utilizador de sacarose” conforme utilizado no presente refere-se a um micro-organismo capaz de produzir isobutanol a partir da sacarose. Tais micro-organismos são tipicamente micro-organismos recombinantes que compreendem uma via biossintética do isobutano! modificada.

[0087] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “rendimento” refere-se à quantidade de produto pela quantidade de fonte de carbono em g/g. O rendimento pode ser exemplificado para a glicose como fonte de carbono. Entende-se, a menos que indicado de outra forma, que o rendimento é expresso como uma percentagem do rendimento teórico. Em referência a um micro-organismo ou via metabólica, o “rendimento teórico” é definido como a quantidade máxima de produto que pode ser gerada pela quantidade total de substrato tal como ditado pela estequiometria da via metabólica usada para produzir o produto. Por exemplo, o rendimento teórico para uma conversão típica de glicose em isopropanol é de 0,33 9g/g. Dessa forma, um rendimento de isopropanol a partir da glicose de 29,7 g/g será expresso como 90% do teórico ou > 90% do rendimento teórico. Entende-se que embora na presente descrição o rendimento seja exemplificado para a glicose como fonte de carbono, a invenção pode ser aplicada a outras fontes de carbono e o rendimento pode variar dependendo da fonte de carbono utilizada. Um técnico do assunto pode calcular o rendimento em diferentes fontes de carbono.

[0088] O termo “título efetivo” conforme utilizado na presente invenção, refere-se à quantidade total de álcool produzida pela fermentação por litro de meio de fermentação. A quantidade total de álcool inclui: (1) a quantidade de álcool no meio de fermentação; (ii) a quantidade de álcool recuperado a partir do extrator orgânico; e (ii) a quantidade de álcool recuperado a partir da fase gasosa, se a dessorção gasosa é utilizada.

[0089] O termo “taxa efetiva” conforme utilizado na presente invenção, refere-se à quantidade total de álcool produzido pela fermentação por litro de meio de fermentação por hora de fermentação.

[0090] O termo “rendimento efetivo” conforme utilizado no presente, refere-se à quantidade de álcool produzida por unidade de substrato de carbono fermentável consumida pelo micro-organismo descrito na presente invenção.

[0091] O termo “produtividade específica”, conforme utilizado no presente, refere-se à quantidade (g) de álcool produzida por g de peso celular seco de células por unidade de tempo.

[0092] Os termos “derivado” e “análogo” referem-se a um polipeptídeo diferente das enzimas da presente invenção, mas conservando as propriedades essenciais destas. O termo “derivado” pode referir-se a uma célula hospedeira diferente das células hospedeiras da presente invenção, mas mantendo as propriedades essenciais destas. Em geral, derivados e análogos são muito semelhantes, e em muitas regiões, idênticas às enzimas da invenção. Os termos - “derivado a partir de”, “derivado” e “análogo” - quando referindo-se às enzimas da invenção incluem quaisquer polipeptídeos que retêm pelo menos uma parte da atividade do polipeptídeo nativo correspondente ou a atividade de seu domínio catalítico.

[0093] Os derivados de enzimas divulgados na presente invenção são polipeptídeos que foram alterados de modo a exibir características não encontradas no polipeptídeo nativo. Os derivados podem ser covalentemente modificados pela substituição (por exemplo, substituição de um aminoácido), quimicamente, enzimaticamente, ou por outros meios apropriados, com uma porção diferente de um aminoácido que ocorre naturalmente (por exemplo, uma porção detectável tal como uma enzima ou radioisótopo). Exemplos de derivados incluem proteínas de fusão, ou proteínas que são baseadas na sequência de uma proteína que ocorre naturalmente, mas que foram alteradas. Por exemplo, as proteínas podem ser desenvolvidas pelo conhecimento de uma sequência de aminoácidos específica, e/ou uma estrutura secundária, terciária e/ou quaternária específica. Os derivados incluem proteínas que são modificadas com base no conhecimento de uma sequência anterior, natural ou sintética, a qual é, em seguida, opcionalmente modificada, frequentemente, mas não necessariamente, para conferir uma função melhorada. Estas sequências, ou proteínas, são então ditas com sendo derivadas a partir de uma determinada sequência de proteína ou aminoácidos. Em alguns exemplos de realização da invenção, um derivado pode reter pelo menos cerca de 50% de identidade, pelo menos cerca de 60% de identidade, pelo menos cerca de 70% de identidade, pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 90% de identidade, pelo menos cerca de 95 % de identidade, pelo menos cerca de 97% de identidade, ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a sequência da qual é “derivada”. Em alguns exemplos de realização da invenção, uma enzima é dita como sendo derivada a partir de uma enzima encontrada naturalmente em uma espécie particular se, utilizando técnicas de genética molecular, a sequência de DNA para uma parte ou a totalidade da enzima é amplificada e colocada em uma nova célula hospedeira.

POLIPEPTÍDEOS E POLINUCLEOTÍDEOS

[0094] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “polipeptídeo” pretende abranger um único “polipeptídeo”, bem como vários “polipeptídeos”, e refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações amida (também conhecido como ligações peptídicas). O termo “polipeptídeo” refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não faz referencia a um comprimento específico do produto. Desse modo, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos e oligopeptídeos, “proteínas”, “cadeia de aminoácidos”, ou qualquer outro termo utilizado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos estão incluídos dentro da definição de “polipeptídeo”, e o termo “polipeptídeo” pode ser utilizado no lugar de, ou de forma alternada com, qualquer um destes termos. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou pode ser produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácido nucleico designada. Ele pode ser gerado de qualquer modo, incluindo pela síntese química. Os polipeptídeos utilizados nesta invenção compreendem polipeptídeos de comprimento total e fragmentos dos mesmos.

[0095] Tal como utilizado no presente, “atividade reduzida” ou “expressão reduzida” refere-se a qualquer diminuição mensurável em uma atividade biológica conhecida ou expressão de um polipeptídeo, quando comparada com a mesma atividade biológica ou expressão do polipeptídeo antes da alteração resultante na atividade ou expressão reduzida. Uma mudança pode incluir uma modificação de um polipeptíideo ou um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tal como descritos na presente invenção. A atividade ou expressão reduzida de um polipeptídeo descrito no presente pode ser determinada por métodos bem conhecidos no estado da técnica e aqui descritos.

[0096] Tal como utilizado no presente, “atividade eliminada” ou “expressão eliminada” refere-se a qualquer diminuição mensurável em uma atividade biológica conhecida ou expressão de um polipeptídeo, quando comparada com a mesma atividade biológica ou expressão do polipeptídeo antes da alteração resultante na atividade ou expressão eliminada. Uma mudança pode incluir uma modificação de um polipeptíideo ou um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tal como descritos na presente invenção. A atividade ou expressão eliminada inclui a atividade biológica ou a expressão de um polipeptídeo que não é mensurável quando comparada com a mesma atividade biológica ou expressão do polipeptídeo antes da alteração resultante na atividade ou expressão eliminada. A atividade ou expressão eliminada de um polipeptídeo descrito no presente pode ser determinada por métodos bem conhecidos no estado da técnica e aqui descritos.

[0097] Tal como utilizado no presente, “atividade aumentada” ou “expressão aumentada” refere-se a qualquer aumento mensurável em uma atividade biológica conhecida ou expressão de um polipeptídeo, quando comparada com a mesma atividade biológica ou expressão do polipeptídeo antes da alteração resultante na atividade ou expressão aumentada. Uma mudança pode incluir uma modificação de um polipeptíideo ou um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tal como descritos na presente invenção. A atividade ou expressão aumentada de um polipeptídeo descrito no presente pode ser determinada por métodos bem conhecidos no estado da técnica e aqui descritos.

[0098] Por um polipeptídeo “isolado” ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo, entende-se um polipeptídeo que não está em seu meio natural. Nenhum nível especifico de purificação é necessário. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido do seu ambiente nativo ou natural. Os polipeptídeos produzidos de forma recombinante e proteínas expressas em células hospedeiras são considerados isolados para os propósitos da invenção, assim como os polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados, ou parcial ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.

[0099] Um polipeptídeo da invenção pode ser de um tamanho de cerca de 10; 20; 25; 50; 75; 100; 200; 500; 1000; 2000; ou mais aminoácidos.

Os polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora eles não tenham, necessariamente, tal estrutura. Os polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como enovelados, e os polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas que ao invés disso podem adotar um grande número de diferentes conformações são referidos como não enovelados.

[00100] Também incluídos como polipeptídeos da presente invenção são os derivados, análogos, ou variantes dos polipeptídeos mencionados acima, e qualquer combinação dos mesmos. Os termos “variante ativo”, “fragmento ativo”, “derivado ativo” e “análogo” referem-se aos polipeptídeos da presente invenção. As formas variantes de polipeptídeos da presente invenção incluem polipeptídeos com as sequências de aminoácidos alteradas devido a substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos. Os variantes podem ocorrer naturalmente ou pode ser de ocorrência não natural. Variantes de ocorrência não natural podem ser produzidos usando técnicas de mutagênese conhecidas no estado da técnica. Os polipeptídeos variantes podem compreender substituições, deleções e/ou adições de aminoácidos conservadoras ou não conservadoras. Os derivados de polipeptídeos da presente invenção podem ser polipeptídeos que foram alterados de modo a exibir características adicionais que não são encontradas no polipeptídeo nativo. Como exemplos temos as proteínas de fusão. Polipeptídeos variantes também podem ser referidos na presente invenção como “análogos polipeptídicos”. Conforme utilizado na presente invenção, um “derivado” de um polipeptídeo refere-se a um polipeptídeo objeto da invenção que possui um ou mais resíduos derivatizados quimicamente pela reação de um grupo lateral funcional. Também estão incluídos como “derivados” aqueles peptídeos que contêm um ou mais derivados de aminoácidos de ocorrência natural dentre os vinte aminoácidos. Por exemplo, 4-hidroxiprolina pode ser substituída por prolina; 5-hidroxilisina pode ser substituída por lisina; 3-metilhistidina pode ser substituída por histidina; homoserina pode ser substituída por serina; e ornitina pode ser substituída por lisina.

[00101] Um “fragmento” é uma porção única de um polipeptídeo ou outra enzima utilizada na invenção que é idêntica na sequência, porém mais curta no comprimento do que a sequência parental de comprimento total. Um fragmento pode compreender até todo o comprimento da sequência definida, menos um resíduo de aminoácido. Por exemplo, um fragmento pode compreender cerca de 5 a cerca de 1000 resíduos de aminoácidos contíguos. Um fragmento pode ser de pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 150, pelo menos 250, ou pelo menos 500 resíduos de aminoácidos contíguos de comprimento. Os fragmentos podem ser preferencialmente selecionados a partir de determinadas regiões de uma molécula. Por exemplo, um fragmento de polipeptideco pode compreender um determinado comprimento de aminoácidos contíguos selecionados a partir dos primeiros 100 ou 200 aminoácidos de um polipeptídeo conforme mostrado em uma determinada sequência definida. Claramente estes comprimentos são exemplares, e qualquer comprimento que seja respaldado pelo relatório descritivo, incluindo a Listagem de Sequências, Tabelas e Figuras, pode ser abrangido pelos presentes exemplos de realização.

[00102] Alternativamente, os variantes recombinantes que codificam esses polipeptídeos idênticos ou semelhantes podem ser sintetizados ou selecionados, fazendo uso da “redundância” no código genético. Diversas substituições de códons, tais como as alterações silenciosas que produzem vários sítios de restrição, podem ser introduzidas para otimizar a clonagem em um plasmídeo ou vetor viral ou expressão em um sistema de célula hospedeira.

[00103] “Substituições” de aminoácidos podem ser resultantes da substituição de um aminoácido por outro aminoácido que possui propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes, ou seja, substituições conservadoras de aminoácidos, ou podem ser resultantes da substituição de um aminoácido por um aminoácido que possui propriedades estruturais e/ou químicas diferentes, ou seja, substituições não conservadoras de aminoácidos. As substituições “conservadoras” de aminoácidos podem ser feitas com base na similaridade da polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, apolares (hidrofóbicos) incluem os aminoácidos alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; aminoácidos de polaridade neutra incluem a glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina, histidina e; os aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem o ácido aspártico e ácido glutâmico. Alternativamente, as substituições “não conservadoras” de aminoácidos podem ser realizadas selecionando diferenças na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, natureza anfipática ou de qualquer um destes aminoácidos. As “inserções” ou “deleções” podem estar na faixa de cerca de | a cerca de 20 aminoácidos, mais preferencialmente de cerca de 1 a cerca de 10 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada experimentalmente fazendo sistematicamente inserções, deleções ou substituições de aminoácidos em uma molécula de polipeptídeo usando técnicas de DNA recombinante e avaliando as variantes recombinantes resultantes pela atividade.

[0100] Conforme utilizado no presente o termo “variante” (com relação a um polipeptídeo) refere-se a um polipeptídeo diferente de um polipeptídeo especificamente recitado na invenção por inserções, deleções,

mutações, e substituições de aminoácidos, criado utilizando, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, tal como a mutagênese. A orientação para a determinação dos resíduos de aminoácido que podem ser substituídos, adicionados ou deletados sem abolir a atividade de interesse pode ser encontrada pela comparação da sequência do polipeptídeo em questão com a de polipeptídeos homólogos, por exemplo, de levedura ou bacteriana, minimizando o número de alterações na sequência de aminoácidos realizadas em regiões de alta homologia (regiões conservadas) ou pela substituição de aminoácidos com as sequências de consenso.

[0101] Um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácido, ou polipeptídeo que é pelo menos, por exemplo, 95% “idêntica” a uma sequência de aminoácido de consulta da presente invenção significa que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo objeto da invenção é idêntica à sequência de consulta (referência) exceto pelo fato de que a sequência de polipeptídeo objeto da invenção pode incluir até cinco alterações de aminoácidos para cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácido de consulta. Em outras palavras, para se obter um polipeptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácido de consulta, até 5% dos resíduos de aminoácidos na sequência objeto da invenção podem ser inseridos, deletados ou substituídos por um outros aminoácidos. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições amino- ou carboxi-terminal da sequência de aminoácido de referência ou em qualquer lugar entre essas posições terminais, intercaladas seja individualmente entre resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

[0102] Por uma questão prática, se qualquer polipeptídeo específico é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico a um polipeptídeo de referência isso pode ser determinado convencionalmente utilizando programas de computador conhecidos. Um método preferido para determinar a melhor correspondência global entre uma sequência de consulta (por exemplo, uma sequência da presente invenção) e uma sequência objeto, também referido como alinhamento da sequência global, pode ser determinado utilizando o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo de Brutlag et al., Comp. Appl. Biosci. 6:237-245 (1990). Em um alinhamento de sequências as sequências de consulta e objeto da invenção são sequências de nucleotídeos ou sequências de aminoácidos. O resultado do alinhamento de sequência global está em percentagem de identidade. Os parâmetros preferidos usados em um alinhamento de aminoácido com o FASTDB são: Matriz=PAM 0, k-tuple=2, penalidade por pareamento incorreto (substituição) (Mismatch Penalty)=1, penalidade por junção (Joining Penalty)=20, comprimento de grupo de randomização (Randomization Group Length)=0, Cutoff Score=1, Tamanho da Janela Window Size=tamanho da sequência (sequence length), penalidade por lacuna (Gap Penalty)=5, penalidade por tamanho de lacuna (Gap Size Penalty)=0,05, Tamanho da Janela (Window Size)=500 ou o comprimento da sequência de aminoácido objeto da invenção, o que for mais curto.

[0103] Se a sequência objeto da invenção é mais curta do que a sequência de consulta devido a deleções N- ou C-terminais, e não devido a deleções internas, uma correção manual deve ser feita aos resultados. Isto é porque o programa FASTDB não leva em conta truncamentos N- e C-terminais da sequência objeto ao calcular a percentagem de identidade global. Para sequências objeto da invenção truncadas nas extremidades N- e C-terminais, em relação à sequência de consulta, a percentagem de identidade é corrigida pelo cálculo do número de resíduos da sequência de consulta que são N- e C- terminais da sequência objeto da invenção, que não estão pareadas/alinhadas com um resíduo da sequencia objeto correspondente, como uma percentagem do total de bases da sequência de consulta. Se um resíduo está pareado corretamente/alinhado, isto é determinado pelos resultados do alinhamento de sequências FASTDB. Esta percentagem é então subtraída da percentagem de identidade, calculado pelo programa FASTDB acima utilizando os parâmetros especificados para se chegar a uma pontuação final da percentagem de identidade. Esta pontuação de percentagem de identidade final é a que é utilizada para os propósitos da presente invenção. Apenas os resíduos das extremidades N- e C-terminais da sequência objeto da invenção que não estão pareados corretamente/alihhados com a sequência de consulta são considerados a fim de ajustar manualmente a pontuação de percentagem de identidade. Isto é, apenas as posições nos resíduos de consulta que estão fora dos resíduos N- e C-terminais mais distantes da sequência objeto da invenção.

[0104] Por exemplo, uma sequência objeto da invenção de 90 resíduos de aminoácido é alinhada com uma sequência de consulta de 100 resíduos para determinar a percentagem de identidade. A deleção ocorre no N- terminal da sequência objeto da invenção e, portanto, o alinhamento FASTDB não mostra um pareamento correto/alinhamento dos primeiros 10 resíduos no N-terminal. Os 10 resíduos não pareados representam 10% da sequência (número de resíduos na extremidade N- e C-terminal que não estão pareados corretamente/número total de resíduos na sequência de consulta), assim > 10% é subtraído da pontuação de percentagem de identidade calculada pelo programa FASTDB. Se os 90 resíduos restantes foram perfeitamente alinhados a percentagem de identidade final seria de 90%. Em outro exemplo, uma sequência objeto da invenção de 90 resíduos é comparada com uma sequência de consulta de 100 resíduos. Desta vez as deleções são deleções internas, de modo que não há resíduos na extremidade N- ou C-terminal da sequência objeto da invenção que não estão pareados corretamente/alinhados em relação a sequência de consulta. Neste caso, a percentagem de identidade calculada pelo FASTDB não é corrigida manualmente. Mais uma vez, apenas as posições de resíduos fora das extremidades N- e C-terminais da sequência objeto da invenção, conforme mostrado no alinhamento FASTDB, que não estão pareadas corretamente/alinhadas com a sequência de consulta são corrigidas manualmente. Nenhuma outra correção manual deve ser feita para os propósitos da presente invenção.

[0105] Polipeptídeos e outras enzimas adequadas para o uso na presente invenção e os fragmentos destas são codificados por polinucleotídeos. O termo “polinucleotídeo” pretende abranger um único ácido nucleico bem como diversos ácidos nucleicos, e refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada ou construída, por exemplo, RNA mensageiro (mMRNA), RNA viralmente derivado ou DNA plasmidial (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação amida, tal como encontrada em ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). Um polinucleotídeo pode incluir a sequência de nucleotídeos da sequência de cDNA de comprimento total, ou um fragmento desta, incluindo as sequências 5' e 3' não traduzidas e as sequências codificantes. O polinucleotídeo pode ser constituído por polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, os polinucleotídeos podem ser compostos de DNA de fita simples ou DNA de fita dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita simples e fita dupla, RNA de fita dupla e RNA que é uma mistura de regiões com RNA fita simples e RNA fita dupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem ser de fita simples ou, mais tipicamente, de fita dupla ou uma mistura de regiões de de fita simples e fita dupla. “Polinucleotídeo” abrange formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas.

[0106] O termo “ácido nucleico” refere-se a qualquer um dentre um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA presentes em um polinucleotídeo. Os polinucleotídeos de acordo com a presente invenção incluem ainda tais moléculas produzidas sinteticamente. Os polinucleotídeos da invenção podem ser nativos para a célula hospedeira ou podem ser heterólogos. Além disso, um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador, tal como um promotor, local de ligação ao ribossomo, ou um terminador da transcrição.

[0107]EM determinados exemplos de realização, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. No caso de DNA, um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução operacionalmente ligados a um ou mais regiões codificantes. Uma associação operável é quando uma região codificante de um produto gênico, por exemplo, um polipeptídeo, está associada com uma ou mais sequências reguladoras, de tal modo esta associação coloca a expressão do produto gênico sob a influência ou controle da(s) sequência(s) reguladora(s) Dois fragmentos de DNA (tal como uma região codificadora do polipeptídeo e um promotor associado a esta) estão “operacionalmente associados” se a indução da função do promotor resulta na transcrição de MRNA que codifica o produto gênico desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere com a capacidade das sequências reguladoras direcionar a expressão do produto gênico, ou não interfere com a capacidade do DNA molde de ser transcrito. Assim, uma região promotora estaria operacionalmente associada com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de afetar a transcrição do ácido nucleico. Outros elementos de controle da transcrição, além de um promotor, por exemplo, enhancers, operadores, repressores, e sinais de terminação da transcrição, podem ser operacionalmente associados com o polinucleotídeo. Promotores adequados e outras regiões de controle da transcrição estão descritos na presente invenção e são bem conhecidos no estado da técnica.

[0108] Uma sequência de polinucleotídeo pode ser referida como “isolada”, se ela foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo com atividade enzimática (por exemplo, capacidade de converter um substrato em xilulose) contido em um vetor é considerado isolado para os propósitos da presente invenção. Exemplos adicionais de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Os polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados de acordo com a presente invenção incluem ainda tais moléculas produzidas sinteticamente. Um fragmento de polinucleotídeo isolado na forma de um polímero de DNA pode ser composto por um ou mais segmentos de CDNA, DNA genômico ou DNA sintético.

[0109] O termo “gene” refere-se a um fragmento de ácido nucleico que é capaz de ser expresso como uma proteína específica, incluindo opcionalmente — sequências — regulatórias precedentes — (sequências não codificantes 50) e seguintes (sequências não codificantes 3') à sequência de codificação.

[0110] Conforme utilizado na presente invenção, uma “região codificante” ou “ORF” é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Embora um “códon de parada” (TAG, TGA, ou TAA) não seja traduzido em aminoácido, ele pode ser considerado como parte de uma região codificante, se presente, mas quaisquer sequências flanqueadoras, por exemplo, promotores sítios de ligação ao ribossomo, terminadores da transcrição, íntrons, regiões 5' e 3' não traduzidas, e similares não são parte de uma região codificante. “Sequências regulatórias adequadas”

referem-se a sequências nucleotídicas localizadas a montante (sequências 5' não codificantes), dentro, ou a jusante (sequências 3' não codificantes) de uma sequência codificante, que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade do RNA, ou a tradução da sequência codificante associada. As sequências regulatórias podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, íntrons, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítios de processamento de RNA, sítios de ligação efetora e estruturas stem-loop.

[0111] Uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida pelos técnicos peritos no assunto. Estes incluem, mas não estão limitados a, sítios de ligação ao ribossomo e códons de iniciação e terminação da tradução, e elementos derivados de sistemas virais (particularmente um sítio interno de entrada no ribossomo, ou IRES). Em outros exemplos de realização, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, sob a forma de RNA mensageiro (mMRNA). O RNA da presente invenção pode ser de fita simples ou fita dupla.

[0112] As regiões codificantes de polinucleotídeo e ácido nucleico da presente invenção podem estar associadas com regiões codificantes adicionais que codificam peptídeos secretores ou sinal, que direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção.

[0113] Conforme utilizado no presente, o termo “transformação” refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico para dentro do genoma de um organismo hospedeiro, resultando na herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácidos nucleicos transformados são referidos como organismos “recombinantes” ou “modificados”.

[0114]O termo “expressão”, conforme utilizado no presente, refere-se a transcrição e acúmulo estável de (RNAm) sense ou RNA antisense derivado do fragmento de ácido nucleico da invenção. A expressão também pode se referir à tradução do RNAm em um polipeptídeo.

[0115] O termo “superexpressão”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um aumento no nível de ácido nucleico ou proteína de uma célula hospedeira. Assim, a superexpressão pode resultar a partir do aumento do nível de transcrição ou tradução de uma sequência endógena em uma célula hospedeira, ou pode resultar a partir da introdução de uma sequência heteróloga em uma célula hospedeira. A superexpressão pode também resultar de um aumento da estabilidade de um ácido nucleico ou sequência de proteína.

[0116] Os termos “plasmídeo”, “vetor” e “cassete” referem-se a um elemento extracromossômico que geralmente carregam genes que não fazem parte do metabolismo central da célula e, normalmente, estão sob a forma de fragmentos de DNA circular de fita dupla. Tais elementos podem ser sequências que se replicam autonomamente, sequências de integração do genoma, fago ou sequências de nucleotídeos, lineares ou circulares, de fita simples ou de fita-dupla, de DNA ou RNA, provenientes de qualquer fonte, no qual uma variedade de sequências nucleotídicas foram unidas ou recombinadas em uma única construção que é capaz de introduzir um fragmento promotor e sequência de DNA de um produto gênico selecionado, junto com a sequência 3' não traduzida adequada em uma célula. “Cassete de transformação” refere-se a um vetor específico, contendo um gene estrangeiro e possuindo elementos além do gene estrangeiro que facilita a transformação de uma célula hospedeira específica. Um “cassete de expressão” refere-se a um vetor específico contendo um gene estrangeiro e possuindo elementos além do gene estrangeiro que permite uma expressão melhorada daquele gene em uma célula diferente.

[0117] O termo “artificial” refere-se a uma composição derivada de uma célula que não é a célula hospedeira, sintética, por exemplo, um oligonucleotídeo sintetizado quimicamente.

[0118]O termo “nativo” referese que a forma de um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo é como a encontrada na natureza com as suas próprias sequências reguladoras, se estiverem presentes.

[0119] O termo “endógeno”, quando utilizado em referência a um polinucleotídeo, um gene ou polipeptídeo refere-se a um polinucleotídeo ou gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo, ou refere-se a um polipeptídeo nativo transcrito e traduzido a partir desta localização no genoma.

[0120] O termo “heterólogo” quando usado em referência a um polinucleotídeo, um gene, ou polipeptídeo refere-se a um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo normalmente não encontrado no organismo hospedeiro. Os “polinucleotídeo heterólogo” inclui uma região codificante nativa, ou parte dela, que é reintroduzida no organismo de origem de uma forma que é diferente do polinucleotídeo nativo correspondente . “Gene heterólogo” inclui uma região codificante nativa, ou parte dela, que é reintroduzida no organismo de origem de uma forma que é diferente do gene nativo correspondente, por exemplo, não na sua localização natural no genoma do organismo. Por exemplo, um gene heterólogo pode incluir uma região de codificação nativa que é uma porção de um gene quimérico, incluindo regiões regulatórias não nativas que são reintroduzidas no hospedeiro nativo. Um “transgene” é um gene que foi introduzido no genoma por um processo de transformação. “Polipeptídeo heterólogo” inclui um polipeptídeo nativo, ou parte deste, que é reintroduzido no organismo fonte de uma forma que é diferente do polipeptídeo nativo correspondente. O polinucleotídeo heterólogo ou gene pode ser introduzido no organismo hospedeiro, por exemplo, por transferência de genes.

[0121] Conforme utilizado no presente, o termo “modificação”

refere-se a uma alteração de um polinucleotídeo revelado na presente invenção que resulta em atividade alterada de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo, bem como uma alteração em um polipeptídeo divulgado na presente invenção que resulta na atividade alterada do polipeptídeo. Tais alterações podem ser feitas por métodos bem conhecidos no estado da técnica, incluindo, mas não se limitando a, deleção, mutação (por exemplo, mutagênese espontânea, mutagênese aleatória, mutagênese causada por mutadores genéticos, ou mutagênese por transposon), substituição, inserção, alteração da localização celular, alteração do estado do polinucleotídeo ou polipeptídeo (por exemplo, metilação, fosforilação ou ubiquitinação), remoção de um cofator, modificação química, modificação covalente, irradiação com raios UV ou raios-X, recombinação homóloga, recombinação mitótica, métodos de substituição do promotor e/ou combinações dos mesmos. A orientação na determinação de quais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos podem ser modificados pode ser encontrada na comparação da sequência do polinucleotídeo ou polipeptídeo particular, com a sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos homólogos, por exemplo, de levedura ou bacteriana, e a maximização do número de modificações feitas nas regiões de alta homologia (regiões conservadas) ou sequências de consenso.

[0122] Conforme utilizado no presente o termo “variante” (com relação a um polinucleotídeo) refere-se a um polinucleotídeo diferente de um polinucleotídeo especificamente recitado na invenção por inserções, deleções, mutações, e substituições de nucleotídeos, criado utilizando, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, tal como a mutagênese. Alternativamente, os variantes de polinucleotídeos recombinantes que codificam o mesmo polipeptídeo ou polipeptídeos semelhantes podem ser sintetizados ou selecionados, fazendo uso da “redundância” do código genético. Diversas substituições de códons, tais como as alterações silenciosas que produzem vários sítios de restrição, podem ser introduzidas para otimizar a clonagem em um plasmídeo ou vetor viral para a expressão. As mutações na sequência de polinucleotídeos podem ser refletidas no polipeptídeo ou domínios de outros peptídeos adicionados ao polipeptídeo para modificar as propriedades de qualquer parte do polipeptídeo.

[0123] A expressão “elemento de expressão gênica recombinante” refere-se a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma ou mais proteínas específicas, incluindo sequências regulatórias anteriores (sequências não codificadoras 5º) e seguintes (sequências não codificadoras 3') às sequências codificadoras das proteínas. Um gene quimérico é um elemento de expressão genética recombinante. As regiões codificadoras de um operon podem constituir um elemento de expressão gênica recombinante, juntamente com um promotor operacionalmente ligado e a região de terminação.

[0124] “Sequências de regulação” ou “sequências regulatória” referem-se a sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequência 5' não codificante), no interior, ou a jusante (sequência 3' não codificante) de uma sequência codificante, e que influenciam a transcrição, processamento do RNA ou estabilidade, ou tradução da sequência codificante associada. As sequências regulatórias podem incluir promotores, facilitadores (enhancers), operadores, repressores, sinais de término da transcrição, sequências líderes de tradução, íntrons, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítio de processamento de RNA, sítio de ligação ao efetor e estrutura em stem-loop.

[0125] O termo “promotor” refere-se a uma sequência de ácido nucleico capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. Em geral, uma sequência codificante está localizada a 3' de uma sequência promotora. Os promotores podem ser obtidos em sua totalidade a partir de um gene nativo, ou podem ser compostos por diversos elementos provenientes de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de ácido nucleico sintético. É compreendido pelos técnicos no assunto que diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos celulares, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos celulares são, na maioria das vezes, comumente referidos como “promotores constitutivos”. “Promotores indutíveis”, por outro lado, fazem com que um gene seja expresso quando o promotor é induzido ou ativado por um sinal ou molécula específica para aquele promotor. É ainda reconhecido que na maioria dos casos os limites exatos das sequências regulatórias podem não ser completamente definidos, fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade promotora idêntica. Por exemplo, deve-se compreender que o “promotor FBA1” pode ser utilizado para se referir a um fragmento derivado da região promotora do gene FBA1.

[0126] O termo “terminador”, conforme utilizado no presente, refere-se às sequências de DNA localizadas a jusante de uma sequência codificante. Isso inclui sequências de reconhecimento de poliadenilação e outras sequências codificantes de sinais regulatórios capazes de afetar o processamento do mRNA ou da expressão gênica. O sinal de poliadenilação é normalmente caracterizado por afetar a adição de tratos de ácido poliadenílico na extremidade 3' do mMRNA precursor. A região 3' pode influenciar a transcrição, processamento ou estabilidade do RNA, ou a tradução da sequência codificante associada. É ainda reconhecido que na maioria dos casos os limites exatos das sequências regulatórias não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade terminadora idêntica. Por exemplo, deve-se compreender que o termo “erminador CYC1” pode ser utilizado para se referir a um fragmento derivado da região terminadora do gene CYC1.

[0127] O termo “operacionalmente ligado” refere-se à associação de sequências de ácidos nucleicos em um único fragmento de ácido nucleico,

de modo que a função de uma é afetada pela outra. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência codificante quando esta é capaz de afetar a expressão da sequência codificante (ou seja, a sequência codificante está sob controle transcricional do promotor). As sequências codificantes podem estar operacionalmente ligadas às sequências reguladoras em uma orientação sense ou antisense.

[0128] Conforme utilizado no presente, o termo “transformação” refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico para dentro do genoma de um organismo hospedeiro, resultando na herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácidos nucleicos transformados —são referidos como organismos “transgênicos” ou “recombinantes” ou “modificados”.

[0129] O termo “códon otimizado” quando se refere a genes ou regiões codificantes de moléculas de ácidos nucleicos para a transformação de vários hospedeiros, refere-se à alteração de códons nos genes ou regiões codificantes das moléculas de ácidos nucleicos para refletir os códons de uso preferencial (codon usage) típicos do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo codificado pelo DNA. Esta otimização inclui a substituição de pelo menos um, ou mais do que um, ou um número significativo, de códons por um ou mais códons que são mais frequentemente utilizados nos genes daquele organismo.

[0130] Desvios na sequência de nucleotídeos que compreendem os códons codificantes dos aminoácidos de qualquer cadeia polipeptídica permitem variações na sequência codificante do gene. Uma vez que cada códon consiste de três nucleotídeos, e os nucleotídeos compreendendo DNA estão restritos a quatro bases específicas, há 64 possíveis combinações de nucleotídeos, 61 delas codificam aminoácidos (os três códons restantes codificam sinais que terminam a tradução). O “código genético”, que exibe quais códons codificam aminoácidos é reproduzido no presente como a Tabela 1 (ou seja, o código genético padrão). Como resultado, muitos aminoácidos são designados por mais de um códon. Por exemplo, os aminoácidos alanina e prolina são codificados por quatro tripletos, os aminoácidos serina e arginina por seis, enquanto que os aminoácidos triptofano e metionina são codificados apenas por um tripleto. Esta degenerescência permite que composição base do DNA varie em uma larga gama sem alterar a sequência de aminoácidos das proteínas codificadas pelo DNA. TABELA 1 LOTE E RE —— T TTT Fen TCT Ser TATTir(l) |TGTCis(C) (F) (S) TAC“ TGC TTC“ TCC“ TAA Ter TGA Ter TTA Leu TCA“ TAG Ter TGG Trp (W) (L) TCG TIG* [ CTT Leu CCT Pro CAT His (H) | CGT Arg (R) (L) (P) CAC “ CcGc “ CTC“ CCcc “ CAA GIn CGA“ CTA“ CCA “ (Q) cGG “ cTG" ccG “ CAG “ ATT Ile (Il) | ACT Tre AAT Asn AGT Ser (S) ATC * (T) (N) AGC *“ ATA“ ACC “ AAC “ AGA Arg (R) ATG Met |ACA“ AAA Lis (K) | AGG“ (M) ACG “ AAG “ GTT Val GCT Ala GAT Asp GGT Gli (G) (V) (A) (D) GGCc “ GTC“ GCC “ GAC “ GGA “ GTA“ GCA “ GAA Glu (E) | GGG “ GTG* GCG “ GAG “

[0131] Muitos organismos exibem uma tendência para a utilização de códons específicos ao codificarem a inserção de um aminoácido específico na cadeia peptídica em formação. A preferência de códon ou codon-bias, diferenças na utilização de códons entre organismos, é proporcionada pela degenerescência do código genético, e está bem documentado entre muitos organismos. O códon bias muitas vezes se correlaciona com a eficiência de tradução do RNA mensageiro (mMRNA), que por sua vez acredita-se ser dependente, inter alia, das propriedades dos códons sendo traduzidos e da disponibilidade de determinadas moléculas de RNAs de transferência (tRNA). À predominância de tRNAs selecionados de uma célula é geralmente um reflexo dos códons utilizados mais frequentemente na síntese peptídica. Consequentemente, os genes podem ser adaptados para a expressão gênica ótima em um dado organismo com base na otimização de códons.

