CN105950525A - 整合编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸 - Google Patents

整合编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明涉及整合编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸，以及具有至少一种整合多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽。本发明也涉及使用此类宿主细胞提高异丁醇、2，3‑丁二醇、2‑丁醇或2‑丁酮的生物合成产量的方法。

Description

整合编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸
本申请是申请日为2011年9月7日、申请号为201180042345.8、发明名称为“整合编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸”的PCT申请的分案申请。
相关专利申请的交叉引用
本专利申请涉及并要求提交于2010年9月7日的美国临时专利申请61/380,563和提交于2011年3月23日的美国临时专利申请61/466,557的优先权，它们均全文以引用方式并入本文。
以电子方式提交的序列表参考
与本专利申请一起提交的、以ASCII文本文件格式的电子方式提交的序列表内容(文件名：20110907_CL5178USNA_SeqList.txt，文件大小：669,953字节，并且创建日期为：2011年8月31日)全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及工业微生物和丁醇及其异构体的发酵生产领域。更具体地讲，本发明涉及具有一种或多种整合多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽。
背景技术
丁醇是重要的工业化学品，其用作燃料添加剂、塑料工业中的化学原料以及食品和香料工业中的食品级提取剂。每年由石油化学方法生产了100至120亿磅的丁醇，并且对这种通用化学品的需求还很可能会增加。2-丁酮，也被称为甲基乙基酮(MEK)，是被广泛使用的溶剂，并且是继丙酮之后最重要的商品化生产的酮。它被用作用于漆料、树脂和粘合剂的溶剂，以及选择性提取剂、氧化反应的活化剂，并且它能够通过在催化剂的存在下与氢反应而以化学方法被转化为2-丁醇(Nystrom等人，J.Am.Chem.Soc.，69：1198，1947)。2，3-丁二醇可被用于丁烯和丁二烯(二者是重要的化工原料，目前由裂化石油获得)的化学合成中，并且2，3-丁二醇的酯可被用作增塑剂(Voloch等人，“Fermentation Derived 2，3-Butanediol，”：Comprehensive Biotechnology，Pergamon Press Ltd.，England，第2卷，第3节，第933-947页，1986)。
可工程化微生物以表达用于生产例如2，3-丁二醇、2-丁酮、2-丁醇和异丁醇的产物的生物合成途径。美国专利7,851,188公开了用于生产异丁醇的工程化重组微生物。美国专利申请公布20070259410和20070292927公开了用于生产2-丁酮或2-丁醇的工程化重组微生物。已知多个用于异丁醇和2-丁醇的生物合成的途径，它们全部从细胞的丙酮酸开始。丁二醇是2-丁醇途径中的中间体，所述途径在美国专利申请公布20070292927中公开。
已经改变了酵母中的丙酮酸代谢以生产乳酸和甘油。美国专利申请公布20070031950公开了带有一种或多种丙酮酸脱羧酶或丙酮酸脱氢酶基因的破坏并且表达D-乳酸脱氢酶基因的酵母菌株，其被用于生产D-乳酸。Ishida等人(Biosci.Biotech.andBiochem.，70：1148-1153，2006)描述了具有破坏的丙酮酸脱羧酶基因并表达乳酸脱氢酶的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。美国专利申请公布2005/0059136公开了没有丙酮酸脱水酶活性的葡萄糖耐受的不依赖C2碳源(GCSI)的酵母菌株，其可以具有外源乳酸脱氢酶基因。Nevoigt等人(Yeast，12：1331-1337，1996)描述了在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)中降低的丙酮酸脱羧酶和提高的NAD-依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶对甘油产量的影响。
工业发酵生产醇或其它化合物需要酵母细胞稳定生产丙酮酸生物合成途径的多核苷酸。此外还需要在重组宿主细胞如酵母中生产异丁醇、2，3-丁二醇、2-丁醇或2-丁酮的改善方法。
发明内容
本文提供了具有一种或多种整合多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽。与不具有编码催化生物合成途径步骤(例如丙酮酸至乙酰乳酸的转化)的多肽的整合多核苷酸的宿主细胞相比，此类宿主细胞提供稳定和/或增加生物合成途径产物形成的方法，所述产物例如异丁醇、2，3-丁二醇、2-丁醇或2-丁酮。
本发明的一个方面涉及包含编码多肽的多核苷酸的重组宿主细胞，所述多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化，所述多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中。在另一方面，所述宿主细胞包含利用丙酮酸的生物合成途径和编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸，所述多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中。在另一方面，所述多核苷酸是宿主细胞异源性的。
本发明的一个方面涉及重组宿主细胞，其包含异丁醇生物合成途径，其中所述途径包括由多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，所述多肽由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码，并且其中所述途径包括由多肽催化的乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的底物至产物的转化，所述多肽由质粒上的多核苷酸编码。在多个实施例中，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述异丁醇生产的滴度是提高的。
本发明的一个方面涉及重组宿主细胞，其包含2，3-丁二醇、2-丁醇或2-丁酮生物合成途径，其中所述途径包括由多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，所述多肽由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码，并且其中所述途径包括至少一种由多肽催化的底物至产物的转化，所述多肽由质粒上的多核苷酸编码。在多个实施例中，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述2，3-丁二醇、2-丁醇或2-丁酮生产的滴度是提高的。
在另一方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；和编码第三多肽的第三异源性多核苷酸，所述第三多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；其中所述第一和第二异源性多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中；其中所述第三异源性多核苷酸没有被整合到宿主细胞的染色体中；并且其中所述第一、第二、和第三多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的不同步骤。
在另一方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含(a)编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化；(b)编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化；和(c)编码第三多肽的第三异源性多核苷酸，所述第三多肽催化不是(a)或(b)的转化步骤的异丁醇生物合成途径转化步骤；其中所述第一和第二异源性多核苷酸被整合到染色体中；其中所述第三异源性多核苷酸没有被整合到染色体中；并且其中所述宿主细胞产生异丁醇。
在另一方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含(a)编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化；和(b)编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化不是(a)的转化步骤的异丁醇生物合成途径转化步骤；其中所述第一异源性多核苷酸被整合到染色体中；其中所述第二异源性多核苷酸没有被整合到染色体中；并且其中所述宿主细胞产生异丁醇。
在本发明的多个方面，所述宿主细胞是细菌、蓝细菌、丝状真菌或酵母。在另一方面，宿主细胞是下列属的成员：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)或糖酵母属(Saccharomyces)。在另一方面，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、屎肠球菌(Enterococcus faecalis)或啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在另一方面，所述宿主细胞是兼性厌氧菌。
在本发明的另一方面，利用丙酮酸的生物合成途径包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化途径的底物至产物的转化。在另一方面，一种或多种多核苷酸被整合到染色体中。在另一方面，利用丙酮酸的生物合成途径形成产物2，3-丁二醇、异丁醇、2-丁醇或2-丁酮。
在本发明的一个方面，利用丙酮酸的生物合成途径是丁醇生物合成途径。在另一方面，丁醇生物合成途径是2-丁醇生物合成途径或异丁醇生物合成途径。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(iii)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；(iv)α-酮异戊酸至异丁醛；或(v)异丁醛至异丁醇。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)或(v)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(iii)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；(iv)α-酮异戊酸至异丁酰-CoA；(v)异丁酰-CoA至异丁醛；或(vi)异丁醛至异丁醇。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(iii)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；(iv)α-酮异戊酸至缬氨酸；(v)缬氨酸至异丁胺；(vi)异丁胺至异丁醛；或(vii)异丁醛至异丁醇。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)或(vii)的一种或多种多核苷酸在质粒上。
在本发明的另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至2，3-丁二醇；或(iv)2，3-丁二醇至2-丁酮。在另一方面，(ii)、(iii)或(iv)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至2，3-丁二醇；(iv)2，3-丁二醇至2-丁酮；或(v)2-丁酮至2-丁醇。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)或(v)的一种或多种多核苷酸在质粒上。
在本发明的另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)α-乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇；(iv)3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸；(v)或3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)或(v)的一种或多种多核苷酸在质粒上。在另一方面，宿主细胞包含一种或多种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)α-乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至3-氨基-2-丁醇；(iv)3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸；(v)3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮；或(vi)2-丁酮至2-丁醇。在另一方面，(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的一种或多种多核苷酸在质粒上。
在另一方面，至少其中一种编码催化底物至产物转化的多肽的多核苷酸是异源性的。在另一个实施例中，多于一种编码催化底物至产物转化的多肽的多核苷酸是异源性的。在另一个实施例中，所有编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中每个底物至产物转化的多肽的多核苷酸是异源性的。
在本发明的一个方面，催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物转化的多肽是乙酰乳酸合酶。在另一方面，乙酰乳酸合酶与表1所述的乙酰乳酸合酶具有至少约80％的氨基酸序列同一性。在另一方面，乙酰乳酸合酶与具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列具有至少约80％的同一性。在另一方面，催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽对应于酶委员会编号(Enzyme Commission Number)EC 2.2.1.6。
在本发明的另一方面，催化乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的转化的多肽对应于酶委员会编号EC 1.1.1.86。在另一方面，催化2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的转化的多肽对应于酶委员会编号EC 4.2.1.9。在另一方面，催化α-酮异戊酸至异丁醛的转化的多肽对应于酶委员会编号EC 4.1.1.72或4.1.1.1。在另一方面，催化异丁醛至异丁醇的转化的多肽对应于酶委员会编号EC 1.1.1.265、1.1.1.1或1.1.1.2。
在一个方面，本发明的宿主细胞中丙酮酸脱羧酶的表达是降低的或基本上消除的。在另一方面，宿主细胞包含内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换，所述内源性多核苷酸编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽。
在本发明的另一方面，一种或多种编码催化本文所述的生物合成途径步骤的多肽的多核苷酸在质粒中。在另一方面，所述质粒包含与SEQ ID NO：1至89中的一种或多种至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列，或者与SEQ ID NO：129-133或它们的编码区中的任何一个至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。
在一个方面，本发明的宿主细胞中甘油-3-磷酸脱氢酶的表达是降低的或基本上消除的。在另一方面，本发明的宿主细胞中FRA2的表达是降低的或基本上消除的。在另一方面，本文所述的一种或多种多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中PDC1-TRX1基因间区域处。
在一个方面，本发明涉及生产来自本发明宿主细胞的生物合成途径产物的方法。在另一方面，本发明涉及生产丁醇的方法，所述方法包括(a)提供本发明的重组宿主细胞；以及(b)在产生丁醇的条件下，使所述重组宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。在另一方面，所述方法还包括使所述发酵液体培养基与提取剂接触以产生两相发酵混合物。在另一方面，所述提取剂包括脂肪酸。在另一方面，所述脂肪酸来源于玉米油或大豆油。在另一方面，所述提取剂包括与水不混溶的有机提取剂如C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪酰胺或C12-C22脂肪醛。在另一方面，所述方法还包括使所述发酵液体培养基与有机酸和酶接触，所述酶能够用所述有机酸酯化丁醇。在另一方面，所述方法还包括蒸发所述发酵液体培养基的至少一部分以形成包含水和丁醇的蒸气流。
在一个方面，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的宿主细胞相比，本发明的宿主细胞的丁醇生产速率提高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。在另一方面，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的宿主细胞相比，本发明的宿主细胞的丁醇生产滴度提高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。
在另一方面，本发明涉及提高非整合重组多核苷酸的拷贝数或表达的方法，所述重组多核苷酸编码催化本文所述的生物合成途径步骤的多肽，所述方法包括在产生生物合成途径产物的条件下，使本发明的宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。在另一方面，本发明涉及提高利用丙酮酸的生物合成途径的流量的方法，所述方法包括：(a)提供本发明的重组宿主细胞；以及(b)在提高所述宿主细胞中利用丙酮酸的生物合成途径的流量的条件下，使所述宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。