[0132] Devido ao grande número de sequências de genes disponíveis para uma ampla variedade de espécies de animais, vegetais e microbianos, é possível calcular as frequências relativas da utilização preferencial de códons (codon usage). As tabelas da utilização preferencial de códons (codon usage) estão prontamente disponíveis, por exemplo, na base de dados da utilização preferencial de códons disponível na página da web http://www.kazusa.or.jp/codon/, e essas tabelas podem ser adaptadas de diversas maneiras (vide, por exemplo, Nakamura, et al, Nucl. Acids Res. 28:292, 2000). As tabelas da utilização preferencial de códons para leveduras, calculada a partir da publicação GenBank 128.0 [15 de Fevereiro de 2002], são reproduzidas a seguir como Tabela 2; (Tabela da utilização preferencial de códons (codon usage) para Genes da Saccharomyces cerevisiae). Esta tabela utiliza a nomenclatura de mRNA, e portanto, em vez da timina (T) que é encontrada no DNA, a tabela usa a uracila (U) que é encontrada no RNA. A Tabela foi adaptada de modo que as frequências são calculadas para cada aminoácido, em vez de serem calculadas para todos os 64 códons.

TABELA 2 Aminoácido Frequência por mil Ee ee mz

FOR FR e e e

Aminoácido Frequência por mil

FT

Aminoácido Frequência por mil

FE Parada UAA 6913

[0133] Pela utilização desta tabela ou de tabelas similares, um técnico hábil no assunto pode aplicar as frequências para qualquer dada sequência de polipeptídeo, e produzir um fragmento de ácido nucleico de uma região codificante códon-otimizada que codifica o polipeptídeo, mas que utiliza códons ótimos para uma dada espécie.

[0134] A atribuição aleatória de códons com uma frequência otimizada para codificar uma dada sequência de polipeptídeo, pode ser feita manualmente por meio do cálculo das frequências de códons para cada aminoácido, e, em seguida, atribuindo-se os códons para a sequência de polipeptídeo de forma aleatória. Além disso, vários algoritmos e softwares de computador estão prontamente disponíveis para os técnicos do assunto. Por exemplo, a função “EditSeg” no pacote de programas Lasergene”, disponível pela DNAstar, Inc., (Madison, WI), a função “backtranslation” (retrotradução) na Suite VectorNTIº, disponível pela InforMax, Inc., (Bethesda, MD), e a função “backtranslate” no pacote GCG-Wisconsin, disponível pela Accelrysº, Inc. (San Diego, CA). Além disso, vários recursos estão publicamente disponíveis para realizar a códon-otimização de sequências da região codificante, por exemplo, a função “backtranslation” na página “http://www.entelechon/bioinformatics/backtranslation.php?lang=eng" (Entelechon GmbH, Bad Abbach, Alemanha) e a função “backtranseq” disponível na página: http://emboss.bioinformatics.nl/cgi- bin/emboss/backtranseq. A construção de um algoritmo rudimentar para atribuir códons com base em uma dada frequência também pode ser facilmente realizado com funções matemáticas básicas por um técnico hábil no assunto.

[0135] As regiões codificantes códon-otimizadas podem ser concebidas por vários métodos conhecidos pelos técnicos do assunto, incluindo os pacotes de softwares como o “synthetic gene designer' na página da web http://www.umbc.edu/codon/sgd/ (University of Maryland, Baltimore County, Baltimore, MD).

[0136] Um polinucleotídeo ou fragmento de ácido nucleico é “hibridizável” a outro fragmento de ácido nucleico, tal como um DNA, DNA genômico, ou molécula de RNA, quando uma forma de fita-simples do fragmento de ácido nucleico pode parear com o fragmento de ácido nucleico sob condições adequadas de temperatura e força iônica da solução. As condições de hibridização e de lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2º Ed, Cold Spring Harbor Laboratory:. Cold Spring Harbor, Nova lorque (1989), especialmente o Capítulo 11 e Tabela 11.1 aí contidas. As condições de temperatura e força iônica determinam a “estringência” da hibridização. Condições de estringência podem ser ajustadas para selecionar fragmentos moderadamente similares, (tais como sequências homólogas a partir de organismos distantemente relacionados) até fragmentos muito similares (tais como genes que duplicam enzimas funcionais a partir de organismos estreitamente relacionados). A lavagem pós-hibridização determina as condições de estringência. Um conjunto de condições preferenciais usa uma série de lavagens iniciais com 6X SSC, 0,5% de SDS em temperatura ambiente por 15 min, em seguida, repetido com 2X SSC, 0,5% de SDS a 45 ºC por 30 min, e depois repetido duas vezes com 0,2 X SSC, 0,5% de SDS a 50 ºC por min. Um conjunto de condições de estringência mais preferido utiliza altas temperaturas em que lavagens são idênticas às mencionadas anteriormente, exceto que a temperatura das duas últimas lavagens de 30 min em 0,2 X SSC, 0,5% de SDS foi aumentada para 60 ºC. Outro conjunto preferido de condições altamente estringentes utiliza duas lavagens finais em 0,1 X SSC, 0,1% de SDS a 65 ºC. Um conjunto adicional de condições de estrigência inclui a hibridação em SSC 0,1 X, 0,1% de SDS, a 65 ºC e lavagens com SSC 2X, 0,1% de SDS, seguido por SSC 0,1 X, 0,1% de SDS, por exemplo.

[0137]A hibridização exige que os dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares, contudo, dependendo da estringência da hibridização, pareamentos inadequados entre as bases são possíveis. À estringência adequada para hibridização de ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementariedade, variáveis bem conhecidas no estado da técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre as duas sequências de nucleotídeos, maior o valor de Tm para os híbridos de ácidos nucleicos com essas sequências. A estabilidade relativa (correspondendo a um Tm maior) de hibridizações de ácidos nucleicos diminui na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos com mais de 100 nucleotídeos de comprimento, foram obtidas equações para o cálculo do Tm (vide, por exemplo, Sambrook et al. Supra, 9.50-9.51). Para hibridizações com ácidos nucleicos mais curtos, ou seja, oligonucleotídeos, a posição de pareamentos inadequados se torna mais importante, e o comprimento do oligonucleotídeo determina a sua especificidade (vide, por exemplo, Sambrook et al. Supra, 11.7-11.8). Em um exemplo de realização, o comprimento de um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos. Preferencialmente, um comprimento mínimo para um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de 15 nucleotídeos, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, e mais preferencialmente ainda de pelo menos cerca de 30 nucleotídeos de comprimento. Além disso, o técnico hábil no assunto irá reconhecer que a temperatura e a concentração de sal na solução de lavagem podem ser ajustadas conforme o necessário de acordo com fatores como o comprimento da sonda.

[0138] Uma “porção substancial” de um aminoácido ou uma sequência de nucleotídeos é a porção que compreende uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ou sequência de nucleotídeos de um gene que é suficiente para identificar putativamente o polipeptídeo ou gene, seja pela avaliação manual da sequência por um técnico do assunto, ou por comparação e identificação de sequência automatizada por computador utilizando algoritmos como o BLAST (Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403 410, 1993). Em geral, uma sequência de dez ou mais aminoácidos contíguos ou de trinta ou mais nucleotídeos é necessária para identificar putativamente um polipeptídeo ou sequência de ácidos nucleicos como homóloga a um gene ou proteína conhecida. Além disso, com relação às sequências nucleotídicas, sondas de oligonucleotídeos gene específicas compreendendo de 20-30 nucleotídeos contíguos podem ser usadas em métodos de identificação de genes dependente de sequência (por exemplo, a hibridização Southern) e isolamento (por exemplo, hibridização in situ de colônias bacterianas ou placas de bacteriófago). Além disso, oligonucleotídeos curtos de 12-15 bases podem ser usados como primers para amplificação por PCR, a fim de se obter um fragmento de ácido nucleico específico compreendendo os primers. Assim, uma “porção substancial” de uma sequência de nucleotídeos compreende o suficiente da sequência para identificar especificamente e/ou isolar um fragmento de ácido nucleico que compreende a dita sequência. O presente relatório descritivo ensina as sequências completas de aminoácido e nucleotídeos que codificam proteínas específicas. O técnico hábil assunto, possuindo o benefício das sequências descritas na presente invenção, pode agora utilizar a totalidade ou uma porção substancial das sequências reveladas para fins conhecidos aos técnicos hábeis neste assunto. Assim, a presente invenção compreende as sequências completas conforme fornecido no presente, bem como porções substanciais dessas sequências definidas acima.

[0139] O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeos que são capazes de hibridizar entre si. Por exemplo, com relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina.

[0140] A expressão “porcentagem de identidade”, como é conhecida no estado da técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas, duas ou mais sequências nucleotídicas, conforme determinado pela comparação das sequências. No estado da técnica, “identidade” significa também o grau de relação de sequência entre as sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, conforme o caso, como determinado pelo pareamento entre as cadeias de tais sequências. A “identidade” e “similaridade” podem ser facilmente calculadas por meio de métodos conhecidos, incluindo, mas não se limitando aos divulgados em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part | (Griffin, A. M., e Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).

[0141] Métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para dar o melhor pareamento entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade e similaridade estão codificados em programas de computador disponíveis publicamente. Os Alinhamentos de sequência e cálculos de percentagem da identidade foram realizados utilizando o programa Megalignº da Lasergeneº bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, WI). O alinhamento múltiplo das sequências é realizado utilizando o “método de alinhamento de Clustal”, que abrange diversas variedades do algoritmo, incluindo o “método de alinhamento Clustal V”, correspondente ao método de alinhamento Clustal V marcado (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989);. Higgins, D.G. et al, Comput App! Biosci, 8:189-191 (1992)) e encontrado no programa MegAlignº da Lasergeneº bioinformatics = computing suite (DNASTAR Inc, Madison, WIl). Para alinhamentos múltiplos, os valores padrão correspondem a GAP PENALTY = e GAP LENGTH PENALTY = 10. Os parâmetros padrão para alinhamentos pareados e o cálculo da percentagem de identidade das sequências de proteínas utilizando o método Clustal são KTUPLE = 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 e DIAGONALS SAVED = 5. Para ácidos nucleicos estes parâmetros são KTUPLE = 2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4. Após o alinhamento das sequências utilizando o programa Clustal V, é possível obter uma percentagem de identidade pela visualização da tabela distâncias de sequência no mesmo programa. Além disso, o “método de alinhamento Clustal W" está disponível e corresponde ao método de alinhamento Clustal W marcado (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS 5:151- 153, 1989;. Higgins, D.G. et al, Comput Appl Biosci. . 8:189-191, 1992) e encontrado no programa MegaAlignº v6.1 da Lasergeneº bioinformatics computing suíte (DNASTAR Inc., Madison, WI). Os parâmetros padrão para o alinhamento múltiplo podem ser: GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.2, Delay Divergen Segs(%)=30, DNA Transition Weight=0.5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA Weight Matrix=lUB. Após o alinhamento das sequências utilizando o programa Clustal W, é possível obter uma percentagem de identidade pela visualização da tabela distâncias de sequência no mesmo programa.

[0142] A expressão “software de análise de sequência” refere-se a qualquer algoritmo ou programa de computador que seja útil para a análise de sequências de nucleotídeos ou aminoácidos. O "software de análise de sequência” pode ser comercialmente disponível ou desenvolvido de forma independente. Softwares de análise de sequência típicos incluem, mas não estão limitados a: Suíte de programas GCG (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI); BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990); DNASTAR (DNASTAR, Inc,, Madison, WI); Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml); e programa FASTA que incorpora o algoritmo Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), 1992, 111-20. Editor(es): Suhai, Sandor. Plenum: Nova lorque, NY). Dentro do contexto do presente pedido, será compreendido que, quando o software de análise de sequência é utilizado para a análise, os resultados da análise serão baseados nos valores predefinidos (default) do programa referenciado, salvo quando indicado de outra forma. Conforme utilizado no presente “valores predeterminados” (default) ou “valores-padrão” significa qualquer conjunto de valores ou parâmetros originalmente carregados com o software quando este é inicializado pela primeira vez.

[0143]Um ácido nucleico ou polinucleotídeo possuindo uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de referência da presente invenção, pretende- se dizer que a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo é idêntica à sequência de referência, exceto que o sequência de polinucleotídeo pode incluir até cinco mutações pontuais para cada 100 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de referência. Em outras palavras, para se obter um polinucleotídeo possuindo uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos por um outro nucleotídeo, ou um número de nucleotídeos de até 5% dos nucleotídeos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência.

[0144] Por uma questão prática, para saber se qualquer molécula de ácido nucleico específica ou polipeptídeo é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeos ou de polipeptideos da presente invenção, isso pode ser determinado convencionalmente utilizando programas de computador conhecidos. Um método preferido para determinar a melhor correspondência global entre uma sequência de consulta (por exemplo, uma sequência da presente invenção) e uma sequência objeto, também referido como alinhamento da sequência global, pode ser determinado utilizando o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo de Brutlag et al, Comp. Appl. Biosci. 6:237-245 (1990). Em um alinhamento de sequência as sequências de consulta e objeto são duas sequências de DNA. Uma sequência de RNA pode ser comparada pela conversão da uracila (U) por timina (T). O resultado do alinhamento de sequência global está em percentagem de identidade. Os parâmetros preferidos usados em um alinhamento FASTDB de sequências de DNA para calcular percentagem de identidade são: Matrix=Unitary, k-tuple=4, Mismatch Penalty=1, Joining Penalty30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0,05, Window Size=500 Matriz = ou o comprimento das sequências de nucleotídeos objeto da invenção, o que for mais curto.

[0145] Se a sequência objeto é mais curta do que a sequência de consulta devido a deleções 5' ou 3', e não devido a deleções internas, uma correção manual deve ser feita aos resultados. Isto é porque o programa FASTDB não leva em conta truncamentos em 5' e 3' da sequência objeto da invenção ao calcular a percentagem de identidade global. Para sequências em questão truncadas nas extremidades 5' ou 3', em relação à sequência de consulta, a percentagem de identidade é corrigida pelo cálculo do número de bases da sequência de consulta que estão a 3' e 5' da sequência objeto que não está corretamente pareado/alinhado, como uma percentagem do total de bases da sequência de consulta Se um nucleotídeo está pareado corretamente/alinhado, isto é determinado pelos resultados do alinhamento de sequências FASTDB. Esta percentagem é então subtraída da percentagem de identidade, calculado pelo programa FASTDB acima utilizando os parâmetros especificados para se chegar a uma pontuação final da percentagem de identidade. Esta pontuação (escore) corrigida é a que é utilizada para os propósitos da presente invenção. Apenas as bases fora das bases na região 5' e 3' da sequência objeto da invenção, conforme exibido pelo alinhamento FASTDB, que não estão corretamente pareadas/alinhadas com a sequência de consulta são consideradas para os propósitos de ajuste manual da pontuação de percentagem de identidade.

[0146] Por exemplo, uma sequência objeto da invenção de 90 bases é alinhada com uma sequência de consulta de 100 bases para determinar a percentagem de identidade. A deleção ocorre na extremidade 5' da sequência objeto da invenção e, portanto, o alinhamento FASTDB não exibe um pareamento correto/alinhamento das primeiras 10 bases na extremidade 5". As 10 bases não pareadas representam 10% da sequência (número de bases nas extremidades 5' e 3' que não estão pareadas corretamente/número total de bases na sequência de consulta), assim 10% é subtraído da pontuação de percentagem de identidade calculada pelo programa FASTDB. Se as 90 bases restantes foram perfeitamente alinhadas, a percentagem de identidade final seria de 90%. Em outro exemplo, uma sequência objeto da invenção de 90 bases é comparada com uma sequência de consulta de 100 bases. Desta vez as deleções são deleções internas, de modo que não há bases nas extremidades 5' e 3' da sequência objeto que não estão pareadas corretamente/alinhadas em relação a sequência de consulta. Neste caso, a percentagem de identidade calculada pelo FASTDB não é corrigida manualmente. Mais uma vez, apenas as bases a 5' e 3' da sequência objeto da invenção que não estão corretamente pareadas/alinhada com a sequência de consulta são corrigidas manualmente. Nenhuma outra correção manual deve ser feita para os propósitos da presente invenção.

[0147] Técnicas de DNA recombinante e de clonagem molecular padrões utilizadas na presente invenção são bem conhecidas no estado da técnica e são descritas, por exemplo, por Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2º Ed; Cold Spring Harbor Laboratory Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY (1989); e por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. e Enquist, L. W. Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); e por Ausubel, F. M. et al, Em: Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene

Publishing and Wiley-Interscience, (1987). Métodos adicionais são descrito em Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Parte A, de 2004, Christine Guthrie e Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA).

[0148] Os métodos para aumentar ou para reduzir a expressão de genes alvo são bem conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto. Os métodos para a expressão gênica em leveduras são conhecidos no estado da técnica conforme descrito, por exemplo, em Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Part A, 2004, Christine Guthrie & Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA). Os métodos para aumentar a expressão incluem o aumento do número de genes que são integrados ao genoma ou plasmídeos que expressam a proteína alvo, e usando um promotor que é mais altamente expresso do que o promotor natural. Os promotores que podem estar operacionalmente ligados a um gene quimérico construído para expressão incluem, por exemplo, promotores constitutivos, como FBA1, TDH3, ADH1 e GPMI1, e promotores induzíveis como os promotores GAL1, GAL10 e CUP1. Os terminadores da transcrição adequados que podem ser utilizados na construção de um gene quimérico para a expressão incluem, mas não estão limitados a: FBA1t, TDH3t, GPM1t, ERG10t, GAL1t, CYC1t, e ADH1t.

[0149] Promotores e terminadores da transcrição adequados e as regiões codificantes podem ser clonados em vetores transportadores (E. coli) levedura, e transformados em células de levedura. Estes vetores permitem a propagação tanto em E. coli como em cepas de levedura. Normalmente, o vetor contém um marcador selecionável e sequências que permitem a replicação autônoma ou a integração cromossômica no hospedeiro desejado. Os plasmídeos usados na levedura são, por exemplo, vetores transportadores PRS423, pRS424, pRS425 e pRS426 (American Type Culture Collection,

Rockville, MD), que contêm uma origem de replicação da E. coli (por exemplo, PMB1), uma origem de replicação de levedura 24, e um marcador para a seleção nutricional. Os marcadores de seleção para esses quatro vetores são His3 (vetor pRS423), TRP1 (vetor pRS424), LEU2 (vetor pRS425) e URAS (vetor pRS426). A construção de vetores de expressão pode ser realizada por qualquer técnica padrão de clonagem molecular em E. coli ou pelo método de recombinação e reparo de gap em levedura.

[0150] Os métodos para reduzir a expressão incluem a utilização da modificação genética dos genes codificantes. Muitos métodos para a modificação genética de genes-alvo para reduzir ou eliminar a expressão são conhecidos pelos técnicos no assunto e podem ser usados para criar as células hospedeiras de produção da presente invenção, como leveduras. As modificações que podem ser usadas incluem, mas não se limitam a, deleção do gene inteiro ou parte do gene que codifica a proteína, a inserção de um fragmento de DNA em um gene codificante (por exemplo, no promotor ou na região codificante), de modo que a proteína não é expressa ou é expressa em níveis mais baixos, a introdução de uma mutação em uma região codificante que acrescenta um códon de parada ou uma mudança no quadro de leitura de tal forma que uma proteína funcional não é expressa, e a introdução de uma ou mais mutações em uma região codificante para alterar os aminoácidos de modo que uma proteína não funcional ou enzimaticamente menos ativa seja expressa. Além disso, a expressão de um gene-alvo pode ser bloqueada pela expressão de um RNA antisense ou um RNA interferente, e construções que resultam na cosupressão podem ser introduzidas. Além disso, a síntese ou a estabilidade da transcrição pode ser reduzida por mutação. Da mesma forma, a eficiência pela qual a proteína é traduzida a partir do MRNA pode ser modulada por mutação. Todos esses métodos podem ser facilmente praticados por um técnico hábil no assunto fazendo uso das sequências conhecidas ou identificadas que codificam as proteínas-alvo.

[0151] Sequências de DNA que flanqueiam uma sequência codificante alvo são também úteis em alguns procedimentos de modificação. Em particular, sequências de DNA flanqueando, por exemplo, uma sequência codificante de um gene alvo são úteis para os métodos de modificação usando recombinação homóloga. Neste método, as sequências que flanqueiam o gene alvo são colocadas delimitando um gene marcador selecionável para mediar a recombinação homóloga, de modo que o gene marcador substitui o gene alvo. Também sequências parciais do gene alvo e sequências flanqueando o gene alvo que delimitam um gene marcador selecionável podem ser usadas para mediar a recombinação homóloga em que o gene marcador substitui uma porção do gene alvo. Além disso, o marcador selecionável pode ser delimitado por sítios de recombinação sítio específicos, de modo que após a expressão da recombinase sítio-específica correspondente, o gene de resistência é excisado do gene alvo sem reativar o último. A recombinação sítio-específica deixa para trás um sítio de recombinação que perturba a expressão da proteína alvo. Os vetores de recombinação homóloga podem ser construídos para também deixar uma deleção no gene alvo após a excisão do marcador selecionável, como é bem sabido pelos técnicos hábeis no assunto.

[0152] Deleções poderão ser feitas utilizando a recombinação mitótica, conforme descrito em Wach et a/. (Yeast 10:1793-1808, 1994). Este método envolve a preparação de um fragmento de DNA que contém um marcador selecionável entre as regiões genômicas que podem ser tão curtas quanto 20 pb, e que ligam uma sequência de DNA alvo. Este fragmento de DNA pode ser preparado pela amplificação por POR do gene marcador selecionável usando como primers oligonucleotídeos que hibridizam com as extremidades do gene marcador e que incluem as regiões genômicas que podem se recombinar com o genoma da levedura. O fragmento de DNA linear pode ser eficientemente transformado na levedura e recombinado no genoma, resultando na substituição de genes, incluindo a eliminação da sequência do DNA alvo (conforme descrito em Methods in Enzymology, v194, págs. 281-301 1991).

[0153] Além disso, os métodos de substituição do promotor podem ser usados para trocar os elementos de controle transcricional endógenos permitindo que outro meio module a expressão (vide, por exemplo, Mnaimneh et al. Cell 118 (1):31-44. 2004).

[0154] Além disso, a atividade do gene alvo codificado pode ser interrompida utilizando a mutagênese aleatória, que é seguida pelo rastreio para a identificação de cepas com atividade reduzida. Utilizando este tipo de método, a sequência de DNA da região codificante do gene alvo, ou qualquer outra região do genoma que afete a atividade, não precisa ser conhecida. Os métodos para a criação de mutações genéticas são comuns e bem conhecidos no estado da técnica e podem ser aplicados para o exercício de criação de mutantes. Os métodos de modificação genética aleatória comumente utilizados (revisto em Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) incluem mutagênese espontânea, mutagênese causada por genes mutantes, mutagênese química, irradiação com UV ou raios-X, ou mutagênese por transposon.

[0155] A mutagênese química de leveduras geralmente envolve o tratamento de células de levedura com um dos seguintes agentes mutagênicos do DNA: metanossulfonato de etila (EMS), ácido nitroso, sulfato de dietila, ou N-metil-N'-nitro-N-nitroso-guanidina (MNNG). Estes métodos de mutagênese foram revistos em Spencer, et al, (Mutagenesis in Yeast, 1996, Yeast Protocols: Methods in Cell and Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ). A mutagênese química com EMS pode ser realizada conforme descrito em Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold

Spring Harbor, NY. A irradiação com luz ultravioleta (UV) ou raios-X pode também ser usada para produzir a mutagênese aleatória em células de levedura . O efeito primário da mutagênese por irradiação UV é a formação de dímeros de pirimidina que perturbam a fidelidade da replicação de DNA. Protocolos para a mutagênese de leveduras utilizando UV podem ser encontrados em Spencer, et al, (Mutagenesis in Yeast, 1996, Yeast Protocols: Methods in Cell and Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ). A introdução de um fenótipo do agente de mutação também pode ser usada para gerar mutações aleatórias cromossômicas em leveduras. Fenótipos mutantes comuns podem ser obtidos por meio do inter-rompimento de um ou mais dos seguintes genes: PMS1, MAG1, RAD18 ou RADB51. A restauração do fenótipo do agente de mutação pode não ser facilmente obtida pela inserção do alelo tipo selvagem. Coleções de células modificadas produzidas a partir de qualquer um destes ou de outros processos conhecidos de mutagênese aleatória podem ser pesquisadas para a atividade reduzida.

MODIFICAÇÃO DA FOSFODIESTERASE

[0156] Em alguns exemplos de realização da invenção, um micro- organismo pode compreender atividade da fosfodiesterase reduzida ou eliminada. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode também compreender uma via biossintética do isobutanol, uma via biossintética de 1-butanol, uma via biossintética de 2-butanol, ou uma via biossintética de 2- butanona, tal como descrito adicionalmente na presente invenção. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do isobutanol pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de um substrato em produto, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) piruvato em acetolactato, (b) acetolactato em 2,3-dihidroxiisovalerato, (c) 2,3- dihidroxiisovalerato “em 2-cetoisovalerato; (d) 2-cetoisovalerato em isobutiraldeído, e (e) isobutiraldeído em isobutanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do isobutanol pode compreender polinucleotídeos que codificam polipeptídeos possuindo atividade de acetolactato sintase, atividade de cetoácido redutoisomerase, atividade de ácido dihidroxi desidratase, atividade de cetoisovalerato descarboxilase e/ou atividade de álcool desidrogenase.

[0157] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode compreender uma via biossintética do 1-butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do 1-butanol pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de um substrato em produto, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) acetil- CoA em acetoacetil-CoA; (b) acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA; (c) 3- hidroxibutiril-CoA em crotonil-CoA; (d) crotonil-CoA em butiril-CoA; (e) butiril- CoA em butiraldeído, e (f) butiraldeído em 1-butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética de 1-butanol pode compreender polinucleotídeos que codificam polipeptideos possuindo atividade de aceti-CoA- acetiltransferase; atividade de 3-hidroxibutiril-CoA-desidrogenase; atividade de crotonase; atividade de butiri-CoA desidrogenase; atividade de butiraldeído desidrogenase e/ou butanol desidrogenase.

[0158] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode compreender uma via biossintética do 2-butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do 2-butanol pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de um substrato em produto, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) piruvato em alfa-acetolactato; (b) alfa-acetolactato em acetoína; (c) acetoína em 3- amino-2-butanol; (d) 3-amino-2-butanol em fosfato de 3-amino-2-butanol; (e) fosfato de 3-amino-2-butanol em 2-butanona; e (f) 2-butanona em 2-butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintitética de 2-butanol pode compreender polinucleotídeos que codificam polipeptídeos possuindo atividade de acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase, atividade de acetonina aminase, atividade de aminobutanol quinase, atividade de fosfato de aminobutano!l fosforilase, e/ou atividade de butanol desidrogenase.

[0159] Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do 2- butanol pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de um substrato em produto, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) de piruvato em alfa-acetolactato, (b) de alfa- acetolactato em acetoína, (c) acetoína em 2,3-butanodiol; (d) de 2,3-butanodiol em 2-butanona; e (e) de 2-butanona em 2-butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintitéica de 2-butanol pode compreender polinucleotídeos que codificam polipeptídeos possuindo atividade de acetolactato sintase, atividade de acetolactato descarboxilase, atividade de butanodiol desidrogenase; atividade de diol desidratase; e/ou atividade de butanol desidrogenase.

[0160] Em alguns exemplos de realização da invenção, um micro- organismo pode incluir uma alteração ou inter-rompimento de um polinucleotídeo ou gene que codifica um polipeptídeo contendo a atividade de fosfodiesterase ou uma alteração ou inter-rompimento de um polipeptídeo possuindo atividade de fosfodiesterase. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode compreende uma inserção, deleção, mutação, e/ou substituição em um polinucleotídeo endógeno ou gene que codifica um polipeptídeo possuindo atividade de fosfodiesterase ou em um polipeptídeo endógeno possuindo atividade de fosfodiesterase. Tais modificações, inter- rompimentos, inserções, deleções, mutações e/ou substituições podem resultar em atividade de fosfodiesterase que é reduzida ou eliminada. Ainda em outros exemplos de realização, um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo com atividade de fosfodiesterase pode corresponder à enzima com o Número da Comissão de Enzimas: EC 3.1.4.17.

[0161] Exemplos de polinucleotídeos, genes e polipeptídeos da fosfodiesterase que podem ser alvos para a modificação ou inativação em um micro-organismo descrito na presente invenção incluem, mas não estão limitados, às SEQ ID NOs: 1-3.

[0162] Outros — exemplos de polinucleotídeos, genes e polipeptídeos que podem ser alvos para a modificação ou inativação em um micro-organismo divulgado na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, polinucleotídeo, gene e/ou polipeptídeos possuindo pelo menos cerca de 70% a cerca de 75%, cerca de 75% a cerca de 80%, cerca de 80% a cerca de 85 %, cerca de 85% a cerca de 90%, cerca de 90% a cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou cerca de 99% de identidade de sequência com as SEQ ID NOs: 1-3, em que tal polinucleotídeo ou gene codificante, ou tal polipeptídeo tem atividade de fosfodiesterase. Ainda em outros exemplos de polinucleotídeos, genes e polipeptídeos da fosfodiesterase que podem ser alvos para a modificação ou inativação em um micro-organismo descrito na presente invenção incluem, mas não estão limitados a um variante, fragmento ou derivado ativos das SEQ ID NOs: 1-3, em que tal polinucleotídeo ou gene codificante, ou tal polipeptídeo tem, atividade de fosfodiesterase.

[0163] Em alguns exemplos de realização, as sequências de outros polinucleotídeos, genes e/ou polipeptídeos da fosfodiesterase podem ser identificados na literatura e/ou em bases de dados de bioinformática bem conhecidas pelos técnicos no assunto utilizando as sequências divulgadas na presente invenção e disponíveis no estado da técnica. Por exemplo, estas sequências podem ser identificadas pela pesquisa BLAST em bases de dados publicamente disponíveis conhecidas utilizando as sequências polipeptídicas ou polinucleotídicas codificantes da fosfodiesterase. Em tal método, as identidades podem ser baseadas no método de alinhamento Clustal W usando os parâmetros preestabelecidos: GAP PENALTY=10, GAP LENGTH

PENALTY=0,1; e matriz de peso proteico Gonnet 250 series.

[0164] Além disso, as sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos da fosfodiesterase descritas na presente invenção ou aquelas conhecidas no estado da técnica podem ser usadas para identificar outras fosfodiesterase homólogas na natureza. Por exemplo, cada um dos fragmentos de ácidos nucleicos codificantes da fosfodiesterase divulgados na presente invenção pode ser usado para isolar genes que codificam proteínas homólogas. O isolamento de genes homólogos usando protocolos dependentes de sequência é bem conhecido no estado da técnica. Exemplos de protocolos de dependentes de sequência incluem, mas não estão limitados a, métodos de hibridização de ácidos nucleicos e métodos de amplificação de DNA e RNA conforme exemplificado por vários usos de tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos [por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), Patente US 4.683.202; reação em cadeia da ligase (LCR) Tabor. et al. Proc. Acad. Sci. USA 82:1074 1985; ou amplificação por deslocamento de fita (SDA), Walker et al, Proc.. Natl. Acad. Sci. USA, 89:392 1992]; e métodos de construção da biblioteca e seleção por complementação.

[0165] Em alguns exemplos de realização, os polinucleotídeos, genes, e/ou polipeptídeos da fosfodiesterase relacionados com um micro- organismo divulgado na presente invenção podem ser modificados ou interrompidos. Muitos métodos para a modificação genética e interrupção de genes-alvo para reduzir ou eliminar a expressão são conhecidos por um técnico hábil no assunto e podem ser utilizados para criar um micro-organismo descrito na presente invenção. As modificações que podem ser usadas incluem, mas não se limitam a, deleção do gene inteiro ou parte do gene que codifica um polipeptídeo da fosfodiesterase, a inserção de um fragmento de DNA em um gene codificante (tanto no promotor como na região codificante), de modo que a proteína não é expressa ou é expressa em níveis mais baixos,

a introdução de uma mutação em uma região codificante que acrescenta um códon de parada ou uma mudança no quadro de leitura de tal forma que uma proteína funcional não é expressa, e/ou a introdução de uma ou mais mutações em uma região codificante para alterar os aminoácidos de modo que uma proteína não funcional ou enzimaticamente menos ativa seja expressa. Em alguns exemplos de realização, a expressão de um gene-alvo pode ser bloqueada pela expressão de um RNA antisense ou um RNA interferente, e construções que resultam na cosupressão podem ser introduzidas. Em alguns exemplos de realização, a síntese ou a estabilidade da transcrição pode ser reduzida por mutação. Em alguns exemplos de realização, a eficiência pela qual a proteína é traduzida a partir do MRNA pode ser modulada por mutação. Esses métodos podem ser facilmente praticados por um técnico hábil no assunto fazendo uso das sequências conhecidas ou identificadas que codificam as proteínas-alvo.

[0166] A modificação da fosfodiesterase em um micro-organismo descrito na presente invenção para reduzir ou eliminar a atividade da fosfodiesterase pode ser confirmada utilizando os métodos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, o inter-rompimento de uma fosfodiesterase particular pode ser confirmado pelo rastreio por PCR utilizando primers internos e externos para o gene da fosfodiesterase ou pela técnica de Southern blot utilizando uma sonda desenhada para a sequência do gene da fosfodiesterase. Alternativamente, podemos utilizar métodos de ensaio para medir a atividade da enzima fosfodiesterase (por exemplo, ensaios Bridge-lº PDE, Mediomics, LLC, St. Louis, MO; ensaio de fosfodiesterase - PDE-GloTM, Promega, Madison, WI; Younes et al., Anal. Biochem. 417: 36-40, 2011).

VIAS BIOSSINTÉTICAS

[0167] As vias biossintéticas para a produção de isobutanol que podem ser utilizadas incluem aquelas descritas na Patente US 7.851.188, que é incorporada ao presente pela referência. Em um exemplo de realização, a via biossintética do isobutanol pode compreender as seguintes conversões de substrato para produto: a) piruvato para acetolactato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela acetolactato sintase; b) acetolactato para 2,3-dihidroxiisovalerato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela ácido acetohidroxi isomeroredutase; c) 2,3-dihidroxiisovalerato para a-cetoisovalerato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela ácido acetohidroxi desidratase; d) a-cetoisovalerato para isobutiraldeído, que pode ser catalisada, por exemplo, por uma a-cetoácido descarboxilase de cadeia ramíficada; e e) isobutiraldeído para isobutanol, que pode ser catalisada, por exemplo, por uma enzima álcool desidrogenase de cadeia ramificada.

[0168] Em outro exemplo de realização, a via biossintética do isobutanol pode compreender as seguintes conversões de substrato para produto: a) piruvato para acetolactato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela acetolactato sintase; b) acetolactato para 2,3-dihidroxiisovalerato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela cetol-ácido redutoisomerase; c) 2,3-dihidroxiisovalerato para a-cetoisovalerato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela enzima dihidroxiácido desidratase; d) a-cetoisovalerato para valina, que pode ser catalisada, por exemplo, pela transaminase ou valina desidrogenase; e) valina para isobutilamina, que pode ser catalisada, por exemplo, pela enzima valina descarboxilase, f) isobutilamina para isobutiraldeído, que pode ser catalisada, por exemplo, pela enzima omega transaminase; e g) isobutiraldeído para isobutanol, que pode ser catalisada, por exemplo, por uma enzima desidrogenase de álcool de cadeia ramificada.

[0169] Em outro exemplo de realização, a via biossintética do isobutanol pode compreender as seguintes conversões de substrato para produto: a) piruvato para acetolactato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela acetolactato sintase; b) acetolactato para 2,3-dihidroxiisovalerato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela ácido acetohidroxi isomeroredutase; c) 2,3-dihidroxiisovalerato para a-cetoisovalerato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela ácido acetohidroxi desidratase; d) a-cetoisovalerato para isobutiraldeído-CoA, que pode ser catalisada, por exemplo, por uma desidrogenase de cetoácido de cadeia ramiíficada; e) isobutiril-CoA para isobutiraldeído, que pode ser catalisada, por exemplo, pela aldeído desidrogenase (acetilante); e f) isobutiraldeído para isobutanol, que pode ser catalisada, por exemplo, por uma enzima álcool desidrogenase de cadeia ramificada.

[0170] As vias biossintéticas para a produção de 1-butanol que podem ser utilizadas incluem aquelas descritas na Publicação do Pedido de Patente US 2008/0182308, que é incorporada ao presente pela referência. Em um exemplo de realização, a via biossintética do 1-butanol pode compreender as seguintes conversões de substrato para produto: a) acetil-CoA para acetoacetil-CoA, que pode ser catalisada, por exemplo, pela acetil-CoA acetiltransferase; b) acetoaceti-CoA para 3-hidroxibutiri-CoA, que pode ser catalisada, por exemplo, pela 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase; c) 3-Hidroxibutiril-CoA para crotonil-CoA, que pode ser catalisada,

por exemplo, pela crotonase; d) Crotonil-CoA para butiril-CoA, que pode ser catalisada, por exemplo, pela butiril-CoA desidrogenase; e) Butiri-CoA para butiraldeído, que pode ser catalisada, por exemplo, pela butiraldeído desidrogenase; e f) Butiraldeído para 1-butanol, que pode ser catalisada, por exemplo, pela butano! desidrogenase.

[0171] As vias biossintéticas para a produção de 2-butanol que podem ser utilizadas incluem aquelas descritas na Publicação do Pedido de Patente US 2007/0259410 e Publicação do Pedido de Patente US 2009/0155870, que são incorporadas ao presente pela referência. Em um exemplo de realização, a via biossintética do 2-butanol pode compreender as seguintes conversões de substrato para produto: a) piruvato para alfa-acetolactato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela acetolactato sintase; b) alfa-acetolactato para acetoína, que pode ser catalisada, por exemplo, pela acetolactato descarboxilase; c) acetoína para 3-amino-2-butanol, que pode ser catalisada, por exemplo, pela acetonina aminase; d) 3-amino-2-butanol para 3-amino-2-butanol fosfato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela aminobutano! quinase; e) 3-amino-2-butanol fosfato para 2-butanona, que pode ser catalisada, por exemplo, pela fosforilase de aminobutano! fosfato; e f) 2-butanona para 2-butanol, que pode ser catalisada, por exemplo, pela butano! desidrogenase.

[0172] Em outro exemplo de realização, a via biossintética do 2- butanol pode compreender as seguintes conversões de substrato para produto: a) piruvato para alfa-acetolactato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela acetolactato sintase; b) alfa-acetolactato para acetoína, que pode ser catalisada, por exemplo, pela acetolactato descarboxilase; c) acetoína para 2,3-butanodiol, que pode ser catalisada, por exemplo, pela butanodiol desidrogenase; d) 2,3-butanodiol para 2-butanona, que pode ser catalisada, por exemplo, pela dial desidratase; e e) 2-butanona para 2-butanol, que pode ser catalisada, por exemplo, pela butanol desidrogenase.

[0173] As vias biossintéticas para a produção de 2-butanona que podem ser utilizadas incluem aquelas descritas na Publicação do Pedido de Patente US 2007/0259410 e Publicação do Pedido de Patente US 2009/0155870, que são incorporadas ao presente pela referência. Em um exemplo de realização, a via biossintética de 2-butanona pode compreender as seguintes conversões de substrato para produto: a) piruvato para alfa-acetolactato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela acetolactato sintase; b) alfa-acetolactato para acetoína, que pode ser catalisada, por exemplo, pela acetolactato descarboxilase; c) acetoína para 3-amino-2-butanol, que pode ser catalisada, por exemplo, pela acetonina aminase; d) 3-amino-2-butanol para 3-amino-2-butanol fosfato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela aminobutano! quinase; e e) 3-amino-2-butanol fosfato para 2-butanona, que pode ser catalisada, por exemplo, pela fosforilase de aminobutano! fosfato.

[0174] Em outro exemplo de realização, a via biossintética da 2- butanona pode compreender as seguintes conversões de substrato para produto:

a) piruvato para alfa-acetolactato, que pode ser catalisada, por exemplo, pela acetolactato sintase; b) alfa-acetolactato para acetoína, que pode ser catalisada, por exemplo, pela acetolactato descarboxilase; c) acetoína para 2,3-butanodiol, que pode ser catalisada, por exemplo, pela butanodiol desidrogenase; d) 2,3-butanodiol para 2-butanona, que pode ser catalisada, por exemplo, pela diol desidratase.

[0175] Em alguns exemplos de realização, os métodos descritos na presente invenção podem produzir butanol a partir de fontes de carbono derivadas de vegetais, evitando o impacto ambiental negativo associado aos processos petroquímicos padrão para a produção de butanol. Em alguns exemplos de realização, os métodos para a produção de butanol utilizam células hospedeiras recombinantes que compreendem uma via do butanol. Em alguns exemplos de realização, as vias biossintéticas do butanol podem compreender pelo menos um polinucleotídeo, pelo menos dois polinucleotídeos, pelo menos três polinucleotídeos, ou pelo menos quatro polinucleotídeos que é/são heterólogos para a célula hospedeira recombinante. Em alguns exemplos de realização, cada substrato para a conversão do produto de uma via biossintética do butanol em uma célula hospedeira recombinante é catalisada por um polipeptídeo heterólogo. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo que catalisa a conversão de substrato em produto de acetolactato para 2,3-di-hidroxi-isovalerato e/ou o polipeptídeo catalisa a conversão de substrato em produto de isobutiraldeído para isobutanol são capazes de utilizar a nicotinamida-adenina dinucleotídeo reduzida (NADH) como cofator.

[0176] Os termos “acetohidroxiácido sintase” e “acetolactato sintase” e “acetolactato sintetase” (abreviado como “ALS”) são usados de maneira intercambiável na presente invenção para se referirem a uma enzima que catalisa a conversão de piruvato em acetolactato e CO». Exemplo de acetolactato sintase preferidos são conhecidos pelo número EC 2.2.1.6 9 (Nomenclatura de Enzimas 1992, Academic Press, San Diego). Estas enzimas não modificadas estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não se limitado a, Bacillus subtilis (GenBank Nº: CAB15618 (SEQ ID NO: 4), Z99122 (SEQ ID NO: 5), CABO7802 (SEQ ID NO: 272), Klebsiella pneumoniae (GenBank N': AAA25079 (SEQ ID NO: 6), M73842 (SEQ ID NO: 7)), e Lactococcus lactis (GenBank N': AAAZ5161 (SEQ ID NO: 8), L16975 (SEQ ID NO: 9)).

[0177]O termo “cetol-ácido redutoisomerase” (“KARI”), “ácido acetohidroxi isomeroredutase" e “ácido acetohidroxi redutoisomerase” são utilizados indiferentemente e referem-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade de enzima capaz de catalisar a reação de (S)- acetolactate em 2,3-dihidroxisovalerato. Exemplos de enzimas KARI podem ser classificados como número EC 1.1.1.86 (Nomenclatura de Enzimas 1992, Academic Press, San Diego), e estão disponíveis a partir de uma vasta gama de micro-organismos, incluindo, mas não se limitando a, E. coli (GenBank Nº NP 418222 (SEQ ID NO: 10), NC 000913 (SEQ ID NO: 11)), Saccharomyces cerevisiae (GenBank N': NP 013459 (SEQ ID NO: 12), NC 001144 (SEQ ID NO: 13)), Methanococcus maripaludis (GenBank Nº: CAF30210 (SEQ ID NO: 14), BK957220 (SEQ ID NO: 15)), e Bacillus subtilis (GenBank Nº: CAB14789 (SEQ ID NO: 16), 299118 (SEQ ID NO: 17)). Karis incluem KAR!I variantes de Anaerostipes caccae “K9G9” e “K9D3” (SEQ ID NOs: 18 e 19, respectivamente). Enzimas cetol-ácidos redutoisomerase estão descritas nas Publicações de Pedidos de Patente US 2008/0261230, 2009/0163376, e 2010/0197519, e Publicação PCT WO/2011/041415, que são incorporadas ao presente pela referência. Exemplos de KARIs divulgadas nestas publicações são as de Lactococcus lactis, Vibrio cholera, Pseudomonas aeruginosa PAO1 e Pseudomonas fluorescens PF5 mutantes. Em alguns exemplos de realização, a KARI utiiza NADH. Em alguns exemplos de realização, a KARI utiliza nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH).

[0178]Os termos “ácido —acetohidroxi desidratase"r e “dihidroxiácido desidratase” (“DHAD”) referem-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade de enzima que catalisa a conversão de 2,3-di-hidroxi-isovalerato para a-cetoisovalerato. Exemplos de enzimas ácido acetohidróxi desidratases são conhecidos pelo número EC 4.2.1.9. Tais enzimas estão disponíveis a partir de uma vasta gama de micro-organismos, incluindo, mas não se limitando a, E. coli (GenBank Nº: YP 026248 (SEQ ID NO: 20), NCO00913 (SEQ ID NO: 21)), Saccharomyces cerevisiae (GenBank Nº: NP 012550 (SEQ ID NO: 22), NC 001142 (SEQ ID NO: 23)), M. maripaludis (GenBank Nº: CAF29874 (SEQ ID NO: 24), BX957219 (SEQ |D NO: 25)), Bacillus subtilis (GenBank Nº: CAB14105 (SEQ ID NO: 26), 299115 (SEQ ID NO: 27)), L. lactis, e N. crassa. Publicação do Pedido de Patente US 2010/0081154, e Patente US 7.851.188, que são incorporadas ao presente pela referência, descrevem as dihidroxiácido desidratases (DHADs), incluindo uma DHAD a partir de Streptococcus mutans.

[0179]O termo “descarboxilase de a-ceto ácido cadeia ramificada”, “a-cetoácido descarboxilase”, “a-cetoisovalerato descarboxilase” ou “2-cetoisovalerato descarboxilase” (“KIVD”) refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma enzima atividade que catalisa a conversão de a- cetoisovalerato em isobutiraldeído e CO>. Exemplos de descarboxilases de a- cetoácido de cadeia ramificada são conhecidos pelo número EC 4.1.1.72 e estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não se limitando a, Lactococcus lactis (GenBank Nº: AAS49166 (SEQ ID NO: 28), AY548760 (SEQ ID NO: 29); CAG34226 (SEQ ID NO: 30), AJ746364 (SEQ ID NO: 31),

Salmonella typhimurium (GenBank Nº: NP 461346 (SEQ ID NO: 32), NC 003197 (SEQ ID NO: 33)), Clostridium acetobutylicum (GenBank Nº: NP 149189 (SEQ ID NO: 34), NC 001988 (SEQ ID NO: 35)), M. caseolyticus (SEQ ID NO: 36), e L. grayi (SEQ ID NO: 37).

[0180] O termo “desidrogenase de álcool de cadeia ramificada” (“ADH”) refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos), possuindo uma atividade de enzima que catalisa a conversão de isobutiraldeído em isobutanol. Exemplos das desidrogenases de álcool de cadeia ramificada são conhecidos pelo número EC 1.1.1.265, mas também podem ser classificadas sob outras álcool desidrogenases (especificamente, EC 1.1.1.1 ou 1.1.1.2). As enzimas álcool desidrogenases podem ser dependentes de NADPH ou dependentes de NADH. Tais enzimas estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não se limitando a, Saccharomyces cerevisiae (GenBank Nº: NP 010656 (SEQ ID NO: 38), NC 001136 (SEQ ID NO: 39), NP 014051 (SEQ ID NO: 40), NC 001145 (SEQ ID NO: 41)), E. coli (GenBank Nº: NP 417484 (SEQ ID NO: 42), NO 000913 (SEQ ID NO: 43)), Clostridium acetobutylicum (GenBank Nº: NP 349892 (SEQ ID NO: 44), NC 003030 (SEQ ID NO: 45); NP. 349891 (SEQ ID NO: 46), NC 003030 (SEQ ID NO: 47)). A Publicação do Pedido de Patente US 2009/0269823 descreve SadB, uma álcool desidrogenase (ADH) de Achromobacter xylosoxidans. Álcool desidrogenases também incluem ADH de fígado de cavalo e ADH de Beijerinkia indica (tal como descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2011/0269199, incorporada ao presente pela referência).

[0181]O termo “butanol desidrogenase” referese a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de isobutiraldeído em isobutanol ou a conversão de 2 butanona em 2-butanol. As enzimas butanodiol desidrogenases são um subconjunto da ampla família das enzimas álcool desidrogenases. A butanol desidrogenase pode ser dependente de NAD ou NADP. As enzimas dependentes de NAD são conhecidas como EC 1.1.1.1 e estão disponíveis, por exemplo, a partir do Rhodococcus ruber (GenBank Nº: CAD36475, AJ491307). As enzimas dependentes de NADP são conhecidas como EC 1.1.1.2 e estão disponíveis, por exemplo, a partir do Pyrococcus furiosus (GenBank Nº: AAC25556, AFO13169). Adicionalmente, uma butanol desidrogenase está disponível a partir de E. coli (GenBank Nº: NP 417484, NC 000913) e uma ciclohexanol desidrogenase está disponível a partir de Acinetobacter sp. (GenBank Nº: AAG10026, AF282240). O termo “butanol desidrogenase” refere- se a uma enzima que catalisa a conversão de butiraldeído em 1-butanol, usando o NADH ou NADPH como cofator. As enzimas butanol desidrogenases estão disponíveis a partir de, por exemplo, Clostridium acetobutylicum (GenBank Nº: NP 149325, NC 001988; nota: esta enzima possui tanto a atividade de desidrogenase de aldeído como de álcool; NP 349891, NC 003030, NP 349892, NC 003030) e E. coli (GenBank Nº: NP 417-484, NC 000913).

[0182] O termo “desidrogenase de cetoácido de cadeia ramificada” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de a-cetoisovalerato em isobutiril-CoA (isobutiril-coenzima A), tipicamente utilizando NAD* (nicotinamida adenina dinucleotídeo) como aceptor de elétrons. Exemplos de desidrogenases de ceto ácido de cadeia ramificada são conhecidos pelo número EC 1.2.4.4. Tais desidrogenases de ceto-ácido de cadeia ramificada são compostas de quatro subunidades e sequências a partir de todas subunidades disponíveis em uma vasta gama de micro-organismos, incluindo, mas não se limitando a, Bacillus subtilis (GenBank Nº: CAB14336 (SEQ ID NO: 48), 299116 (SEQ ID NO: 49); CAB14335 (SEQ ID NO: 50), 299116 (SEQ ID NO: 51); CAB14334 (SEQ ID NO: 52), 299116 (SEQ ID NO: 53); e CAB14337 (SEQ ID NO: 54), 299116

(SEQ ID NO: 55)) e Pseudomonas putida (GenBank Nº: AAAG65614 (SEQ ID NO: 56), M57613 (SEQ ID NO: 57); AAA65615 (SEQ ID NO: 58), M57613 (SEQ ID NO: 59); AMA65617 (SEQ ID NO: 60), M57613 (SEQ ID NO: 61); e AAAG5618 (SEQ ID NO: 62), M57613 (SEQ ID NO: 63)).

[0183] O termo “aldeído desidrogenase acilante” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade de enzima que catalisa a conversão de isobutiri-CoA em isobutiraldeído, tipicamente usando NADH ou NADPH como doador de elétrons. Exemplos de aldeído desidrogenases acilantes são conhecidos pelos números EC 1.21.10 e

1.2.1.57. Tais enzimas estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não se limitando a; Clostridium beijerinckii (GenBank Nº: AAD31841 (SEQ ID NO: 64), AF157306 (SEQ ID NO: 65)), Clostridium acetobutylicum (GenBank Nº: NP 149325 (SEQ ID NO: 66), NC 001988 (SEQ ID NO: 67); NP 149199 (SEQ ID NO: 68), NC 001988 (SEQ ID NO: 69)), P. putida (GenBank Nº: AAAS9106 (SEQ ID NO: 70), U13232 (SEQ ID NO: 71)), e Thermus thermophilus (GenBank Nº: YP 145486 (SEQ ID NO: 72), NC 006461 (SEQ ID NO: 73)).

[0184] O termo “transaminase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de a-cetoisovalerato em L-valina, usando alanina ou glutamato como um doador de amina. Exemplos são conhecidos pelos números EC 2.6.1.42 e 2.6.1.66. Tais enzimas estão disponíveis a partir de diversas fontes. Exemplos de fontes de enzimas dependentes de alanina incluem, mas não estão limitados a, E. coli (GenBank Nº: YP 026231 (SEQ ID NO: 74), NC 000913 (SEQ ID NO: 75)) e Bacillus licheniformis (GenBank Nº: YP 093743 (SEQ ID NO: 76), NC 006322 (SEQ ID NO: 77)). Exemplos de fontes de enzimas dependentes de glutamato incluem, mas não estão limitados a, E. coli (GenBank Nº: YP 026247 (SEQ ID NO: 78), NC 000913 (SEQ ID NO: 79)), Saccharomyces cerevisiae (GenBank

Nº: NP 012682 (SEQ ID NO: 80), NC 001142 (SEQ |D NO: 81)) e Methanobacterium thermoautotrophicum (GenBank Nº: NP 276546 (SEQ ID NO: 82), NC 000916 (SEQ ID NO: 83)).

[0185] O termo “valina desidrogenase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de a-cetoisovalerato em L-valina, tipicamente utilizando NAD(P)H como doador de elétrons e amônia como doador de amina. Exemplos de valina desidrogenases são conhecidos pelos números EC 1.4.1.8 e 14.19 e tais enzimas estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não se limitando a, Streptomyces coelicolor (GenBank Nº: NP 628270 (SEQ ID NO: 84), NC 003888 (SEQ ID NO: 85)) e Bacillus subtilis (GenBank Nº: CAB14339 (SEQ ID NO: 86), 299116 (SEQ ID NO: 87)).

[0186]O termo “valha descarboxilase” referese a um polipeptídeo (ou polipeptídeos), possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de L-valina em isobutilamina e CO>. Exemplos de valina descarboxilases são conhecidos pelo número EC 4.1.1.14. Estas enzimas são encontradas em Streptomyces, tal como, por exemplo, Streptomyces viridifaciens (GenBank Nº: AAN10242 (SEQ ID NO: 88), AY116644 (SEQ ID NO: 89)).

[0187] O termo “ômega transaminase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de isobutilamina em isobutiraldeído usando um aminoácido adequado como um doador de amina. Exemplos de ômega transaminases são conhecidos pelo número EC 2.6.1.18 e estão disponíveis a partir de inúmeras fontes, incluindo, mas não se limitando a, Alcaligenes denitrificans (AAP92672 (SEQ ID NO: 90), AY330220 (SEQ ID NO: 91)), Ralstonia eutropha (GenBank Nº: YP 294474 (SEQ ID NO: 92), NO 007347 (SEQ ID NO: 93)), Shewanella oneidensis (GenBank Nº: NP 719046 (SEQ ID NO: 94), NC 004347 (SEQ ID

NO: 95)), e P. putida (GenBank Nº: AAN66223 (SEQ ID NO: 96), AE016776 (SEQ ID NO: 97)).

[0188] O termo “acetil-CoA acetiltransferase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de duas moléculas de acetil-CoA para acetoacetil-CoA e coenzima A (CoA). Exemplos de acetil-CoA acetiltransferases preferidas são as acetil-CoA acetiltransferases com preferências de substrato (reação na direção forward) para uma acil-CoA e acetil-CoA de cadeia curta e são classificadas como E.C. 2.3.1.9 [Enzyme Nomenciature 1992, Academic Press, San Diego], embora as enzimas com uma faixa mais ampla de substratos (C.E. 2.3.1.16) também sejam funcionais. As acetil-CoA acetiltransferases estão disponíveis a partir de diversas fontes, por exemplo, E. coli (GenBank Nº: NP 416728, NC 000913; sequência de aminoácido NCBI, sequência de nucleotídeos NCBI), Clostridium acetobutylicum (GenBank Nº: NP 349476.1, NC 003030; NP 149242, NC 001988), Bacillus subtiis (GenBank Nº: NP 390297, NC 000964), e Saccharomyces cerevisiae (GenBank Nº: NP 015297, NC 001148).

[0189] O termo “3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo atividade enzimática que catalisa a conversão da acetoaceti-CoA em 3-hidroxibutiri-CoA. Exemplos de 3- hidroxibutiril-CoA desidrogenase podem ser dependentes de NADH, com uma preferência para o substrato (S)-3-hidroxibutiri-CoA ou (R)-3-hidroxibutiril-CoA. Exemplos podem ser classificados como EC 1.1.1.835 e EC 1.1.1.30, respectivamente. Adicionalmente, as S-hidroxibutiril-CoA desidrogenases podem ser dependentes de NAPH, com uma preferência de substrato para a (S)-3-hidroxibutiril-CoA ou (R)-3-hidroxibutiril-CoA e são classificadas como EC

1.1.1157 e EC 111.36, respectivamente. As —3-hidroxibutiri-CoA desidrogenases estão disponíveis a partir de diversas fontes, por exemplo,

Clostridium acetobutylicum (GenBank Nº: NP 349314, NC 003030), Bacillus subtilis (GenBank Nº: AABO9614, U29084), Ralstonia eutropha (GenBank Nº: YP 294481, NC 007347), e Alcaligenes eutrophus (GenBank Nº: AAA2Z1973, JO4987).

[0190] O termo “crotonases” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de 3-hidroxibutiri-CoA em crotonil-CoA e HO. As crotonases podem ter uma preferência para o substrato (S)-3-hidroxibutiril-CoA ou (R)-3-hidroxibutiri-CoA e podem ser classificadas como EC 4.2.1.17 e EC 4.2.1.55, respectivamente. As crotonases estão disponíveis a partir de diversas fontes, por exemplo, E. coli (GenBank Nº: NP 415911, NC 000913), Clostridium acetobutylicum (GenBank Nº: NP 349318, NC 003030), Bacillus subtilis (GenBank Nº: CAB13705, 299113), e Aeromonas caviae (GenBank Nº: BAA21816, D88825).

[0191]O termo “butirill-CoA desidrogenase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de crotoni-CoA em butirill-CoA. As butiril-CoA desidrogenases podem ser dependentes de NADH, dependentes de NADPH ou dependentes de flavina e são classificadas como EC 1.3.1.44, E.C. 1.3.1.38 e EC 1.3.99.2, respectivamente. As butiril-CoA desidrogenases estão disponíveis a partir de diversas fontes, por exemplo, Clostridium acetobutylicum (GenBank Nº: NP 347102, NC 003030), Euglena gracilis (GenBank Nº: Q5EU90, AY741582), Streptomyces collinus (GenBank Nº: AAA92890, U37135), e Streptomyces coelicolor (GenBank Nº: CAA22721, AL939127).

[0192]O termo “butiraldeído desidrogenase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de butiril-CoA para butiraldeído, usando o NADH ou NADPH como cofator. As butiraldeído desidrogenases com uma preferência para NADH são conhecidas como EC 1.2.1.57 e estão disponíveis a partir do,

por exemplo, Clostridium beijerinckii (GenBank Nº: AAD31841, AF157306) e Clostridium acetobutylicum (GenBank Nº: NP.sub.--149325, NC.sub.--001988).

[0193] O termo “isobutiril-CoA mutase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de butiril-CoA em isobutiril-CoA. Esta enzima utiliza a coenzima B12 como cofator. Exemplos de isobutiril-CoA mutases são conhecidos pelo número EC 5.4.99.13. Estas enzimas encontram-se em diversas Streptomyces, incluindo, mas não se limitando a, Streptomyces cinnamonensis (GenBank Nº: AACO8713 (SEQ ID NO: 98), U67612 (SEQ ID NO: 99); CAB59633 (SEQ ID NO: 100), AJ246005 (SEQ ID NO: 101)), Streptomyces coelicolor (GenBank Nº: CAB70645 (SEQ ID NO: 102), AL939123 (SEQ ID NO: 103); CAB92663 (SEQ ID NO: 104), AL939121 (SEQ ID NO: 105)), e Streptomyces avermitilis (GenBank Nº: NP 824008 (SEQ ID NO: 106), NC 003155 (SEQ ID NO: 107); NP 824637 (SEQ ID NO: 108), NO 003155 (SEQ ID NO: 109)).

[0194] O termo “acetolactato descarboxilase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos), possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de alfa-acetolactato em acetoína. As acetolactato descarboxilases são conhecidas como EC 4.1.1.5 e estão disponíveis, por exemplo, a partir do Bacillus subtilis (GenBank Nº: AAAZ2223, LO4470), Klebsiella terrigena (GenBank Nº: ARA25054, LO4507) e Klebsiella pneumonia (GenBank Nº: AAU43774, AY722056).

[0195] O termo “acetoína aminase” ou “acetoína transaminase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de acetoína em 3-amino-2-butanol. As acetoína aminases podem utilizar o cofator piridoxal 5-fosfato ou NADH ou NADPH. O produto resultante pode ter estereoquímica (R) ou (S) na posição 3. A enzima piridoxal dependente de fosfato pode utilizar um aminoácido tal como alanina ou glutamato como doador amino. As enzimas dependentes de NADH e NADPH podem utilizar amônia como segundo substrato. Um exemplo adequado de acetoína aminase dependente de NADH, também conhecida como amino álcool desidrogenase, é descrita por Ito et a/., (Patente US

6.432.688). Um exemplo de uma acetoína aminase dependente de piridoxal é a amina: piruvato aminotransferase (também chamada de amina:piruvato- transaminase), descrita por Shin e Kim (J. Org. Chem. 67: 2848-2853, 2002).

[0196] O termo “acetoína quinase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos), possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de acetoína em fosfoacetoína. A acetoína quinase pode utilizar ATP (trifosfato de adenosina) ou fosfoenolpiruvato como o doador de fosfato na reação. As enzimas que catalisam a reação análoga sobre o substrato dihidroxiacetona similar incluem, por exemplo, enzimas conhecidas como EC 2.7.1.29 (Garcia- Alles, et al, Biochemistry 43:13037-13046, 2004).

[0197]O termo “acetoína fosfato aminase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de fosfoacetoína em 3-amino-2-butanol O-fosfato. As acetoína fosfato aminases podem utilizar o cofator piridoxal 5'-fosfato ou NADH ou NADPH. O produto resultante pode ter estereoquímica (R) ou (S) na posição

3. A enzima piridoxal dependente de fosfato pode utilizar um aminoácido tal como alanina ou glutamato. As enzimas dependentes de NADH e NADPH podem utilizar amônia como segundo substrato. Embora não existam relatos de enzimas que catalisam esta reação sobre a fosfoacetoína, há uma enzima dependente de fosfato de piridoxal a qual é proposta realizar uma reação análoga sobre o substrato similar fosfato de serinol (Yasuta, et al. Appl. Environ. Microbial. 67: 4999-5009, 2001).

[0198]O termo “aminobutanol fosfato fosfoliase”, também denominado “aminoálcool liase O-fosfato,” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de

3-amino-2-butanol O-fosfato em 2-butanona. A amino butano! fosfato fosfoliase pode utilizar o cofator de piridoxal 5'-fosfato. Há relatos de enzimas que catalisam a reação análoga sobre o substrato similar 1-amino-2-propanol fosfato (Jones, et al, Biochem J. 134:. 167-182, 1973). A Publicação do Pedido de Patente US 2007/0259410 descreve um aminobutano! fosfato fosfoliase de Erwinia carotovora.

[0199] O termo “aminobutanol quinase” referese a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de 3-amino-2-butanol em 3-amino-2-butanol O-fosfato. À amino butanol quinase pode utilizar ATP como doador de fosfato. Embora não existam relatos de enzimas que catalisam esta reação sobre o 3-amino-2- butanol, existem relatos de enzimas que catalisam a reação análoga sobre substratos similares etanolamina e 1-amino-2-propanol (Jones, et al. Supra). À Publicação do Pedido de Patente US 2009/0155870 descreve, no Exemplo 14, uma amino álcool quinase de Erwinia carotovora subsp. Atroseptica.

[0200] O termo “butanodiol desidrogenase” também conhecido como “acetoína redutase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de acetoína em 2,3-butanodiol. As butanodiol desidrogenases são um subconjunto da ampla família das álcool desidrogenases. As enzimas butanodiol desidrogenases podem ter especificidade para produção de estereoquímica-(R) ou —(S) no produto álcool. As butanodiol desidrogenases (S)-específicas são conhecidas como EC 1.1.1.76 e estão disponíveis, por exemplo, a partir da Klebsiela pneumoniae (GenBank Nº: BBA13085, D86412). As butanodio!l desidrogenases R-específicas são conhecidas como EC 1.1.1.4 e estão disponíveis, por exemplo, a partir do Bacillus cereus (GenBank Nº. NP 830481, NC 004722; AAPO7682, AEO17000), e Lactococcus lactis (GenBank Nº. AAKO04995, AEONO6323).

[0201] O termo “butanodiol desidratase” também conhecido como

“dial desidratase” ou “propanodiol desidratase” refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a conversão de 2,3-butanodiol em 2-butanona. As butanodiol desidratases podem utilizar o cofator adenosil cobalamina (também conhecido como coenzima Bw ou vitamina B12, embora a vitamina B12 possa se referir também a outras formas de cobalamina que não são coenzima B12). As enzimas dependentes de adenosil cobalamina são conhecidas como EC 4.2.1.28 e estão disponíveis, por exemplo, a partir de Klebsiella oxytoca [(GenBank Nº: AAO8099 (subunidade alfa), D45071; BAAO8100 (subunidade beta), D45071; e BBAO8101 (subunidade gama), D45071 (Observe que todas as três subunidades são necessárias para atividade)], e Klebsiella pneumonia (GenBank Nº: AAC98384 (subunidade alfa) AFIO2064; AAC98385 (subunidade beta), AF102064; AAC98386 (subunidade gama), AF102064). Outras dial desidratases adequadas incluem, mas não estão limitadas a, dial desidratases dependentes de B12 disponíveis a partir de Salmonella typhimurium (GenBank Nº: AAB84102 (subunidade grande), AFO26270; AAB84103 (subunidade média), AFO26270; AAB84104 (subunidade pequena), AFO026270); e Lactobacillus collinoides (GenBank Nº: CAC82541 (subunidade grande), AJ297723; CAC82542 (subunidade média); AJ297723; CADO01091 (subunidade pequena), AJ297723); e enzimas de Lactobacilus brevis (particularmente das cepas CNRZ 734 e CNRZ 735, Speranza, et al., J. Agric. Food Chem. 45:3476-3480, 1997), e sequências de nucleotídeos que codificam enzimas correspondentes. Os métodos de isolamento de genes da dial desidratase são bem conhecidos no estado da técnica (por exemplo, Patente US 5.686.276).

[0202] O termo “piruvato descarboxilase” (PDC) refere-se a um polipeptídeo (ou polipeptídeos) possuindo uma atividade enzimática que catalisa a descarboxilação de ácido pirúvico em acetoaldeído e dióxido de carbono. As enzimas piruvato desidrogenases são conhecidas pelo número EC

4.1.1.1. Estas enzimas encontram-se em diversas leveduras, incluindo a Saccharomyces cerevisiae (GenBank Nº: CAA97575 (SEQ ID NO: 110), CAAS97705 (SEQ ID NO: 112), CAA9S7091 (SEQ ID NO: 114)).