在另一方面，本发明涉及制备重组宿主细胞的方法，所述方法包括用下列多核苷酸转化宿主细胞：(i)一种或多种编码催化利用丙酮酸的生物合成途径的底物至产物转化的多肽的多核苷酸；和(ii)编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸；其中(ii)的多核苷酸被整合到染色体中。在另一方面，本发明涉及提高利用丙酮酸的生物合成途径产物的形成的方法，所述方法包括：(i)提供本发明的重组宿主细胞；以及(ii)使所述宿主细胞在形成利用丙酮酸的途径产物的条件下生长，其产物量大于由不包含整合到染色体中的编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸的宿主细胞形成的产物量。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含(i)本发明的宿主细胞；(ii)丁醇；和(iii)提取剂。在另一方面，本发明涉及组合物，其包含(i)本发明的宿主细胞；(ii)丁醇；(iii)提取剂；和(iv)酯化酶。在另一方面，此类组合物的丁醇是异丁醇。
在另一方面，本发明涉及将乙酰乳酸合酶(als)染色体整合到酵母宿主细胞的方法，所述方法包括用包含SEQ ID NO：131的整合载体转化所述宿主细胞。在另一方面，宿主细胞还包含异丁醇生物合成途径。在另一方面，所述宿主包含至少两个染色体整合的多核苷酸。
附图说明
并入本文并成为说明书的一部分的附图示出了本发明，并且与说明书一起进一步用来解释本发明的原理并使得本领域的技术人员能够利用本发明。
图1示出利用丙酮酸的途径和酶。
图2示出三种不同的异丁醇生物合成途径
图3示出四种不同的2-丁醇生物合成途径。
图4A-4D示出乙酰乳酸合酶(als)编码区的序列关系，所述编码区用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)AlsS序列的BLAST分析进行检索，限制为该序列的100个最近邻居。als编码序列通过它的来源生物进行鉴定。
图5示出PNY2204基因座(pdc1Δ：：ilvD：：pUC19-kan：：FBA-alsS：：TRX1)。
图6示出PNY2211基因座(pdc1Δ：：ilvD：：FBA-alsS：：TRX1)。认为pdc1-trx1基因间区域中的alsS基因整合是“无痕”插入，因为载体、标记基因和loxP序列丢失。
根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和所附的序列描述形成了本申请的一部分。
下列序列符合37C.F.R.§§1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”)并且符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)和EPO和PCT的序列表要求[规则5.2和49.5(a-bis)，以及行政性指示的208节和附录C]。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822所示的规定。
表1：本文涉及的编码区和蛋白质的序列号(SEQ ID NO)
*相同的氨基酸序列由SEQ ID NO：47和49编码
表2：本文涉及的靶基因编码区和蛋白质的序列号(SEQ ID NO)
SEQ ID NO：90-222和243-246是在实例中使用并描述的序列。
SEQ ID NO：238-242是本文涉及的杂合启动子。
具体实施方式
除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本专利申请(包括其定义)为准。除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。本文提及的所有公布、专利和其它参考文献出于各种目的全文以引用方式并入本文，如同每一单独的公布或专利申请均特定且个别地以引用方式并入一样，除非仅专利或专利申请的特定部分被提及以引用方式并入本文。
材料、方法和实例仅是例示性的并且不旨在进行限制。根据发明详述和权利要求，本发明的其它特点和优点将显而易见。
本发明涉及用于生产丁醇的重组微生物和方法。本发明满足多种商业需求和工业需求。丁醇是一种具有多种应用的重要工业日用化学品，其中其作为燃料或燃料添加剂的潜力尤为重要。尽管丁醇仅仅是四碳醇，但是其具有与汽油相似的能含量，并且可以与任何化石燃料共混。丁醇是优选的燃料或燃料添加剂，因为它在标准内燃机中燃烧时仅生成CO2并且几乎不产生或根本不产生SOX或NOX。另外，丁醇的腐蚀性不及另一种燃料添加剂乙醇。
丁醇除了可用作生物燃料或燃料添加剂之外，在新兴的燃料电池工业中还具有影响氢分配问题的潜力。如今，由于氢的运输和分配存在安全隐患，燃料电池饱受困扰。可以容易地对丁醇重整其氢含量，并且可以通过现有的加油站以燃料电池或汽车所需的纯度进行分配。
下列定义和缩写用于权利要求和说明书的判读。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”，或其任何其它变型旨在是非排他的或可广泛解释的。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备所固有的元素。此外，除非另外特别说明，否则“或”是指包含性的或，而不是指排它性的或。例如，下列任何一个均表示满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
如本文所用，术语“基本上由组成”在权利要求的上下文中旨在代表介于封闭式权利要求中写作“由组成”格式和在完全开放式权利要求中写作“包括”格式之间的中间范围。参见M.P.E.P.§2111.03。
此外，涉及元素或组分例子(即出现)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在为非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如下列方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值10％范围内，优选地在报告数值5％范围内。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施例，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施例。
如本文所用的术语“丁醇”是指2-丁醇、异丁醇或它们的混合物。
术语“异丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生异丁醇的酶途径。
术语“2-丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生2-丁醇的酶途径。
术语“2-丁酮生物合成途径”是指从丙酮酸产生2-丁酮的酶途径。
如本文所用，术语“提取剂”是指用于从发酵液体培养基中提取丁醇和/或其它组分的一种或多种有机溶剂。
术语“乙酰乳酸合酶”和“乙酰乳酸合成酶”本文互换使用，指催化丙酮酸转化成乙酰乳酸和CO2的酶。已知乙酰乳酸合酶的例子为EC编号2.2.1.6(Enzyme Nomenclature1992，Academic Press，San Diego)。这些酶可得自多种来源，包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[基因库编号(GenBank No)：CAB15618和Z99122，分别是NCBI(National Center for Biotechnology Information)氨基酸序列、NCBI核苷酸序列]、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(基因库编号：AAA25079和M73842)、以及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(基因库编号：AAA25161和L16975)。附加的例子也在表1中提供。
术语“乙酰乳酸脱羧酶”指具有催化α-乙酰乳酸转化成乙偶姻的酶活性的多肽(或多个多肽)。乙酰乳酸脱羧酶的例子已知编号为EC 4.1.1.5并且可例如来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(DNA：SEQ ID NO：21，蛋白质：SEQ ID NO：22)、土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)(DNA：SEQ ID NO：23，蛋白质：SEQ ID NO：24)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(DNA：SEQ ID NO：19，蛋白质：SEQ ID NO：20)。
术语“乙偶姻胺化酶”指具有催化乙偶姻转化成3-氨基-2-丁醇的酶活性的多肽(或多个多肽)。乙偶姻胺化酶可利用辅因子5′-磷酸吡哆醛或NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)。所得产物可在3-位点具有(R)或(S)立体化学构型。依赖磷酸吡哆醛的酶可使用氨基酸如丙氨酸或谷氨酸作为氨基供体。依赖NADH-和NADPH-的酶可使用氨作为第二底物。NADH-依赖的乙偶姻胺化酶的合适例子也称为氨基醇脱氢酶，由Ito等人(美国专利6,432,688)进行了描述。依赖吡哆醛的乙偶姻胺化酶的例子是胺：丙酮酸氨基转移酶(也称为胺：丙酮酸转氨酶)，如Shin和Kim所述(J.Org.Chem.67：2848-2853(2002))。
术语“氨基丁醇激酶”指具有催化3-氨基-2-丁醇转化成3-氨基-2-丁醇邻位磷酸的酶活性的多肽(或多个多肽)。氨基丁醇激酶可利用ATP作为磷酸供体。有对催化相似底物胆胺和1-氨基-2-丙醇的类似反应的酶的报道(Jones等人(1973)Biochem.J.134：167-182)。美国专利申请公布20070292927在实例14中描述了氨基醇激酶胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐亚种(Erwinia carotovora subsp.atroseptica)。
术语“氨基丁醇磷酸磷酸裂解酶”，也称为“氨基醇邻位磷酸裂解酶”，指具有催化3-氨基-2-丁醇邻位磷酸转化成2-丁酮的酶活性的多肽(或多个多肽)。氨基丁醇磷酸磷酸裂解酶可利用辅因子5′-磷酸吡哆醛。有对催化相似底物1-氨基-2-丙醇磷酸的类似反应的酶的报道(Jones等人(1973)Biochem.J.134：167-182)。美国专利申请公布20070292927在实例15中描述了新鉴定的氨基丁醇磷酸磷酸裂解酶，其来自生物胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)。
术语“丁二醇脱氢酶”也称为“乙偶姻还原酶”，指具有催化乙偶姻转化成2，3-丁二醇的酶活性的多肽(或多个多肽)。丁二醇脱氢酶是醇脱氢酶大家族的一个亚群。丁二醇脱氢酶可具有生产(R)-或(S)-立体化学构型的醇产物的特异性。(S)-特异性丁二醇脱氢酶的例子已知编号为EC1.1.1.76并且可例如来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(DNA：SEQ ID NO：25，蛋白质：SEQ ID NO：26)。(R)-特异性丁二醇脱氢酶的例子已知编号为EC 1.1.1.4并且可例如来自蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)(DNA：SEQ ID NO：27，蛋白质：SEQ ID NO：28)，和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(DNA：SEQ ID NO：29，蛋白质：SEQID NO：30)。
术语“乙酰羟酸异构还原酶”和“乙酰羟酸异构还原酶”以及“酮醇酸还原异构酶”(KARI)本文互换使用，指催化乙酰乳酸转化成2，3-二羟基异戊酸的酶。适用的酶利用NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和/或NADPH作为电子供体。已知乙酰羟酸异构还原酶的例子为EC编号1.1.1.86，并且序列得自大量的微生物阵列，包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)(基因库编号：NP_418222和NC_000913)、啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)(基因库编号：NP_013459和NC_001144)、海沼甲烷球菌(Methanococcusmaripaludis)(基因库编号：CAF30210和BX957220)、和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(基因库编号：CAB14789和Z99118)。
术语“乙酰羟酸脱水酶”是指催化2，3-二羟基异戊酸转化为α-酮异戊酸的酶。乙酰羟酸脱水酶的例子已知其EC编号为EC 4.2.1.9。这些酶可得自多种微生物，包括但不限于大肠杆菌(E.coli)(基因库编号：YP_026248和NC_000913)、酿酒酵母(S.cerevisiae)(基因库编号：NP_012550和NC_001142)、海沼甲烷球菌(M.maripaludis)(基因库编号：CAF29874和BX957219)、和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(基因库编号：CAB14105和Z99115)。
术语“支链α-酮酸脱羧酶”指催化α-酮异戊酸转化为异丁醛和CO2的酶。已知支链α-酮酸脱羧酶的例子为EC编号4.1.1.72，并且得自许多来源，包括但不限于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(基因库编号：AAS49166、AY548760、CAG34226和AJ746364)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(基因库编号：NP_461346和NC_003197)、和丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(基因库编号：NP_149189和NC_001988)。
术语“支链醇脱氢酶”是指催化异丁醛转化为异丁醇的酶。支链醇脱氢酶的例子是已知EC编号1.1.1.265的酶，但是所述酶也可被归类为其它醇脱氢酶(具体地讲，EC1.1.1.1或1.1.1.2)。这些酶利用NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和/或NADPH作为电子供体并可得自多种来源，包括但不限于啤酒糖酵母(S.cerevisiae)(基因库编号：NP_010656、NC_001136；NP_014051；和NC_001145)、大肠杆菌(E.coli)(基因库编号：NP_417484和NC_000913)和丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(基因库编号：NP_349892、NC_003030；NP_349891、和NC_003030)。
术语“支链酮酸脱氢酶”是指催化α-酮异戊酸转化为异丁酰-CoA(异丁酰-辅酶A)的酶，使用NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为电子受体。支链酮酸脱氢酶的例子已知其编号为EC 1.2.4.4。这些支链酮酸脱氢酶由四个亚基构成，并且来自所有亚基的序列可得自多种微生物，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(基因库编号：CAB14336、Z99116、CAB14335、Z99116、CAB14334、Z99116、CAB14337和Z99116)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)(基因库编号：AAA65614、M57613、AAA65615、M57613、AAA65617、M57613、AAA65618和M57613)。
术语“酰化醛脱氢酶”指催化异丁酰-CoA转化成异丁醛的酶，其使用NADH或NADPH作为电子供体。已知酰化醛脱氢酶的例子为EC编号1.2.1.10和1.2.1.57。这些酶得自多种来源，包括但不限于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)(基因库编号：AAD31841和AF157306)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(基因库编号：NP_149325、NC_001988、NP_149199和NC_001988)、恶臭假单胞菌(P.putida)(基因库编号：AAA89106和U13232)、和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(基因库编号：YP_145486和NC_006461)。
术语“转氨酶”指催化α-酮异戊酸转化成L-缬氨酸的酶，其使用丙氨酸或谷氨酸作为胺供体。转氨酶的例子已知为EC编号2.6.1.42和2.6.1.66。这些酶可得自多个来源。依赖丙氨酸的酶的来源例子包括但不限于大肠杆菌(E.coli)(基因库编号：YP_026231和NC_000913)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)(基因库编号：YP_093743和NC_006322)。依赖谷氨酸的酶的来源例子包括但不限于大肠杆菌(E.coli)(基因库编号：YP_026247和NC_000913)、酿酒酵母(S.cerevisiae)(基因库编号：NP_012682和NC_001142)和嗜热碱甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(基因库编号：NP_276546和NC_000916)。
术语“缬氨酸脱氢酶”指催化α-酮异戊酸转化成L-缬氨酸的酶，其使用NAD(P)H作为电子供体并用氨作为胺供体。缬氨酸脱氢酶的例子已知为EC编号1.4.1.8和1.4.1.9并且可得自多个来源，包括但不限于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(基因库编号：NP_628270和NC_003888)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(基因库编号：CAB14339和Z99116)。
术语“缬氨酸脱羧酶”指催化L-缬氨酸转化成异丁胺和CO2的酶。缬氨酸脱羧酶的例子已知为EC编号4.1.1.14。这些酶存在于链霉菌属中，例如生绿链霉菌(Streptomycesviridifaciens)(基因库编号：AAN10242和AY116644)。
术语“ω转氨酶”催化异丁胺转化成异丁醛的酶，其使用合适的氨基酸作为胺供体。已知ω转氨酶的例子为EC编号2.6.1.18，并且得自许多来源，包括但不限于反硝化产碱菌(Alcaligenes denitrificans)(基因库编号：AAP92672和AY330220)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)(基因库编号：YP_294474和NC_0073479)、奥奈达湖希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)(基因库编号：NP_719046和NC_004347)、和恶臭假单胞菌(P.putida)(基因库编号：AAN66223和AE016776)编码。
术语“异丁酰-CoA变位酶”指催化丁酰-CoA转化成异丁酰-CoA的酶。这种酶使用辅酶B12作为辅因子。异丁酰-CoA变位酶的例子已知为EC编号5.4.99.13。这些酶存在于多个链霉菌属中，包括但不限于肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)(基因库编号：AAC08713、U67612、CAB59633和AJ246005)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)(基因库编号：CAB70645、AL939123、CAB92663和L939121)、和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)(基因库编号：NP_824008、NC_003155、NP_824637和NC_003155)。
术语“基本上不具有”当用于指在与存在的异丁醇途径竞争的碳途径中存在或缺乏酶活性(例如丙酮酸脱羧酶)时，指酶含量基本上小于野生型宿主中的相同酶的含量，其中优选地小于约20％的野生型含量，较优选地小于约15％或10％的野生型含量。所述活性可为小于约5％、4％、3％、2％或1％的野生型活性。
术语“兼性厌氧菌”是指能够在有氧和无氧环境中生长的微生物。
术语“碳底物”或“能发酵的碳底物”是指本发明的宿主生物体能够代谢的碳源，和尤其是选自：单糖、寡糖、多糖、和单碳底物或它们的混合物的碳源。碳底物的来源可包括任何原料，例如可再生的原料来源，包括但不限于玉米、小麦、甘蔗、木材、藻类；任何农业废物或残余以及任何木质纤维素和/或半纤维素材料。
术语“基因”指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调节序列(5′非编码序列)和编码序列后的调节序列(3′非编码序列)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调节序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调节序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来基因”或“异源性基因”指正常情况下不存在于宿主生物中，但是通过例如基因转移导入宿主生物的基因，或者存在于宿主生物中或是宿主生物天然具有的，但是经某些方法修饰而影响其功能的基因。认为如本文所述整合到染色体中的多核苷酸(天然的或非天然的多核苷酸)是异源性多核苷酸。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。
如本文所用，术语“编码序列”和“编码区”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
术语“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整体源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至可包含合成的DNA片段。本领域的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应不同的环境条件或生理条件而指导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。还应认识到因为在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。
如本文所用，术语“表达”指源于本发明核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致基因稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。
术语“质粒”、“载体”和“盒”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进入独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′端非翻译序列一起导入细胞中。“转化盒”指含有外来基因并且除了该外来基因外还含有有利于转化特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”指包含外来基因并且除了该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的特定载体。
如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏倚性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，期望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
如本文所用，术语“内源性的”指由生物产生或合成的某些产物或加到生物体周围的某些产物。
如它是指用于转化各种宿主的基因或编码区的核酸分子，术语“密码子优化的”是指在基因或编码区的核酸分子中的密码子改变，反映了在没有改变DNA编码的多肽情况下宿主生物典型的密码子使用情况。此类优化包括将至少一个或多于一个或显著的数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一个或多个密码子。
如本文所用，“分离的核酸片段”或“分离的核酸分子”可互换使用，并将指单链或双链的RNA或DNA聚合体，任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交和洗涤条件为人们所熟知，示例参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold SpringHarbor，NY(1989)，尤其是在该文献第11章和表11.1(全文以引用方式并入本文)中进行了例示。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤确定严格性条件。一组条件使用一系列洗涤，开始是6X SSC、0.5％SDS在室温下洗涤15分钟，然后用2X SSC、0.5％SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2XSSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤两次，每次30分钟。另一组严格性条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2X SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组高严格性条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1X SSC、0.1％SDS进行。例如，另一组严格条件包括在0.1X SSC、0.1％SDS中于65℃下杂交并用2X SSC、0.1％SDS洗涤，随后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤。
杂交需要两种核酸含有互补序列，但取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域内熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按下列顺序依次降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的公式(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施例中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。在另一个实施例中，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸、至少约20个核苷酸，或至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”是指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))的算法通过计算机自动化的序列比对和鉴定进行。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬菌斑的原位杂交)的方法中。此外，12-15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了编码特定真菌蛋白质的完整的氨基酸和核苷酸序列。具有如本文报道序列的有益效果，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包括如随附的序列表中所示的完整序列，以及如上文定义的这些序列的基本部分。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
如本领域所熟知的，术语“百分比同一性”是两个或更多个多肽序列之间或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。本领域中“同一性”也意为多肽或多核苷酸序列之间的序列关联度，视情况而定，如由此类序列字符串的匹配来测定。“同一性”和“相似性”能通过已知方法容易地计算出来，包括但不限于下列描述：(1)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)Oxford University：NY(1988)；(2)Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)Academic：NY(1993)；(3)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humania：NJ(1994)；(4)Sequence Analysis in Molecular Biology(vonHeinje，G.编辑)Academic(1987)；和(5)Seauence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton：NY(1991)。
设定确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包(LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.，Madison，WI))中的MegAlignTM程序进行。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干个不同的算法，包括对应于称为“Clustal V比对方法”的Clustal V比对方法(描述于Higgins等人，CABIOS.5：151-153，1989；Higgins等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191，1992中)，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlignTM程序中找到的比对方法。对于多重比对，默认值对应于GAPPENALTY＝10、以及GAP LENGTH PENALTY＝10。用Clustal方法进行蛋白质序列的百分比同一性成对比对和计算的默认参数为KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5、以及DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2、GAP PENALTY＝5、WINDOW＝4、以及DIAGONALS SAVED＝4。在使用Clustal V程序进行序列比对后，通过查看同一程序中的“序列距离”表格有可能获得“百分比同一性”。此外，也可以使用“Clustal W比对方法”，该方法对应于称为Clustal W的比对方法(描述于Higgins等人，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992)中)，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlignTM v6.1程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数(GAP PENALTY＝10、GAP LENGTH PENALTY＝0.2、Delay Divergen Seqs(％)＝30、DNA Transition Weight＝0.5、Protein Weight Matrix＝Gonnet系列、以及DNAWeight Matrix＝IUB)。在使用Clustal W程序进行序列比对后，通过查看在同一程序中的“序列距离”表有可能获得“百分比同一性”。
本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其它物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。有用的一致性百分比例子包括但不限于：24％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或24％至100％的任何整数百分比可用于描述本发明，例如25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，或至少250个氨基酸的多肽。
术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：(1)GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；(2)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；(3)DNASTAR(DNASTAR Inc.，Madison，WI)；(4)Sequencher(Gene Codes Corporation，AnnArbor，MI)；和(5)所述FASTA程序结合了Smith-Waterman算法(W.R.Pearson，Comput.Methods GenomeRes.，[Proc.Int.Symp.](1994)，会议日期1992，111-20编辑：Suhai，Sandor，Plenum：New York，NY)。在本专利申请案的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。在此所用的“默认值”指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY(1989)(下文“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，published by Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)。附加的方法参见Methods in Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics and Molecular andCell Biology(Part A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(编辑)，ElsevierAcademic Press，San Diego，CA)。其它的分子工具是本领域已知的，包括通过重叠延伸聚合酶链反应(PCR)的拼接(Yu等人(2004)Fungal Genet.Biol.41：973-981)，对于啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)URA3基因座突变的阳性选择(Boeke，J.D.等人(1984)Mol.Gen.Genet.197，345-346；M A Romanos等人，Nucleic Acids Res.1991年1月11日，19(1)：187)，cre-lox位点特异性重组系统以及突变lox位点和FLP底物突变(Sauer，B.(1987)Mol Cell Biol 7：2087-2096；Senecoff等人(1988)Journal of Molecular Biology，第201卷，第2期，第405-421页；Albert等人(1995)The Plant Journal.第7卷，第4期，第649-659页)，“无缝”基因缺失(Akada等人(2006)Yeast，23(5)：399-405)，和空位修复方法(Ma等人，Genetics 58：201-216，1981)。
通过丙酮酸转化成乙酰乳酸的生物合成途径生产
微生物细胞从糖中生产丙酮酸，其随后被多种细胞代谢途径利用，包括如图1所示的那些。可工程化微生物宿主细胞以产生许多期望的产物，其初始生物合成途径步骤为将内源丙酮酸转化成乙酰乳酸。用于合成异丁醇的工程化生物合成途径(图2)在美国专利申请公布20070092957中进行了描述，其以引用方式并入本文，并且该途径用于合成2-丁醇和2-丁酮(图3)在美国专利申请公布20070259410和20070292927中进行了描述，它们以引用方式并入本文。产物2，3-丁二醇是在美国专利申请公布20070292927中描述的生物合成途径的中间体。这些途径每个均具有通过乙酰乳酸合酶将丙酮酸转化成乙酰乳酸的初始步骤。因此，这些生物合成途径的产物产量将部分取决于由丙酮酸产生的乙酰乳酸的量和可利用的丙酮酸的量。
申请人已经发现包含编码催化丙酮酸转化成乙酰乳酸的多肽的多核苷酸(其被整合到宿主细胞的染色体中)的重组宿主细胞可具有改善的利用丙酮酸的生物合成途径的产物产量(例如丁醇如异丁醇)。申请人发现本发明的宿主细胞与其中所述多核苷酸没有被整合到染色体中的细胞相比可具有改善的丁醇产量，这通过提高的产物滴度、提高的生产速率或提高的细胞密度显示。
在多个实施例中，本发明涉及包含利用丙酮酸的生物合成途径和编码催化丙酮酸转化成乙酰乳酸的多肽的多核苷酸(其被整合到宿主细胞的染色体中)的重组宿主细胞。在多个实施例中，所述多核苷酸对于宿主细胞是异源性的。在多个实施例中，利用丙酮酸的生物合成途径包含一种或多种多核苷酸，其编码催化所述途径底物至产物转化的多肽。在多个实施例中，一种或多种多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体。
乙酰乳酸合酶的表达和整合
在本发明的实施例中，催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物转化的多肽是乙酰乳酸合酶。本发明宿主细胞中的内源乙酰乳酸合酶可在线粒体基因组中编码并在线粒体中表达。在多个实施例中，为了制备本发明的重组宿主细胞(例如酵母)，进行基因修饰以使乙酰乳酸合酶在胞质中表达。在此类实施例中，乙酰乳酸合酶从细胞核中表达并且不包括线粒体靶向信号，以便所述酶保留在胞质中(定位于胞质)。乙酰乳酸合酶的胞质表达在美国专利申请公布20090305363中进行了描述。
乙酰乳酸合酶也称为乙酰羟酸合酶，属于EC 2.2.1.6(在2002年从4.1.3.18变更过来)，并且是为人们所熟知的。这些酶参与多个生物中的蛋白氨基酸亮氨酸和缬氨酸的生物合成途径，以及2，3-丁二醇和乙偶姻的发酵生产途径。