[0203]Será apreciado que os micro-organismos compreendendo uma via biossintética do isobutanol conforme previsto na presente invenção possam compreender ainda uma ou mais modificações adicionais. A Publicação do Pedido de Patente US 2009/0305363 (incorporado ao presente pela referência) revela o aumento da conversão de piruvato em acetolactato pela engenharia genética em leveduras para a expressão de uma acetolactato sintase localizada no citosol e a eliminação substancial da atividade piruvato descarboxilase. Em alguns exemplos de realização, os micro-organismos podem compreender modificações para reduzir a atividade da glicerol-3-fosfato desidrogenase e/ou ruptura em pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo contendo atividade de piruvato descarboxilase ou uma ruptura em pelo menos um gene que codifica um elemento regulador que controla a expressão gênica da piruvato descarboxilase, tal como descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2009/0305363 (incorporada ao presente pela referência), as modificações em uma micro-organismo que fornecem um aumento do fluxo de carbono através de uma via Entner-Doudoroff ou redução do equilíbrio de equivalentes, tal como descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2010/0120105 (incorporada ao presente pela referência). Outras modificações incluem a integração de pelo menos um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa uma etapa em uma via biossintética que utiliza piruvato. Outras modificações incluem pelo menos uma deleção, mutação e/ou substituição de um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo que possui atividade de acetolactato redutase. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo possuindo atividade de acetolactato redutase é o YMR226c (SEQ ID NOs: 130, 131) de Saccharomyces cerevisiae ou um homólogo deste.

Modificações adicionais incluem uma inserção, deleção, mutação e/ou substituição de um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo possuindo atividade de aldeído desidrogenase e/ou atividade de aldeído oxidase.

Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo que possui atividade de aldeído desidrogenase é o ALD6 de Saccharomyces cerevisiae ou um homólogo deste.

Uma modificação genética, que tem o efeito de reprimir a redução de glicose, em que a célula hospedeira de produção é pdc é descrita na publicação do pedido de Patente US 2011/0124060, incorporada ao presente pela referência.

Em alguns exemplos de realização, a piruvato descarboxilase, que é deletada ou regulada negativamente, é selecionada a partir do grupo consistindo de: PDC1, PDC5, PDC6, e combinações destes.

Em alguns exemplos de realização, a piruvato descarboxilase é selecionada a partir das enzimas na Tabela 3 (SEQ ID NOs das Regiões Codificantes de Genes PDC Alvos e Proteínas). Em alguns exemplos de realização, os micro- organismos podem conter uma deleção ou regulação negativa de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de gliceraldeído-3-fosfato em glicerato 1,3 bisfosfato.

Em alguns exemplos de realização, a enzima que catalisa esta reação é a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.

TABELA3 Aminoácidos Acidos Nucleicos piruvato descarboxilase cerevisiae

Descrição SEQ ID NO: de SEQ ID NO: de e Aminoácidos Ácidos Nucleicos piruvato descarboxilase PDCS de 112 113 Saccharomyces cerevisiae piruvato descarboxilase PDC6 de 114 115 Saccharomyces cerevisiae piruvato descarboxilase de Candida glabrata 1186 17 piruvato descarboxilase PDC1 de Pichia stipitis 118 11º piruvato descarboxilase PDC?2 de Piíchia stípitis 120 12 piruvato descarboxilase 192 123 de Kluyveromyces lactis piruvato descarboxilase 124 125 de Yarrowia lipolytica piruvato descarboxilase de Schizosaccharomyces 126 127 pombe piruvato descarboxilase de Zygosaccharomyces 128 129 rouxii

[0204] As leveduras podem ter um ou mais genes que codificam a piruvato descarboxilase. Por exemplo, existe um gene que codifica a piruvato descarboxilase em Candida glabrata e Schizosaccharomyces pombe, enquanto existem três isozimas da piruvato descarboxilase codificadas pelos genes PDC1, PCD5, e PDC6 em Saccharomyces cerevisiae. Em alguns exemplos de realização, as células de levedura podem ter pelo menos um gene PDC que é inativado. Se a célula de levedura tem mais do que um gene PDC expresso (ativo), então, cada um dos genes PDC ativos podem ser modificados ou inativados, produzindo assim uma célula pac. Por exemplo, na levedura Saccharomyces cerevisiae, os genes PDC1, PDC5, e PDC6 podem ser modificados ou inativados. Se um gene PDC não está ativo sob as condições de fermentação sendo utilizadas, então, tal gene não precisa ser modificado ou inativado.

[0205] Outros genes-alvo, tais como aqueles que codificam proteínas piruvato descarboxilase possuindo pelo menos cerca de 70-75%, pelo menos cerca de 75-85%, pelo menos cerca de 80-85%, pelo menos cerca de 85% -90%, pelo menos cerca de 90-95%, ou pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou, pelo menos, cerca de 99% de identidade de sequência com as piruvato descarboxilases de SEQ ID NOs: 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126 ou 128 podem ser identificados na literatura e em bases de dados de bioinformática bem conhecidos para o técnico hábil no assunto.

[0206] Os micro-organismos podem compreender ainda (a) pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo possuindo a atividade de di-hidroxi-ácido desidratase; e (b) (i) pelo menos uma deleção, mutação, e/ou substituição de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo que afeta a biossíntese de centros Fe-S; e/ou (ii) pelo menos um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo que afeta a biossíntese de centros Fe-S. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo que afeta a biossíntese de centros Fe-S é codificado por AFT1, AFT2, FRAZ2, GRX3 ou CCC1. AFT1 e AFT2 estão descritos na Publicação PCT WO 2001/103300, que é aqui incorporada ao presente pela referência. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo que afeta a biossíntese de centros Fe-S é o mutante constitutivo AFT1 L99A, AFT1 L102A, AFT1 C291F, ou AFT1 C293F.

MÉTODOS DE DETECÇÃO

[0207] São divulgados na presente invenção métodos e processos adequados para a produção de butanol a partir de um substrato de carbono empregando um micro-organismo (por exemplo, uma célula hospedeira recombinante). A capacidade de utilizar substratos de carbono para produzir isobutanol pode ser confirmada utilizando métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo, mas não se limitando aos descritos na patente US

7.851.188, que é incorporada ao presente pela referência. Por exemplo, para confirmar a utilização da sacarose para produzir isobutanol, a concentração de isobutanol no meio de cultura pode ser determinada por uma série de métodos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, um método de cromatografia líquida de alto desempenho específico (HPLC) utiliza uma coluna de Shodexº SH-1011 com uma coluna de guarda Shodexº SH-G, (Waters Corporation, Milford, MA), com índice refrativo (RI) de detecção. A separação cromatográfica foi conseguida usando 0,01 M de H2SO, como fase móvel com velocidade de fluxo de 0,5 mL/min e temperatura de coluna de 50 ºC. O isobutanol teve um tempo de retenção de 46,6 min, nas condições usadas. Alternativamente, métodos de cromatografia gasosa (GC) estão disponíveis. Por exemplo, um método de GC específico utilizou uma coluna HP-INNOwax (30 m x 0,58 mm de diâmetro, uma espessura de filme de tum, Agilent Technologies, Wilmington, DE), com um detector de ionização de chama (FID). O gás de arraste foi o hélio a uma vazão de 4,5 mL/min, mensurado a 150 ºC com um nível de pressão constante; injetor tipo sp/it com razão split de 1:25 a 200 ºC; temperatura do forno foi de 45 ºC por 1 min, 45 a 220 ºC a 10 ºC/min e 220 ºC por 5 min; e foi empregada a detecção com um Detector por ionização de chama (FID) a 240 ºC, com 26 mL/min de gás hélio. O tempo de retenção do isobutano! foi de 4,5 min.

PRODUÇÃO DE BUTANOL

[0208] São divulgados na presente invenção métodos e processos adequados para a produção de butanol e utilizando um micro-organismo (por exemplo, célula hospedeira recombinante), e métodos para melhorar a viabilidade celular e a produtividade.

[0209] O termo “reciclagem de células” ou “reciclagem celular” refere-se ao processo pelo qual a levedura ou outros micro-organismos (por exemplo, células hospedeiras recombinantes) são separados a partir do caldo de fermentação, tal como por centrifugação, e em seguida reciclando a levedura de volta ao fermentador.

[0210] Em alguns exemplos de realização, a etapa de reciclagem de células é repetida, pelo menos, cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 125 vezes, pelo menos cerca de 150 vezes, pelo menos cerca de 175 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 250 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, ou mais.

[0211] O termo “lavagem ácida” ou “lavado com ácido” refere-se a qualquer lavagem ácida de suspensões de células. Em alguns exemplos de realização, a suspensão de células pode ser uma suspensão de leveduras ou outros micro-organismos (por exemplo, células hospedeiras recombinantes). À lavagem com ácido supera as dificuldades da técnica anterior juntamente com a conversão eficaz de substratos de carbono em butano! ou outros produtos da fermentação devido à presença de contaminantes microbianos. A lavagem ácida é descrita na Publicação do Pedido de Patente US 2011/0207192, que é incorporada ao presente pela referência.

[0212] Durante a etapa de lavagem ácida, os contaminantes microbianos são expostos a um pH que é inferior a cerca de 2,0 pela adição de ácido. O pH pode ser maior do que cerca de 1, mas inferior a 3,0. Isto inclui todos os subvalores existentes entre, por exemplo, um pH de pelo menos cerca de 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8 ou 2,9, ou qualquer pH entre estes valores está incluído dentro do escopo da invenção.

[0213] Exemplos de intervalos de pH que podem ser utilizados incluem, pelo menos cerca de 1,0 a pelo menos cerca de 3,0, pelo menos cerca de 1,0 a pelo menos cerca de 2,9, pelo menos cerca de 1,0 a pelo menos cerca de 2,8, pelo menos cerca de 1,0 a pelo menos cerca de 2,75, pelo menos cerca de 1,0 a pelo menos cerca de 2,5, pelo menos cerca de 1,0 a pelo menos cerca de 2,4, pelo menos cerca de 1,0 a pelo menos cerca de 2,3, pelo menos cerca de 1,0 a pelo menos cerca de 2,2, pelo menos cerca de 1,0 a pelo menos cerca de 2,1,ou pelo menos cerca de 1,0 a pelo menos cerca de 2,0.

[0214] Em um exemplo de realização da invenção, o ácido é um ácido mineral selecionado dentre o grupo consistindo de: ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ácido sulfuroso, ácido fosfórico e ácido nítrico.

[0215] Em alguns exemplos de realização, a etapa de lavagem ácida das células é repetida, pelo menos, cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 125 vezes, pelo menos cerca de 150 vezes, pelo menos cerca de 175 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 250 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, ou mais.

[0216] Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante é submetida a uma etapa de lavagem ácida durante a reciclagem de células. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante é submetida a uma etapa de lavagem ácida após a reciclagem de células. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante é submetida a uma etapa de lavagem ácida a cada reciclagem de células. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante é submetida a uma etapa de lavagem ácida a cerca de pelo menos cada etapa de reciclagem de células, a cerca de pelo menos cada três etapas de reciclagem de células, a cerca de pelo menos cada quatro etapas de reciclagem de células, a cerca de pelo menos cada cinco etapas de reciclagem de células, a cerca de pelo menos cada seis etapas de reciclagem de células, a cerca de pelo menos cada sete etapas de reciclagem de células, a cerca de pelo menos cada oito etapas de reciclagem de células, a cerca de pelo menos cada nove etapas de reciclagem de células, a cerca de pelo menos cada dez etapas de reciclagem de células, a cerca de pelo menos cada quinze etapas de reciclagem de células, a cerca de pelo menos cada vinte etapas de reciclagem de células ou mais.

[0217] O termo “rejuvenescimento” refere-se a um processo pelo qual a levedura ou outros micro-organismos (por exemplo, células hospedeiras recombinantes) são separados a partir do caldo de fermentação, tal como por centrifugação, e expostos a um meio rico em nutrientes por um período de tempo.

[0218] O termo “meio rico em nutrientes” refere-se ao meio, formulações, ou composições que podem conter qualquer um dos seguintes: substrato de carbono, nitrogênio, minerais, oligoelementos e vitaminas. Por exemplo, o meio rico em nutrientes pode conter qualquer um dos seguintes: biotina, pantotenato, ácido fólico, niacina, ácido aminobenzóico, piridoxina, riboflavina, tiamina, inositol, potássio (por exemplo, fosfato de potássio), ácido bórico, cálcio, crômio, cobre (por exemplo, sulfato de cobre), iodeto (por exemplo, iodeto de potássio), ferro (por exemplo, cloreto férrico), lítio, magnésio (por exemplo, sulfato de magnésio), manganês (por exemplo, sulfato de manganês), molibdênio, cloreto de cálcio, cloreto de sódio, vanádio, zinco (por exemplo, sulfato de zinco), extrato de levedura, peptona de soja, e similares.

[0219] Em alguns exemplos de realização, o processo de rejuvenescimento pode ser repetido pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, ou mais.

[0220] Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante é submetida a um processo de rejuvenescimento após a etapa de lavagem ácida. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante é submetida a um processo de rejuvenescimento após cada lavagem ácida. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante é submetida ao processo de rejuvenescimento a pelo menos cerca de cada etapa de lavagem ácida, a pelo menos cerca de cada três etapas de lavagem ácida, a pelo menos cerca de cada quatro etapas de lavagem ácida, a pelo menos cerca de cada cinco etapas de lavagem ácida, a pelo menos cerca de cada seis etapas de lavagem ácida, a pelo menos cerca de cada sete etapas de lavagem ácida, a pelo menos cerca de cada oito etapas de lavagem ácida, a pelo menos cerca de cada nove etapas de lavagem ácida, a pelo menos cerca de cada quinze ou mais etapas de lavagem ácida.

[0221] Em um exemplo de realização, a presente invenção é direcionada a um processo para a produção de um álcool caracterizado por compreender: (a) o fornecimento de um micro-organismo, em que o micro- organismo produz um álcool; (b) o contato do micro-organismo com uma ou mais fontes de carbono, em condições nas quais o álcoo! é produzido; (c) a coleta do micro-organismo;

(d) a recuperação do álcool; (e) o contato do micro-organismo da etapa (c) com um ou mais substratos de carbono, em condições nas quais o álcool é produzido; (f) a repetição das etapas (c) - (e); e Opcionalmente, a exposição do micro-organismo coletado da etapa (c) à condições de baixo pH;

[0222] EM um exemplo de realização, a presente invenção é direcionada a um processo para a produção de butanol compreendendo: (a) o fornecimento de um micro-organismo, em que o micro- organismo produz butanol!; (b) o contato do micro-organismo com um ou mais substratos de carbono, em condições em que o butanol é produzido em um rendimento eficaz; (c) a coleta do micro-organismo; (d) a recuperação do butanol; (b) o contato do micro-organismo da etapa (c) com um ou mais substratos de carbono, em condições em que o butanol é produzido em um rendimento eficaz; (f) a repetição das etapas (c) - (e); e, opcionalmente a exposição do micro-organismo da etapa (c) à condições de baixo pH;

[0223]EmM um exemplo de realização, a presente invenção é direcionada a um processo para a produção de um álcool caracterizado por compreender: (a) o fornecimento de um micro-organismo, em que o micro- organismo produz um álcool; (b) o contato do micro-organismo com um ou mais substratos de carbono, em condições nas quais o álcoo! é produzido;

(c) a coleta do micro-organismo; (d) a recuperação do álcool; (e) o contato do micro-organismo da etapa (c) com um meio rico em nutrientes.

(f) a coleta do micro-organismo da etapa (e); (9) o contato do micro-organismo da etapa (f) com um ou mais substratos de carbono, sob condições em que o álcool é produzido em um rendimento eficaz; (h) a repetição das etapas (c)—(g).

[0224] EM um exemplo de realização, a presente invenção é direcionada a um processo para a produção de butanol compreendendo: (a) o fornecimento de um micro-organismo, em que o micro- organismo produz butanol; (b) o contato do micro-organismo com um ou mais substratos de carbono, em condições em que o butanol é produzido em um rendimento eficaz; (c) a coleta do micro-organismo; (d) a recuperação do butanol; (e) o contato do micro-organismo da etapa (c) com um meio rico em nutrientes.

(f) a coleta do micro-organismo da etapa (e); (9) o contato do micro-organismo da etapa (f) com um ou mais substratos de carbono, em condições em que o butanol é produzido em um rendimento eficaz; (h) a repetição das etapas (c)—(g).

[0225]EmM um exemplo de realização, a presente invenção é direcionada a um processo para a produção de um álcool caracterizado por compreender:

(a) o fornecimento de um micro-organismo, em que o micro- organismo produz um álcool; (b) o contato do micro-organismo com um ou mais substratos de carbono, em condições nas quais o álcool! é produzido; (c) a coleta do micro-organismo; (d) a recuperação do álcool; (e) a exposição do micro-organismo da etapa (c) às condições de baixo pH; (f) a coleta do micro-organismo a partir da etapa (e); (9) o contato do micro-organismo da etapa (f) com um meio rico em nutrientes.

(h) a coleta do micro-organismo da etapa (g); (i) o contato do micro-organismo da etapa (h) com um ou mais substratos de carbono, em condições nas quais o álcool é produzido; e (]) opcionalmente, a repetição das etapas (c)—(i).

[0226] Em um exemplo de realização, a presente invenção é direcionada a um processo para a produção de butanol compreendendo: (a) o fornecimento de um micro-organismo, em que o micro- organismo produz butanol; (b) o contato do micro-organismo com um ou mais substratos de carbono, em condições em que o butanol é produzido em um rendimento eficaz; (c) a coleta do micro-organismo; (d) a recuperação do butanol; (e) a exposição do micro-organismo da etapa (c) às condições de baixo pH; (f) a coleta do micro-organismo a partir da etapa (e); (9) o contato do micro-organismo da etapa (f) com um meio rico em nutrientes.

(h) a coleta do micro-organismo da etapa (9); (i) o contato do micro-organismo da etapa (h) com um ou mais substratos de carbono, em condições em que o butanol é produzido em um rendimento eficaz; e (]) opcionalmente, a repetição das etapas (c)—(i).

[0227] Em alguns exemplos de realização, o pH é inferior ou igual a cerca de 2,0. Em alguns exemplos de realização, as condições de pH podem ser de cerca de 2 a cerca de 4. Em alguns exemplos de realização, o micro- organismo coletado pode ser exposto a condições de pH inferiores ou iguais a cerca de 2,0 por cerca de pelo menos uma hora. Em alguns exemplos de realização, o álcool produzido é metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol ou hexanol. Em alguns exemplos de realização, o butanol é isobutanol, 1-butanol, 2-butanol ou 2-butanona.

[0228] Em alguns exemplos de realização, quando é produzido butanol, o butanol é recuperado com uma concentração de pelo menos cerca de 6 g/L. Em alguns exemplos de realização, o rendimento eficaz da segunda etapa de contato (por exemplo, as etapas (e), (g), ()) é pelo menos cerca de 90% do rendimento eficaz da primeira etapa de contato (por exemplo, etapa (b)). Em alguns exemplos de realização, o rendimento eficaz da segunda etapa de contato (por exemplo, etapas (e), (g), ()) é pelo menos cerca de 99% do rendimento eficaz da primeira etapa de contato (por exemplo, etapa (b)). Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo é exposto durante pelo menos cerca de uma hora e/ou na presença pelo menos de cerca de 0,3% de butanol.

[0229] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo é reciclado por pelo menos 5 vezes. Em alguns exemplos de realização, o micro- organismo é reciclado por pelo menos 10 vezes. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo é lavado com ácido durante a etapa de reciclagem. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo é lavado com ácido após a etapa de reciclagem.

[0230] Em alguns exemplos de realização, após a produção de isobutanol desejado, o micro-organismo pode ser coletado. A coleta pode ser realizada por qualquer método conhecido no estado da técnica, incluindo, por exemplo, a centrifugação. Em alguns exemplos de realização, o micro- organismo coletado pode ser submetido a condições ácidas, e, em seguida, colocado novamente em contato com o substrato de carbono em uma etapa de lavagem ácida. Em alguns exemplos de realização da invenção utilizando a reciclagem de células, o ácido pode ser adicionado à suspensão de células, que é separada a partir do caldo de fermentação antes de voltar a contatar as células tratadas com ácido com o substrato de carbono. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo coletado pode ser submetido a um meio rico em nutrientes por um período de tempo, coletado e coletado novamente com o substrato de carbono. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser submetido à lavagem ácida antes da exposição ao meio rico em nutrientes.

[0231] Em alguns exemplos de realização, o primeiro contato com o substrato de carbono pode ocorrer em condições anaeróbias. Em alguns exemplos de realização, o primeiro contato com o substrato de carbono pode ocorrer em condições microaeróbicas. Em alguns exemplos de realização, a reciclagem pode ocorrer em condições anaeróbicas. Em alguns exemplos de realização, a reciclagem pode ocorrer em condições microaeróbicas.

[0232] Em alguns exemplos de realização, o substrato de carbono é selecionado a partir do grupo consistindo de: oligossacarídeos, polissacarídeos, monossacarídeos e misturas dos mesmos. Em alguns exemplos de realização, o substrato de carbono é selecionado a partir do grupo consistindo de: frutose, glicose, lactose, maltose, galactose, sacarose, amido, celulose, matérias primas, etanol, lactato, succinato, glicerol, mosto de milho, cana-de-açúcar, biomassa, um açúcar C5, tal como a xilose e arabinose, e misturas dos mesmos.

[0233] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo é colocado em contato com os substratos de carbono sob condições em que o isobutanol! é produzido. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo em uma determinada densidade celular pode ser adicionado a um recipiente de fermentação, juntamente com os meios adequados. Em alguns exemplos de realização, os meios podem conter o substrato de carbono, ou o substrato de carbono pode ser adicionado separadamente. Em alguns exemplos de realização, o substrato de carbono pode estar presente em qualquer concentração no início e/ou durante a produção de isobutanol.

[0234] Em alguns exemplos de realização, a concentração inicial de substrato de carbono está na faixa de aproximadamente 60 a 80 g/L.

[0235] As temperaturas adequadas para a fermentação são conhecidas pelos especialistas na técnica e dependerá do gênero e/ou espécie de micro-organismo utilizado. Em alguns exemplos de realização, as temperaturas adequadas estão na faixa de 25 ºC a 43 ºC. Em alguns exemplos de realização, o contato ocorre até que pelo menos cerca de 90% da sacarose é utilizada ou até que um título eficaz de isobutanol desejado seja alcançado. Em alguns exemplos de realização, o título eficaz de isobutanol é pelo menos cerca de 40 g/L, pelo menos cerca de 50 g/L, pelo menos cerca de 60 g/L, pelo menos cerca de 70 g/L, pelo menos cerca de 80 g/L, pelo menos cerca de 90 g/L, pelo menos cerca de 100 g/L, ou pelo menos cerca de 110 g/l. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser incubado a uma temperatura de 30 ºC a 37 ºC. Em alguns exemplos de realização, o micro- organismo pode ser incubado por um período de tempo de uma a cinco horas.

Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser incubado com agitação (por exemplo, 100 a 400 rpm) em agitadores (Innova 44R, New Brunswick Scientific, CT, EUA).

[0236] O contato entre o micro-organismo e o substrato de carbono pode ser qualquer período de tempo em que o isobutanol é produzido. Em alguns exemplos de realização, o contato do micro-organismo com um ou mais substratos de carbono é de pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 12 horas, pelo menos cerca de 24 horas, pelo menos cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 72 horas, pelo menos cerca de 96 horas, pelo menos cerca de 120 horas, pelo menos cerca de 144 horas, pelo menos cerca de 168 horas, pelo menos cerca de 192 horas, pelo menos cerca de 216 horas ou mais. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo é lavado com ácido após a etapa de contato. Em alguns exemplos de realização, o contato ocorre em menos de 8 horas.

[0237] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo está presente a uma densidade celular de pelo menos cerca de 0,5 gdew/L no primeiro contato com o substrato de carbono. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser cultivado a uma densidade celular de pelo menos cerca de 6 gdcw/L antes do contato com o substrato de carbono para a produção de isobutanol. Em alguns exemplos de realização, a densidade celular pode ser pelo menos cerca de 20 gdcew/L, pelo menos cerca de 25 gdcw/L, ou pelo menos cerca de 35 gdew/L, antes do contato com o substrato de carbono.

[0238] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo tem uma produtividade específica de pelo menos cerca de 0,1 g/gdew/h. Em alguns exemplos de realização, o butanol é produzido a uma taxa eficaz de pelo menos cerca de 0,1 g/gdew/h durante o primeiro contato com o substrato de carbono. Em alguns exemplos de realização, o primeiro contato com o substrato de carbono ocorre na presença de um agente de extração (extrator). Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo mantém uma taxa de captação de açúcar pelo menos de cerca de 1,0 g/gdew/h. Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo mantém uma taxa de captação de açúcar pelo menos de cerca de 0,5 g/g/hr. Em alguns exemplos de realização, a taxa de utilização da glicose é de pelo menos cerca de 2,5 g/gdew/h. Em alguns exemplos de realização, a velocidade de absorção da glicose é pelo menos de cerca de 2,5 g/gdew/h. Em alguns exemplos de realização, a velocidade de absorção da glicose e frutose combinadas é pelo menos de cerca de 2,5 g/gdcw/h.

[0239] Em alguns exemplos de realização, o primeiro contato com o substrato de carbono pode ocorrer na presença de um agente de extração (extrator). Em alguns exemplos de realização, o primeiro contato com o substrato de carbono na presença de um agente de extração (extrator) ocorre em condições anaeróbicas. Em alguns exemplos de realização, o primeiro contato com o substrato de carbono na presença de um agente de extração (extrator) ocorre em condições microeróbicas.

[0240] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo produz butanol a pelo menos cerca de 90% do rendimento eficaz, a cerca de 91% do rendimento eficaz, a cerca de 92% do rendimento eficaz, a cerca de 93% do rendimento eficaz, a cerca de 94% do rendimento eficaz, a cerca de 95% do rendimento eficaz, a cerca de 96% do rendimento eficaz, a cerca de 97% do rendimento eficaz, a cerca de 98% do rendimento eficaz, ou a cerca de 99% do rendimento eficaz. Em alguns exemplos de realização, o micro- organismo produz butanol de pelo menos cerca de 55%, a pelo menos cerca de 75% do rendimento eficaz, pelo menos, cerca de 50% a pelo menos cerca de 80% do rendimento eficaz, pelo menos, cerca de 45% a pelo menos cerca de 85% do rendimento eficaz, pelo menos, cerca de 40% a pelo menos cerca de 90% do rendimento eficaz, pelo menos, cerca de 35% a pelo menos cerca de 95% do rendimento eficaz, pelo menos, cerca de 30% a pelo menos cerca de 99% do rendimento eficaz, pelo menos cerca de 25% a pelo menos cerca de 99% do rendimento eficaz, pelo menos, cerca de 10% a pelo menos cerca de 99% do rendimento eficaz ou, pelo menos, cerca de 10% a pelo menos cerca de 100% de rendimento eficaz.

[0241] Em alguns exemplos de realização, o micro-organismo pode ser uma célula hospedeira recombinante. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante pode compreender uma via biossintética do butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do butanol é uma via biossintética de isobutanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do isobutanol compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de um substrato em produto, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) piruvato em acetolactato, (b) acetolactato em 2,3-dihidroxiisovalerato, (c) 2,3- dihidroxiisovalerato “em 2-cetoisovalerato; (d) 2-cetoisovalerato em isobutiraldeído, e (e) isobutiraldeído em isobutanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do isobutanol compreende polinucleotídeos que codificam polipeptídeos possuindo atividade de acetolactato sintase, atividade de cetoácido redutoisomerase, atividade de ácido dihidroxi desidratase, atividade de cetoisovalerato descarboxilase e/ou atividade de álcool desidrogenase.

[0242] Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do isobutanol pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de um substrato em produto, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) de piruvato em acetolactato, (b) de acetolactato em 2,3-dihidroxiisovalerato, (c) de 2,3-dihidroxiisovalerato em a-cetoisovalerato; (d) a-cetoisovalerato em isobutiril CoA; (e) isobutiril CoA em isobutirilaldeído; e (f)

isobutirilaldeído em isobutanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do isobutanol compreende polinucleotídeos que codificam polipeptídeos possuindo atividade de acetolactato sintase; atividade de ácido acetohidróxi redutoisomerase; atividade de ácido acetohidróxi desidratase; atividade de desidrogenase de cetoácido de cadeia ramificada, atividade de aldeído desidrogenase; e atividade de álcool desidrogenase de cadeia ramificada.

[0243] Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante pode compreender uma via biossintética de 1-butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do 1-butanol pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de um substrato em produto, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) acetil- CoA em acetoacetil-CoA; (b) acetoacetil-CoA em 3-hidroxibutiril-CoA; (c) 3- hidroxibutiril-CoA em crotonil-CoA; (d) crotonil-CoA em butiril-CoA; (e) butiril- CoA em butiraldeído, e (f) butiraldeído em 1-butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética de 1-butanol pode compreender polinucleotídeos que codificam polipeptideos possuindo atividade de aceti-CoA- acetiltransferase; atividade de 3-hidroxibutiril-CoA-desidrogenase; atividade de crotonase; atividade de butiril-CoA desidrogenase; atividade de butiraldeído desidrogenase e butanol desidrogenase.

[0244] Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante pode compreender uma via biossintética de 2-butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do 2-butanol compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de um substrato em produto, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) piruvato em alfa-acetolactato; (b) alfa-acetolactato em acetoína; (c) acetoína em 3- amino-2-butanol; (d) 3-amino-2-butanol em fosfato de 3-amino-2-butanol; (e) fosfato de 3-amino-2-butanol em 2-butanona; e (f) 2-butanona em 2-butanol.

Em alguns exemplos de realização, a via biossintitética de 2-butanol compreende polinucleotídeos que codificam polipeptídeos possuindo atividade de acetolactato sintase, acetolactato descarboxilase, atividade de acetonina aminase, atividade de aminobutanol quinase, atividade de fosfato de aminobutano!l fosforilase, e atividade de butanol desidrogenase.

[0245] Em alguns exemplos de realização, a via biossintética do 2- butanol pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que catalisa a conversão de um substrato em produto, selecionado a partir do grupo consistindo de: (a) de piruvato em alfa-acetolactato, (b) de alfa- acetolactato em acetoína, (c) acetoína em 2,3-butanodiol; (d) de 2,3-butanodiol em 2-butanona; e (e) de 2-butanona em 2-butanol. Em alguns exemplos de realização, a via biossintitética de 2-butanol compreende polinucleotídeos que codificam polipeptídeos possuindo atividade de acetolactato sintase, atividade de acetolactato descarboxilase, atividade de butanodiol desidrogenase; atividade de diol desidratase; e atividade de butanol desidrogenase.

[0246] Em alguns exemplos de realização, um ou mais substratos para as conversões de produto utiliza NADH ou NADPH como cofator. Em alguns exemplos de realização, o NADH é o cofator preferido.

[0247] Em alguns exemplos de realização, a via do butanol da célula hospedeira recombinante compreende pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de enzimas que têm os seguintes Números da Comissão de Enzimas: EC 2.2.1.6, EC 1.1.1.86, EC 4.2.1.9, EC 4.1.1.72, EC

1.1.1.1, EC 1.1.1.265, EC 1.1.1.2, EC 1.2.4.4, EC 1.3.99.2, EC 1.2.1.57, EC

1.2.1.10, EC 2.6.1.66, EC 2.6.1.42, EC 1.4.1.9, EC 1.4.1.8, EC 4.1.1.14, EC

2.6.1.18, EC 2.3.1.9, EC 2.3.1.16, EC 1.1.130, EC 1.1.1.35, EC 1.1.1.157, EC

1.1.1.36, EC 4.2.1.17, EC 4.2.1.55, EC 1.3.1.44, EC 1.3.1.38, EC 5.4.99.13, EC

4.1.1.5, EC 2.7.1.29, EC 1.1.1.76, EC 1.2.1.57, e EC 4.2.1.28.

[0248] Em alguns exemplos de realização, a via do butanol da célula hospedeira recombinante compreende pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do seguinte grupo de enzimas: acetolactato sintase, ácido acetohidroxi isomeroredutase, ácido ácido acetohidroxi desidratase, descarboxilase de ácido alfa-ceto de cadeia ramificada, desidrogenase de álcool de cadeia ramiíficada, aldeído desidrogenase acilante, desidrogenase de ácido ceto de cadeia ramificada, butiri-CoA-desidrogenase, butiraldeído desidrogenase, transaminase, valina desidrogenase, valina descarboxilase, transaminase — ômega, — acetil-CoA-acetiltransferase, — 3-hidroxibutiril-CoA- desidrogenase, crotonase, butiri-CoA-desidrogenase, isobutiri-CoA-mutase, acetolactato-descarboxilase, acetonina aminase, butanol desidrogenase, butiraldeído desidrogenase, acetoína quinase, acetoína fosfato aminase, fosfato — aminobutanol — fosfoliase, aminobutanol quinase, butanodiol- desidrogenase, e butanodiol desidratase.

[0249] Em alguns exemplos de realização, as enzimas partir das vias de biossíntese estão localizadas no citosol. Em alguns exemplos de realização, as enzimas de vias biossintéticas que normalmente são localizadas nas mitocôndrias estão localizadas no citosol. Em alguns exemplos de realização, uma enzima a partir das vias biossintéticas está localizada no citosol pela remoção da sequência de direcionamento mitocondrial. Em alguns exemplos de realização, a mitocôndria é eliminada pela geração de novos códons de iniciação, tal como descrito, por exemplo, na Patente US 7.851.188, que é incorporada ao presente pela referência em sua totalidade. Em alguns exemplos de realização, a enzima partir das via biossintética que está localizada no citosol é DHAD. Em alguns exemplos de realização, a enzima partir das via biossintética que está localizada no citosol é KARI.

[0250] Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante pode compreender uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de um ou mais componentes da via de transdução de sinal cAMP. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante pode compreender uma ou mais modificações que alteram a expressão e/ou atividade de uma ou mais fosfodiesterases. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante pode compreender uma fosfodiesterase e/ou atividade de fosfodiesterase reduzida ou eliminada. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante pode compreender uma modificação em um polinucleotídeo codificante de um polipeptídeo possuindo atividade de fosfodiesterase. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante pode compreende uma inserção, deleção, mutação, e/ou substituição em um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo possuindo atividade de fosfodiesterase. Em alguns exemplos de realização, o polipeptíideo possuindo a atividade de fosfodiesterase corresponde à enzima com o Número da Comissão de Enzimas: EC 3.1.4.17. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo possuindo a atividade da fosfodiesterase é PDE1.