技术人员将会知道分离自多种来源的具有乙酰乳酸合酶活性的多肽可用于本发明，不受序列同一性的影响。适用的乙酰乳酸合酶得自如定义所述的多种来源。对于丙酮酸的底物偏好性在酮丁酸之上的乙酰乳酸合酶活性是特别有用的，如那些由芽孢杆菌属(Bacillus)的alsS和克雷伯氏菌属(Klebsiella)的budB所编码的(Gollop等人，J.Bacteriol.172(6)：3444-3449，1990；和Holtzclaw等人，J.Bacteriol.121(3)：917-922，1975)。
因为乙酰乳酸合酶是为人们所熟知的，并且因为基因组测序的广泛应用，适用的乙酰乳酸合酶可由本领域的技术人员基于序列相似度，使用生物信息学方法容易地鉴定。典型地，利用已知的乙酰乳酸合酶氨基酸序列，例如本文所提供的那些，对可公开获得的数据库的BLAST(参见上文)检索被用于鉴定可在本文的菌株中使用的乙酰乳酸合酶和它们的编码序列。例如，在图4的系统发育树中描述了乙酰乳酸合酶，它们是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)AlsS序列的100个最近邻居。所述序列之间的同源性关系在这个系统发育树中进行鉴定。在这些序列之间是那些具有40％同一性的序列，然而这些序列已经被确认为乙酰乳酸合酶。乙酰乳酸合酶蛋白与表1中的任何具有乙酰乳酸合酶蛋白或图4中示出的任何乙酰乳酸合酶蛋白具有至少约70-75％、75％-80％、80-85％、85％-90％、90％-95％或至少约98％或99％的序列同一性，它们可用于本发明的菌株。同一性基于Clustal W比对方法，所述方法采用GAP PENALTY＝10、GAP LENGTH PENALTY＝0.1、以及Gonnet 250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数。
在表1中列出了编码乙酰乳酸合酶的序列例子，所述酶可用于乙酰乳酸合酶(als)活性的胞质表达。可用于酵母胞质表达的附加乙酰乳酸合酶编码序列可在文献中或生物信息学数据库中鉴定，这是技术人员熟知的，并且一些als蛋白的编码区由来源生物在图4中示出。具有EC编号2.2.1.6的任何als可由本领域的技术人员鉴定并且可用于本发明的宿主细胞。
此外，本文所述的或本领域所述的序列可用于鉴定天然的其它同源物。例如本文所述的每一乙酰乳酸合酶编码核酸片段可用于分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的例子包括但不限于：(1)核酸杂交方法；(2)DNA和RNA扩增方法，这可通过核酸扩增技术的多种用法来举例说明[如聚合酶链反应(PCR)，Mullis等人，美国专利4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor，等人，Proc.Acad. Sci.USA 82：1074，1985；或链置换扩增(SDA)，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392，1992]；和(3)文库构建和互补筛选方法。
例如，与本文所述的乙酰乳酸合酶编码基因编码相似的蛋白质或多肽的基因，可以用本领域的技术人员所熟知的方法，通过将本发明的核酸片段的全部或部分用作DNA杂交探针来筛选来自任何目标生物的文库而被直接分离。基于所公开的核酸序列的特异性寡核苷酸探针，可通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)设计和合成。而且，整个序列可用于通过技术人员已知的方法(如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术)直接合成DNA探针，或使用可用的体外转录体系合成RNA探针。另外，可设计特异性引物并将其用于扩增部分(或全长)的本发明序列。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应后标记，并被用作探针，以通过在适当严格度的条件下的杂交分离全长的DNA片段。
通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于所需的检测条件，应该设计引物序列以提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是本领域常见且熟知的(Thein等人，“The use of as specific hybridizationprobes in the Diagnosis of Genetic Disorders”，in Human Genetic Diseases：APractical Approach，K.E.Davis编辑，1986，第33-50页，IRL：Herndon等人，In Methods inMolecular Biology，White，B.A.编辑，(1993)第15卷，第31-39页，PCR Protocols：CurrentMethods and Applications.Humania：Totowa，NJ)。
通常，可以将本文所述序列的两个短片段在聚合酶链反应规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。聚合酶链反应也可以用克隆的核酸片段的文库进行，其中一个引物的序列源自本文所述核酸片段，而另一个引物的序列利用编码微生物基因的mRNA前体的3′端的多腺苷酸片的存在。
作为另外一种选择，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如，技术人员能够按照RACE规程(Frohman等人，PNAS USA 85：8998(1988))，通过利用PCR扩增转录物中的一个单独位点和3′或5′端之间的区域的拷贝，生成cDNA。以3′和5′方向取向的引物可用本发明的序列设计。使用可商购获得的3′RACE或5′RACE体系(例如BRL，Gaithersburg，MD)，能够分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等人，PNAS USA 86：5673，1989；Loh等人，Science，243：217，1989)。
作为另外一种选择，所述乙酰乳酸合酶编码序列可作为用于鉴定同源物的杂交试剂。核酸杂交试验的基本组成包括探针、怀疑含有目的基因或基因片段的样本及特定的杂交方法。探针通常是与待检测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是“可杂交的”。探针长度可从5个碱基至数万个碱基不等，并且可取决于具体待完成的测试。通常约15个碱基至约30个碱基的探针长度是合适的。然而，只需要探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区内的一定比率的碱基未与正确的互补碱基配对。
杂交方法是有严格规定的。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在正确浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间的任何可能的杂交都可发生。混合物中的探针或标记的浓度将决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。任选地，可以加入离液剂。离液剂通过抑制核酸酶活性来稳定核酸。此外，离液剂允许短寡核苷酸探针在室温下的敏感和严格杂交(Van Ness等人，Nucl.AcidsRes.19：5143-5151，1991)。合适的离液剂包括但不限于氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯等。离液剂的最终浓度可为约3M。如果需要，技术人员可将甲酰胺加到杂交混合物中，通常为30-50％(v/v)。
可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20％至60％体积，优选30％体积的极性有机溶剂。普通的杂交溶液采用约30-50％v/v甲酰胺、约0.15M至1M氯化钠、约0.05M至0.1M缓冲液(如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05％至0.2％去污剂(如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(约300-500千道尔顿)、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500千道尔顿)和血清白蛋白。一般的杂交溶液还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以及任选约0.5％至2％重量/体积的甘氨酸。还可以包含其它添加剂，例如包括多种极性水溶性或可膨胀试剂(如聚乙二醇)、阴离子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖类聚合物(如硫酸葡聚糖)在内的体积排阻剂。
核酸杂交可适用于多种测定形式，例如夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要组分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。
乙酰乳酸合酶的细胞质内表达可通过用包含编码乙酰乳酸合酶蛋白的序列的基因转化来完成，所述序列无线粒体靶向信号序列。酵母中基因表达的方法是本领域已知的(参见例如Methods in Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics and Molecularand Cell Biology，Part A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(编辑)，ElsevierAcademic Press，San Diego，CA中)。基因在酵母中的表达通常需要可操作地连接至所关注的编码区的启动子，和转录终止子。可使用多个酵母启动子来构建编码乙酰乳酸合酶的基因的表达盒，包括但不限于组成型启动子FBA、GPD1、ADH1和GPM，以及诱导型启动子GAL1、GAL10和CUP1。其它酵母启动子包括杂合启动子UAS(PGK1)-FBA1p(SEQ ID NO：238)、UAS(PGK1)-ENO2p(SEQ ID NO：239)、UAS(FBA1)-PDC1p(SEQ ID NO：240)、UAS(PGK1)-PDC1p(SEQ ID NO：241)和UAS(PGK)-OLE1p(SEQ ID NO：242)。适宜的转录终止子包括但不限于FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、GAL1t、CYC1、和ADH1。
适用的启动子、转录终止子、和编码区可被克隆进酵母2微米质粒并被转化到酵母细胞中(Ludwig等人，Gene，132：33-40，1993；美国专利申请公布20080261861A1)。
适合的启动子、转录终止子和编码区可被克隆进大肠杆菌-酵母穿梭载体中，并被转化到酵母细胞，如实例所述。这些载体允许菌株在大肠杆菌和酵母株中繁殖。
载体通常包含选择性标记和在目标宿主中允许自主复制或染色体整合的序列。在酵母中通常使用的质粒是穿梭载体pRS423、pRS424、pRS425和pRS426(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)，它们包含大肠杆菌复制起点(例如，pMB1)、酵母2μ复制起点，以及用于营养选择的标记。这四种载体的选择标记物是His3(载体pRS423)、Trp1(载体pRS424)、Leu2(载体pRS425)和Ura3(载体pRS426)。构建具有编码多肽的嵌合基因的表达载体能以或者在大肠杆菌中标准分子克隆技术完成或者在酵母中间隙修复重组方法完成。
空位修复克隆方法利用了酵母中高效的同源重组。典型地，酵母载体DNA被消化(例如，在其多克隆位点)，以在其序列中产生“空位”。生成了许多受关注的插入DNA，所述插入DNA在5′和3′端包含≥21bp的序列，这些序列彼此依次重叠，并且与载体DNA的5′和3′端重叠。例如，为构建“Gene X”的酵母表达载体，表达盒选择了酵母启动子和酵母终止子。所述启动子和终止子扩增自酵母基因组DNA，而基因X通过PCR扩增自其源生物，或者从包含基因X序列的克隆载体获得。至少21bp的重叠序列存在于在线性载体和启动子序列的5′之间、在启动子和基因X之间、基因X与终止子序列之间、和在终止子与线性载体3′端之间。然后，所述“有间隙的”载体和所述插入DNA共转化到酵母菌株中并且接种到包含适宜化合物混合物的培养基上，将允许质粒上的营养选择标记互补。通过利用从选择的细胞制备的质粒DNA进行PCR作图，能够验证正确的插入组合的存在。然后可将从酵母分离的质粒DNA(通常浓度较低)转入大肠杆菌菌株，例如TOP10，然后通过小量抽提和限制性作图进一步验证所述质粒构建体。最后，所述构建体可通过序列分析得到验证。
与空位修复技术类似，向酵母基因组的整合也利用了酵母中的同源重组系统。典型地，利用高保真度DNA聚合酶和引物，包含编码区加上控制元件(启动子和终止子)和营养缺陷型标记的盒被PCR扩增，其中所述引物与所述盒杂交，并且包含与期望插入发生的基因组区域的5′和3′区同源的40-70碱基对的序列。然后将PCR产物转入酵母，并铺板于包含适当的化合物混合物的培养基上，所述混合物允许对所整合的营养缺陷型标记的选择。例如，为了将“基因X”整合到染色体位置“Y”上，所述启动子-编码区X-终止子的构建体从质粒DNA构建体上扩增，并通过SOE(重叠延伸剪接)PCR或通过常见限制性酶切消化和克隆连接到自养型标记上(如URA3)。所述全长盒，包含启动子-编码区X-终止子-URA3区，是PCR扩增得到的，所用引物序列为包含40-70个碱基对、与酵母染色体Y位置的5′和3′区同源。上述PCR产物被转入酵母，并在缺乏尿嘧啶的生长培养基上进行选择。转化体可通过克隆PCR或通过对染色体DNA的直接测序得到验证。作为另外一种选择，可构建整合载体并在大肠杆菌(E.coli)中增殖。可将染色体整合必需的元件(至少一个宿主特异性的靶序列和一个酵母选择性标记)加到任何合适的大肠杆菌(E.coli)克隆载体上。在从大肠杆菌(E.coli)宿主中制备载体后，通过在宿主特异性靶序列中进行限制性消化可将它线性化并转化到酵母中。在线性载体和天然靶序列之间的同源重组将引起整个载体的整合(Rothstein，R.，Methods in Enzymology，第194卷，第281-301页)。通过营养缺陷型标记的选择获得转化体，并通过PCR方法或直接测序进行确认。
在多个实施例中，本发明涉及生产重组宿主细胞的方法，所述方法包括用下列多核苷酸转化宿主细胞：(i)至少一个编码催化利用丙酮酸的生物合成途径的底物至产物转化的多肽的多核苷酸；和(ii)编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸；其中(ii)的多核苷酸被整合到染色体中。
生物合成途径
用于生产丁醇的适当的生物合成途径是本领域中已知的，并且某些适当的途径描述于本文中。在一些实施例中，所述丁醇(包括异丁醇)生物合成途径包含至少一种对宿主细胞是异源的基因。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径包含一种以上对宿主细胞是异源的基因。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径包含异源性基因，所述异源性基因编码的多肽对应于生物合成途径的每一步骤。如本文所用，异源指为本文目的已经经修饰的天然的和非天然的基因。
利用丙酮酸的生物合成途径的产物可在本发明的宿主细胞中有利地生产。此类产物的列表包括但不限于2，3-丁二醇、2-丁酮、2-丁醇、和异丁醇。在多个实施例中，利用丙酮酸的生物合成途径包含一种或多种多核苷酸，其编码催化所述途径底物至产物转化的多肽。在多个实施例中，一种或多种多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中。
在一些实施例中，本发明涉及重组宿主细胞，其包含编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；和编码第三多肽的第三异源性多核苷酸，所述第三多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的转化步骤；其中所述第一和第二异源性多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中；其中所述第三异源性多核苷酸没有被整合到宿主细胞的染色体中；并且其中所述第一、第二、和第三多肽催化利用丙酮酸的生物合成途径的不同步骤。
在一些实施例中，本发明涉及重组宿主细胞，其包含(a)编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化；(b)编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化；和(c)编码第三多肽的第三异源性多核苷酸，所述第三多肽催化不是(a)或(b)的转化步骤的异丁醇生物合成途径转化步骤；其中所述第一和第二异源性多核苷酸被整合到染色体中；其中所述第三异源性多核苷酸没有被整合到染色体中；并且其中所述宿主细胞产生异丁醇。
在一些实施例中，本发明涉及重组宿主细胞，其包含(a)编码第一多肽的第一异源性多核苷酸，所述第一多肽催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化；和(b)编码第二多肽的第二异源性多核苷酸，所述第二多肽催化不是(a)的转化步骤的异丁醇生物合成途径转化步骤；其中所述第一异源性多核苷酸被整合到染色体中；其中所述第二异源性多核苷酸没有被整合到染色体中；并且其中所述宿主细胞产生异丁醇。
起始于将丙酮酸转化成乙酰乳酸的步骤的用于合成异丁醇的生物合成途径在美国专利申请公布20070092957进行了描述，其以引用方式并入本文。如美国专利申请公布20070092957所述，在异丁醇生物合成途径例子中的步骤使用乙酰乳酸，所述步骤包括下列转化：
-乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(图2途径步骤b)由例如乙酰羟酸异构还原酶催化；
-2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸(图2途径步骤c)由例如乙酰羟酸脱水酶催化；
-α-酮异戊酸至异丁醛(图2途径步骤d)由例如支链α-酮酸脱羧酶催化；以及
-异丁醛至异丁醇(图2途径步骤e)由例如支链乙醇脱氢酶催化。