[0251] Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante não expressa ou possui expressão reduzida da piruvato descarboxilase. Em alguns exemplos de realização, a redução na expressão é resultado de uma inserção, deleção, mutação e/ou substituição de um gene que codifica a piruvato descarboxilase. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante pode compreender uma modificação em um polinucleotídeo codificante de um polipeptídeo possuindo atividade de descarboxilase. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante pode compreende uma inserção, deleção, mutação, e/ou substituição em um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo possuindo atividade de piruvato descarboxilase. Em alguns exemplos de realização, o polipeptídeo possuindo a atividade de piruvato descarboxilase é selecionado a partir do grupo consistindo de: PDC1, PDC5, PDC6, e combinações das mesmas. Em alguns exemplos de realização, o polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo possuindo a atividade da piruvato descarboxilase é selecionado a partir do grupo consistindo de: PDC1, PDC5, PDC6, e combinações das mesmas.

[0252] Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante não expressa ou possui expressão reduzida da gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase. Em alguns exemplos de realização, a redução na expressão é resultado de uma inserção, deleção, mutação e/ou substituição de um gene que codifica a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante não expressa ou tem expressão reduzida de BDH1. Em alguns exemplos de realização, a redução na expressão é resultado de uma inserção, deleção, mutação e/ou substituição de um gene que codifica BDH1. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante não expressa ou possui expressão reduzida de um gene codificante de acetolactato redutase. Em alguns exemplos de realização, a redução na expressão é resultado de uma inserção, deleção, mutação e/ou substituição de um gene que codifica YMR226c.

[0253] A presente invenção também é direcionada às composições compreendendo uma a célula hospedeira recombinante conforme descrito no presente. Em alguns exemplos de realização, a composição também compreende um meio rico em nutrientes. Em alguns exemplos de realização, a composição pode ter um pH de pelo menos cerca de 2. Em alguns exemplos de realização, a composição pode ter um pH inferior ou igual a cerca de 2. Em alguns exemplos de realização, a composição pode ter um pH de cerca de 2 a cerca de 4. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante da composição pode ser um membro do gênero Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces,

Yarrowia, Issatchenkia ou Pichia. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante da composição é Saccharomyces cerevisiae. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira recombinante pode compreender uma enzima modificada, que catalisa a conversão do substrato para produto: acetolactato para 2,3-di-hidroxi-isovalerato.

BUTANOLOGÊNICOS

[0254] Em alguns exemplos de realização, célula hospedeira recombinante pode ser um butanologênico. Em alguns exemplos de realização, o butanologênico pode ser um isobutanologênico. Em alguns exemplos de realização, isobutanologênicos adequados incluem qualquer levedura usada como hospedeiro útil para a modificação genética e expressão do gene recombinante. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira isobutanolgênica pode ser um membro do gênero Schizosaccharomyces, Issatchenkia, Kluyveromyces, Yarrowia, Pichia, Candida, Hansenula ou Saccharomyces. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira pode ser Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces thermotolerans, K. marxianus, Candida glabrata, Candida albicans, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, E. coli, ou Lactobacillus plantarum. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira é uma célula hospedeira de levedura. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira é um membro do gênero Saccharomyces. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira é Kluyveromyces lactis, Candida glabrata ou Schizosaccharomyces pombe. Em alguns exemplos de realização, a célula hospedeira — Saccharomyces —cerevisiae. As leveduras Saccharomyces cerevisiae são conhecidas no estado da técnica e estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes, incluindo, mas não se limitando a, American Type Culture Collection (Rockville, MD), Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, LeSaffre, Gert Strand AB, Ferm Solutions,

North American Bioproducts, Martrex e Lallemand. As Saccharomyces cerevisiae incluem, mas não estão limitadas a, BY4741, CEN.PK 113-7D, Ethanol RedO yeast, levedura Ferm Pro'Y, levedura Bio-Ferm6 XR, levedura Gert Strand Prestige Batch Turbo alcohol, levedura Gert Strand Pot Distillers, levedura Gert Strand Distillers Turbo, FerMax'” levedura Green, levedura FerMax'" Gold, levedura Thermosacc8, BG-1, PE-2, CAT-1, CBS7959, CBS7960 e CBS7961.

[0255] “PNY860" —refereese a uma cepa derivada da Saccharomyces cerevisiae, que foi depositada no banco de culturas norte- americano ATCC sob o Tratado de Budapeste em 21 de julho de 2011 no American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 e possui a designação de depósito de patente PTA-12007.

[0256] Em alguns exemplos de realização, o isobutanologênico é um derivado da PNY860. Em alguns exemplos de realização, o isobutanologênico é um derivado haploide da cepa PNY860. Em alguns exemplos de realização, o isobutanologênico é um derivado não esporulados da PNY860. Em alguns exemplos de realização, o isobutanologênico é um derivado não proveniente do acasalamento da PNY860.

SUBSTRATOS DE CARBONO

[0257] Substratos de carbono apropriados podem incluir, mas não estão limitados a; monossacarídeos como a frutose ou glicose, oligossacarídeeos como a lactose, maltose, galactiose ou sacarose, polissacarídeos, como amido ou celulose ou misturas destes e misturas impuras de matérias-primas renováveis, tais como permeado do soro de queijo, água de maceração de milho, melaço de beterraba, e malte da cevada. Outros substratos de carbono podem incluir etanol, lactato, succinato ou glicerol.

[0258] “Açúcar” inclui monossacarídeos como a frutose ou glicose; oligossacarídeeos como a lactose, maltose, galactose ou sacarose;

polissacarídeos, como amido ou celulose; açúcares C5, como xilose e arabinose; e misturas dos mesmos.

[0259] Além disso, o substrato de carbono também pode ser substratos de um carbono tal como o dióxido de carbono, ou metanol para que a conversão metabólica em intermediários bioquímicos fundamentais seja demonstrada. Além de substratos de um e dois carbono(s) organismos metilotróficos são também conhecidos por utilizar uma variedade de outros compostos contendo carbono, como a metilamina, glucosamina e uma variedade de aminoácidos para a atividade metabólica. Por exemplo, leveduras metilotróficas são conhecidas por utilizar o carbono a partir da metilamina para formar trealose ou glicerol (Bellion et al, Microb. Growth C1 Compa,, [7º Int. Symp.J, (1993), 415 32, Editores: Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. /ntercept, Andover, Reino Unido). Da mesma forma, diversas espécies de Candida irá metabolizar alanina ou ácido oleico (Suiter et al. Arch. Microbiol. 153:485489, 1990). Por isso, é contemplada a possibilidade de que a fonte de carbono utiizada na presente invenção possa incluir uma grande variedade de substratos que contenham carbono e a fonte utilizada só será limitada pela escolha do micro-organismo.

[0260] Embora seja contemplado que todos os substratos de carbono mencionados acima e suas misturas sejam adequados para a presente invenção, em alguns exemplos de realização os substratos de carbono preferenciais são glicose, frutose e sacarose ou misturas destes com açúcares de C5 tal como a xilose e arabinose para células leveduras modificadas para usarem açúcares C5. A sacarose pode ser derivada de fontes renováveis, como cana-de-açúcar, beterraba, mandioca, sorgo doce, e misturas destes. A glicose e dextrose podem ser derivadas de fontes de grãos renováveis a partir da sacarificação de matérias-primas à base de amido, incluindo grãos como o milho, trigo, centeio, cevada, aveia e misturas destes.

Além disso, os açúcares fermentáveis podem ser derivados a partir de fontes renováveis de biomassa celulósica ou lignocelulósica por meio de processos de pré-tratamento e sacarificação, como descrito, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente US 2007/0031918 A1 que é incorporada ao presente pela referência. A biomassa inclui materiais que contêm celulose, e, opcionalmente, compreendendo ainda a hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. A biomassa pode também incluir componentes adicionais, tais como proteínas e/ou lipídios. A biomassa pode ser derivada de uma fonte única, ou a biomassa pode compreender uma mistura de derivados de mais de uma fonte, por exemplo, a biomassa pode compreender uma mistura de sabugo de milho e palha de milho, ou uma mistura de grama e folhas. À biomassa inclui, mas não é limitada a, cultivares destinadas a bioenergia, resíduos agrícolas, resíduos sólidos urbanos, resíduos sólidos industriais, lodo da fabricação de papel, resíduos verdes, madeira e resíduos florestais. Exemplos de biomassa incluem, mas não estão limitados a, grão de milho, sabugo de milho, resíduos de colheitas, como a casca de milho, palha de milho, gramíneas, trigo, palha de trigo, cevada, palha de cevada, feno, palha de arroz, gramíneas (Panicum virgatum), resíduos de papel, bagaço de cana-de- açúcar, sorgo, soja, componentes obtidos a partir de moagem de grãos, folhas, lascas de madeira, serragem, esterco animal, e misturas destes.

[0261] Em alguns exemplos de realização, o substrato de carbono é a glicose derivada do milho. Em alguns exemplos de realização, o substrato de carbono é a glicose derivada do trigo. Em alguns exemplos de realização, o substrato de carbono é a sacarose derivada da cana de açúcar.

[0262] Além de uma fonte de carbono adequada, o meio de fermentação pode conter minerais adequados, sais, cofatores, tampões e outros componentes apropriados, conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto, adequados para o crescimento das culturas e promoção de uma via enzimática divulgada na presente invenção.

CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO

[0263] Normalmente, as células são cultivadas a uma temperatura na faixa de cerca de 20 ºC até cerca de 40 ºC em um meio apropriado. Meios de crescimento adequados na presente invenção incluem meios comuns comercialmente preparados, tal como o caldo Dextrose Sabouraud (SD), caldo meio de levedura (YM), ou caldo que inclui base nitrogenada de levedura, sulfato de amônio e dextrose (como fonte de carbono/energia) ou meio YPD, uma mistura de peptona, extrato de levedura e dextrose em proporções ótimas para o cultivo da maioria das cepas de Saccharomyces cerevisiae. Outros meio de cultura definido ou sintético também podem ser usados, e o meio adequado para o crescimento do micro-organismo em questão será do conhecimento de um técnico no assunto da ciência da microbiologia ou fermentação. O uso de agentes que modula a repressão catabólica, de maneira direta ou indireta, por exemplo, a adenosina cíclica 2':3'-monofosfato, também pode ser incorporado ao meio de fermentação.

[0264] Os intervalos de pH adequados para a fermentação são de cerca de pH 3,0 a cerca de pH 9,0. Em um exemplo de realização, cerca de pH 6,0 a cerca de pH 8,0 é usado para a condição inicial. Os intervalos de pH adequados para a fermentação de leveduras estão tipicamente de pH 3,0 a cerca de pH 9,0. Em um exemplo de realização, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 8,0 é usado para a condição inicial. Os intervalos de pH adequados para a fermentação de outros micro-organismos estão tipicamente entre cerca de pH 3,0 a cerca de pH 7,5. Em um exemplo de realização, cerca de pH 4,5 a cerca de pH 6,5 é usado para a condição inicial.

[0265] As fermentações podem ser realizadas sob condições aeróbicas ou anaeróbicas. Em exemplos de realização, podem ser utilizadas condições anaeróbias ou microaeróbicas para as fermentações.

FERMENTAÇÕES CONTÍNUA E DESCONTÍNUA (BATCH) INDUSTRIAIS

[0266] O isobutanol|, ou outros produtos da fermentação, pode ser produzido usando um método de fermentação descontínuo (em batelada ou “batch”). Uma fermentação clássica em batelada é um sistema fechado onde a composição do meio é estabelecia no início da fermentação e não está sujeita a alterações artificiais durante a fermentação. Uma variação no sistema em batelada padrão é o sistema descontínuo alimentado (ou sistema batelada- alimentado — “Fed-batch"). Os processos de fermentação descontínua- alimentada são aplicáveis também na presente invenção e compreendem um sistema em batelada “batch” típico, com a exceção de que o substrato é adicionado em incrementos enquanto a fermentação progride. Os sistemas descontínuos alimentados são úteis quando a repressão catabólica é capaz de inibir o metabolismo das células e onde é desejável dispor de uma quantidade limitada de substrato no meio. As fermentações descontínuas (Batch) e descontínuas alimentadas (Fed-Batch) são comuns e bem conhecidas no estado da técnica e exemplos podem ser encontrados em Thomas D. Brock em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edição, (1989), Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, ou em Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227, 1992).

[0267] O isobutanol, ou outros produtos da fermentação, também pode ser produzido usando métodos de fermentação contínua. A fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é acrescentado continuamente a um recipiente de fermentação (por exemplo, um biorreator) e uma quantidade igual de meio condicionado é removido ao mesmo tempo para o processamento. A fermentação contínua, geralmente mantém as culturas com uma densidade elevada e constante, em que as células estão essencialmente na fase de crescimento /og. A fermentação contínua possibilita a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam o crescimento celular ou a concentração do produto final. Métodos de modulação nutrientes e fatores de crescimento para os processos de fermentação contínua, bem como técnicas para maximizar a taxa de formação do produto são bem conhecidos no estado da técnica da microbiologia industrial e uma variedade de métodos é detalhada por Brock, supra.

[0268] Contempla-se que a produção de isobutanol, ou outros produtos da fermentação, possa ser praticada usando os processos descontínuo (Batch), descontínuo alimentado (Fed-Batch), ou contínuo, e que qualquer — modalidade “conhecida de fermentação seria adequada. Adicionalmente, é contemplado que as células podem ser imobilizadas em um substrato, como catalisadores de células inteiras e submetidas a condições de fermentação para a produção de isobutanol.

MÉTODOS PARA O ISOLAMENTO DE ISOBUTANOL A PARTIR DO MEIO DE FERMENTAÇÃO

[0269] O isobutanol bioproduzido ou outros alcoóis fermentativos podem ser isolados a partir do meio de fermentação usando métodos conhecidos no estado da técnica para fermentações ABE (vide, por exemplo, Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:639-648, 1998, Groot et al. Process. Biochem 27:61-75, 1992, e as referências citadas). Por exemplo, os sólidos podem ser removidos do meio de fermentação por centrifugação, filtração, decantação, ou algum método similar. Em seguida, o isobutanol pode ser isolado do meio de fermentação utilizando métodos como a destilação, destilação azeotrópica, extração líquido-líquido, adsorção, evaporação gasosa, evaporação em membrana, pervaporação ou combinações dos mesmos.

[0270] Pelo fato do isobutanol ter um baixo ponto de ebulição, mistura azeotrópica com água, a destilação só pode ser usada para separar a mistura até à sua composição azeotrópica. A destilação pode ser usada em combinação com outro método de separação para se obter a separação em torno do azeótropo. Métodos que podem ser utilizados em combinação com a destilação para isolar e purificar isobutanol incluem, mas não estão limitados a, decantação, extração líquido-líquido, adsorção e técnicas baseados em membranas. Além disso, o isobutanol pode ser isolado usando destilação azeotrópica usando um incorporador (vide, por exemplo, Doherty e Malone, Conceptual Design of Distillation Systems, McGraw Hill, Nova lorque, 2001).

[0271]A mistura Ááguaisobutanol forma um azeótropo heterogêneo de modo que a destilação pode ser usada em combinação com a decantação para isolar e purificar o isobutanol. Neste método, o caldo de fermentação contendo o isobutanol é destilado até próximo da composição azeotrópica. Em seguida, a mistura azeotrópica é condensada, e o isobutanol é separado do meio de fermentação por decantação. A fase aquosa decantada pode ser devolvida à coluna de destilação como refluxo. A fase orgânica decantada rica em isobutanol pode ainda ser purificada por destilação, por exemplo, em uma segunda coluna de destilação.

[0272] O isobutanol também pode ser isolado do meio de fermentação utilizando extração líquido-líquido em combinação com a destilação. Neste método, o isobutanol é extraído do caldo de fermentação utilizando a extração líquido-líquido com um solvente adequado. A fase orgânica contendo isobutanol é destilada para separar o isobutanol do solvente.

[0273] A destilação em combinação com adsorção também pode ser usada para isolar o isobutanol do meio de fermentação. Neste método, o caldo de fermentação contendo o isobutanol é destilado até próximo da composição azeotrópica e então a água restante é removida por meio de uma peneira adsorvente, tal como uma peneira molecular (Aden et al, Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehyarolysis and Enzymatic Hyarolysis for Corn Stover,

Referência NREL/TP-510-32438, Laboratório Nacional! de Energias Renováveis, Junho de 2002).

[0274] Além disso, a destilação em combinação com a pervaporação pode ser usada para isolar e purificar o isobutanol a partir do meio de fermentação. Neste método, o caldo de fermentação contendo o isobutano! é destilado até próximo da composição azeotrópica, e então a água restante é removida por pervaporação por meio de uma membrana hidrofílica (Guo et al. J. Membr. Sci. 245, 199-210 (2004)). Outros métodos de destilação podem ser utilizados, incluindo aqueles descritos na Publicação do Pedido de Patente US 2011/0162953; Publicação do Pedido de Patente US 2011/0162954; Publicação do Pedido de Patente US 2011/0288345; Publicação do Pedido de Patente US 2011/0288344; e Publicação do Pedido de Patente US 2011/0315541; cujos conteúdos são integralmente incorporados ao presente pela referência.

[0275] A remoção do produto in situ (ISPR) (também referida como fermentação extrativa) pode ser usada para remover o isobutanol ou outro álcool de fermentação a partir do recipiente de fermentação como este é produzido, permitindo desse modo que o micro-organismo produza isobutano! em alto rendimento. Um método ISPR para a remoção de alcoóis fermentativos que foi descrito no estado da técnica é a extração líquido-líquido. Em geral, no que diz respeito à fermentação de isobutanol, por exemplo, o meio de fermentação que inclui o micro-organismo é colocado em contato com um agente de extração (extrator orgânico) momentos antes da concentração de isobutanol! atingir um nível tóxico. O extrator e o meio de fermentação formam uma mistura bifásica. O isobutanol é separado na fase de extratora, diminuindo a concentração na fase aquosa contendo o micro-organismo, limitando dessa forma a exposição dos micro-organismos ao isobutanol inibidor.

[0276] A extração líquido-líquido pode ser realizada, por exemplo,

de acordo com os processos descritos na Publicação do Pedido de Patente US 2009/0305370, cuja divulgação é incorporada ao presente em sua totalidade. A Publicação do Pedido US 2009/0305370 descreve métodos para a produção e recuperação de isobutanol a partir de um caldo de fermentação utilizando a extração líquido-líquido, cujo método compreende a etapa de contato do caldo de fermentação com um agente de extração imiscível em água para formar uma mistura de duas fases, compreendendo uma fase aquosa e uma fase orgânica. O agente de extração pode ser um agente de extração orgânico selecionado a partir do grupo consistindo de alcoóis graxos C12 a C22, ácidos graxos C1> à Co, ésteres de ácidos graxos Ci2 a C22, aldeídos graxos Ci2 a C>22, saturados, monoinsaturados, poli-insaturados e misturas dos mesmos. O(s) extrator(es) para ISPR pode(m) ser extrator(es) não alcoólicos. O extrator ISRP pode ser um extrator orgânico exógeno, tal como de álcool oleílico, álcool behenílico, álcool cetílico, álcool laurílico, álcool miristílico, álcool estearílico, alcanóis alquílicos, 1-undecanol, ácido oleico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido esteárico, miristato de metila, oleato de metila, undecanol, aldeído láurico, 20-metilundecanol|, óxido de trioctil fosfina e misturas destes. Outros extratores e métodos estão descritos na Publicação do Pedido de Patente US 2010/0143994; Publicação do Pedido de Patente US 2010/0143995; Publicação do Pedido de Patente US 2010/0143992; Publicação do Pedido de Patente US 2010/0143993; Publicação do Pedido de Patente US 2011/0097773; Publicação do Pedido de Patente US 2011/0159558; Publicação do Pedido de Patente US 2011/0136193; e os conteúdos de cada pedido são integralmente incorporados ao presente pela referência.

[0277] Em alguns exemplos de realização, um éster pode ser formado pelo contato de um álcool em um meio de fermentação com um ácido orgânico (por exemplo, ácidos graxos) e um catalisador capaz de realizar a esterificação do álcool com o ácido orgânico. Em tais exemplos de realização,

o ácido orgânico pode servir como um agente de extração ISPR que esterifica o álcool na partição.

O ácido orgânico pode ser fornecido ao recipiente de fermentação e/ou pode ser derivado da biomassa que fornece carbono fermentável alimentada ao recipiente de fermentação.

Os lipídios presentes na matéria-prima podem ser hidrolisados de modo catalítico em ácido orgânico, e o mesmo catalisador (por exemplo, enzimas) pode esterificar o ácido orgânico com o álcool.

O catalisador pode ser fornecido à matéria-prima antes da fermentação, ou pode ser fornecido ao recipiente de fermentação, antes ou simultaneamente com o fornecimento da matéria-prima.

Quando o catalisador é fornecido no recipiente de fermentação, ésteres de álcool podem ser obtidos por meio da hidrólise dos lipídeos em ácido orgânico e a esterificação substancialmente simultânea do ácido orgânico com o álcool presente no recipiente de fermentação.

O ácido orgânico e/ou óleo não nativo derivado da matéria-prima pode também ser introduzido no recipiente de fermentação, com o óleo nativo sendo hidrolisado em ácido orgânico.

Qualquer ácido orgânico não esterificado com o álcool pode servir como parte do extrator ISPR.

O extrator contendo ésteres de álcool pode ser separado do meio de fermentação, e o álcool pode ser recuperado a partir do extrator.

Em alguns exemplos de realização, o extrator pode ser reciclado paro o recipiente de feremnetação.

Assim, no caso da produção de isobutanol, por exemplo, a conversão do isobutanol em um éster diminui a concentração de isobutanol livre no meio de fermentação, protegendo o micro-organismo do efeito tóxico causado pelo aumento da concentração de isobutanol.

Além disso, os grãos não fracionados podem ser usados como matéria-prima sem a separação de lipídeos de seu interior, uma vez que os lipídeos podem ser cataliticamente hidrolisados em ácido orgânico, diminuindo desse modo a taxa de acúmulo de lipídeos no extrator ISPR.

Outros métodos de recuperação do produto álcool! e/ou ISPR podem ser utilizados, incluindo aqueles descritos na Publicação de

Pedido de Patente US 2009/0305370; Publicação de Pedido de Patente US 2010/0221802; Publicação de Pedido de Patente US 2010/0279370; Publicação de Pedido de Patente US 2011/0097773; Publicação de Pedido de Patente US 2011/0312044; Publicação de Pedido de Patente US 2011/0312043; Publicação de Pedido de Patente US 2012/0035398; Publicação de Pedido de Patente US 2012/0211348; e Publicação de Pedido de Patente US 2012/0156738; e os conteúdos de cada pedido são integralmente incorporados ao presente pela referência.

[0278] No produto in situ a remoção pode ser realizada em um modo descontínuo (batch) ou em um modo contínuo. Em um modo contínuo de ISPR, o produto é continuamente removido do recipiente de fermentação (por exemplo, do reator). Em um modo descontínuo de /SPR, um volume de extrator orgânico é adicionado ao recipiente de fermentação e o extrator não é removido durante o processo. Para /SPR, o extrator orgânico pode contatar com o meio de fermentação no início da fermentação, formando um meio de fermentação bifásico. Alternativamente, o extrator orgânico pode contatar com meio de fermentação após o micro-organismo ter atingido uma quantidade desejada de crescimento, que pode ser determinada pela medição da densidade óptica da cultura. Além disso, o extrator orgânico pode ser colocado em contato com o meio de fermentação no momento em que o nível de álcool no meio de fermentação atinge um nível pré-selecionado. No caso da produção de isobutanol de acordo com alguns exemplos de realização da presente invenção, o agente de extração de ácido orgânico pode ser colocado em contato com o meio de fermentação de uma vez antes que a concentração de isobutano! atinja um nível tóxico, de modo a esterificar o isobutanol com o ácido orgânico para produzir ésteres de isobutanol e, consequentemente, reduzir a concentração de isobutanol no recipiente de fermentação. A fase orgânica contendo o éster pode então ser removida a partir do recipiente de fermentação

(e separada a partir do caldo de fermentação que constitui a fase aquosa) após o título eficaz desejado de ésteres de isobutanol ter sido alcançado. Em alguns exemplos de realização, a fase orgânica contendo o éster é separada da fase aquosa após a fermentação do açúcar fermentável disponível no tanque de fermentação ser substancialmente concluída. O título de isobutanol em qualquer fase pode ser determinado por métodos conhecidos no estado da técnica, tal como a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou cromatografia em fase gasosa, tal como descrito, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente US 2009/0305370, que é incorporada ao presente pela referência.

EXEMPLOS

[0279] A presente invenção é adicionalmente definida nos seguintes Exemplos. Deve ser compreendido que estes exemplos, embora indicando exemplos de realizações da presente invenção, são dados apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e destes Exemplos, um técnico hábil no assunto pode determinar as características essenciais da presente invenção, e sem se afastar do espírito e do escopo da presente invenção, pode fazer várias alterações e modificações na invenção para adaptá-la aos diversos usos e condições.

MÉTODOS GERAIS

[0280] Técnicas de DNA recombinante e de clonagem molecular utilizadas nos Exemplos são bem conhecidas no estado da técnica e estão descritas mais detalhadamente em Sambrook, et al. (Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989) e por Ausubel et al. (Ausube!l et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. & Wiley- Interscience, 1987).

[0281] Materiais e métodos adequados para a manutenção e o crescimento de culturas bacterianas são bem conhecidos no estado da técnica. Técnicas adequadas para uso nos seguintes Exemplos podem ser encontradas conforme o estabelecido em: Manual of Methods for General Bacteriology (Phillipp Gerhardt, et al. Eds., American Society for Microbiology, Washington, DC, 1994) ou por Thomas D. Brock em: Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2º Edição, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, (1989). Todos os reagentes, enzimas de restrição e materiais utilizados para o cultivo e manutenção das células bacterianas foram obtidos da Sigma-Aldrich Chemicals (St. Louis, MO), BD Diagnostic Systems (Sparks, MD), Invitrogen (Carlsbad, CA), HiMedia (Mumbai, Índia), SD Fine Chemicals (Índia), ou Takara Bio Inc. (Shiga, Japão), salvo quando indicado de outra forma.

[0282] O significado das abreviações são: “s” significa segundo(s), “min” significa minuto(s), “h” significa hora(s); “nm” significa nanômetros, “ul” significa microlitro(s), “mL” significa mililitro(s), “mg/mL” significa miligrama por mililitro, “L” significa litro(s) “nm” significa nanômetros, “mM” significa milimolar, “M” significa molar, “mmol” significa milimoles(s), “umol” significa micromole(s), “kg” significa quilograma(s), “9” significa grama(s), “ug” significa microgramas(s), e “ng” significa nanograma(s), “PCR “significa reação em cadeia da polimerase, “OD” significa densidade óptica, “OD600” significa que a densidade óptica mensurada no comprimento de onda de 600 nm, “kDa” significa kilodaltons, “9” também pode significar a constante gravitacional, “pb” significa pares de base, “kpb” significa quilo pares de base, “kb” significa quilobase, “%” significa por cento, “% p/v" significa por cento em peso/volume, “% v/v" significa por cento em volume/volume, “HPLC” significa cromatografia líquida de alto desempenho, “g/L” significa grama por litro, “(ug/L” significa micrograma por litro, “ng/ul” significa nanograma por microlitro, “pmol/ul” significa picomol por microlitto, “RPM” significa rotações por minuto, “(umol/min/mg” significa micromole por minuto por miligrama, “p/v” significa peso por volume, “v/v” significa volume por volume. EXEMPLO 1

CONSTRUÇÃO DE UMA CEPA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE COM UMA DELEÇÃO PDET1

[0283] A cepa PNY1500 foi derivada a partir da CEN.PK 113-7D (CBS 8340; Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversiry Centre, Holanda) e contém deleções nos genes URA3 e HIS3.

DELEÇÃO DE URA3

[0284] Para deletar a região codificante de URAS, um cassete ura3::loxP-kanMX-loxP foi amplificado por PCR a partir do DNA molde pLA54 (SEQ ID NO: 132). O pLA5S4 contém o promotor TEF1 de K. lactis e o marcador kKkanMX, e é flanqueado por sítios /oxP para permitir a recombinação com a “Cre recombinase' e remoção do marcador. A PCR foi feita usando a DNA polimerase Phusionº (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) e os primers BK505 e BK506 (SEQ ID NOs: 133 e 134). A porção URAS3 de cada primer foi derivada da região 5' a montante do promotor URAS3 e região 3' a jusante da região codificante, de tal forma que a integração do marcador loxP-kanMX-loxP resultou na substituição da região codificante de URAS. O produto da PCR foi transformado em CEN.PK 113-7D usando técnicas genéticas padrão (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 201-202), e os transformantes foram selecionados em meio YPD contendo G-418 (Geneticin&, 100 ug/mL) a 30 ºC. Os transformantes foram rastreados para verificar a integração correta por PCR utilizando os primers LA468 e LA492 (SEQ ID NOs: 135 e 136) e designado CEN.PK 113-7D ura3A:: kanMX.

DELEÇÃO DE HIS3

[0285] A deleção de HIS3 foi realizada por um procedimento de deleção scarless adaptado a partir de Akada, et a/, (Yeast 23:399 - 405, 2006).

Um cassete de PCR para a deleção Scarless foi feito pela combinação de quatro fragmentos, A-B-U-C, e por PCR de sobreposição. O cassete de PCR continha um marcador selecionável/marcador contra-selecionável, URAS (Fragmento U), que consiste do gene URAS3 nativo do CEN.PK 113-7D, juntamente com o promotor (250 pb a montante do gene URAS3) e terminador (150 pb a jusante do gene URAS3). Os fragmentos A e C, cada um com 500 pb de comprimento, correspondendo aos 500 pb imediatamente a montante do gene alvo (fragmento A) e a 500 pb a 3' do gene alvo (fragmento C). Os fragmentos A e C foram usados para a integração do cassete no cromossomo por recombinação homóloga. O fragmento B (de 500 pb de comprimento) correspondeu aos 500 pb imediatamente a jusante do gene alvo e foi utilizado para a excisão do marcador URAS e fragmento C a partir do cromossomo por recombinação homóloga, assim uma repetição direta da sequência correspondente ao fragmento B foi criada mediante integração do cassete no cromossomo.

[0286]Os quatro fragmentos para o cassete de PCR para a deleção Scarless de HIS3 foram amplificados utilizando a mistura “Phusion High Fidelity PCR Master Mix" (New England Biolabs; Ipswich, MA) e o DNA genômico do CEN.PK 113-7D como DNA molde preparado com o kit Gentra6& PuregeneO Yeast/Bact, kit (Qiagen, Valencia, CA). O fragmento A HIS3 foi amplificado com o primer oBP452 (SEQ ID NO: 137) e o primer oBP453 (SEQ ID NO: 138), contendo uma cauda 5º homóloga a extremidade 5' do fragmento B HIS3. O fragmento B HIS3 foi amplificado com o primer oBP454 (SEQ ID NO: 139), contendo uma cauda 5º com homologia para a extremidade 3' do fragmento A HIS3, e o primer oBP455 (SEQ ID NO: 140), contendo uma cauda 5' com homologia a extremidade 5' do fragmento U HIS3. O fragmento U HIS3 foi amplificado com o primer oBP456 (SEQ ID NO: 141), contendo uma cauda 5º com homologia para a extremidade 3' do fragmento B HIS3, e o primer oBP457 (SEQ ID NO: 142), contendo uma cauda 5º com homologia para a extremidade 5' do fragmento C HIS3. O fragmento C de HIS3 foi amplificado com o primer oBP458 (SEQ ID NO: 143), contendo uma cauda 5' com homologia para a extremidade 3' do fragmento U HIS3, e o primer oBP459 (SEQ ID NO: 144). Os produtos da PCR foram purificados com o kit de purificação “PCR Purification kit' (Qiagen, Valencia CA). O Fragmento AB de HIS3 foi criado por PCR de sobreposição misturando o fragmento A e fragmento B de HIS3 e amplificando com os primers oBP452 (SEQ ID NO: 137) e oBP455 (SEQ ID NO: 140). O Fragmento UC de HIS3 foi criado por PCR de sobreposição misturando o fragmento U e fragmento C de HIS3 e amplificando com os primers oBP456 (SEQ ID NO: 141) e oBP459 (SEQ ID NO: 144). Os produtos da PCR resultantes foram purificados em um gel de agarose seguido pela purificação com o kit “Gel Extration” (Qiagen, Valencia, CA). O cassete ABUC HIS3 foi criado por PCR de sobreposição pela mistura do Fragmento AB HIS3 e Fragmento UC HIS3, pela amplificação com os primers oBP452 (SEQ ID NO: 137) e oBP459 (SEQ ID NO: 144). O produto da PCR foi purificado com o kit de purificação “PCR Purification kit (Qiagen, Valencia, CA).

[0287] As células competentes de CEN.PK 113-7D ura3A::kanMX foram feitas e transformadas com o cassete de POR HIS3 ABUC usando um kit de transformação “Frozen-EZ Yeast Transformation Il kif' (Zymo Research; Orange, CA). As misturas dos transformantes foram semeadas em meio sintético completo sem uracila suplementado com 2% de glicose a 30 ºC. Os transformantes com um nocaute para his3 foram rastreados por POR com os primers oBP460 (SEQ ID NO: 145) e oBP461 (SEQ ID NO: 146), usando DNA genômico preparado com kit Gentra& Puregene6 Yeast/Bact kit (Qiagen, Valencia, CA). Um transformante correto foi selecionado como cepa CEN.PK

113-7D ura3A::kanMX his3A::URAS.

REMOÇÃO DO MARCADOR KANMX A PARTIR DO SÍTIO URASA E A REMOÇÃO DO MARCADOR URA3 A PARTIR DO SÍTIO HIS3A.