本文和/或本领域已描述了可用于底物以生成如本文所述产物转化的基因和多肽，以及鉴别此类基因和多肽的方法例如对于异丁醇，参见实例和美国专利公开7,851,188。酮醇酸还原异构酶的描述参见美国专利申请公布20080261230 A1、20090163376 A1、20100197519 A1、和PCT申请公布WO/2011/041415。本文所述的KARI的例子为那些来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1、以及荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)PF5突变体。KARI包括粪厌氧棒状菌(Anaerostipes caccae)KARI变体“K9G9”和“K9D3”(分别为氨基酸序列SEQ ID NO：225和224)。美国专利申请公布20100081154 A1和美国专利公开7,851,188描述了二羟基丙酸脱水酶(DHAD)，包括来源于变异链球菌(Streptococcus mutans)的DHAD。用于催化α-酮异戊酸转化成异丁醛的适用多肽包括来自格氏李斯特菌(Listeriagrayi)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、和溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)的那些，它们分别具有SEQ ID NO：247、48和248。美国专利申请公布20090269823 A1描述了SadB，来源于木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)的乙醇脱氢酶(ADH)。乙醇脱氢酶也包括马肝ADH和印度拜耶林克氏菌(Beijerinkia indica)ADH(蛋白质SEQ ID NO：237)。以上引用的每一申请和专利以引用方式并入本文。
对于利用所公开的生物合成途径的异丁醇生产，美国专利申请公布20070092957还描述了嵌合基因的构建和酵母，例如啤酒糖酵母的基因工程。
在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含对所述酵母细胞是异源的至少一种基因、至少两种基因、至少三种基因或至少四种基因。在一些实施例中，所述重组宿主细胞包含针对异丁醇生物合成途径的每一底物至产物的转化的异源性基因。在多个实施例中，所述催化乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的底物至产物转化的多肽，和/或催化异丁醛至异丁醇的底物至产物转化的多肽，可利用NADH作为辅因子。
用于合成2-丁酮和2-丁醇的生物合成途径起始于将丙酮酸转化成乙酰乳酸的步骤，所述途径公开于美国专利申请公布20070259410和20070292927中，它们以引用方式并入本文。图3提供了所公开的2-丁酮和2-丁醇生物合成途径的图示。2-丁酮是当图示的最后步骤，将2-丁酮转化为2-丁醇被省去时的制得的产物。在本文公开的菌株中的2-丁酮或2-丁醇的生产得益于乙酰乳酸提高的可用性。如美国专利申请公布20070292927所述，在生物合成途径例子中的步骤使用乙酰乳酸，所述步骤包括下列转化：
-乙酰乳酸至乙偶姻(图3步骤b)由例如乙酰乳酸脱羧酶催化；
-乙偶姻至2，3-丁二醇(图3步骤i)由例如丁二醇脱氢酶催化；
-2，3-丁二醇至2-丁酮(图3步骤j)由例如二醇脱水酶或甘油脱水酶催化；以及
-2-丁酮至2-丁醇(图3步骤f)由例如丁醇脱氢酶催化。
可以用这些酶表达的基因在美国专利申请公布20070292927中进行了描述。在酵母这个途径中所用的丁二醇脱水酶来源于食葡糖罗斯拜瑞士菌(Roseburiainulinivorans)，RdhtA(蛋白质SEQ ID NO：32，编码区SEQ ID NO：31)，其公开于美国专利申请公布20090155870中。这个酶与来自食葡糖罗斯拜瑞士菌(Roseburia inulinivorans)RdhtB(蛋白质SEQ ID NO：34，编码区SEQ ID NO：33)的丁二醇脱水酶再激活酶一起使用。
如美国专利申请公布20070292927所述，在生物合成途径例子中的步骤使用乙酰乳酸，所述步骤包括下列转化：
-α-乙酰乳酸至乙偶姻(图3步骤b)，由例如乙酰乳酸脱羧酶催化；
-乙偶姻至3-氨基-2-丁醇(图3步骤c)，由例如乙偶姻胺化酶催化；
-3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸(图3步骤d)，由例如氨基丁醇激酶催化；
-3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮(图3步骤e)，由例如氨基丁醇磷酸磷酸裂解酶催化；以及
-2-丁酮至2-丁醇(图3步骤f)由例如丁醇脱氢酶催化。
2-丁酮是当最后描述的将2-丁酮转化成2-丁醇的步骤被省略时形成的产物。在本文公开的菌株中的2-丁酮或2-丁醇的生产得益于乙酰乳酸提高的可用性。
对于将2-丁酮转化为2-丁醇的最后一步有用的是新型丁醇脱氢酶，其分离自一种被鉴定为木糖氧化无色杆菌Achromobacter xylosoxidans)的环境隔离的细菌，其公开于美国专利申请公布20090269823(DNA：SEQ ID NO：35，蛋白质SEQ ID NO：36)。
也描述于美国专利申请公布20090155870中的是嵌合基因的构建和用于2-丁醇生产的酵母的基因工程，其使用美国专利申请公布20070292927所公开的生物合成途径。2，3-丁二醇是在这个2-丁醇途径中的中间体并且在它的合成中的步骤也在上文中进行了描述。
在本发明的多个实施例中，利用丙酮酸的生物合成途径形成包括2，3-丁二醇、异丁醇、2-丁醇或2-丁酮在内的产物。在多个实施例中，利用丙酮酸的生物合成途径是丁醇生物合成途径。在多个实施例中，丁醇生物合成途径是2-丁醇生物合成途径或异丁醇生物合成途径。在多个实施例中，宿主细胞包含至少一种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(iii)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；(iv)α-酮异戊酸至异丁醛；或(v)异丁醛至异丁醇。在多个实施例中，宿主细胞包含至少一种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(iii)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；(iv)α-酮异戊酸至异丁酰-CoA；(v)异丁酰-CoA至异丁醛；或(vi)异丁醛至异丁醇。在其它实施例中，宿主细胞包含至少一种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；(iii)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；(iv)α-酮异戊酸至缬氨酸；(v)缬氨酸至异丁胺；(vi)异丁胺至异丁醛；或(vii)异丁醛至异丁醇。
在多个实施例中，宿主细胞包含至少一种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至2，3-丁二醇；或(iv)2，3-丁二醇至2-丁酮。在多个实施例中，宿主细胞包含至少一种编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：(i)丙酮酸至乙酰乳酸；(ii)乙酰乳酸至乙偶姻；(iii)乙偶姻至2，3-丁二醇；(iv)2，3-丁二醇至2-丁酮；或(v)2-丁酮至2-丁醇。
在多个实施例中，所述重组宿主细胞包含：(a)编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物转化的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸被整合到染色体中；(b)编码催化乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的底物至产物转化的多肽的异源性多核苷酸；(c)编码催化2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的底物至产物转化的多肽的异源性多核苷酸；和(d)编码催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物转化的多肽的异源性多核苷酸，其中所述宿主细胞基本上不具有丙酮酸脱羧酶活性；并且其中所述宿主细胞产生异丁醇。
在多个实施例中，催化乙酰乳酸转化成2，3-二羟基异戊酸的多肽对应于酶委员会编号EC 1.1.1.86。在多个实施例中，催化2，3-二羟基异戊酸转化成α-酮异戊酸的多肽对应于酶委员会编号EC 4.2.1.9。在多个实施例中，催化α-酮异戊酸转化成异丁醛的多肽对应于酶委员会编号EC 4.1.1.72或4.1.1.1。在多个实施例中，催化异丁醛转化成异丁醇的多肽对应于酶委员会编号EC 1.1.1.265、1.1.1.1或1.1.1.2。
在本发明的其它实施例中，编码催化本文所述生物合成途径的任何转化步骤的多肽的一种或多种多核苷酸在质粒上。在多个实施例中，编码催化本文所述生物合成途径的任何转化步骤的多肽的一种或多种多核苷酸被整合到宿主细胞的染色体中PDC1-TRX1基因间区域处。
在其它实施例中，本发明宿主细胞催化甘油-3-磷酸转化成二羟基丙酮磷酸的多肽的表达可是降低的或基本上消除的。在多个实施例中，催化甘油-3-磷酸转化成二羟基丙酮磷酸的多肽是甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)。在多个实施例中，宿主细胞包括在编码多肽的内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换，所述多肽催化甘油-3-磷酸转化成二羟基丙酮磷酸。在多个实施例中，催化甘油-3-磷酸转化成二羟基丙酮磷酸的多肽对应于酶委员会编号1.1.1.8。在多个实施例中，编码催化甘油-3-磷酸转化成二羟基丙酮磷酸的多肽的多核苷酸是GPD1或GPD2。在多个实施例中，编码催化甘油-3-磷酸转化成二羟基丙酮磷酸的多肽的多核苷酸包括表2的GPD序列。对宿主细胞的此类修饰和其它形式在美国专利申请公布20090305363中进行了描述。
在其它实施例中，本发明的宿主细胞的铁调节蛋白的表达可是降低的或基本上消除的。在多个实施例中，本发明的宿主细胞的影响铁-硫(Fe-S)簇生物合成的多肽的表达可是降低的或基本上消除的。在多个实施例中，重组宿主细胞还包括(a)至少一种编码具有二羟酸脱水酶活性的异源多肽；和(b)(i)编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一种缺失、突变、和/或替换；和/或(ii)编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸。在多个实施例中，所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由AFT1(核酸SEQ ID NO：227、氨基酸SEQ ID NO：228)、AFT2(SEQ ID NO：229和230)、FRA2(SEQ ID NO：231和232)、GRX3(SEQ ID NO：233和234)或CCC1(SEQ ID NO：235和236)编码。在多个实施例中，所述影响Fe-S簇生物合成的多肽为组成型突变体AFT1L99A、AFT1 L102A、AFT1 C291F或AFT1C293F。在多个实施例中，所述影响铁-硫簇生物合成的多肽选自AFT1、AFT2、PSE1、FRA2、GRX3、MSN5或它们的组合。在多个实施例中，宿主细胞包括在编码铁调节蛋白的内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换。在多个实施例中，宿主细胞包括在编码多肽的内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换，所述多肽影响Fe-S簇生物合成。在多个实施例中，编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的多核苷酸包括在WIPO申请公布WO/2011/103300中公开的序列。
应当理解，包含丁醇生物合成途径，如本文提供的异丁醇生物合成途径的宿主细胞还可包含一个或多个附加的修饰。美国专利申请公布20090305363(以引用方式并入)公开了通过工程化酵母以表达定位于胞质的乙酰乳酸合酶和基本除去丙酮酸脱羧酶活性而提高丙酮酸至乙酰乳酸的转化。降低甘油-3-磷酸脱氢酶的活性的修饰，和/或干扰至少一个基因，其编码具有丙酮酸脱羧酶或的多肽，或干扰至少一个基因，其编码一个控制丙酮酸脱羧酶基因表达的调节元件，如美国专利申请公布20090305363所述(以引用方式并入本文)，对宿主细胞的修改通过Entner-Doudoroff途径提供增加的碳流量或降低等价平衡，如美国专利申请公布20100120105所述(以引用方式并入本文)。其它的修饰包括编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的至少一个缺失、突变、和/或替换。在多个实施例中，所述具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽为啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisae)的YMR226C(SEQ ID NO：226)或它们的同源物。附加的修饰包括编码具有醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的多肽的内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换。在多个实施例中，所述具有醛脱氢酶活性的多肽为来自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ALD6(SEQ ID NO：223)或它们的同源物。在其中该酵母生产的宿主细胞是pdc-的具有降低葡萄糖抑制的基因修饰，其描述参见美国专利申请公开20110124060，其以引用方式并入本文。此外，宿主细胞可包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源性多核苷酸和/或编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源性多核苷酸，如美国专利申请序列13/161,168所述，该申请提交于2011年6月15日，以引用方式并入本文。降低的丙酮酸脱羧酶活性
微生物细胞的内源丙酮酸脱羧酶活性将丙酮酸转化成乙醛，其随后经由乙酸被转化成乙醇或乙酰-CoA(参见图1)。微生物细胞可具有一个或多个编码丙酮酸脱羧酶的基因。例如，在酵母中存在一个在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)中编码丙酮酸脱羧酶的基因，而在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中存在由PDC1、PDC5和PDC6基因编码的三个丙酮酸脱羧酶的同功酶，以及一个丙酮酸脱羧酶调节基因PDC2。丙酮酸脱羧酶从PDC6开始的表达是最少的。在本发明的多个实施例中，宿主细胞可具有降低的丙酮酸脱羧酶活性，所述降低通过破坏至少一个编码丙酮酸脱羧酶的基因或一个调节丙酮酸脱羧酶基因表达的基因来完成。例如，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中，PDC1和PDC5基因，或所有三个基因被破坏。此外，丙酮酸脱羧酶活性可通过破坏酿酒酵母(S.cerevisiae)中的PDC2调节基因而被降低。在其它酵母中，编码丙酮酸脱羧酶蛋白的基因，例如具有与PDC1或PDC5至少约80-85％、85％-90％、90％-95％或至少约98％的序列同一性的那些基因可被破坏。
已经报道了具有由于丙酮酸脱羧酶编码基因的破坏导致丙酮酸脱羧酶活性降低的酵母菌株的例子，例如Flikweert等人对于糖酵母属(Saccharomyces)的报道(Yeast，12：247-257，1996)、Bianchi等人对于克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的报道(Mol.Microbiol.，19(1)：27-36，1996)，以及Hohmann对于调节基因破坏的报道(Mol GenGenet.，241：657-666，1993)。糖酵母(Saccharomyces)菌株无丙酮酸脱羧酶活性，它们可得自ATCC，具有登录号200027和200028。
丙酮酸脱羧酶基因的表达可在任何宿主细胞中减少，所述细胞也发生乙酰乳酸合酶表达和用于生产来源于乙酰乳酸的化合物的其它生物合成途径酶编码基因的工程化。可定向破坏的酵母丙酮酸脱羧酶基因的例子在表2中列出(SEQ ID NO：50、52、54、56、58、60、62、64和66)。其它靶基因如编码丙酮酸脱羧酶蛋白的那些与表2中列出的那些丙酮酸脱羧酶具有至少约80-85％、85％-90％、90％-95％或至少约98％或99％的序列同一性(SEQ IDNO：51、53、55、57、59、61、63、65和67)，它们可在技术人员熟知的文献中或生物信息学数据库中鉴定。此外，本文所述序列或本领域所述的那些序列可用于鉴定其它酵母菌株中的同源物，如上所述用于鉴定乙酰乳酸合酶编码基因。
作为另外一种选择，因为丙酮酸脱羧酶编码序列是为人们所熟知的，并且因为酵母基因组测序的广泛应用，适用的丙酮酸脱羧酶靶基因可基于序列相似度，使用生物信息学方法进行鉴定。对于下列的酵母菌株，基因组已被完整测序和被注释，并且可公开地获得：棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895、光滑假丝酵母(Candida glabrata)CBS138、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)NRRL Y-1140、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)CBS 6054、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288c、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)972h-和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)CLIB122。通常用已知的丙酮酸脱羧酶编码序列或丙酮酸脱羧酶氨基酸序列如本文提供的那些BLAST(如上所述)搜索公开可用的数据库以鉴定编码其它酵母序列的丙酮酸脱羧酶。
因此提供与本文公开的任何丙酮酸脱羧酶蛋白(SEQ ID NO：51、53、55、57、59、61、63、65和67)具有至少约70-75％、75％-80％、80-85％、85％-90％、90％-95％或至少约98％或99％的序列同一性的丙酮酸脱羧酶蛋白位于本发明的范围内。同一性基于Clustal W比对方法，所述方法采用GAP PENALTY＝10、GAP LENGTH PENALTY＝0.1、以及Gonnet 250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数。
在多个实施例中，本发明宿主细胞的丙酮酸脱羧酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、铁调节蛋白、和/或影响铁-硫(Fe-S)簇生物合成的多肽的表达可减少或消失。在其它实施例中，宿主细胞包括在编码多肽的内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换，所述多肽具有丙酮酸脱羧酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、铁调节蛋白质或影响Fe-S簇生物合成的多肽的活性。