[0288] O marcador KanMX foi removido pela transformação da CEN.PK 113-7D ura3A::kanMX his3A::URA3 com o pRS423::Peaui-cre (SEQ ID NO: 147) usando um kit de transformação Frozen-EZ Yeast Transformation 1º (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) e plagueamento em meio sintético completo sem histidina e uracila suplementado com 2% de glicose a 30 ºC. Os transformantes foram cultivados em meio YP suplementado com 10 g/L de galactose a 30 ºC durante - 6 horas para induzir recombinase CRE e a excisão do marcador KanMX, e plaqueados em placas YPD (20 g/L de glicose) a 30 ºC para a recuperação. Um isolado foi cultivado durante a noite em meio YPD e plaqueado em meio sintético completo contendo ácido 5-fluoro-orótico (5- FOA, 1 g/L) a 30 ºC para selecionar os isolados que perderam o marcador URAS3. Isolados 5-FOA resistentes foram cultivados e plaqueados em YPD para remoção do plasmídeo pRS423::Peat1-cre (SEQ ID NO: 147). Os isolados foram verificados quanto a perda do marcador KanMX, marcador URAS3 e o plasmídeo pRS423::PeaL1-cre mediante a análise de crescimento em placas YPD+G418 com meio sem uracila e meio completo sintético sem histidina. Um isolado correto que era sensível a G-418 e auxotrófico para uracila e histidina foi selecionado como cepa CEN.PK 113-7D ura3A::loxP his3A e designado como PNY1500 (BP857). As deleções e remoção do marcador foram confirmadas por PCR e sequenciamento com os primers oBP450 (SEQ ID NO: 148) e OBP451 (SEQ ID NO: 149) para uragA e os primers oBP460 (SEQ ID NO: 145) e oBP461 (SEQ ID NO: 146 ) para his3A usando DNA genômico preparado com um kit GentraGê PuregeneO Yeast/Bact. kit (Qiagen, Valencia, CA).

[0289] A deleção do gene foi feita nas cepas PNYO1500 haploides. A deleção do gene cromossômico foi criada por recombinação homóloga com um cassete contendo homologia a montante e a jusante do gene alvo. Os transformantes foram selecionados usando um marcador de resistência G-418 ou crescimento em meio deficiente em uracila. O cassete de inter-rompimento do gene foi gerado por PCR utilizando primers específicos com 50-55 pb flanqueando a montante e a jusante do gene a ser interrompido. A reciclagem do marcador foi conseguida utilizando o sistema Cre-lox.

[0290] Para deletar a região codificante de PDE1 endógeno, um cassete de deleção foi amplificado por PCR a partir do pLAS9 (SEQ ID NO: 150) que contém o cassete URASp-URA3-URA3St flanqueado pelos sítios loxP71 e loxP66 degenerados para a remoção do marcador URA3. A PCR foi realizada usando a DNA polimerase Phusion& (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) e os primers PDE1 F URAS (SEQ ID NOs: 151) e PDE1 R URA3 (SEQ ID NO: 152). O produto da PCR foi transformado na PNY01500 usando técnicas genéticas padrão (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 201-202), com seleção sobre meio sintético completo (base nitrogenada de levedura sem aminoácidos 1X, mistura de aminoácios sem uracila suplementado com 20 g/L de glicose) a 30 ºC. Os transformantes foram rastreados por PCR de colônia com os primers URA IR e PDE1F (SEQ ID NOs: 153 e 154) para verificar a presença do cassete de integração, e primers URAIF e PDE1IR (SEQ ID NOs: 155 e 156). Para remover o marcador URA3 as células foram transformadas com o cassete pRS423: GAL 1p-cre (SEQ ID NO: 147) e os transformantes foram selecionados em meio completo sintético (base nitrogenada de levedura 1X, mistura de aminoácidos sem histidina suplementado com 20 g/L glicose 1X) a 30 ºC. Os transformantes foram semeados em placa de ágar extrato de levedura + peptona (YP) suplementado com 5 g/L de galactose para induzir a expressão da recombinase Cre. A remoção do marcador foi confirmada pelo plaqueamento de colônias em meio sintético completo sem uracila e suplementado com 20 g/L de glicose para verificar a ausência de crescimento. A deleção e remoção do marcador também foram confirmadas por PCR e sequenciamento com os primers PDEIF e PDEIR (SEQ ID NOs: 154 e 156), usando DNA genômico preparado com kit Gentra& Puregene6 Yeast/Bact kit (Qiagen, Valencia, CA). A cepa com deleção de PDE1 resultante da PNY01500 foi denominada PNYO03001 (MATa ura3A :: loxP his3A pde1A :: loxp71/66). EXEMPLO 2

CONSTRUÇÃO DE CEPAS PARA PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL

[0291] A cepa de levedura PNY860 (Depósito ATCC: PTA-12007, depositado em 21 de Julho de 2011) foi testada para a competência de esporulação (Codón, et al. Appl. Environ. Microbiol. 61: 630-638, 1995) pelo crescimento durante a noite a 30 ºC em 2 mL de meio de pré-esporulação (0,8% de Extrato de levedura, 0,3% de peptona, 10% de glucose) em um agitador do tipo tambor rotatório, seguido pela diluição 1:10 em meio de pré- esporulação fresco por mais 4 horas. As células foram recuperadas por centrifugação e resuspensas em 2 mL de meio de esporulação (0,5% de acetato de potássio) e incubadas durante 4 dias em um tambor rotatório a 30 ºC. O exame microscópico revelou que havia ocorrido a esporulação. Aproximadamente 30% das células estavam sob a forma de asco, e cerca da metade dos ascos continham quatro esporos. A cultura de esporulação (100 mL) foi recuperada por centrifugação e resuspensa em Zymolyase6 (50 uog/mL em 1 M de sorbitol), e incubada durante 20 minutos à temperatura ambiente.

[0292] Uma alíquota (5 mL) foi transferida para uma placa de Petri, e 18 tétrades foram dissecadas usando um microscópio de dissecção Singer HSH (Singer Instrument Co. Ltd., Somerset, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante.

[0293] A placa foi incubada durante 3 dias a 30 ºC e a viabilidade dos esporos foi pontuada. A Figura 1 mostra a placa de dissecção de tétrades.

[0294] Para identificar os tipos de acasalamento, quatro colônias de esporos de duas tétrades foram analisadas por PCR de colônia (vide, por exemplo, Huxley, et al., Trends Genet. 6:. 236, 1990) utilizando a mistura para PCR Phusion& High Fidelity PCR Master Mix (New England BioLabs Inc; Ipswich, MA) com três primers oligonucleotídicos, AKO9-1 MAT (SEQ ID NO: 272), AK09-2 HML (SEQ ID NO: 273), e AK09-03 HMR (SEQ ID NO: 274).

[0295] As células de colônias foram lisadas por suspensão em NaOH 0,02 M e aquecimento a 99 ºC durante 10 min. Uma porção deste lisado foi então utilizada como molde em uma reação de PCR utilizando a Taq polimerase (Promega, Madison, WI) conforme recomendado pelo fabricante. Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose. Cepas mating type a são esperadas para gerarem um produto de 404 pb, cepas mating type a são esperadas para gerarem um produto de 544 pb, e diplóides devem produzir ambas as bandas. A Figura 2 mostra que a cepa parental, PNY860, produz duas bandas, e a progênie de esporos produzir apenas uma banda proeminente, de - 400 pb ou de - 550 pb (embora algumas tenham produzido bandas fracas de outro tamanho). Estes resultados sugerem que a PNY860 é diplóide e é em grande parte heterotálica (apesar de um baixo nível de troca do tipo acasalamento possa ter ocorrido).

[0296] Com base nos tamanhos dos fragmentos da PCR, os tipos de acasalamento podem ser inferidos como se segue na Tabela 4: TABELA4 Cepa da Tipo de Levedura Acasalamento (Mating Type) PNY860 Diploide

Cepa da Tipo de Levedura Acasalamento (Mating Type) PNY860-1B a PNY860-1C a PNY860-1D a PNY860-2A a PNY860-2B a PNY860-2C a

[0297] Para confirmar essas atribuições, esporos da tétrade 1 (PNY860-1) foram cruzados e o tipo de acasalamento foi pontuado observando a formação do zigoto por microscopia, com os seguintes resultados exibidos na Tabela 5:

TABELAS Cruzamento Esperado Observado AxXxC Não Parceiro Não Parceiro

[0298] As cepas de levedura foram designadas da seguinte forma: PNY860-1A foi designada como PNY891, PNY860-1B foi designada como PNY0892, PNY860-1C foi designada como PNY893, e PNY860-1D foi designada como PNY0894.

[0299] As cepas haploides (PNY891 MATa e PNYO894 MATA) foram escolhidas como hospedeiros para produção do isobutanol. A deleção e integração do gene foram realizadas nas cepas haploides para criar uma cepa de base genética apropriada para a produção de isobutanol. A deleção do gene cromossômico foi realizada por recombinação homóloga com um cassete de PCR contendo homologia a montante e a jusante do gene alvo, e um marcador de resistência G-418 ou gene URAS3 para seleção dos transformantes. Para a integração do gene, o gene a ser integrado foi incluído no cassete de PCR. À reciclagem do marcador seletivo foi conseguida utilizando o sistema Cre-lox ou um método de deleçao scarless (Akada, et al, Yeast 23:. 399, 2006).

[0300] Primeiro, a deleção gênica (URAS3, HIS3, PDC6 e PDC1) e integração (ilvD no sítio do PDC1) foram realizadas na cepa PNY891 MATa para gerar a PNY1703 (= MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc64 pde1A::ilvD). Em segundo lugar, a PNY1703 foi acasalada com a PNY0894 MATa para produzir um diploide. O diploide resultante foi esporulado e a tétrade foi dissecada, e os segregantes dos esporos foram selecionados para fenótipo de crescimento em meio de glicose e etanol, e genótipo carregava ura3A::loxP his3A::loxP pdc6A pdetá::ilvD. Dois haploides de acordo com o tipo de acasalamento, PNY1713 (= MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc6A pde1A::ilvD) e PNY 1714 (= MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc6A padc1A::ilvD) foram isolados. Em terceiro lugar, a deleção do gene (PDC5, FRAZ2, GPD2, BDH1 e YMR226c) e integração (kivD, ilvD, alsS e ilvD-ADH nos sítios PDC5, FRAZ2, GPD2 e BDH1, respectivamente) foram realizados no cepa de base genética PNY 1714 para construir a PNY 1758 (= =MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc6A pdce14::ilvD pdec5A4::kivD(y)fra2A::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)gpd24::loxP71/66-FBA1p- alsS bdhtA::UAS(PGK1)-ENO2Zp-ilvD-ILV5p-adh ymr226c4A). Em quarto lugar, a PNY 1758 foi transformada com os dois plasmídeos, pWZ009 (SEQ ID NO: 158) contendo o gene K9D3.KARI e pWZ001 (SEQ ID NO: 159) contendo o gene ilvD, para construir o isobutanologênico de cana, PNY1775 (=MATa ura3Ã::loxP hisSA::loxP pdc6A pdetá::ilvD pde5d::kivD(y) fra2A::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y) gpd24::l0xP71/66-FBA1p-alsS bdh14::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-ILV5p-adh ymr226cA/DWZ009, pWwZ001). DELEÇÃO DE URA3

[0301] Para deletar a região codificante de URA3S endógeno, um cassete de deleção foi amplificado por PCR a partir do pLA54 (SEQ ID NO: 132), que contém um cassete TEF1p-kanMX-TEF1t flanqueado por sítios loxP para permitir a recombinação homóloga in vivo, e a subsequente remoção do marcador KanMX. A PCR foi realizada usando a DNA polimerase Phusionº (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) e os primers BK505 (SEQ ID NO: 133) e BK506 (SEQ ID NO: 134). A porção URAS3 de cada primer foi derivada da região 5' de 180 pb a montante do ATG URA3 e a região 3' 78 pb a jusante da região codificante de tal forma que a integração do cassete kanMX4 resultou na substituição da região codificante de URA3. O produto da PCR foi transformado na PNY891, uma cepa haplóide, usando técnicas genéticas padrão (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 201-202), e os transformantes foram selecionados em meio rico suplementado com 2% de glicose e G-418 (Geneticinaº, 200 ug/mL) a 30 ºC.º Os transformantes foram plaqueados sobre meio suplementado com 2% de glicose e repicados sobre meio completo sintético sem uracila e suplementado com 2% de glicose para identificar auxotróficos para uracila. Estas placas foram rastreadas por PCR de colônia com os primers LA468 (SEQ ID NO: 135) e LA492 (SEQ ID NO: 136) para verificar a presença do cassete de integração. Um mutante de URAS3 foi obtido; NYLAS96 (= MATa ura3A::loxP-kanMX-loxP).

DELEÇÃO DE HIS3

[0302] Para deletar a região codificante de HIS3 endógeno, um cassete de deleção foi amplificado por PCR a partir do pLA33 (SEQ ID NO: 160), que contém um cassete URASp-URAS-URASt flanqueado por sítios loxP para permitir a recombinação homóloga in vivo, e a subsequente remoção do marcador URAS. A PCR foi realizada usando a DNA polimerase PhusionO (New England BioLabs Inc., Ibswich, MA) e os primers 351 (SEQ ID NOs: 161) e 316 (SEQ ID NO: 162). A porção HIS3 de cada primer foi derivada da região 5' de 50 pb a montante do ATG de HIS3 e a região 3' 50 pb a jusante da região codificante de tal forma que a integração do cassete URAS resultou na substituição da região codificante de HIS3. O produto da PCR foi transformado em NYLAS96 usando técnicas genéticas padrão (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 201-202), e seleção em meio completo sintético sem uracila suplementado com 2% de glicose a 30 ºC. Os transformantes foram rastreados por PCR de colônia com os primers 92 (SEQ ID NO: 163) e 346 (SEQ ID NO: 164) para verificar a presença do cassete de integração. O marcador URAS3 foi reciclado pela transformação com pRS423::GAL 1p-cre (SEQ ID NO: 147) e plaqueado sobre meio completo sintético sem histidina suplementado com 2% de etanol a 30 ºC. Os transformantes foram semeados em placa de ágar extrato de levedura + peptona (YP) suplementado com 0,5%/L de galactose para induzir a expressão da recombinase Cre. A remoção do marcador foi confirmada pelo plaqueamento de colônias em meio sintético completo sem uracila e suplementado com 2%/L de glicose para verificar a ausência de crescimento. Além disso, a remoção do cassete marcador KanMX, usado para apagar URAS, foi confirmado pelo plaqueamento das colônias em meio rico suplementado com glicose a 2% e G-418 (Geneticinº, 100 ug/mL) a 30 ºC para verificar a ausência de crescimento. A cepa resultante com deleção de URA3 e HIS3 foi denominada NYLA107 (= MATa ura3A::loxP his34::loxP). DELEÇÃO DE PDC6

[0303] A Saccharomyces cerevisiae possui trêê genes PDC (PDC1, PDC5, PDC6), codificando três isoenzimas diferentes da piruvato descarboxilase. A piruvato descarboxilase catalisa a primeira etapa na fermentação de etanol, produzindo acetaldeído a partir do piruvato gerado na glicólise.

[0304] A sequência codificante de PDC6 foi deletada pela recombinação homóloga com uma cassete de PCR (A-B-U-C) contendo homologia a montante (fragmento A) e a jusante (fragmento B) da região codificante do PDC6, um gene URAS3, juntamente com o promotor (250 pb a montante do gene URAS) e o terminador (150 pb a jusante do gene URAS) (fragmento L) para a seleção dos transformantes, e a região 3' da região codificante de PDC6 (fragmento C), de acordo com um método de deleção do tipo scarless (Akada, et al. Yeast 23: 399, 2006). Os quatro fragmentos (A, B, U, OC) para o cassete de PCR para a deleção scarless de PDC6 foram amplificados a partir do DNA genômico da cepa PNY891 como molde usando a mistura para PCR “PhusionO High Fidelity PCR Master Mix' (New England Biolabs Inc .; Ibswich, MA). O DNA genômico da PNY891 foi preparado com o kit “Gentra Puregene Yeast/Bact' (Qiagen; Valência, CA). O fragmento A de PDCS6 foi amplificado com o primer oBP440 (SEQ ID NO: 165) e o primer oBP441 (SEQ ID NO: 166), contendo uma cauda 3' homóloga a extremidade 5' do fragmento B de PDC6. O fragmento B de PDCS6 foi amplificado com o primer oBP442 (SEQ ID NO: 167), contendo uma cauda 5' com homologia para a extremidade 3' do fragmento A de PDCG6, e o primer oBP443 (SEQ ID NO: 168), contendo uma cauda 5' com homologia a extremidade 5' do fragmento U de PDC6. O fragmento U de PDCG6 foi amplificado com o primer oBP444 (SEQ ID NO: 169), contendo uma cauda 5' com homologia para a extremidade 3' do fragmento B de PDCS6, e o primer oBP445 (SEQ ID NO: 170), contendo uma cauda 5' com homologia para a extremidade 5' do fragmento C de PDC6. O fragmento C de PDCS6 foi amplificado com o primer oBP446 (SEQ ID NO: 171), contendo uma cauda 5' com homologia para a extremidade 3' do fragmento U de PDCS6, e o primer oBP447 (SEQ ID NO: 172). Os produtos da PCR foram purificados com o kit de purificação “PCR Purification kif' (Qiagen, Valencia CA). O Fragmento A-B de PDC6 foi criado por PCR de sobreposição misturando o fragmento A e fragmento B de PDC6 e amplificando com os primers oBP440 (SEQ ID NO: 165) e oBP443 (SEQ ID NO: 168). O Fragmento U-C de PDCG foi criado por PCR de sobreposição misturando o fragmento U e fragmento C de PDC6 e amplificando com os primers oBP444 (SEQ ID NO: 169) e oBP447 (SEQ ID NO: 172). Os produtos da PCR resultantes foram purificados em gel de agarose seguido pela purificação com o kit “Gel Extration" (Qiagen, Valencia, CA). O cassete A-B-U-C do PDCSG6 foi criado por PCR de sobreposição pela mistura do Fragmento A-B de PDC6 e Fragmento U-C de PDCG6, pela amplificação com os primers oBP440 (SEQ ID NO: 165) e oBP447 (SEQ ID NO: 172). O produto da PCR foi purificado com o kit de purificação “PCR Purification kif' (Qiagen, Valencia, CA).

[0305] As células competentes da cepa NYLA107 foram feitas e transformadas com o cassete de PCR PDC6 A-B-U-C usando um kit de transformação “Frozen-EZ Yeast Transformation ll kif' (Zymo Research; Orange, CA). As misturas dos transformantes foram semeadas em meio sintético completo sem uracila suplementado com 2% de glicose a 30 ºC. Os transformantes com um nocaute para pdc6 foram rastreados por POR com os primers oBP448 (SEQ ID NO: 173) e oBP449 (SEQ ID NO: 174), usando DNA genômico preparado com kit Gentra&ê PuregeneO Yeast/Bact kit (Qiagen, Valencia, CA). Para remover o marcador URA3 do cromossomo, um transformante correto foi cultivado de um dia para o outro em meio YPD e plaqueado em meio sintético completo contendo ácido 5-fluoro-orótico (0,1%) a ºC para selecionar os isolados que perderam o marcador URAS. A deleção e remoção do marcador foram confirmadas por PCR e sequenciamento com os primers oBP448 (SEQ ID NO: 173) e oBP449 (SEQ ID NO: 174), usando DNA genômico preparado com kit Gentra& PuregeneO Yeast/Bact kit (Qiagen,

Valencia, CA). A ausência do gene PDCG6 a partir do isolado foi demonstrada por um resultado negativo da PCR utilizando os primers específicos para a sequência codificante de PDC6, oBP554 (SEQ ID NO: 175) e oBP555 (SEQ ID NO: 176). O isolado correto foi selecionado como cepa PNY1702 (=MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc64). DELEÇÃO DE PDC1 E INTEGRAÇÃO DE ILVD

[0306] A região codificante de PDC1 foi deletada e substituída pela região codificante de ilvD de Streptococcus mutans ATCC 700610, por recombinação homóloga com um cassete de PCR (A-ilvD-B-U-C) contendo homologia a montante (fragmento A) e a jusante (fragmento B) da região codificante de PDC1, a região codificante de ilvD (fragmento ilvD), um gene URAS3, juntamente com o promotor e terminador (fragmento L) para a seleção de transformantes, e a região 3' da região codificante de PDC1 (fragmento C). O fragmento A seguido pela região codificante de ilvD de Streptococcus mutans para o cassete de PCR para a deleção de PDC1 — integração de ilvD foi amplificado utilizando a mistura “Phusion High Fidelity PCR Master Mix" (New England Biolabs; Ipswich, MA) e o DNA genômico do NYLA83 (descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2011/0312043, que é incorporada ao presente pela referência) como DNA molde preparado com o kit GentraG&M Puregene6 Yeast/Bact, kit (Qiagen, Valencia, CA). O fragmento do PDC1, A- ilvD, foi amplificado com o primer oBP513 (SEQ ID NO: 177) e o primer oBP515 (SEQ ID NO: 178), contendo uma cauda 5' homóloga a extremidade 5' do fragmento B de PDC7. Os fragmentos B, U e C para o cassete de PCR para a deleção PDC1 — Integração ilvD foram amplificados utilizando a mistura “Phusion High Fidelity PCR Master Mix' (New England Biolabs; Ipswich, MA) e o DNA genômico do PNY891 como DNA molde preparado com o kit Gentra&M Puregene6 Yeast/Bact, kit (Qiagen, Valencia, CA). O fragmento B de PDC1 foi amplificado com o primer oBP516 (SEQ ID NO: 179), contendo uma cauda 5'

com homologia com a extremidade 3' do fragmento A de PDC1-ilvD, e o primer oBP517 (SEQ ID NO: 180), contendo uma cauda 5º com homologia com a extremidade 5º do fragmento U de PDC1. O fragmento U de PDCI1 foi amplificado com o primer oBP518 (SEQ ID NO: 181), contendo uma cauda 5' com homologia com a extremidade 3' do fragmento B de PDC1, e o primer oBP519 (SEQ ID NO: 182), contendo uma cauda 5' com homologia com a extremidade 5' do fragmento C de PDC1. O fragmento C de PDC1 foi amplificado com o primer oBP520 (SEQ ID NO: 183), contendo uma cauda 5' com homologia para a extremidade 3' do fragmento U de PDC1, e o primer oBP521 (SEQ ID NO: 184). Os produtos da PCR foram purificados com o kit de purificação “PCR Purification kit' (Qiagen, Valencia CA). O Fragmento A-ilvD-B de de PDC1 foi criado por PCR de sobreposição misturando o fragmento A-ilvD de PDC1 e fragmento B de PDC1 e amplificando com os primers oBP513 e oBP517. O Fragmento U-C de PDC1 foi criado por PCR de sobreposição misturando o fragmento U de PDC1 e fragmento C de PDC1 e amplificando-os com primers oBP518 (SEQ ID NO: 181) e oBP521 (SEQ ID NO: 184). Os produtos da PCR resultantes foram purificados em um gel de agarose seguido pela purificação com o kit “Gel Extration" (Qiagen, Valencia, CA). O Fragmento A-ilvD-B-U-C de PDC1 foi criado por PCR de sobreposição misturando o fragmento A-ilvD-B de PDC1 e fragmento U-C de PDC1 e amplificando-os com os primers oBP513 (SEQ ID NO: 177) e oBP521 (SEQ ID NO: 184). O produto da PCR foi purificado com o kit de purificação “PCR Purification kit' (Qiagen, Valencia, CA).

[0307] As células competentes da cepa PNY1702 foram feitas e transformadas com o cassete de POR PDC1 A-ilvD-B-U-C usando um kit de transformação “Frozen-EZ Yeast Transformation Il kil' (Zymo Research; Orange, CA). As misturas dos transformantes foram semeadas em meio sintético completo sem uracila suplementado com 2% de glicose a 30 ºC. Os transformantes com um nocaute para pdc1 pela integração de ilvD foram rastreados por POR com os primers oBP511 (SEQ ID NO: 185) e oBP512 (SEQ ID NO: 186), usando DNA genômico preparado com kit GentraG& Puregene6 Yeast/Bact Kit (Qiagen, Valencia, CA). A ausência do gene pdc1 a partir do isolado foi demonstrada por um resultado negativo da PCR utilizando os primers específicos para a sequência codificante do PDC1, oBP550 (SEQ ID NO: 187) e oBP551 (SEQ ID NO: 188). Para remover o marcador URAS do cromossomo, um transformante correto foi cultivado de um dia para o outro em meio YPD e plaqueado em meio sintético completo contendo ácido 5-fluoro- orótico (0,1%) a 30 ºC para selecionar os isolados que perderam o marcador URAS. A deleção de PDC7, integração de ilvD, e a remoção do marcador foram confirmadas por PCR com os primers ilvDSm(1354F) (SEQ ID NO: 189) e oBP512 (SEQ ID NO: 186), e sequenciamento com os primers ilvDSm(788R) (SEQ ID NO: 190) e ilvDSm(1354F) (SEQ ID NO: 189) usando DNA genômico preparado com kit Gentra& Puregene& Yeast/Bact kit (Qiagen, Valencia, CA). O isolado correto foi selecionado como cepa PNY1703 (=MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc6A pdc1A::ilvD).

[0308] PNY17038 MATa x PNYO894 MATa acasalamento, esporulação e dissecção da tétrade para isolar PNY1713 (=MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc6A pdcetA::ilvD) e PNY 1714 (=MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc64 pdc1A::ilvD).

[0309] Células diploides (MATa/a) foram criadas pelo cruzamento de PNY1703 MATa e PNYO0894 MATa em YPD a 30 ºC durante a noite. As potenciais diploides foram semeadas em uma placa YPD e incubadas a 30 ºC durante 4 dias para isolar colônias únicas. Para identificar diploides, POR de colônia (Huxley, et al, Trends Genet. 6:. 236, 1990) foi realizada utilizando a mistura para POR “Phusion6 High Fidelity PCR Master Mix' (New England Biolabs Inc .; Ibpswich, MA) com três primers oligonucleotídicos, MAT1 (SEQ ID

NO: 191) correspondendo a uma sequência no lado direito e voltado para o locus MAT, MAT2 (SEQ ID NO: 192) correspondendo a uma sequência dentro da região a-específica situada em MATa e HMLa; e MAT3 (SEQ ID NO: 193) correspondendo a uma sequência dentro da região a-específica, localizada em MATa e HMRa.

Colônias diploides foram determinadas por produzirem dois produtos da PCR, MATa-específica de 404 pb e MATa-específica de 544 pb.

As cepas diploides resultantes foram cultivadas em meio de pré-esporulação e, em seguida, inoculadas em meio de esporulação (Codón, et al., Appl Environ Microbiol. 61: 630, 1995). Após 3 dias, a eficiência de esporulação foi verificada por microscópio.

Os esporos foram digeridos com 0,05 mg/ml Zymolyaseº (Zymo Research Corporation, Irvine, CA; utilizando o procedimento de Methods in Yeast Genetics, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Oito (8) placas de tétrades foram dissecadas (18 tétrades por placa, totalizando 144 tétrades, 576 esporos) em placas de YPD e colocadas a º C por 4 dias.

Para rastrear a progênie de esporos quanto ao genótipo ura3A e his3A e fenótipo de crescimento em meio com etanol e glicose, os esporos em placas YPD foram sequencialmente plaqueados a 1) meio sintético completo (SC) sem uracila (ura) suplementado com 2% de glicose, 2) SC sem histidina (his) suplementado com 2% de glicose, e depois 3) SC suplementado com 0,5% de etanol, utilizando um aparato de plaqueamento em réplica de leveduras (Corastyles, Hendersonville, NO). Os esporos que não conseguiram crescer em placas SC-ura e SC-his, mas cresceram em SC + 0,5% etanol e placas YPD foram selecionados e analisados por PCR para determinar o seu tipo de acasalamento (Huxley, et al, Trends Genet. 6: 236, 1990). Para determinar se os esporos contêm pdcia::ilvD, os esporos selecionados foram verificadas por PCR de colônia utilizando os primers oBP512 (SEQ ID NO: 186) e ivDSm (1354F) (SEQ ID NO: 189). Os esporos contendo pdc1L::ifvD produzem um produto da PCR esperado de 962 pb, mas aqueles sem a exclusão não produzem produto da PCR. Os esporos positivos foram então verificados por PCR quanto a deleção de PDCG6 utilizando os primers BP448 (SEQ ID NO: 173), e BP449 (SEQ ID NO: 174). Os tamanhos dos fragmentos de PCR esperados foram de 1,3 kpb para as células contendo o pdc6A e 2,9 kpb para as células contendo o gene PDCG6 tipo selvagem. Os isolados corretos foram selecionados para ambos os tipos de acasalamento, e designados como PNY1713 (=MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc6A pdetá::ilvD) e PNY1714 (=MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc6A pde14::ilvD). DELEÇÃO DE PDC5 E INTEGRAÇÃO DE KIVD(Yy)

[0310] A região codificante de PDCS5 foi deletada e substituída pela região codificante de kivD de Lactococcus lactis, por recombinação homóloga com um cassete de PCR (A-kivD(y)-B-U-C) contendo homologia a montante (fragmento A) e a jusante (fragmento B) da região codificante de PDCS5, a região codificante de kivD(y) (fragmento KivD(y)), códon-otimizado para a expressão em Saccharomyces cerevisiae, um gene URAS, juntamente com o promotor e terminador (fragmento U) para a seleção de transformantes, e a região 3' da região codificante de PDCS5 (fragmento C).

[0311] O fragmento A de PDCSB5 foi amplificado a partir do DNA genômico do PNY891 como molde utilizando o kit Phusion& High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs Inc .; Ibswich, MA) com o primer T-A (PDC5) (SEQ ID NO: 194) e primer B-A (KkivD) ( SEQ ID NO: 195), que contém uma cauda 3' com homologia com a extremidade 5' de KkivD(y). A sequência codificante de kivD(y) foi amplificada a partir da (SEQ ID NO: 196) como molde com o primer T-kivD (A) (SEQ ID NO: 197), que contém uma cauda 5' com homologia com a extremidade 3' do fragmento A de PDCS5, e o primer B- KkivD(B) (SEQ ID NO: 198), que contém uma cauda 3' com homologia com a extremidade 5' do fragmento B de PDC5. O fragmento A-KkivD(y) de PDCSB5 foi criado por PCR de sobreposição pela mistura do Fragmento A e kivD (y) de

PDC5 e amplificando-os com os primers T-A (PDC5) e B-A (kivD). O fragmento B de PDCB5 foi clonado no puUC19-URASMCS para criar a porção B-U do cassete de PCR PDC5 A-kivD(y)-B-U-C. O plasmídeo resultante foi designado de pUC19-URA3-sadB-PDC5fragmentB (SEQ ID NO: 199). Um plasmídeo PUC19-URA3-sadB-PDC5fragmentB foi usado como um molde para a amplificação do Fragmento B-Fragmento L de PDCS5 utilizando os primers T-B (kivD) (SEQ ID NO: 200), que contém uma cauda 5' com homologia com a extremidade 3' do fragmento kivD (y), e oBP546 (SEQ ID NO: 201), que contém uma cauda 3' com homologia com a extremidade 5' do Fragmento C de PDC5. O fragmento C de PDCS5 foi amplificado com o primer oBP547 (SEQ ID NO: 202), contendo uma cauda 5' com homologia para a extremidade 3' do Fragmento B-Fragmento U de PDCS5, e o primer oBP539 (SEQ ID NO: 203). Os produtos da PCR foram purificados com o kit de purificação “PCR Purification kif' (Qiagen, Valencia CA). O Fragmento B-Fragmento U-Fragmento C de PDCS5 foi criado por PCR de sobreposição misturando o Fragmento B- Fragmento U de PDC5 e o fragmento C de PDC5 e amplificando-os com os primers T-B(kivD) (SEQ ID NO: 200) e oBP539 (SEQ ID NO: 203). O produto da PCR resultante foi purificado em gel de agarose seguido pela purificação com o kit “Gel Extration" (Qiagen, Valencia, CA). O cassete A-kivD(y)-B-U-C de PDCS foi criado por PCR de sobreposição misturando o fragmento A-kivD(y) de PDCS5 e fragmento B de PDC5-Fragmento-U de PDC5- fragmento C de PDC5 e amplificando-os com os primers T-A(PDC5) (SEQ ID NO: 194) e oBP539 (SEQ ID NO: 203). O produto da PCR foi purificado com o kit de purificação “PCR Purification kit' (Qiagen, Valencia, CA).

[0312] As células competentes da cepa PNY1714foram feitas e transformadas com o cassete de POR PDCS5 A-kivD(y)-B-U-C usando um kit de transformação “Frozen-EZ Yeast Transformation ll kif' (Zymo Research; Orange, CA). As misturas dos transformantes foram semeadas em meio sintético completo sem uracila suplementado com 0,5% de etanol (sem glicose) a 30 ºC. Os transformantes com um nocaute para pdc5 pela integração de kivD foram rastreados por PCR com os primers oBP540 (SEQ ID NO: 204) e kivD(652R) (SEQ ID NO: 205), usando DNA genômico preparado com kit Gentra& Puregene6 Yeast/Bact Kit (Qiagen, Valencia, CA). A ausência do gene PDCS a partir do isolado foi demonstrada por um resultado negativo da PCR utilizando os primers específicos para a sequência codificante do PDCS5 , oBP552 (SEQ ID NO: 206) e oBP553 (SEQ ID NO: 207). Para remover o marcador URA3 do cromossomo, de cada transformante correto, cepas MATa ou MATa foram cultivadas de um dia para o outro em meio YPE e plaqueadas em meio sintético completo suplementado com etanol (sem glicose0 e contendo ácido 5-fluoro-orótico (0,1%) a 30 ºC para selecionar os isolados que perderam o marcador URAS. A deleção de PDCSB5, integração de kivD(y) e remoção do marcador foi confirmada por PCR com os primers oBP540 e oBP541 utilizando o DNA genômico preparado com um kit Gentra& PuregeneO Yeast/Bact kit (Qiagen, Valencia, CA). A integração correta da região codificante de KkivD(y) foi confirmada pela sequência de DNA com os primers kivD(652R) (SEQ ID NO: 205), kivD(602F) (SEQ ID NO: 208), e kivD(1250F) (SEQ ID NO: 209). Os isolados corretos foram designados como cepas PNY1716 (=MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc6A pde1A::ilvD pdc5A::kivD(y)). DELEÇÃO DE FRA2 E UAS (PGK1) -FBA1P-ILVD (Y) -I!NTEGRAÇÃO DE TEF1T

[0313] A região codificante FRA2Z foi deletada e substituída por um cassete UAS (PGK1) -FAB1p-ilvD(y)TEFItHisSG-URAS-hisG por recombinação homóloga. O cassete UAS(PGK1)-FAB1p-ilvD(y)-TEF1t-HisG- URAS-HisG contém o promotor híbrido UAS(PGK1)-FABIp, a região codificante ilvD(y) de Streptococcus mutans ATCC 700610, códon otimizada para expressão em Saccharomyces cerevisiae, o terminador TEFIt e o gene URAS, juntamente com o promotor e terminador, flanqueado por fragmentos HisG.

[0314] Um plasmídeo pRS423-TPI1p-ilvD(y) (SEQ ID NO: 210) foi digerido com as enzimas de restrição Notl e Sal, e o fragmento TPI1p-ilvD(y) de 2,270 pb foi purificado em gel de agarose seguido por um kit de extração em gel (Qiagen, Valencia, CA). O fragmento TPI1p-ilvD(y) foi clonado nos sítios Not e Sal no pMOD-URA3r2 (SEQ ID NO: 211) para construir o pMOD- URA3r2-TPI1p-ilvD(y). O pMOD-URA3r2 é basedo no pUC19 e contém a sequência do gene URAS3 flanqueada pelos fragmentos HisG. A POR TEF1t (285pb) foi amplificada a partir do DNA genômico da Saccharomyces cerevisiae como molde utilizando o kit Phusion& High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs Inc .; Ipswich, MA) com o primer T-TEF1t (Notl) (SEQ ID NO: 212) e o primer B-TEF1t (Notl) (SEQ ID NO: 213). O fragmento da PCR TEF1t foi digerido com uma enzima de restrição Notl e depois clonado em um sítio Notl no pMOD-URA3r2-TPI1p-ilvD(y). A orientação correta do TEF1t foi confirmada pela análise por PCR de colônia com T-DSmo(RPS5p) (SEQ ID NO: 214) e B-TEF1t (Notl) (SEQ ID NO: 213) com 2,009 pb de tamanho esperado. O plasmídeo resultante foi designado como pMOD-URA3r2-TPIip- ilvD(y)-TEF1t. Em seguida, o promotor TPI1p sobre o pMOD-URA3r2-TPI1p- ilvD(y) -TEF1t foi substituído com o promotor híbrido UAS(PGK1)-FBA1p (SEQ ID NO: 215). O cassete de PCR UAS(PGK1)-FBA1p foi amplificado a partir de um plasmídeo pRS316-UAS(PGK1)-FBA1p-GUS (SEQ ID NO: 216), utilizando o kit Phusion& High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs Inc .; Ipswich, MA) com o primer TU/PGK1 (XhoApa) (SEQ ID NO: 217) e o primer B- FBA1(Spel) (SEQ ID NO: 218). O produto da PCR UAS(PGK1)-FBA1p foi digerido com as enzimas de restrição Xhol e Spel e o fragmento da PCR foi purificado em gel de agarose seguido de um kit de extração em gel (Qiagen, Valencia, CA). Um plasmídeo pMOD-URA3r2-TPI1p-ilvD(y)-TEF1t foi digerido com as enzimas de restrição Sal e Spel, e o fragmento de 6.887 pb sem TPI1p foi purificado em gel de agarose seguido por um kit de extração em gel (Qiagen, Valencia, CA). Os 6887 pb de pMOD-URA3r2- -ilvD(y)-TEF1t foram ligados com o produto UAS(PGK1)-FBA1p digerido com Xhol e Spel para criar PMOD-URA3r2-UAS (PGK1) -FBA1p-ilvD(y) -TEF1t (SEQ ID NO: 219). O cassete de PCR UAS (PGK1) -FAB1p-ilvD(y) -TEF1t-hisG-URAS-HisG foi amplificado a partir de um plasmídeo pMOD-URA3r2-UAS (PGK1) -FBA1p- ilvD(y)-TEF1t usando o kit PhusionO High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs Inc .; Ibpswich, MA) com os primers t-FRA (DSM) (SEQ ID NO: 220), contendo a região 5' de 50 pb a montante de FRAZ2 ATG, e B-FRA(Dsm) (SEQ ID NO: 221), contendo a região 3' de 50 pb a jusante da região codificante de FRAZ. O produto da PCR foi purificado com o kit de purificação “PCR Purification kit' (Qiagen, Valencia, CA).

[0315] As células PNY1716 competentes foram feitas e transformadas com o cassete de POR UAS(PGK1)-FAB1pilvD-(y)-TEF1t-HisG- URAS3-HisG utilizando um kit Frozen-EZ Yeast Transformation IITV (Zymo Research Corporation, Irvine, CA). As misturas dos transformantes foram semeadas em meio sintético completo sem uracila suplementado com 0,5% de etanol (sem glicose) a 30 ºC. Os transformantes com um nocaute para fra1 e integração UAS(PGK1)-FAB1p-ilvD(y)-TEF1t-HisG-URAS3S-HisG foram rastreados por PCR com os primers oBP602 (SEQ ID NO: 222) e B- TEF1t(Notl) utilizando o DNA genômico preparado com kit Gentra& PuregeneO Yeast/Bact Kit (Qiagen, Valencia, CA). Para remover o marcador URA3 do cromossomo, os transformantes corretos foram cultivados de um dia para o outro em meio YPE (0,5% de etanol) e plaqueados em meio sintético completo suplementado com etanol (sem glicose0 e contendo ácido 5-fluoro-orótico (0,1%) a 30 ºC para selecionar os isolados que perderam o marcador URAS. À deleção de FRAZ, integração de UAS(PGK1)-FABI1p-ilvD(y)-TEFIt e a remoção do marcador URAS3 foram confirmadas pelo sequenciamento de DNA com os primers DSm(o)50R (SEQ ID NO: 223), DSm(o)1F (SEQ ID NO: 224), DSm(o)688F (SEQ ID NO: 225), e DSm(o)1352F (SEQ ID NO: 226) usando DNA genômico preparado com kit Gentra& Puregene6 Yeast/Bact kit (Qiagen, Valencia, CA). Os isolados corretos foram designados como cepas PNY1720 (=MATa —ura3A::loxP his3A:loxP pdc6A pdetá:zilvD pdeS5A:kivD(y) fra2A::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)). DELEÇÃO DE GPD2 E INTEGRAÇÃO DE FBA1P-ALSS

[0316] A região codificante GPD2 foi deletada e substituída com o promotor FAB1 e região codificante a/lsS por recombinação homóloga com um cassete de PCR (URA3S-FBA1p-alsS) contendo o cassete URASp-URAS-URASt flanqueado pelos sítios degenerados loxP71/l0xP66, o promotor FBA1 de Saccharomyces cerevisiae, e alsS a partir de Bacillus subtilis subsp. subtilis cepa 168 (GenBank NC 000964).

[0317]O fragmento da PCR URASPp-URAS-URASt flanqueado pelos sítios loxP71/l0xP66 foi amplificado a partir do pLAS9 (SEQ ID NO: 150), utilizando a DNA polimerase Phusionº (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) com os primers T-URA(gpd 60bp) (SEQ ID NO: 227), que contém a região 5' 60 pb a montante do GPD2 ATG e B-URA(alsS) (SEQ ID NO: 228), contendo uma cauda 3' com homologia com a extremidade 5' do fragmento FBA1p-alsS. O fragmento da PCR FBA1p-alsS foi amplificado a partir do pUC19- kan::pdc1::FBA-alsS::TRX1 (SEQ ID NO: 229), utiizando a DNA polimerase Phusionº (New England BioLabs Inc., Ipbswichy, MA) com os primers T- alsS(URA) (SEQ ID NO: 230), que contém uma cauda 5' com homologia com a extremidade 3' do fragmento URASp-URA3-URA3t, e B-alsS(gpd 60bp) (SEQ ID NO: 231), contendo a região 3' 60 pb a jusante do gene GPD2. O produto da PCR resultante foi purificado em gel de agarose seguido pela purificação com o kit “Gel Extration" (Qiagen, Valencia, CA). O cassete URA3S-FBA1p-alsS foi criado pela PCR de sobreposição misturando o fragmento URAS3Sp-URAS-

URASt e fragmento FBA1ip-alsS e ampliando com os primers T- URA(gpd 60bp) e B-alsS(gpd 60bp). O produto da PCR foi purificado com o kit de purificação “PCR Purification kif' (Qiagen, Valencia, CA).

[0318]As células PNY1720 competentes foram feitas e transformadas com o cassete de PCR URAS-FBA1p-alsS utilizando um kit Frozen-EZ Yeast Transformation II" (Zymo Research Corporation, Irvine, CA). As misturas dos transformantes foram semeadas em meio sintético completo sem uracila suplementado com 0,5% de etanol (sem glicose) a 30 ºC. Os transformantes com um nocaute para gpd2 pela integração de URA3- FBA1p-alsS foram rastreados por POR com os primers FBA-als1557 (SEQ ID NO: 232) e gpd2-down178 (SEQ ID NO: 233), utilizando o DNA genômico preparado com kit Gentra& PuregeneO Yeast/Bact Kit (Qiagen, Valencia, CA). O marcador URAS3S (foi reciclado pela transformação com PRS423::Peaui-cre (SEQ ID NO: 147) e plaqueado em meio completo sintético sem histidina suplementado com 0,5% de etanol a 30 ºC. Os transformantes foram semeados em estriadas sobre meio completo sintético suplementado com 0,5% de etanol e contendo ácido 5-fluoro-orótico (0,1%) e, em seguida, foram incubados a 30 ºC para selecionar os isolados que perderam o marcador URAS. Isolados 5-FOA resistentes foram cultivados e plaqueados em YPE (0,596 de etanol) para remoção do plasmídeo PRS423::Peati-cre. A deleção de GPDZ2, integração de FBA1p-ailsS, e remoção do marcador foram verificadas por POR com os primers gpd2- up229 (SEQ ID NO: 234) e B-FBA1(Spel) (SEQ ID NO: 218), e confirmadas pelo sequenciamento do DNA com os primers T-alsS(URA), FBA-als752 (SEQ ID NO: 235), FBA-als1557 (SEQ ID NO: 232), e gpd2-down178 usando o DNA genômico preparado com o kit GentraGê PuregeneO Yeast/Bact. kit (Qiagen, Valencia, CA). Os isolados corretos foram designados como cepas PNY1725 (=MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc6A pde1A::ilvD pdc54::kivD(y) fra2A::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y) gpd24::loxP71/66-FBA1p-alsS). DELEÇÃO DE BDH1 E INTEGRAÇÃO DE UAS(PGK1)-ENO2P-ILVD-TEF1T-ILV5P-

ADH

[0319] A região codificante BDH1 foi deletada e substituída por um cassete UAS UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-TEF1t-ILV5p-adh por recombinação homóloga. A deleção de BDH1 e a integração do cassete UAS(PGK1)-ENO2p- ilvD-TEF1tILV5p-adh (A-UAS(PGK1)-ENO?2p-ilvD-TEF1t-ILV5p-adh-B-U-C) contém a homologia a montante (fragmento A) e a jusante (fragmento B) da região codificante de BDH71, o promotor híbrido UAS(PGK1)-ENO2p, a região codificante ilvD de Streptococcus mutans ATCC 700610, o terminador TEF1t o promotor /LV5p, a região codificante de adh, juntamente com o terminador da Beijerinckia indica, e um gene URAS3 juntamente com o promotor e terminador (fragmento L) para a seleção de transformantes, e a região 3' da região codificante de BDH1 (fragmento OC). O fragmento A, UAS(PGK1)-ENO?2p, ilvD, TEF1t, ILV5p, adh, fragmento B, fragmento U e fragmento C foram clonados no plasmídeo baseado no pUC19 para criar o pBP 1339 (=pA-UAS(PGK1)-ENO2p- ilvD-TEF1t-ILV5p-adh-B-U-C) (SEQ ID NO: 236). O cassete A-UAS(PGK1)- ENO?2p-ilvD-TEF1t-ILV5p-adh-B-U-C foi amplificado a partir do pBP1339 usando a DNA polimerase Phusionº (New England BioLabs Inc., Ipswich, MA) com os primers oBP685 (SEQ ID NO: 237) e oBP690 (SEQ ID NO: 238). O produto da PCR foi purificado com o kit de purificação “PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA).

[0320] As células PNY1725 competentes foram feitas e transformadas com o cassete de PCR A-UAS(PGK1)-ENO?2p-ilvD-TEF1t-ILV5p- adh-B-U-C utilizando um kit Frozen-EZ Yeast Transformation II" (Zymo Research Corporation, Irvine, CA). As misturas dos transformantes foram semeadas em meio sintético completo sem uracila suplementado com 0,5% de etanol (sem glicose) a 30 ºC. Os transformantes com um nocaute para bdh1 e integração de UAS(PGK1)-ENO?2p-ilvD-TEF1t-ILV5p-adh-B-Uforam rastreados por PCR com os primers oBP726 (SEQ ID NO: 239) e DSmMm1354F (SEQ ID NO: 240), usando DNA genômico preparado com kit Gentra& Puregene& Yeast/Bact Kit (Qiagen, Valencia, CA). Para remover o marcador URAS3 do cromossomo, os transformantes corretos foram cultivados de um dia para o outro em meio YPE (0,5% de etanol) e plaqueados em meio sintético completo suplementado com etanol (sem glicose0 e contendo ácido 5-fluoro-orótico (0,1%) a 30 ºC para selecionar os isolados que perderam o marcador URAS. A deleção de BDH1, integração de UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-TEF1tILV5Sp-adh, e a remoção do marcador URAS foram confirmadas pelo sequenciamento de DNA com os primers DSm?788R (SEQ ID NO: 241), DSM696F (SEQ ID NO: 242), DSm1354F (SEQ ID NO: 240), ADHBI643R (SEQ ID NO: 243), e ADHBISS4F (SEQ ID NO: 244) usando DNA genômico preparado com kit Gentra& Puregene& Yeast/Bact kit (Qiagen, Valencia, CA). Os isolados corretos foram designados como cepas PNY1730 (=MATa ura3A::loxP hisSA::loxP pdc6A pdetá::ilvD pde5A::kivD(y) fra2A::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)-gpd24::l0xP71/66-FBA1p-alsS bah14A::UAS(PGK1)-ENOZ2p-ilvD-IL V5p-adh). DELEÇÃO DE YMR226c

[0321] O gene YMR226c foi deletado na cepa PNY1730 por recombinação homóloga utilizando um cassete de deleção scarless linear de

2.0 kb amplificado por PCR. O cassete foi construído a partir de fragmentos amplificados por POR de splicings compostos do gene URAS3, juntamente com o seu promotor nativo e terminador como um marcador de seleção, a montante e a jusante as sequências de homologia que flanqueiam o /ocus do gene cromossômico YMR226c para promover a integração do cassete de deleção e a remoção da sequência de intervenção nativa e uma sequência de repetição para promover a recombinação e a remoção do marcador URAS. O cassete de expressão de 1208 pb URAS3 foi amplificado por PCR a partir de pLA3S3 (SEQ ID NO: 160) com os primers de PCR direto e reverso N1251 (SEQ ID NO: 245) e N1252 (SEQ ID NO: 246). Os primers direto e reverso N1253 (SEQ ID NO: 247) e N1254 (SEQ ID NO: 248) amplificaram uma sequência de homologia de 250 pb a jusante com uma sequência marcadora de sobreposição 3' URA3 a partir de uma preparação de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae cepa PNY2211 (MATa ura3A:loxP his3A pdc6A pdcetA::P[/PDCIJ- DHAD/ilvD Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS[/alsS Bs-CYC1t pdc54::P[PDCS]- ADH/isadB Ax-PDC5t gpd24::0xP fraeh —adhtA::UAS(PGK1)P[IFBA1I]- kivD LI(y)-ADH1t8). Os primers da PCR direto e reverso N1256 (SEQ ID NO: 249) e N1255 (SEQ ID NO: 250) amplificaram uma sequência de repetição de 250 pb com uma sequência marcadora de sobreposição 5' URAS3 a partir da preparação de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae cepa PNY2211. Os primers da PCR direto e reverso N1257 (SEQ ID NO: 251) e N1258 (SEQ ID NO: 252) amplificaram uma sequência de homologia a montante de 250 pb com uma sequência de sobreposição 5' a partir da preparação de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae cepa PNY2211.

[0322] Aproximadamente 1,5 ug do cassete de PCR amplificado foi transformado na cepa PNY1730 tornadas competentes utilizando o kit Frozen-EZ Yeast Transformation II"Y (Zymo Research Corporation, Irvine, CA) e a mistura de transformação foi plaqueada em meio completo sintético sem uracila suplementado com 0,5% etanol (sem glicose) a 30 ºC para a seleção de células com um cassete ymr226c4::URAS3 integrado. Os transformantes que aparecem após 72 a 96 horas são subsequentemente semeados sobre o mesmo meio e incubados a 30 ºC durante 24 a 48 horas. As estrias curtas são rastreadas para presença de ymr226cA::URA3 por PCR, com um primer interno específico para o cassete de deleção URAS voltado para a porção 5' externa - N1249 (SEQ ID NO: 253) pareado com um primer específico para a região do cromossomo voltado para a porção flanqueadora interna - N1239 (SEQ ID NO : 254) e um primer específico para o cassete de deleção URAS voltado para a porção 5' externa - N1250 (SEQ ID NO: 255) pareado com um primer específico para a região do cromossomo voltado para a porção flanqueadora interna - N1242 (SEQ ID NO: 256). Uma triagem PNY1730 positiva de ymr226cA::URAS3 por PCR resultou em produtos da PCR 5' e 3' de 598 e 726 pb, respectivamente.

[0323] Os clones PNY 1730 positivos para ymr226cA::URA3 foram cultivados durante a noite em meio YPE (0,5% de etanol) e plaqueados em meio sintético completo suplementado com etanol (sem glicose) e contendo ácido 5-fluoro-orótico (0,1%) a 30 ºC para selecionar os isolados que perderam o marcador URAS. As colônias aparecendo após 24 a 48 horas foram triadas por PCR para verificar a perda do marcador com primers específicos do cromossomo 5 'e 3' - N1239 e N1242. Uma triagem por PCR de PNY1730 ymr226cA positivo sem marcador resultou em um produto da PCR de 801 pb. À cepa PNY1730 ymr226cA foi designada PNY1758 (=MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc6A pdc14::ilvD pdc5A ::kivD(y) fra2A::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y) gpd24::loxP71/66-FBA1p-alsS-bdh14::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-IL V5p-adh ymr226cA).

CONSTRUÇÃO DO ISOBUTANOLOGÊNICO PNY 1775

[0324] PNY 1758 foram transformadas com dois plasmídeos pWZ009 (SEQ ID NO: 158) carregando o gene K9D3.KARI de Anaerostipes caccae DSM 14662 e pWZ001 (SEQ ID NO: 159) carregando o gene ilvD de Streptococcus mutans ATCC 700610. As células PNY 1775 competentes foram feitas e transformadas com os plasmídeos pW2Z009 e pWZ001 utilizando um kit Frozen-EZ Yeast Transformation II" (Zymo Research Corporation, Irvine, CA). As células transformadas foram semeadas em meio completo sintético sem uracila e histidina suplementado com 0,5% de etanol (sem glicose) a 30 ºC.

[0325] O transformante resultante foi designado isobutanologênico cepa PNY1775 (=MATa ura3A:loxP his3A:loxP pdc6A pdetá:iilvD pdc54::kivD(y) fra2A::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)-gpd24::l0xP71/66-FBA1p- alsS badh1A::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-IL V5p-adh ymr226cA/pWZ009, pWwZ001).

CONSTRUÇÃO DO ISOBUTANOLOGÊNICO PNY 1789

[0326] A cepa PNY1730 (=MATa ura3A::loxP his3A::loxP pde6A pdce1A::ilvD pde5A::kivD(y)fra2A::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)-gpd24::l0xP71/66- FBA1p-alsS bdh1A::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-ILV5p-adh) foi utilizada para gerar o isobutanologênico PNY 1789.

SUBSTITUIÇÃO DE PDC5A::KIVD (Y) com PDC5A::KIVD.LGe.Y

[0327] A região codificante kivD (y) de Lactococuss lactis integrada na região de deleção pac54 no PNY1730 foi substituída pelo gene kivD de Listeria grayi que foi códon-otimizado para Saccahromyces cerevisiae (=kivD.Lg.y) por recombinação homóloga.

[0328] O cassete de integração KkivD.Lg.y (A-KivD.Lg.yBUC) contém homologia a montante (fragmento A) e a jusante (fragmento B) da região codificante do PDCS5, região codificante de kivD.Lg.y de Listeria grayi, gene URAS3, juntamente com o promotor e terminador (fragmento L) para a seleção de transformantes, e região 3' da região codificante kivD.Li.y (fragmento C). O fragmento A foi amplificado a partir do DNA genômico de PNYO0891 como molde com o primer T-A(PDC5) (SEQ ID NO: 194), e B-A (kivDLg) (SEQ ID NO: 257), que contém uma cauda 5' com homologia com a extremidade 5' de kivD.Li.y. A sequência codificante de kivD.Li.y foi amplificada a partir do PBP1719 (= puC19-ura8MCS-U(PGK1)Pfbai-kivD La(y)-ADH1 BAC- kivD.LI Fragmento C (SEQ ID NO: 258) com o primer T-kivDLa(A) (SEQ ID NO: 259), que contém uma cauda 5' com homologia com a extremidade 3' do fragmento A, e o B-kivDLg(B) (SEQ ID NO: 260), que contém uma cauda 5' com homologia com a extremidade 5' do fragmento B. O fragmento B-U foi amplificado a partir do pBP904 (= pUC19-URA3-sadB-PDC5fragmentB) (SEQ ID NO: 261), com o primer T-B(kivDLg) (SEQ ID NO: 262), que contém uma cauda 5' com homologia com a extremidade 3' de kivD.Li.y, e oBP546 (novo) (SEQ ID NO: 263), que contém uma cauda 5' com homologia com a extremidade 5' do fragmento C. O fragmento C foi amplificado com o primer oBP547 (novo) (SEQ ID NO: 264), contendo uma cauda 5' com homologia com a extremidade 3' do fragmento U, e o primer o0BP539 (novo) (SEQ ID NO: 265). Os produtos da PCR foram purificados com o kit de purificação “PCR Purification kif' (Qiagen, Valencia CA). O fragmento A-kivD.Lg,y foi criado por PCR de sobreposição pela mistura do Fragmento A e fragmento kivD.Lg.y e amplificando-os com os primers T-A (PDC5) e B-kivDLg(B). O fragmento B-U-C foi criado por PCR de sobreposição pela mistura do Fragmento B-U e fragmento C e amplificando-os com os primers T-B(kivDLg) e oBP539(novo). Os produtos da PCR resultantes foram purificados em um gel de agarose seguido pela purificação com o kit “Gel Extration" (Qiagen, Valencia, CA). O cassete A-KivD.Lg.y-B-U-C foi criado por PCR de sobreposição pela mistura do Fragmento A-KivD.Lg.y e fragmento B-U-C e amplificando-os com os primers T-A(PDC5) e oBP539(novo). O produto da PCR foi purificado com o kit de purificação “PCR Purification kif' (Qiagen, Valencia, CA).

[0329] As células competentes da cepa PNY1730 foram feitas e transformadas com o cassete de PCR A-KivD.Lg.y-B-U-C usando um kit de transformação “Frozen-EZ Yeast Transformation ll kif' (Zymo Research; Orange, CA). As misturas dos transformantes foram semeadas em meio sintético completo sem uracila suplementado com 0,5% de etanol (sem glicose) a 30 ºC. Os transformantes com uma integração A-KivD.Lg.y-B-U-C foram rastreados por PCR com o conjunto de primers oBP540/KkivDLg(569R) e kivDLg(530F)/oBP541, usando DNA genômico preparado com kit Gentra&O PuregeneO Yeast/Bact Kit (Qiagen, Valencia, CA). Para remover o marcador

URAS3 do cromossomo, os transformantes corretos foram cultivados de um dia para o outro em meio YPE (0,5% de etanol) e plaqueados em meio sintético completo suplementado com etanol (sem glicoseO0 e contendo ácido 5-fluoro- orótico (0,1%) a 30 ºC para selecionar os isolados que perderam o marcador URAS. A substituição de kivD(y) com kivD.Lg.y, e remoção do marcador URAS foram confirmadas por sequenciamento do DNA com os primers kivDLga(569R) (SEQ ID NO: 266), kivDLg(530F) (SEQ ID NO: 267), e kivDLa(1162F) (SEQ ID NO: 268), utilizando DNA genômico preparado com o kit Gentra& PuregeneO Yeast/Bact. kit (Qiagen, Valencia, CA). Os isolados corretos foram designados como PNY1787 (=MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc6A pdetá:ilvD pdc54::kivD.Lg.y fra2A::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD.y gpd24::l0xP71/66-FBA1p- alsS badh14::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-IL V5p-adh) HIS3+ RESTAURAÇÃO

[0330] A sequência codificante HIS3 deletada foi restaurada na cepa PNY 1787 por recombinação homóloga com um cassete de PCR contendo a região codificante de HIS3 e homologias a montante e a jusante.

[0331] O cassete de PCR codificante de HIS3, contendo a região codificante de HIS3 e regiões flanqueadoras a montante e a jusante, foi amplificado a partir do DNA genômico da cepa PNY891 como molde e utilizando o primer T-HIS3 (UP300) (SEQ ID NO: 269) e primer B-HIS3 (down273) (SEQ ID NO: 270). Os produtos da PCR resultantes foram purificados em um gel de agarose seguido pela purificação com o kit “Gel Extration" (Qiagen, Valencia, CA). As células competentes PNY 1773 foram feitas e transformadas com o cassete de PCR HIS3+ usando um kit de transformação “Frozen-EZ Yeast Transformation Il kil' (Zymo Research; Orange, CA). As misturas de transformação foram semeadas em meio completo sintético sem histidina suplementado com 0,5% de etanol (sem glicose) a 30 ºC. Os transformantes com uma integração de HIS3+ foram rastreados pelo crescimento em meio completo sintético sem histidina suplementado com 0,5% de etanol (sem glicose) e confirmados por PCR de colônia, com o conjunto de primers t-HIS3 (UP300) e B-HIS3 (down273). Os isolados corretos foram designados como PNY1788 (=MATa ura3A::loxP pdc6A pdce1á::ilvD —pde5A::kivD.Lg.y — fra2A:UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD.y gpad24::loxP71/66-FBA1p-alsS badh14::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-IL V5p-adh).

[0332] PNY 1788 foram transformadas com um plasmídeo pWZ001 (SEQ ID NO: 271) carregando o gene K9D3.KARI de Anaerostipes caccae DSM 14662 e o gene ilvD de Streptococcus mutans ATCC 700610. As células PNY1788 competentes foram feitas e transformadas com os plasmídeos PNZO0O01 utilizando um kit Frozen-EZ Yeast Transformation II“ (Zymo Research Corporation, Irvine, CA). As células transformadas foram semeadas em meio completo sintético sem uracila suplementado com 0,5% de etanol (sem glicose) a 30 ºC. O transformante resultante foi designado isobutanologênico cepa PNY1789 (=MATa ura3A::loxP pdc6A pdce1A::ilvD pdc54::kivD(y)fra2A::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y)-gpd24::l0xP71/66-FBA1p-alsS bah14::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD-IL V5p-adh / pNZ001).

EXEMPLO 3 CONSTRUÇÃO DE ISOBUTANOLOGÊNICOS COM UMA DELEÇÃO DE PDE1

[0333] Para deletar a região codificante de PDE1 endógeno no PNYO01758, um cassete de deleção foi amplificado por POR a partir do pLA59 (SEQ ID NO: 150) que contém o cassete URASp-URA3-URA3St flanqueado pelos sítios loxP71 e loxP66 degenerados para a remoção do marcador URA3. A PCR foi realizada usando a DNA polimerase Phusion& (New England BioLabs Inc., Ibswich, MA) e os primers PDE1 F URAS (SEQ ID NOs: 151) e PDE1 R URAS (SEQ ID NO: 152). O produto da PCR foi transformado na PNYO01758 usando técnicas genéticas padrão (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs.

201-202), com seleção sobre meio sintético completo (base nitrogenada de levedura sem aminoácidos 1X, mistura de aminoácios sem uracila) suplementado com 5 g/L de etanol a 30 ºC. Os transformantes foram rastreados por PCR de colônia com os primers URAIR e PDE1F (SEQ ID NOs: 153 e 154) para verificar a presença do cassete de integração, e primers URAIF e PDE1IR (SEQ ID NOs: 155 e 156). Para remover o marcador URA3 as células foram transformadas com o cassete pRS423:?GAL1p-cre (SEQ ID NO: 147) e os transformantes foram selecionados em meio completo sintético (base nitrogenada de levedura sem aminoácidos 1X, mistura de aminoácidos sem histidina 1X) suplementado com 5 g/L de etanol a 30 ºC. Os transformantes foram semeados em placa de ágar extrato de levedura + peptona (YP) suplementado com 0,5%/L de galactose para induzir a expressão da recombinase Cre. A remoção do marcador foi confirmada pelo plaqueamento de colônias em meio sintético completo sem uracila e suplementado com 5 g/L de etanol para verificar a ausência de crescimento. A deleção e remoção do marcador também foram confirmadas por PCR e sequenciamento com os primers PDEIF e PDEIR (SEQ ID NOs: 154 e 156), usando o DNA genômico preparado com kit Gentra& Puregene6 Yeast/Bact kit (Qiagen, Valencia, CA). A cepa PNY01758 com deleção de PDE1 resultante foi designada PNY03040 (=MATa — ura3A:loxP —his3Ã:loxP pde6A pdetA:ilvD. pde5A:kivD(y) fra2A::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y) gpd2A::lo0xP71/66-FBA1p-alsS bdh1A::UAS(PGK1)-ENO?2p-ilvD-ILV5p-adh ymr226cA PDE14::loxP71/66). CONSTRUÇÃO DE ISOBUTANOLOGÊNICOS PNY01759 E PNY03041

[0334] As cepas PNY01758 e PNYO3040 foram transformadas com um plasmídeo pK9D3.OLE1p.llvD (SEQ ID NO: 157) carregando o gene K9D3.KARI de Anaerostipes caccae DSM 14662 e o gene ilvD de Streptococcus mutans ATCC 700610. As células PNY01758 e PNYO03040 competentes foram feitas e transformadas com o cassete de PCR pK9D3.OLE1p.IllvD (SEQ ID NO: 157) utilizando um kit Frozen-EZ Yeast Transformation II” (Zymo Research Corporation, Irvine, CA). As células transformadas foram semeadas em meio completo sintético sem uracila suplementado com 0,5% de etanol (sem glicose) a 30 ºC. O transformante resultante foi designado isobutanologênico cepa PNYO01759 (=MATa ura3A::loxP his3A::loxP pde6A pde1A::ilvD pde5A::kivD(y) fra2A::UAS(PGK1)- FBA1p-ilvD(y) gpd24::lo0xP71/66-FBA1p-alsS bdh1 A::UAS(PGK1)-ENO2p-ilvD- ILV5p-adh ymr226cA/pK9D3.OLE1p.IlvD) e PNYO03041 (=MATa ura3A::loxP his3A::loxP pdc6A pde1A::ilvD pdc54::KivD(y) fra2A::UAS(PGK1)-FBA1p-ilvD(y) god24::10xP71/66-FBA1p- alsS bdhiA::UAS(PGK1)-ENO?2p-ilvD-ILV5p-adhymr226cAPDE1A::loxP71/66/ pK9D3.OLE1p.IlvD).

[0335] Os isobutanologênicos cepas PNYO01759 e PNYO3041 foram cultivados em meio sintético (1X base nitrogenada de levedura sem aminoácidos e meio de levedura sintético suplementado sem uracila) suplementado com 2 g/L de sacarose e 5 g/L de etanol em um balão ventilado de 125 mL. As células foram cultivadas a 30 ºC com agitação a 250 rom durante a noite. Duas colônias independentes da cepa PNYO3041, nomeadamente 3041H5 e 3041%18 foram purificadas sobre meio completo sintético sem uracila suplementado com 5 g/L de etanol (sem glicose) e 2 g/L de sacarose a 30 ºC e usadas nos experimentos subsequentes.

EXEMPLO 4 EFEITO DA DELEÇÃO DE PDE1 SOBRE A HIDRÓLISE DA SACAROSE

[0336] As células foram cultivadas em placas YPD (10 g/L de peptona, 5 g/L de extrato de levedura e 20 g/L de glicose) a 30 ºC por 24 hs. Uma alça de semadura cheia de células PNY01500 ou PNYO03001 (PDE1A) (a partir de placas) foi inoculada em 20 mL de meio completo sintético (SC) (1X base nitrogenada de levedura sem aminoácidos, mistura de aminoácidos 1X suplementado com uracila e histidina), contendo 20 g/L de glicose e incubadas a 30 ºC durante 24 h. As células foram centrifugadas e resuspensas em meio SC contendo 43-44 g/L de sacarose. A densidade ótica das células foi ajustada para 10 (ODgoo) e os tubos foram incubados a ºC e 220 rpm. Amostras (10 mL de volume) foram adicionadas a tubos com tampa de rosca de 50 mL. Aproximadamente 0,5 ml da amostra foi retirado de cada tubo após 2, 6 e 8 horas após a inoculação, centrifugado, e esterilizado por filtração antes da análise do teor de açúcar residual. O teor de sacarose e glicose residual dos meios foi estimado usando o analisador de glicose e lactato YS/ 2300 STAT PLUS (YSI Life Sciences, Yellow Springs, Ohio).

[0337] O teor de açúcar residual das cepas PNYO1500 e PNYO03001 (PDE1A) cultivadas em meio completo sintético contendo sacarose como fonte de carbono é apresentado na Tabela 6. As células PNY01500 e PNYO3001 mostraram padrões semelhantes de hidrólise da sacarose e consumo de açúcar em meio SC. A deleção de PDE1 não influenciou negativamente a hidrólise da sacarose e consumo de açúcar. TABELA6 KO Teor de sacarose Teor de glicose residual : Cepas URA3S e Ene. [PO dm luzes 157 /208 ne) 19 151 [905 22 um /42,95/|/15,7/2,65/0,42| 1,8 [15,1 [9,65] 2,2 EXEMPLO 5

HIDRÓLISE DA SACAROSE NA PRESENÇA DE ISOBUTANOL

[0338]Uma alça de semadura cheia de células PNY01500 ou

PNYO03001 (PDE1A) a partir de placas foi inoculada em 20 mL de meio SC (1X base nitrogenada de levedura sem aminoácidos, mistura de aminoácidos 1X suplementado com uracila e histidina), contendo 20 g/L de glicose e incubadas a 30 ºC durante 24 h. As células foram centrifugadas e resuspensas em meio SC contendo 43-44 g/L de sacarose e 15 g/L de isobutanol. A densidade ótica das células foi ajustada para 10 (ODg009) e os tubos foram incubados a 30 ºC e 220 rpm por 16 h. Amostras (10 mL de volume) foram adicionadas a tubos com tampa de rosca de 50 mL. Aproximadamente 0,5 mL de amostra foi coletada a partir de cada tubo na hora O e após 3 e 5 horas após a inoculação. As amostras foram centrifugadas e esterilizadas por filtração antes da análise do teor de açúcar residual. O teor residual de sacarose, glicose, frutose e etanol foi estimado por HPLC (1260 Infinity System, Agilent Life Sciences, Santa Clara, CA) usando uma coluna HPX 87N Aminexº, 300 x 7,8 mm (BioRad Laboratories, Hercules, CA).