可使用基因修饰破坏任何宿主细胞中编码丙酮酸脱羧酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、铁调节蛋白质或影响Fe-S簇生物合成的多肽的基因。用于靶基因遗传修饰的许多方法是本领域的技术人员已知的，并可被用于产生本发明的酵母菌株。可被用于降低或除去靶蛋白的表达的修饰是包括但不限于下列的破坏：整个基因或所述基因的部分的缺失；向基因中(在启动子或编码区)插入DNA片段，从而使蛋白质不被表达或以较低水平表达；向编码区中引入突变，突变的引入导致终止密码子的加入或移框，从而使功能性蛋白质不被表达；以及向编码区中引入一个或多个突变以改变氨基酸，从而表达无功能的或酶活性较低的蛋白质。此外，可通过表达反义RNA或干涉RNA从而阻止基因的表达，并且可导入导致共抑制的构建体。此外，可合成低表达水平的基因，因为稀有密码子取代了丰富密码子，并且这个基因取代了内源性基因。这种基因将产生相同的多肽，但是产率较低。此外，转录物的合成或其稳定性可通过突变被降低。类似地，从mRNA翻译为蛋白质的效率也可通过突变受到调控。全部这些方法均能够由本领域的技术人员使用已知的或鉴定的基因序列容易地实施。
围绕编码序列的DNA序列在一些修饰方法中也是有用的，并且对于酵母如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，在由NCBI(美国国家生物技术信息中心)协调的基因组计划的以基因组计划ID9518协调的、具有标识GOPID 13838的完整基因组序列中是可用的。酵母基因组序列的附加例子包括解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，GOPIC 13837，以及白假丝酵母(Candida albicans)，其存在于GPID 10771、10701和16373中。本领域的技术人员能够容易地在可公开获得的数据库中找到其它的酵母基因组序列。
具体而言，围绕基因编码序列的DNA序列，对利用同源重组的修饰方法是有用的。例如，在这样的方法中，基因旁侧序列被置于选择性标记基因的边界处，以介导同源重组，从而使所述标记基因置换靶基因。同样，部分的基因序列和位于选择性标记基因边界处的基因旁侧序列可被用于介导同源重组，从而使所述标记基因置换所述靶基因的一个部分。此外，所述选择性标记可以被位点特异性重组位点限定边界，如此在相应的位点特异性重组酶表达之后，抗性基因被从靶基因座处切除，而不会使后者再活化。位点特异性重组留下了中断所述蛋白表达的重组位点。也可以构建同源重组载体以在切除所述选择性标记后在靶基因中留下缺失，如本领域的技术人员所熟知的。
可使用有丝分裂重组形成缺失，如Wach等人所述(Yeast，10：1793-1808，1994)。该方法涉及制备包含介于基因组区域之间的选择性标记的DNA片段，其中所述基因组区域可短至20bp并且限定了靶DNA序列的边界。这种DNA片段可通过对所述选择性标记基因的PCR扩增制备，扩增用与所述标记基因末端杂交的寡核苷酸作为引物并且包括能与酵母基因组重组的基因组区域。线性DNA片段能够被有效地转入酵母并与基因组重组，导致基因置换，包括伴随着靶基因序列的缺失的置换(如“Methods in Enzymology，”第194卷，第281-301页，1991中所述)。
此外，可使用随机诱变破坏在本发明的任何宿主细胞中的丙酮酸脱羧酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、铁调节蛋白质或影响Fe-S簇生物合成的多肽的活性，随后进行筛选以鉴定具有降低的丙酮酸脱羧酶活性的菌株。使用这种类型的方法，不需要知道丙酮酸脱羧酶编码区的DNA序列或影响这些活性表达的任何其它基因组区域的DNA序列。
用于产生基因突变的方法是本领域中通用的和已知的，并可被用于制备突变体的应用中。常用的随机遗传修饰方法(综述于Methods in Yeast Genetics，2005，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)包括自发突变、增变基因导致的突变、化学诱变、UV或X-射线辐照或转座子诱变。
酵母的化学诱变通常涉及用下列DNA诱变剂之一处理细胞：甲磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸、硫酸二乙酯或N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基-胍(MNNG)。Spencer等人已综述了这些方法(Mutagenesis in Yeast，1996，Yeast Protocols：Methods in Cell and MolecularBiology.Humana Press，Totowa，NJ)。使用EMS的化学诱变可如Methods in YeastGenetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY中所述进行。用紫外(UV)光或X-射线辐照也可被用于在酵母细胞中产生随机突变生成。通过UV辐照的诱变的主要效应是会破坏DNA复制保真性的嘧啶二聚体的形成。UV-诱变酵母的规程可见于Spencer等人(Mutagenesis in Yeast，1996，Yeast Protocols：Methods in Cell andMolecular Biology.Humana Press，Totowa，NJ)。增变表型的引入也可被用于在酵母中产生随机的染色体突变。常用的增变表型可通过对下列基因中的一个或多个的破坏而获得：PMS1、MAG1、RAD18或RAD51。非增变表型的恢复可通过插入野生型等位基因容易地实现。可筛选通过这些或其它已知的随机诱变方法中的任何一种产生的改变细胞的集合以获得活性降低的丙酮酸脱羧酶、甘油-3-磷酸脱羧酶、铁调节蛋白或影响Fe-S簇生物合成的多肽。
宿主细胞
本发明的宿主细胞可为适于基因操纵的任何细胞。在多个实施例中，宿主细胞可为细菌、蓝细菌、丝状真菌或酵母。在多个实施例中，宿主细胞是下列属的成员：梭菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱杆菌属、克雷伯氏菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属或糖酵母属。在其它实施例中，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)或屎肠球菌(Enterococcusfaecalis)。
酵母的例子包括但不限于糖酵母属、裂殖糖酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属和毕赤酵母属。酵母菌株的例子包括但不限于啤酒糖酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、白假丝酵母(Candida albicans)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。在一些实施例中，宿主细胞是啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)。啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母为本领域所已知并可购自多种来源，包括但不限于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)、Centraalbureau voorSchimmelcultures(CBS)真菌生物多样性中心、LeSaffre、Gert Strand AB、FermSolutions、North American Bioproducts、Martrex和Lallemand。啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)包括但不限于BY4741、CEN.PK 113-7D、Ethanol酵母、Ferm ProTM酵母、XR酵母、Gert Strand Prestige Batch Turbo alcohol酵母、Gert Strand Pot Distillers酵母、Gert Strand Distillers Turbo酵母、FerMaxTM Green酵母、FerMaxTM Gold酵母、酵母、BG-1、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960和CBS7961。
在多个实施例中，本发明的宿主细胞是兼性厌氧菌。在多个实施例中，用作生产宿主的细胞优选地具有对产生的化学制品的增强耐受性，和/或可具有碳水化合物的高利用率。这些特征可通过诱变和选择、基因工程化赋予或可为天然存在的。
发酵培养基
本发明的宿主细胞可在发酵培养基中生长，所述发酵培养基可包含合适的碳底物。合适的底物可包括但不限于：单糖，例如葡萄糖和果糖；低聚糖，例如乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉、纤维素或它们的混合物；以及来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖蜜及大麦麦芽。另外，碳底物也可以是已被证明可以被代谢转化为关键生化中间产物的诸如二氧化碳的一碳底物或甲醇。除了一碳和二碳底物之外，甲基营养生物体可利用多种其它含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺及用于代谢活动的多种氨基酸。例如，甲基营养酵母已知可利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.Growth C1 Compd.，[Int.Symp.]，7th(1993)，415-32，编辑：Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.Publisher：Intercept，Andover，UK)。类似地，假丝酵母属的多种物种可代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153：485-489(1990))。因此，预期本发明中所利用的碳源能够涵盖各种含碳底物。
除了碳源外，发酵培养基还可含有本领域的技术人员已知的适合培养物生长和促进所期望的产物的生产所必需的酶途径的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂及其它组分。
培养条件
通常本发明的宿主细胞在合适的培养基中，在约20℃至约37℃的温度范围内生长。本发明中适当的生长培养基是普通的商品化制备的培养基，例如包含了酵母氮源、硫酸铵和作为碳/能源的右旋糖的肉汤，或者YPD培养基，蛋白胨、酵母提取物和右旋糖以大多数啤酒糖酵母菌株生长的最适比例的一种混合物。其它确定的或合成的生长培养基也能够被使用，微生物学或发酵科学领域的技术人员将知道用于具体微生物生长的合适培养基。
发酵的适宜pH范围可为介于pH 3.0至pH 7.5之间。PH 4.5.0至pH 6.5的pH范围可用于初始条件。
发酵可在有氧或厌氧条件下进行，其中厌氧或微氧条件是优选的。
发酵培养基中生产的丁醇的量可使用本领域已知的多种方法进行测定，例如高效液相色谱(HPLC)或气相色谱(GC)。
工业分批发酵和连续发酵
本发明的方法可使用分批发酵方法。经典的分批发酵是封闭系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不进行人工改变。因此在发酵开始时，用所需生物体对培养基进行接种，在不向系统添加任何物质的情况下进行发酵。然而，通常来说，“分批”发酵是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批发酵系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至发酵结束。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，对数期中的细胞负责产生大部分终产物或中间产物。
标准分批式系统的一种变型是补料分批系统。补料分批发酵工艺也适用于本发明，并且包括典型的分批式系统，不同的是随着发酵进程递增地添加底物。在分解代谢阻遏往往抑制细胞的代谢作用以及在期望培养基中具有有限量的底物的情况下，补料分批式系统是有用的。补料分批式系统中的实际底物浓度难于测量并因而可根据一些可测量因素例如pH、溶解氧以及废气如CO2的分压进行评估。分批发酵和补料-分批发酵在本领域内是常用的且众所周知，并且例子可见于如下文献：Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbookof Industrial Microbiology，第二版，(1989)，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.，或者Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227，(1992)，该文献以引用方式并入本文。
此外，本发明的方法可适用于连续发酵方法。连续发酵是一种开放式系统，其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续发酵一般使培养物维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高密度。
连续发酵允许调节一种因素或任意数目的因素，这些因素影响细胞生长或终产物浓度。例如，一种方法将维持限制性营养物质例如碳源或氮水平处于固定速率并允许所有其它参数适度。在其它系统中，影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统力求维持稳态的生长条件，并因而在发酵过程中由于培养基被取出而导致的细胞损失必须与细胞的生长率保持平衡。用于调节连续发酵工艺中的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成速率保持最高水平的方法是工业微生物学领域众所周知的，并且多种方法已由Brock(同上)详细描述。
预期可采用分批发酵、补料分批发酵或采用连续发酵工艺来实施本发明，并且任何已知的发酵模式均将适用。另外，预期可以将细胞固定在底物上而作为完整的细胞催化剂并让其经受发酵条件以生产丁醇。
用于从发酵培养基中分离产物的方法
本发明的生物合成途径产物(例如丁醇)可使用本领域已知的方法从发酵培养基中分离得到。例如，能够通过提取、离心、过滤、滗析等方法从发酵培养基中去除固体。然后，可使用诸如蒸馏、液-液提取或基于膜的分离从发酵培养基分离产物(例如丁醇)，所述培养基已如上所述经处理而移除了固体。因为丁醇与水形成低沸点的共沸混合物，蒸馏仅能被用于分离混合物直至其共沸组成。蒸馏能够与其它分离方法组合使用以分离共沸物。能够与蒸馏组合使用以分离并纯化丁醇的方法包括但不限于滗析、液-液提取、吸附和基于膜的技术。此外，可使用共沸蒸馏用夹带剂(参见例如Doherty和Malone，Conceptual Design ofDistillation Systems，McGraw Hill，New York，2001)分离丁醇。
丁醇-水混合物形成非均相共沸物，从而能够组合使用蒸馏和滗析以分离并纯化丁醇。在这种方法中，包含丁醇的发酵液被蒸馏至接近共沸组成。然后，冷凝共沸混合物，通过滗析从发酵培养基分离丁醇。滗析后的含水相能够作为回流返回第一蒸馏塔。富含丁醇的滗析有机相可通过在第二蒸馏塔中蒸馏进一步被纯化。
产物如丁醇也可采用液-液提取与蒸馏的结合从发酵培养基中分离。在这种方法中，使用液-液提取用合适溶剂从发酵液中提取丁醇。然后蒸馏包含丁醇的有机相以从溶剂中分离丁醇。
蒸馏与吸附的组合也可用于从发酵培养基中分离丁醇。在这种方法中，蒸馏包含丁醇的发酵液使其接近共沸组成，然后使用吸附剂移除剩余的水，例如分子筛(Aden等人，Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover，Report NREL/TP-510-32438，National Renewable Energy Laboratory，2002年6月)。
此外，蒸馏组合全蒸发能够被用于从发酵培养基分离和纯化产物(例如丁醇)。在这种方法中，蒸馏包含丁醇的发酵液使其接近共沸组合物，然后用全蒸发通过亲水性膜移除剩余的水(Guo等人，J.Membr.Sci.245：199-210，2004)。
使用提取发酵从发酵液体培养基中生产和回收产物如丁醇的方法详述于提交于2009年6月4日的美国专利申请12/478,389，以及对应公布的美国专利申请公布20090305370、提交于2009年8月6日的美国临时申请61/231,699、提交于2010年7月28日的美国临时申请61/368,429、和美国专利申请公布20100221802与20110097773。此类方法包括那些包括使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提取剂以形成包含水相和含丁醇有机相的两相混合物的步骤，所述有机提取剂选自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪酰胺、C12-C22脂肪醛、以及它们的混合物。“接触”指发酵培养基和有机提取剂在发酵过程期间的任何时间上发生物理接触。
合适提取剂的例子包括但不限于包含至少一种溶剂的提取剂，所述溶剂选自油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、十四烷基醇、硬脂醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、月桂醛、1-壬醇、1-癸醇、1-十一烷醇、2-十一烷醇、1-壬醛、以及它们的混合物。在一个实施例中，所述提取剂包括油醇。这些有机提取剂有多种商品化来源，例如Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，其商品有多种等级，其中许多可适用于生产或回收丁醇的提取发酵。工业级商品包含化合物的混合物，包括所期望的组分以及高级和低级脂肪组分。例如，一种可商购获得的工业级油醇包含约65％的油醇和一种高级和低级脂肪醇的混合物。
在多个实施例中，本发明涉及生产丁醇的方法，所述方法包括(a)提供本发明的重组宿主细胞；以及(b)在产生丁醇的条件下，使所述重组宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。在其它实施例中，所述方法还包括使发酵液体培养基与提取剂接触以产生两相发酵混合物。在其它实施例中，所述提取剂包括脂肪酸。在其它实施例中，所述脂肪酸来源于玉米油或大豆油。在其它实施例中，所述提取剂包括与水不混溶的有机提取剂，所述有机提取剂选自：C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺。在其它实施例中，所述方法还包括使所述发酵液体培养基与有机酸和酶接触，所述酶能够用所述有机酸酯化丁醇。在其它实施例中，所述方法还包括蒸发所述发酵液体培养基的至少一部分以形成包含水和丁醇的蒸气流。
测量丁醇滴度和产量的方法是已知的。例如，丁醇滴度和产量可使用如实例所述的气相色谱法(GC)或高效液相色谱法(HPLC)进行测量。在多个实施例中，与由编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的宿主细胞产生的丁醇量相比，由本发明的宿主细胞产生的丁醇量提高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。在多个实施例中，与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，本发明的宿主细胞的丁醇生产滴度提高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。
在多个实施例中，本发明涉及提高非整合重组多核苷酸的拷贝数或表达的方法，所述重组多核苷酸编码催化本文所述的生物合成途径步骤的多肽，所述方法包括在产生生物合成途径产物的条件(例如本文所述的发酵条件)下，使本发明的宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。在其它实施例中，本发明涉及提高利用丙酮酸的生物合成途径的流量的方法，所述方法包括在提高宿主细胞中利用丙酮酸的生物合成途径的流量的条件(例如本文所述的发酵条件)下，使本发明的宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。
在其它实施例中，本发明涉及提高利用丙酮酸的生物合成途径产物的形成的方法，所述方法包括(i)提供本发明的重组宿主细胞；以及(ii)使宿主细胞在形成利用丙酮酸的途径产物的条件下生长，其中由所述重组宿主细胞形成的产物量大于由不包含整合到染色体中的编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸的宿主细胞形成的产物量。在其它实施例中，利用丙酮酸的生物合成途径形成2，3-丁二醇、异丁醇、2-丁醇或2-丁酮。在其它实施例中，利用丙酮酸的生物合成途径是丁醇生物合成途径。在其它实施例中，丁醇的生物合成途径是(a)2-丁醇生物合成途径；或(b)异丁醇生物合成途径。
在其它实施例中，本发明涉及组合物，其包含(i)本发明的宿主细胞；(ii)丁醇；和(iii)提取剂。在其它实施例中，本发明涉及组合物，其包含(i)本发明的宿主细胞；(ii)丁醇；(iii)提取剂；和(iv)酯化酶。酯化酶是催化酸和醇之间的反应以产生酯的酶。在广义上酯化酶是做用于酯键的水解酶并常称为酯酶。如本文所用，脂肪酶是酯酶的亚型，其显示对发酵液中存在的脂肪酸和异丁醇之间形成酯有效。此类脂肪酶可包括一种或多种酯酶，例如水解酶如脂肪酶。使用的脂肪酶可来自任何来源，包括例如梨头霉属、无色杆菌属、气单胞菌属、产碱菌属、链格孢属、曲霉属、无色杆菌属、出芽短梗霉、芽孢杆菌属、白僵菌属、环丝菌属、假丝酵母属、色杆菌属、鬼伞属、镰孢属、地霉属、汉逊酵母属、腐质霉属、Hyphozyma、乳杆菌、绿僵菌属、毛霉、丛赤壳属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、假单胞菌属、丝核菌属、根毛霉属、根霉、红冬孢酵母属、红酵母属、糖酵母属、Sus、掷孢酵母属、嗜热真菌属、Thiarosporella、木霉属、轮枝孢属、和/或耶氏酵母属菌株。在一个优选的方面，脂肪酶的来源选自布氏犁头霉(Absidia blakesleena)、伞状犁头霉(Absidia corymbifera)、解毒无色杆菌(Achromobacter iophagus)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、芸苔生链格孢(Alternaria brassiciola)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus strgarothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Brochothrix thermosohata、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)(皱褶假丝酵母(Candida rugosa))、副解脂假丝酵母(Candida paralipolytica)、南极假丝酵母(CandidaAntarctica)脂肪酶A、南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶B、欧诺比假丝酵母(Candida ernobii)、畸形假丝酵母(Candida deformans)、粘稠色杆菌(Chromobacterviscosum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinerius)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰孢(Fusarium solani)、茄病镰孢(Fusarium solani pisi)、小麦黄色镰孢(Fusarium roseumculmorunm)、帚状地霉(Geotricum penicillatum)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、短小腐质霉(Humicola brevispora)、短小腐质霉高温变种(Humicola brevisvar.thermoidea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、圆弧青霉(Penicillium cyclopium)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、扩展青霉(Penicillium expansum)、青霉属I(Penicilliumsp.I)、青霉属II(Penicillium sp.II)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、洋葱假单胞菌(与洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)同义)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、解脂臭味假单胞菌(Pseudomonas mephitica lipolytica)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、苗床假单胞菌(Pseudomonas plantari)、类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假单孢菌(Pseudomonas stutzeri)、和威斯康星假单胞菌(Pseudomonaswisconsinensis)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、结节根霉(Rhizopusnodosus)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、红酵母(Rhodotorulaglutinis)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Saccharomyces cerevisiae)、芝谷掷孢酵母(Sporobolomyces shibatanus)、野猪(Sus scrofa)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus(以前称为Humicola lanuginose))、Thiarosporellaphaseolina、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。在另一个优选的方面，脂肪酶选自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomcyces lanuginosus)脂肪酶、曲霉属(Aspergillus sp.)脂肪酶、黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶、南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶B、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)脂肪酶、(Penicillium roqueforti)脂肪酶、沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶、爪哇毛霉(Mucor javanicus)脂肪酶、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶、产碱菌属(Alcaligenes sp.)脂肪酶、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)脂肪酶、畸形假丝酵母(Candida deformans)脂肪酶、来自白地霉(Geotrichum candidum)的脂肪酶A和B、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)脂肪酶、赤球丛赤壳(Nectria haematococca)脂肪酶、异孢镰孢菌(Fusarium heterosporum)脂肪酶、德氏根霉(Rhizopus delemar)脂肪酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、(Rhizopus arrhizus)脂肪酶和米根霉(Rhizopusoryzae)脂肪酶。适用作酶催化剂42的合适商用脂肪酸制剂包括但不限于100L、100L、2000T、CALB L、CALA L和Palatase20000L，它们购自Novozymes，或来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、米赫毛霉(Mucor miehei)、猪胰(hog pancreas)、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、南极假丝酵母(Candidaantarctica)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)或曲霉属(Aspergillus)，它们购自SigmaAldrich。
在多个实施例中，所述提取剂包括脂肪酸。在多个实施例中，所述脂肪酸来源于玉米油或大豆油。在其它实施例中，所述提取剂是与水不混溶的有机提取剂。在其它实施例中，所述提取剂是C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯或C12-C22脂肪醛。
实施例
本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，这些实例尽管说明了本发明的优选实施例，但仅是以例证的方式给出的。从上文的讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本发明的特性，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用途和条件。
一般方法
实例中所用的标准重组DNA技术和分子克隆技术在领域内是众所周知的，并且在下列文献中有所描述：Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual；ColdSpring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)，Silhavy等人，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1984)，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版(1987)，以及Methods in YeastGenetics，2005，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY。
适于细菌培养物维持和生长的材料和方法是本领域所熟知的。下列实例中适用的技术描述可在下列文献中查到：Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt等人编辑，American Society for Microbiology，Washington，DC.，1994)或Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)。使用的用于微生物细胞生长和维持的所有试剂、限制性内切酶和材料得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、BDDiagnostic Systems(Sparks，MD)、Life Technologies(Rockville，MD)、New EnglandBiolabs(Ipswich，MA)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。除非另外指明，微生物菌株获取自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA。所有的寡核苷酸引物由Sigma-Genosys(Woodlands，TX)或Integrated DNA Technologies(Coralsville，IA)合成。完全合成培养基描述于Amberg，Burke和Strathern，2005，Methods in Yeast Genetics，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY中。
GC
所述GC方法利用来自Agilent Technologies(Santa Clara，CA)的一种HP-InnoWax柱(30m×0.32mm ID，0.25μm膜)。载气为氦气，流速为1mL/分钟，在150℃用恒定顶压测量；注射分流比在200℃为1∶10；炉温为45℃1分钟，以10℃/分钟从45℃升温至230℃，并在230℃持续30秒。FID检测在260℃、40mL/分钟的氦气补气条件下使用。在注射前先通过0.2μM旋转过滤器对培养物肉汤样品进行过滤。根据所期望的分析灵敏度，使用了0.1μl或0.5μl的注射体积。生成下列化合物的校准过的标准曲线：乙醇、异丁醇、乙偶姻、内消旋-2，3-丁二醇、以及(2S，3S)-2，3-丁二醇。还利用了分析标准品来鉴定异丁醛、异丁酸和异戊醇的保留时间。
HPLC
对发酵副产物组成的分析是本领域的技术人员所熟知的。例如，一种使用ShodexSH-1011柱和Shodex SH-G保护柱(二者均可购自Waters Corporation，Milford，MA)并联合折射率(RI)检测的高效液相色谱(HPLC)方法。用0.01M H2SO4作为流动相，以0.5mL/分钟流量和50℃的柱温实现色谱分离。异丁醇保留时间为47.6分钟。
测定在培养基中的异丁醇浓度的方法
在培养基中的异丁醇浓度可通过本领域已知的多种方法进行测定。例如，一种特异性的使用Shodex SH-1011柱和Shodex SH-G保护柱(二者均可购自Waters Corporation，Milford，MA)并联合折射率(RI)检测的高效液相色谱(HPLC)方法。用0.01M H2SO4作为流动相，以0.5mL/分钟流量和50℃的柱温实现色谱分离。在使用条件下异丁醇的保留时间为46.6分钟。作为另外一种选择，气相色谱法(GC)是可用的。例如，特异性的GC方法利用HP-INNOWax柱(30m×0.53mm id，1μm膜厚度，Agilent Technologies，Wilmington，DE)，配有火焰离子化检测器(FID)。载气为氦气，流速为4.5mL/分钟，在150℃用恒定顶压测量；注射分流比在200℃为1∶25；炉温为45℃1分钟，以10℃/分钟从45℃升温至220℃，并在220℃保持5分钟；并且FID检测在240℃、26mL/分钟的氦气补气条件下使用。异丁醇的保留时间为4.5分钟。
缩写的含义如下：“s”是指秒，“min”是指分钟，“h”是指小时，“psi”是指磅每平方英寸，“nm”是指纳米，“d”是指天，“μL”是指微升，“mL”是指毫升，“L”是指升，“mm”是指毫米，“nm”是指纳米，“mM”是指毫摩尔每升，“M”是指摩尔每升，“mmol”是指毫摩尔，“μmol”是指微摩尔，“g”是指克，“μg”是指微克并且“ng”是指纳克，“PCR”是指聚合酶链反应，“OD”是指光密度，“OD600”是指在600nm波长测量的光密度，“kDa”是指千道尔顿，“g”是指引力常数，“bp”是指碱基对，“kbp”是指千碱基对，“％w/v”是指重量/体积百分比，“％v/v”是指体积/体积百分比，“wt％”是指重量百分比，“HPLC”是指高效液相色谱，并且“GC”是指气相色谱。术语“摩尔选择率”是指每摩尔被消耗的糖类底物产生的产物的摩尔数，以百分比形式给出。
实例1
构建啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株BP1083(“NGCI-070”； PNY1504)
所述菌株BP1064来源于CEN.PK 113-7D(CBS 8340；Centraalbureau voorSchimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre，Netherlands)并包含下列基因的缺失：URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6和GPD2。用质粒pYZ090(SEQ ID NO：134)和pLH468(SEQID NO：135)转化BP1064以形成菌株NGCI-070(BP1083；PNY1504)。
缺失，即完全去除整个编码序列，通过与PCR片段同源重组而创建，所述PCR片段包含靶基因的上游和下游同源区以及用于选择转化子的G418抗性标记或URA3基因。其侧翼为的G418抗性标记，用Cre重组酶去除。通过同源重组去除所述URA3基因以创建无痕缺失，或如果侧翼为loxP位点则用Cre重组酶去除。
所述无痕去除方法是修改自Akada等人，Yeast 23：399，2006。一般来讲，每个无痕缺失的PCR盒是通过重叠PCR组合四个片段A-B-U-C得到的。所述PCR盒包含可选的/反可选的标记，URA3(片段U)，其包含原生CEN.PK 113-7D URA3基因，连同启动子(URA3基因上游250bp)和终止子(URA3基因下游150bp)。片段A和C每个长500bp，它们对应于紧接靶基因(片段A)上游的500bp和靶基因3′的500bp(片段C)。片段A和C用于通过同源重组将盒整合到染色体中。片段B(500bp长)对应于紧接靶基因下游的500bp并用于通过同源重组，从染色体上切除URA3标记和片段C，在盒整合到染色体时生成作为对应片段B的直接重复序列使用PCR产物ABUC盒，首先将URA3标记整合到基因组，然后通过同源重组从基因组中切除。初始整合删除了除3′的500bp之外的基因。在切除时，也删除了所述基因3′的500bp区域。对于使用这个方法的基因整合，将要整合的基因包含在PCR盒的片段A和B之间。
URA3缺失
为删除内源URA3编码区，ura3：：loxP-kanMX-loxP以盒PCR扩增自pLA54模板DNA(SEQ ID NO：136)。pLA54包含乳酸克鲁维酵母TEF1启动子和kanMX标记，并且侧翼序列为loxP位点，允许Cre重组酶参与重组并去除标记。PCR使用Phusion DNA聚合酶和引物BK505与BK506(SEQ ID NO：137和138)。所述每个引物的URA3部分来源于URA3启动子上游5′区，和编码区下游3′区，使得loxP-kanMX-loxP标记的整合导致URA3编码区的替换。使用标准基因技术将所述PCR产物转化到CEN.PK 113-7D中(Methods in Yeast Genetics，2005，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第201-202页)并且转化子在30℃包含G418(100μg/ml)的YPD上选择。筛选的转化子的正确整合通过PCR来验证，使用引物LA468和LA492(SEQ ID NO：139和140)，并命名为CEN.PK 113-7DΔura3：：kanMX。