[0339]O teor de açúcar residual das cepas PNYO1500 e PNYO03001 (PDE1A) cultivadas em meio completo sintético contendo sacarose e isobutanol é apresentado na Tabela 7. A taxa de hidrólise da sacarose da PNYO01500 e PNYO3001 em meio completo sintético contendo 15 g/L de isobutanol foi comparada. As células PNY01500 e PNYO03001 exibiram um padrão diferente de hidrólise da sacarose e consumo de açúcar em meio SC contendo 15 g/L de isobutanol. As células PNY03001 hidrolisaram a sacarose a uma taxa mais rápida do que as células PNYO01500. Após 5 horas de incubação, as células PNY03001 também consumiram açúcares hidrolisados e produziram 50% mais etanol em comparação com as células PNY01500. A deleção de PDE1 influenciada positivamente a hidrólise da sacarose e o metabolismo do açúcar na presença de isobutanol. A deleção de PDE1 parece ter um desempenho de fermentação melhorado.

TABELAZ7 produzida em diferentes Nocau Sacarose Glicose Frutose Cepas te intervalos de tempo 3 |O a TS e [E 1 ns [E e dede 7,2 7,5 | 11,9 o jol17 o m 5 1 7 2 5 3 PDE1 9,2 | 15,8 | 22 34 1 5/9 |6 1 1 2 EXEMPLO 6 HIDRÓLISE DA SACAROSE TÍTULO DE ISOBUTANOL EM CEPAS NOCAUTES PARA PDE1

[0340] Células PNY01759 e PNY03041 (3041%5 e 3041%18) foram cultivadas conforme descrito no Exemplo 5 e as células foram precipitadas por centrifugação a 3000 rpm durante 5 minutos a 25 ºC e o sobrenadante foi descartado.

FASE DE PRODUÇÃO

[0341] As células foram diluídas para 10 (ODgoo), cerca de 7—8 g/L de peso celular seco, utilizando um meio de produção (PM) (Tabelas 8 e 9) em tubos com tampa de rosca de 50 mL. O meio foi esterilizado por filtração usando papel de filtro de 0,22 um antes da utilização. Os tubos foram agitados a 200 rom a 30 ºC durante 20 h e centrifugados a 4000 rpm durante 5 minutos. As amostras foram preservadas para análise por HPLC da sacarose residual e isobutanol produzido. O sedimento celular foi então submetido a uma lavagem ácida. TABELA 8 Meio de produção (PM) Ingredientes UOM 1L de meio

Ingredientes UOM 1L de Cie CaCl2.2H20 MgSO4.7H720 [Es delas am | so Sacarose aee — se | 15 Cloramfenico!| mL 0,5 Agua (vol. ajustado mL 1000 Bt pH ajustado para 5,50 + 0,1 com ácido sulfúrico diluído temperatura ambiente *MES: ácido (2-(N-morfolino)etanosulfônico TABELA 9 Solução de Vitamina 1000X Químico/Produto: 1L de ss rãs Biotina (D) gm 0,05 Ca D (+) gm 1,0 Ipen

Químico/Produto: UOM 1L de Mio-inositol (para gm 25,0 Cloridrato de gm 20,0 ácido p- gm 0,4 Água (vol ajustado | ml! 1000 e TT

FASE DE LAVAGEM ÁCIDA

[0342] O sedimento de células foi resuspenso em 10 mL de meio de lavagem ácida (AWM - acid wash medium), pH 2 (Tabela 10) e agitado a 200 rpm, 30 ºC durante 120 minutos. TABELA 10 esa — Jar | am YNB sem gm 13,4 Qemmet [smnasimen fon | 55 fisseanss — ToGHT ias | Cloramfenicol mL 0,5 Água (vol. ajustado | mL 1000 CP ss pH ajustado para 2,20 + 0,1 com ácido Esterilizado com filtro e armazenado em

RECICLAGEM CELULAR

[0343] Após a fase de lavagem ácida, as células foram coletadas por centrifugação a 3000 rpm durante 4 minutos; o sobrenadante foi descartado, e 10 mL de PM fresco foi adicionado às células. As células foram incubadas e as amostras foram coletadas para a análise por HPLC para determinar o teor de sacarose residual. Após cada fase de produção, as células foram submetidas a uma lavagem ácida e, em seguida, as células foram recicladas.

[0344] A quantificação da sacarose residual na cultura após 20 horas de incubação em PM indicou que a degradação da sacarose diminuiu gradualmente na cepa PNY01759 após a lavagem ácida das células (Tabela 11). A cepa PNY03041 (PDEI1A) hidrolisou a sacarose de forma eficiente, e não houve acúmulo de sacarose após três ciclos de lavagem ácida das células. O teor de sacarose residual da cultura aumentou após a segunda e terceira rodada de lavagem ácida. As células PNY0341 produziram mais isobutanol após lavagem ácida das células em comparação com as células PNY01759 (Tabela 12). Estes resultados indicam que a deleção de PDE1 melhora a hidrólise da sacarose e melhora o título de isobutanol dos isobutanologênicos.

TABELA 11 isobutanologênicos PNYO0175 3041H18 a AAA Teor de sacarose residual antes da meses Teor de sacarose residual após a 0,14 pimete uma imegemáaa O o Teor de sacarose residual após a 2 0,25 0,15 4,0 (+1,2) lavagem ácida (g/L) (+0,15) Teor de sacarose residual, após a 3º 9,0 (1,5) | 1,0 (+0,4) | 0,9 (+0,5) nsgenastaçã o 199 1a ones TABELA 12 Isobutanologên Antes de Apósa * | Apósa2? Cepas icos lavagem lavagem lavagem em [TE [E e ss | 7 [ss | os [e] 7a | ae | 05 EXEMPLO 7 VIABILIDADE CELULAR DE NocAUTES PDET1 APÓS A LAVAGEM ÁCIDA

[0345] Os isobutanologênicos cepas PNYO01759 e PNYO3041 (PDE1A) foram cultivados em meio SC (1X base nitrogenada de levedura sem aminoácidos e meio de levedura sintético sem uracila) suplementado com 2 g/L de sacarose e 5 g/L de etanol em um balão ventilado de 125 mL. As células foram cultivadas a 30 ºC com agitação a 250 rpm durante a noite. As células foram precipitadas por centrifugação a 3000 rpm durante 5 minutos a 25 ºC, o sobrenadante foi descartado, e as células foram resuspensas em CPM na ODegoo inicial de 20. As células foram submetidas a uma rigorosa fase de fase de lavagem ácida e produção, tal como descrito no Exemplo 6. As amostras foram removidas uma vez no final da fase de lavagem ácida para o de ensaio de contagem de células viáveis (CFU/mL). Para isto, 0,1 mL de cultura foi diluído em base nitrogenada de levedura 1X a 107 e 0,005 mL da cultura diluída foi inoculado em placas de ágar com meio completo sintético sem uracila suplementado com 5 g/L de etanol como fonte de carbono. As Unidades Formadoras de Colônia (UFC) por 1 mL da cultura foram calculadas após a enumeração das colônias após 48-72 h de incubação das placas a 30 ºC.

[0346] A contagem de células viáveis da cepa PNY01759 foi reduzida para 4x10? após três lavagens ácidas, enquanto que a contagem de células viáveis da cepa PNY03041 após três de lavagens ácidas foi 6,5x10º (Tabela 13). O nocaute do gene PDE1 em um isobutanologênico melhorou a viabilidade celular após a lavagem ácida das células. TABELA 13 Isobutanologênicos PNYO0175 | PNYO0175 | PNYO304 | PNY0304 9 9 1 1 Contagem de células 1,6x10 2,0x10 2,4x10 3,1 x 10 viáveis antes da lavagem ácida (CFU/mL. Contagem de células 1x10º 0,8 x 10º 7x10º 8x10º viáveis após a 1 º lavagem ácida (UFC/mL. Contagem de células 0,9x10 2x10 1x10 2x10 viáveis após a 2º lavagem ácida (CFU/mL. Contagem de células 3x10 5x10 7x 10º 6x 10º viáveis após a 3º lavagem ácida (CFU/mL) EXEMPLO 8 TAXA DE CRESCIMENTO DE NOCAUTES PDE71 EM MEIO SINTÉTICO

[0347] Células PNY03041 (PDE1A) e PNY01759 foram inoculadas em meio sintético completo (1X base nitrogenada de levedura sem aminoácidos e meio sintético de levedura sem uracila) suplementado com 2 g/L de sacarose e 5 g/L de etanol em um balão ventilado de 125 mL a uma ODçoo inicial de 0,5. Os frascos foram incubados a 30 ºC com agitação a 220 rpm durante 24 h. As amostras foram coletadas em intervalos de 2 h e a taxa de crescimento foi calculada com base na densidade ótica. A taxa de crescimento (uy) do nocaute para PDE1 PNYO3041 foi maior, em comparação com PNYO01759. A taxa de crescimento da cepa PNYO03041 foi 0,2 e a taxa de crescimento da cepa PNY01759 foi de 0,12. Em meio rico YPE (10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de peptona, 5 g/L de etanol), PNY03041 e PNYO01759 tiveram taxas de crescimento semelhantes (0,27-0,28). EXEMPLO 9 TOLERÂNCIA AO ISOBUTANOL DO NOCAUTE PDE1

[0348] Células PNY03041 (PDE1A) e PNY01759 foram inoculadas em meio sintético completo (1X base nitrogenada de levedura sem aminoácidos e meio sintético de levedura sem uracila) suplementado com 2 g/L de sacarose e 5 g/L de etanol em um balão ventilado de 125 mL a uma ODsoo inicial de 0,5. Os frascos foram incubados a 30 ºC com agitação a 220 rpm durante 24 h. As células foram recuperadas por centrifugação e suspensas a 20 (ODçsoo) com o mesmo meio suplementado com 30 g/L de isobutanol. As células foram incubadas durante 11 h com agitação a 200 rpm. Contagem de células viáveis foi realizada em meio completo sintético com etanol como fonte de carbono, no tempo O e 11 h. Para esta finalidade, a cultura foi diluída em meio base nitrogenada de levedura 1X a 10º e 0,005 ml da suspensão de células diluída foi colocada em placas de ágar. As placas foram incubadas a 30 ºC durante 48-72 h, e as CFU/mL foram calculadas após a enumeração das colônias nas placas.

[0349] Os resultados são apresentados na Tabela 14. A morte celular na PNY03041 foi reduzida em comparação com a PNY01759 em meio contendo 30 g/L de isobutanol. Pode-se concluir que a deleção de PDE1 melhora a tolerância ao isobutanol.

TABELA 14 Contagem de células Cepas Oh 11h EXEMPLO 10

RECICLAGEM CELULAR

[0350] As células PNY01775 foram semeadas a partir do estoque de glicerol para placas de meio sintético completo (1X base nitrogenada de levedura sem aminoácidos, 1X aminoácidos sem histidina e uracila, 1% p/v de ágar) contendo 5 g/L de etanol como fonte de carbono. Após 48 h de incubação a 30 ºC, células a partir da placa foram inoculadas em 20 mL de meio sintético completo líquido em frascos de 125 mL contendo 2 g/L de sacarose e 5 g/L de etanol como fonte de carbono. As células foram cultivadas a 30 ºC durante 24 h, com agitação a 200 rpm em agitadores (Innova 44R, New Brunswick Scientific, CT, EUA). Esta cultura foi usada para inocular 500 mL de meio de crescimento CIG+ 2 (Tabela 15). TABELA 15 Meio de Crescimento de Isobutanologênico %2 Meio de Crescimento de Isobutanologênico, pH 6,0, 2 g/L sacarose (0,2%), 5 g/L de etanol (0,5%), 5 g/L Extrato de Levedura o so Final Meio Base Nitrogena 0,67% de Levedura sem aminoácidos Solução de emo O am

Meio de Crescimento de Isobutanologênico, pH 6,0, 2 g/L sacarose (0,2%), 5 g/L de etanol (0,5%), 5 g/L Extrato de uv o Final Meio Tampão MES, 100 mM Estoque MES = 1 | 100 mL Extrato de 5 g/L 59 [rama Etanol 59/L Estoque de 6,3 mL o ee [O

[0351] A cultura foi cultivada em 100 mL de meio em frascos de 500 mL com uma ODsoo inicial de 0,3 - 0,5 e incubada a 30 ºC a 200 rom. Após 24 h, as células foram coletadas por centrifugação a 4000 rpm durante 5 minutos e resuspensas a uma ODsçoo inicial de 10 de meio de reciclagem e produção, meio CRP 2 (Tabela 16). TABELA 16 Meio de Reciclagem e Produção % 2 Meio de Reciclagem e Produção, pH 6,0, 25 g/L de sacarose, 2 g/L | de etanol, 20 mg/L de tiamina, 100 mg/L, nicotinamida Componente Concentração 1L de meio ms E Fosfato de 0,008 mg/L sulfato de 0,2 g/L Estoque = 40 g/L E a

Meio de Reciclagem e Produção, pH 6,0, 25 g/L de sacarose, 2 g/L de etanol, 20 mg/L de tiamina, 100 mg/L, nicotinamida Componente Concentração 1L de meio ms OR TT Sulfato de 0,1 g/L Estoque = 40 g/L Solução Delft 1mL mea O Solução de 1mL 1mL Tampão MES, pH 100 mM Estoque MES = 1

A seara a egg Etanol 0,20% Estoque Etanol = 2.6 mL sr Nicotinamida 100 mg/L Estoque = 10 g/L

FE

[0352] A fase de produção foi realizada em tubos com tampa de rosca de 50 mL contendo 10 mL de meio de produção e 5 mL de Extrator Isofolº16 autoclavado (Sasol Olefins & Surfactants GmbH, Alemanha) ou mistura de extrator Isofolº16 + óxido de trioctil fosfina (TOPO) (Sigma- Aldrich Co, St. Louis, MO, EUA). A mistura de extração (Isofolº16 + TOPO) foi preparada pela dissolução de 50 g de TOPO lentamente em 40 mL de Isofolº16 autoclavado. As amostras para o ponto de tempo O h (t = O h) foram coletadas imediatamente após a adição do meio de produção e extração. Para evitar a perda de células durante a amostragem O h, os tubos foram centrifugados a 4000 rpm durante 2 minutos antes da coleta. Um mililitro de amostra foi coletado a partir de cada fase (aquosa, bem como fase com o extrator orgânico). Os tubos foram inclinados a um ângulo de 45º em um suporte de tubos e incubados a 30 ºC com agitação a 160 rpm. Após 7 h de incubação, as amostras foram centrifugadas a 4000 rpm durante 2 minutos e foram coletadas amostras de 1 mL a partir de cada fase. Todas as amostras foram armazenadas a -80 ºC até a análise posterior dos açúcares e metabólitos por HPLC (1260 Infinity System, Agilent Life Sciences, Santa Clara, CA) usando uma coluna HPX 87N Aminexº, 300 x 7,8 mm (BioRad Laboratories, Hercules, CA) e cromatografia gasosa (GC 7890A System, Agilent Life Sciences, Santa Clara, CA) usando a coluna HP-Innowax (30 m X 0,82 mm e filme de 0,25 um, Agilent Life Sciences, Santa Clara, CA). Uma incubação de sete horas em meio de produção (CRP%2) foi considerada como a fase de produção. Depois de cada fase de produção, as células foram coletadas por centrifugação e submetidas à lavagem ácida.

[0353] Para a lavagem ácida, as células foram coletadas por centrifugação a 4000 rpm, resuspensas em 1 mL de meio de lavagem com ácido (meio CRP 2 com o pH ajustado para 2 com ácido sulfúrico), e misturadas em vortex. Os tubos foram inclinados em um ângulo de 45º para evitar a deposição de células na parte inferior e incubados a 30 ºC a 200 rom durante 1 h. Esta fase foi considerada como a fase de lavagem ácida. As células lavadas com ácido foram recicladas (reciclagem de células, R) para a produção de isobutanol.

[0354] Para a reciclagem de células, as células foram coletadas por centrifugação a 4000 rpm, após cada fase de lavagem ácida e resuspensas em 10 mL de meio de produção fresco (CRPX$ 2) e 5 mL de extrator autoclavado.

[0355] A PNY1775 foi reciclada na presença do agente de extração, Isofolº16 (Tabela 17) ou em uma mistura de Isofolº16 e TOPO (Tabela 18), com e sem lavagem ácida. R-O, R-1, etc referem-se ao número de reciclagens que as células foram submetidas. Na ausência da lavagem ácida, uma queda gradual nos três parâmetros (título de isobutanol, açúcar total consumido, e taxa de captação de açúcar específica) foi observada após a reciclagem 7. Uma queda no título do isobutanol, taxa de consumo de açúcar total e captação específica de açúcar foram observados após a reciclagem 3 na presença de lavagem ácida sob as condições testadas. Ao final do ciclo 6, as células submetidas a lavagem ácida tiveram 40% da taxa de consumo de açúcar em relação ao controle. Os resultados mostraram que o extrator Isofolº16 ou mistura de extrator Isofolº16 + TOPO não impactam negativamente na produção de isobutanol, sem lavagem ácida.

TABELA 17 (9/g/h) EF eeesEs ácida ácida ácida ácida ácida | Ro [atoa | osso2o | 1998 | 1995 | 08% | 086 | [8 [soa [seroar | 2 [ass [om | 1 | [ne [ssesoas [sansoss | ema | ser | 1 | 1 | [8s [esozom | 57500 | mm [ass [1 | 1 | [na [sonsos2 | sossoss | mao | asas | om | 1 [Rs [ano | sessomo | asa | 2600 | osso | e [n6 [220202 | ssszom | om | 296 | 00 | 105 [17 [rssso0 [ seesos | om [es | om | om [e [resono [esmo | am | mes | om | om | [no [osso | asssoa | om se [om | om] [Ro [ossos [ssszosa | om Tess [om | os

TABELA 18 , . Taxa de Captação Título de Isobutanol Açúcar total . de Açúcar (g/L) consumido (g/L) , específica (g/g/h) Com Sem Com Sem Com Sem lavagem lavagem lavagem lavagem lavagem | lavage ácida ácida ácida ácida ácida m ácida [Ra 4,61 + 0,03 | 4,85 + 0,51 24,40 24,71 [R2 4,63 + 0,35 | 5,28 +0,18 22,31 25,27 [pr raso fa | 1a Tee | om | os EXEMPLO 11

REJUVENESCIMENTO

[0356] Este exemplo demonstra a recuperação da taxa de consumo de açúcar e produção de isobutanol na cepa isobutanolgênica PNY1775. As células foram centrifugadas a 4000 rpm durante 5 minutos, no final da fase de lavagem ácida de reciclagem 7 e na presença de Isofolº16. O meio foi cuidadosamente removido sem desalojar o sedimento e 5 mL de meio CIG * 2 foi adicionado. As células foram incubadas a 30 ºC a 200 rpm durante 4 h. Este tratamento das células com um meio rico em nutrientes é referido como a fase de rejuvenescimento. Após a fase de rejuvenescimento, as células foram novamente centrifugadas conforme descrito acima e o sedimento foi resuspenso em meio de produção fresco (CRPH2).

RECICLAGEM DE CÉLULA E REJUVENESCIMENTO

[0358] Este exemplo descreve o efeito da reciclagem e rejuvenescimento sobre o título de isobutanol, açúcar residual e taxa de captação de açúcar específica em isobutanologênicos PNY1789. As células PNYO01789 foram semeadas a partir do estoque de glicerol para placas de meio sintético completo (1X base nitrogenada de levedura sem aminoácidos, 1X aminoácidos sem histidina e uracila, 1% p/v de ágar) contendo 5 g/L de etanol como fonte de carbono. Após 48 h de incubação a 30 ºC, células a partir da placa foram inoculadas em 20 mL de meio sintético completo líquido em frascos de 125 mL contendo 2 g/L de sacarose e 5 g/L de etanol como fonte de carbono. As células foram cultivadas a 30 ºC durante 24 h com agitação a 200 rpm. Esta cultura foi usada para inocular 500 mL de meio de crescimento CIG*

2. Neste estágio, a cultura foi cultivada em 100 mL de meio em frascos de 500 mL com uma ODgrço, inicial de 0,3 - -0,5 e incubada a 30 ºC a 200 rpm. Após 24 h, as células foram coletadas por centrifugação a 4000 rpm durante 5 minutos e resuspensas com uma ObDsoo inicial de 10 no meio de reciclagem e produção

(CRP 2). A fase de produção foi realizada em tubos de 50 mL com tampa de rosca contendo 10 mL de meio de produção e 5 mL de Isofol&16 autoclavado como Extrator. As amostras para o ponto de tempo O h (t = O h) foram coletadas imediatamente após a adição do meio de produção e extração. Para evitar a perda de células durante a amostragem O h, os tubos foram centrifugados a 4000 rpm durante 2 minutos antes da coleta. Um mililitro (1 mL) de amostra foi coletado a partir de cada fase (aquosa, bem como fase com o extrator orgânico). Os tubos foram inclinados a um ângulo de 45º em um suporte de tubos e incubados a 30 ºC com agitação a 160 rom. Após 10 h de incubação, as amostras foram centrifugadas a 4000 rpm durante 2 minutos e foram coletadas amostras de 1 mL a partir de cada fase. Todas as amostras foram armazenadas a -80 ºC até a análise posterior dos açúcares e metabólitos por HPLC (1260 Infinity System, Agilent Life Sciences, Santa Clara, CA) usando uma coluna HPX 87N Aminexº, 300 x 7,8 mm (BioRad Laboratories, Hercules, CA) e cromatografia gasosa (GC 7890A System, Agilent Life Sciences, Santa Clara, CA) usando a coluna HP-Innowax (30 m X 0,82 mm e filme de 0,25 um, Agilent Life Sciences, Santa Clara, CA). Uma incubação de sete horas em meio de produção (CRP%2) foi considerada como a fase de produção. Depois de cada fase de produção, as células foram coletadas por centrifugação e submetidas à lavagem ácida.

[0359] Para a lavagem ácida, as células foram coletadas por centrifugação a 4000 rpm, resuspensas em 1 mL de meio de lavagem com ácido (meio CRPH 2 com o pH ajustado para 2 com ácido sulfúrico), e misturadas em vortex. Os tubos foram inclinados em um ângulo de 45º para evitar a deposição de células na parte inferior e incubados a 30 ºC a 200 rom durante 1 h. Esta fase foi considerada como a fase de lavagem ácida. As células lavadas com ácido foram recicladas (reciclagem de células, R) para a produção de isobutanol.

[0360] Para a reciclagem de células, as células foram coletadas por centrifugação a 4000 rpm, após cada fase de lavagem ácida e resuspensas em 10 mL de meio de produção fresco (CRPX 2) e 5 mL de Isofolº16 autoclavado.

[0361] Para o rejuvenescimento, as células foram centrifugadas a

4.000 x rpm durante 5 minutos ao fim de reciclagem 7 da fase de lavagem ácida. O meio foi cuidadosamente removido sem desalojar o sedimento e 5 mL de meio CIG * 2 foi adicionado. As células foram incubadas a 30 ºC a 200 rom durante 4 h. Após a fase de rejuvenescimento, as células foram novamente centrifugadas conforme descrito acima e o sedimento foi resuspenso em meio de produção fresco (CRPt2).

[0362] A PNY1789 foi reciclada na presença de Isofolº16 com lavagem ácida. Os resultados são apresentados na Tabela 20. Na presença da lavagem ácida, uma queda nos títulos de isobutanol, taxa de consumo de açúcar total, e taxa de captação de taxa de açúcar específica foram observados após a reciclagem 3. Ao final do ciclo 7 da lavagem ácida, as células tiveram um queda > 30% na taxa de consumo de açúcar em comparação ao ciclo 1. O rejuvenescimento após o ciclo 7 melhorou a taxa de consumo de açúcar em duas vezes ou mais nos ciclos subsequentes.

TABELA 20 , Açúcar total consumido Taxa de Captação de Título de Isobutano! (g/L) . a (9/L) Açúcar específica (g/g/h) Sem Com sem Com Sem Com Rejuvenes | Rejuvenes | Rejuvenes | Rejuvenes | Rejuvenes | Rejuvenes cimento cimento cimento cimento cimento cimento [efess] ss] sw |

|| | resto cetsomanença | PEITO a espeeimea 0 | Título de Isobutano! (g/L) . " (9/L) Açúcar específica (g/g/h) Sem Com Sem Com Sem Com Rejuvenes Rejuvenes Rejuvenes Rejuvenes Rejuvenes Rejuvenes cimento cimento cimento cimento cimento cimento 4,86 + 0,31 25,15 0,79 | R-6 | 423+002 [OU | 208 [Do "os [| | [| R7 | 3472006 [| 1a7eB [| [os | | | R-8 | 262+0,10 | 535+001 | 1340 | 258 | 042 | os | | R-9 | 1,54+0,08 [| 552+0,08 | 791 | 2567 | 025 | os | [ R-10 | 118+000 | 539+016 | 534 | 2572 | om | os | EXEMPLO 13

LAVAGEM ÁCIDA

[0363] O isobutanologênico de cepa PNY1775 foi cultivado em meio sintético (base nitrogenada de levedura sem aminoácidos e meio sintético sem uracila, histidina, triptofano, e leucina) suplementado com 76 mg/L de triptofano, 380 mg/L de leucina, 100 mM de MES pH 6,0, 0,2% de sacarose, e 0,5% de etanol em um balão de 125 mL ventilado. As células foram cultivadas a 30 ºC com agitação a 250 rpm durante a noite. Culturas de um dia para o outro foram centrifugadas a 4000 rom durante 5 minutos, resuspensas em 1 mL em meio CIGH2, e inoculadas em 50 mL de meio CIGH2 em um balão de 125 mL ventilado. As células foram cultivadas a 30 ºC com agitação a 250 RPM em agitadores (Innova 44R, New Brunswick Scientific, CT, EUA). As culturas de um dia para o outro foram centrifugadas a 4000 rpm durante 5 minutos, resuspensas em 1 mL de meio CRP 2, inoculados em 9 mL de meio CRPH2 em tubo cônico de de 15 mL, e cultivadas com tampa fechada em um tambor rotativo a 30 ºC. Após 24 h, os sobrenadantes de cultura (coletados utilizando a unidades de filtro para tubo de centrífuga Spin-X, Costar cat. No. 8169) foram analisados por HPLC, tal como descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2007/0092957, que é incorporado ao presente pela referência. O título de isobutano! (g/L) foi de 6,76 + 0,23 (n=2).

[0364] A cepa PNY1775 foi estriada sobre placa com meio SE fresco -His -Ura (1% de etanol) e incubada a 30 ºC durante aproximadamente 48 h. As células foram removidas a partir da placa, resuspensas em 1 mL de meio SE -His -Ura (1% de etanol) em um tubo de microcentrífuga estéril, e centrifugadas até se obter uma suspensão uniforme. As células foram inoculadas em 25 mL de meio SE -His -Ura em frascos estéreis de 125 mL (frascos em duplicado) com tampas ventiladas e incubadas a 30 ºC com agitação a 120 rom. O ODço, inicial das culturas foi de cerca de 0,5. Após 20 horas de incubação, a ODgoo alcançou 3.3. A cultura foi centrifugada a 4500 rpm durante 5 minutos, em dois tubos de centrífuga de 50 mL. O sobrenadante foi descartado, e as células foram resuspensas em 500 mL de meio CIGH2 e dividido em quatro frascos de 500 mL cada um contendo 125 mL de cultura com uma ODsoo inicial de cerca de 0,5. Após 22 horas de incubação, a ODçoo de cada cultura foi mensurada e variou de 3,23 a 3,62. Duas das culturas foram centrifugadas, reunidas, e resuspensas em 80 mL de CRPH2 e o OD da cultura foi de 10,02 (6 gdcw/L).

[0365] Dez mililitros (10 mL) desta cultura foram pipetados em cada seis tubos cônicos de centrífuga de 15 mL e as culturas foram incubadas a 30 ºC em reator tipo tambor rotativo. Isso gerou amostras em triplicatas para controle e tratamento de lavagem ácida.

[0366] Os tubos foram incubados durante a fase de produção durante 7 h. Ao fim de 7 horas, os tubos foram centrifugados, e os sobrenadantes foram coletados com uma porção filtrada para análise por HPLC. Todos os sobrenadantes foram armazenados a 4 ºC. Os precipitados de células da amostra de controle, em seguida, ficaram à temperatura ambiente durante uma hora com as tampas nos tubos. Os sedimentos da amostra de lavagem ácida foram resuspensos em 1 mL de meio de lavagem ácida. As células foram resuspensas misturando suavemente por pipetagem. As amostras foram então incubadas a 30 ºC com agitação a 120 rom durante cerca de 50 minutos. No final da incubação da lavagem ácida, as culturas da lavagem ácida foram centrifugadas a 4500 rpm durante 3 minutos. Os sobrenadantes da lavagem ácida foram cuidadosamente removidos com uma pipeta a fim de não perturbar as células, e o sobrenadante foi descartado.

[0367] Todos os precipitados celulares foram resuspensos em 10 mL de CRPi2 fresco. Os tubos foram firmemente fechados e a próxima fase de produção iniciou-se com a incubação a 30 ºC em tambor rotativo.

[0368] Todos os sobrenadantes de cultura (coletados utilizando a unidades de filtro para tubo de centrífuga Spin-X, Costar cat. No. 8169) foram analisados por HPLC (tal como descrito na Publicação do Pedido de Patente US 2007/0092957). A sacarose, glicose e frutose foram analisadas por HPLC utilizando uma coluna Aminexº, 300 x 7,8 mm (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Os outros compostos foram analisados por HPLC usando uma coluna Shodex Sugar'M, 300 mm L x 8 mm ID. Os resultados são apresentados na Tabela 21.

[0369] Os dados na Tabela 21 mostram que a taxa de utilização do açúcar melhorou após dois ciclos de lavagem em ambas culturas tratadas, controle e com lavagem ácida. Além disso, o rendimento de isobutanol foi semelhante do ciclo 1 ao 10 em ambos grupos de amostras, controle e tratadas com ácido. A concentração dos intermediários da via (UKIV, DHIV, e ácido isobutírico) foi semelhante nos diversos ciclos tanto no controle como nas amostras com lavagem ácida, o que demonstra que as enzimas da via biossintética do isobutanol estavam ativas e não foram inativadas pela exposição a um pH baixo.

[0370] A partir da descrição acima, fica evidente que foram alcançados os objetivos da presente invenção. Embora apenas alguns exemplos de realização tenham sido estabelecidos, exemplos de realização alternativos e várias modificações serão evidentes a partir da descrição acima para os técnicos hábeis no assunto e estão dentro do espírito e escopo da presente invenção. Os peritos na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes dos exemplos de realização específicos descritos na presente invenção. Pretende-se que tais equivalentes sejam abrangidos pelas reivindicações a seguir.

[0371] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível de perícia dos técnicos hábeis no assunto ao qual pertence a presente invenção, e são incorporados ao presente pela referência na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado pela referência para todos os efeitos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE BUTANOL, caracterizado por compreender: (a) fornecimento de um butanologênico, em que o butanologênico compreende uma via biossintética do butanol geneticamente manipulada por engenharia genética, em que a via biossintética do butanol geneticamente manipulada por engenharia genética é uma via biossintética do isobutanol! geneticamente = manipulada por engenharia genética e em que o butanologênico é uma levedura; (b) contato do butanologênico com um ou mais substratos de carbono, em condições em que o butanol é produzido em um rendimento eficaz; (c) coleta do butanologênico; (d) recuperação do butanol em uma concentração pelo menos de cerca de 6 g/L; (e) contato do butanologênico coletado em (c) com um ou mais substratos de carbono, em condições nas quais o butanol é produzido em um rendimento eficaz, e em que o rendimento eficaz é pelo menos cerca de 90% do rendimento eficaz de (b); (f) repetição das etapas (c) - (e); e, opcionalmente exposição do butanologênico coletado em (c) às condições de pH menores ou iguais a cerca de 2,0 por pelo menos cerca de 1 hora, na presença pelo menos de cerca de 0,3% de butanol.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas etapas (c) — (e) serem repetidas pelo menos dez vezes.

3. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo butanologênico ainda não expressar ou possuir uma expressão reduzida da piruvato descarboxilase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, fosfodiesterase, butanol desidrogenase 1 (BDH1), acetolactato redutase, ou combinações dos mesmos.

4, PROCESSO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela fosfodiesterase ser PDE1.

5. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo butanologênico estar presente a uma densidade celular de pelo menos cerca de 2 gdcw/L (gramas de massa celular seca por litro), durante o contato de (b).

6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo contato da etapa (b) ocorrer na presença de um agente de extração, e/ou em que o contato de (b) e (e) ocorrer em condições anaeróbicas ou microaeróbicas.

7. COMPOSIÇÃO, caracterizada por possuir um pH inferior a cerca de 2 e compreender um isobutanologênico que utiliza sacarose que compreende uma via do isobutanol geneticamente manipulada por engenharia genética, em que o isobutanologênico que utiliza sacarose é um membro de um gênero de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia ou Pichia.

8. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo isobutanologênico que utiliza sacarose compreender uma enzima modificada que catalisa a conversão do substrato em produto; acetolactato em 2,3-dihidroxiisovalerato.

9. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela redução na expressão de acetolactato redutase ser resultado de uma inserção, mutação, substituição e/ou deleção de um gene que codifica a YMR226C.

10. MICRO-ORGANISMO, caracterizado por compreender fosfodiesterase e/ou atividade da fosfodiesterase eliminadas ou reduzidas, em que o micro-organismo produz butanol.

11. MICRO-ORGANISMO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo polipeptídeo possuindo atividade de fosfodiesterase ser o PDE1.

12. “MICRO-ORGANISMO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo micro-organismo compreender uma via biossintética do butanol geneticamente manipulada por engenharia genética, em que a via biossintética do butanol geneticamente manipulada por engenharia genética é uma via biossintética do isobutanol geneticamente manipulada por engenharia genética.

13. — MICRO-ORGANISMO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo micro-organismo ainda não expressar ou possuir uma expressão reduzida da piruvato descarboxilase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, butanol desidrogenase 1 (BDH1), acetolactato redutase, ou combinações dos mesmos.

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