HIS3缺失
用于无痕HIS3缺失的PCR盒的四个片段的扩增使用Phusion High Fidelity PCRMaster Mix(New England BioLabs；IpsWich，MA)和CEN.PK113-7D基因组DNA作为模板，用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen Valencia，CA)制备。HIS3片段A采用引物oBP452(SEQ ID NO：141)和引物oBP453(SEQ ID NO：142)进行扩增，其包含与HIS3片段B的5′端同源的5′尾。HIS3片段B使用下列引物进行扩增：引物oBP454(SEQ ID NO：143)，其包含与HIS3片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP455(SEQ ID NO：144)，其包含与HIS3片段U的5′端同源的5′尾。HIS3片段U使用下列引物进行扩增：引物oBP456(SEQ ID NO：145)，其包含与HIS3片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP457(SEQ ID NO：146)，其包含与HIS3片段C的5′端同源的5′尾。HIS3片段C使用下列引物进行扩增：引物oBP458(SEQ ID NO：147)，其包含与HIS3片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP459(SEQ ID NO：148)。PCR产物用PCRPurification kit(Qiagen)纯化。HIS3片段AB通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物oBP452(SEQ ID NO：141)和oBP455(SEQ ID NO：144)进行扩增。HIS3片段UC通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456(SEQ ID NO：145)和oBP459(SEQ ID NO：148)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过GelExtraction kit(Qiagen)纯化。HIS3 ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452(SEQ ID NO：141)和oBP459(SEQ ID NO：148)进行扩增。用PCRPurification kit(Qiagen)纯化PCR产物。
制备CEN.PK 113-7DΔura3：：kanMX的感受态细胞，并用HIS3 ABUC PCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II kit(Zymo Research；Orange，CA)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以2％的乙醇的合成完全培养基上。具有his3敲除的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP460(SEQ ID NO：149)和oBP461(SEQ ID NO：150)，所用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。正确的转化子选择为菌株CEN.PK113-7DΔura3：：kanMXΔhis3：：URA3。
从Δura3位点移除KanMX标记以及从Δhis3位点移除URA3标记
所述KanMX标记通过用pRS423：：PGAL1-cre(SEQ ID NO：66，如美国临时申请61/290,639中所述)转化CEN.PK 113-7D Δura3：：kanMXΔhis3：：URA3而去除，使用Frozen-EZYeast Transformation II kit(Zymo Research)并在30℃接种到缺乏组氨酸和尿嘧啶辅以2％的葡萄糖的合成完全培养基上。转化子在30℃的辅以1％的半乳糖的YP上生长6个小时以诱导Cre重组酶和KanMX标记切除，并在30℃接种到YPD(2％葡萄糖)平板上以复苏。分离物过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。抗5-氟-乳清酸的分离物生长和接种到YPD中以去除pRS423：：PGAL1-cre质粒。检测分离物中KanMX标记和URA3标记的丢失，并通过在YPD+G418平板、缺乏尿嘧啶的合成完全培养基平板、和缺乏组氨酸的合成完全培养基平板的生长检测，检测pRS423：：PGAL1-cre质粒的丢失。对G418敏感并为尿嘧啶和组氨酸营养缺陷性的正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3并命名为BP857。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，所用引物为oBP450(SEQ ID NO：151)和oBP451(SEQ IDNO：152)，用于Δura3，以及引物oBP460(SEQ ID NO：149)和oBP461(SEQ ID NO：150)，用于Δhis3，使用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。
PDC6缺失
用于无痕PDC6缺失的PCR盒的四个片段的扩增使用Phusion High Fidelity PCRMaster Mix(New England BioLabs)并以CEN.PK 113-7D基因组DNA为模板，用GentraPuregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。PDC6片段A的扩增所用引物为oBP440(SEQ IDNO：153)和引物oBP441(SEQ ID NO：154)，其包含与PDC6片段B的5′端同源的5′尾。PDC6片段B扩增所用引物为oBP442(SEQ ID NO：155)，其包含与PDC6片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP443(SEQ ID NO：156)，其包含与PDC6片段U的5′端同源的5′尾。PDC6片段U扩增所用引物为oBP444(SEQ ID NO：157)，其包含与PDC6片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP445(SEQ IDNO：158)，其包含与PDC6片段C的5′端同源的5′尾。PDC6片段C扩增所用引物为oBP446(SEQID NO：159)，其包含与PDC6片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP447(SEQ ID NO：160)。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen)纯化。PDC6片段AB通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段A和PDC6片段B并用引物oBP440(SEQ ID NO：153)和oBP443(SEQ ID NO：156)进行扩增。PDC6片段UC通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段U和PDC6片段C并用引物oBP444(SEQ IDNO：157)和oBP447(SEQ ID NO：160)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction kit(Qiagen)纯化。所述PDC6ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合PDC6片段AB和PDC6片段UC并用引物oBP440(SEQ ID NO：153)和oBP447(SEQ ID NO：160)进行扩增。用PCR Purification kit(Qiagen)纯化PCR产物。
制备CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3的感受态细胞，并用PDC6ABUCPCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II kit(Zymo Research)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以2％的乙醇的合成完全培养基上。具有pdc6敲除的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP448(SEQ ID NO：161)和oBP449(SEQ ID NO：162)，所用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6：：URA3。
CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6：：URA3分离物过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。所述缺失和标记移除通过PCR和测序确认，所用引物为oBP448(SEQ ID NO：161)和oBP449(SEQ ID NO：162)，所用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。来自分离物的PDC6基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，所用PDC6的编码区的特异性引物为oBP554(SEQ ID NO：163)和oBP555(SEQ ID NO：164)。正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6并被命名为BP891。
PDC1缺失ilvDSm整合
所述PDC1基因被删除并被ilvD替换，其编码区来自变异链球菌(Streptococcusmutans)ATCC 700610。所述A片段接着ilvD编码区，其来自变异链球菌(Streptococcusmutans)，对于用于PDC1缺失-ilvDSm整合的PCR盒使用Phusion High Fidelity PCRMaster Mix(New England BioLabs)进行扩增并用NYLA83(描述于美国临时申请公开61/246,709)基因组DNA作为模板，用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。PDC1片段A-ilvDSm(SEQ ID NO：165)用引物oBP513(SEQ ID NO：166)和引物oBP515(SEQ ID NO：167)扩增，后者包含与PDC1片段B的5′端同源的5′尾。用于PDC1缺失-ilvDSm整合的PCR盒的B、U和C片段用Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs)和作为模板的CEN.PK113-7D基因组DNA进行扩增，用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。PDC1片段B扩增所用引物为oBP516(SEQ ID NO：168)，其包含与PDC1片段A-ilvDSm的3′端同源的5′尾，和引物oBP517(SEQ ID NO：169)，其包含与PDC1片段U的5′端同源的5′尾。PDC1片段U扩增所用引物为oBP518(SEQ ID NO：170)，其包含与PDC1片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP519(SEQ ID NO：171)，其包含与PDC1片段C的5′端同源的5′尾。PDC1片段C扩增所用引物为oBP520(SEQ ID NO：172)，其包含与PDC1片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP521(SEQ ID NO：173)。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen)纯化。PDC1片段A-ilvDSm-B通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm和PDC1片段B并用引物oBP513(SEQID NO：166)和oBP517(SEQ ID NO：169)进行扩增。PDC1片段UC通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段U和PDC1片段C并用引物oBP518(SEQ ID NO：170)和oBP521(SEQ ID NO：173)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction kit(Qiagen)纯化。所述PDC1A-ilvDSm-BUC盒(SEQ ID NO：174)通过重叠PCR生成，通过混合PDC1片段A-ilvDSm-B和PDC1片段UC并使用引物oBP513(SEQ ID NO：166)和oBP521(SEQ ID NO：173)进行扩增。用PCR Purifieation kit(Qiagen)纯化PCR产物。
制备CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6的感受态细胞，并用PDC1A-ilvDSm-BUCPCR盒转化，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II kit(Zymo Research)。转化混合物涂布在30℃的含2％的葡萄糖、不含尿嘧啶补充剂的合成完全培养基上。具有PDC1敲除-ilvDSm整合的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP511(SEQ ID NO：175)和oBP512(SEQ ID NO：176)，所用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。来自分离物的PDC1基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，所用PDC1的编码区的特异性引物为oBP550(SEQ ID NO：177)和oBP551(SEQ ID NO：178)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSm-URA3。
CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSm-URA3过夜生长在YPD中并在30℃接种到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。所述PDC1的缺失、ilvDSm的整合以及标记的移除通过PCR和测序来确认，所用引物为oBP511(SEQ ID NO：175)和oBP512(SEQ ID NO：176)，所用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSm并命名为BP907。
PDC5缺失sadB整合
所述PDC5gene被删除并被sadB编码区替换，所述编码区来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)。对于PDC5缺失-sadB整合的PCR盒的片段首先克隆到质粒pUC19-URA3MCS中。
pUC19-URA3MCS是基于pUC19的并包含处于多克隆位点(MCS)内的URA3基因，其来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。pUC19包含pMB1复制子和编码β-内酰胺酶的基因，该基因负责在大肠杆菌中的复制与选择。除URA3的编码序列外，该基因的上游至下游序列都被包括用于在酵母中表达URA3。所述载体能用于克隆的目的，并且能用做酵母整合载体。
所述DNA涵盖了URA3编码区，连同URA3编码区上游250bp和下游150bp，所述序列来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，CEN.PK 113-7D基因组DNA的扩增所用引物为oBP438(SEQ ID NO：179)，其包含BamHI、AscI、PmeI和FseI限制性位点，和oBP439(SEQ IDNO：180)，其包含XbaI、PacI和NotI限制性位点，使用Phusion High-Fidelity PCR MasterMix(New England BioLabs)。基因组DNA使用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)来制备。在使用BamHI和XbaI消化后，所述PCR产物和pUC19(SEQ ID NO：181)用T4DNA连接酶连接生成载体pUC19-URA3MCS。所述载体通过PCR和测序来确认，所用引物为oBP264(SEQ IDNO：182)和oBP265(SEQ ID NO：183)。
所述sadB编码序列和PDC5片段B克隆到pUC19-URA3MCS生成PDC5A-sadB-BUC PCR盒的sadB-BU部分。所述sadB编码序列扩增以pLH468-sadB(SEQ ID NO：184)作为模板，所用引物为oBP530(SEQ ID NO：185)，其包含AscI限制性位点，和引物oBP531(SEQ ID NO：186)，其包含与PDC5片段B的5′端同源的5′尾。PDC5片段B扩增所用引物为oBP532(SEQ ID NO：187)，其包含与sadB的3′端同源的5′尾，和引物oBP533(SEQ ID NO：188)，其包含PmeI限制性位点。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen)进行纯化。sadB-PDC5片段B通过重叠PCR生成，通过混合sadB片段U和PDC5片段B并用引物oBP530(SEQ ID NO：185)和oBP533(SEQID NO：188)进行扩增。在用合适的酶消化后，所得PCR产物经AscI和PmeI消化用T4DNA连接酶连接到pUC19-URA3MCS对应的位点上。所得质粒用作模板以扩增sadB-片段B-片段U，所用引物为oBP536(SEQ ID NO：189)和oBP546(SEQ ID NO：190)，其包含与PDC5片段C的5′端同源的5′尾。PDC5片段C扩增所用引物为oBP547(SEQ ID NO：191)，其包含与PDC5sadB-片段B-片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP539(SEQ ID NO：192)。PCR产物用PCR Purificationkit(Qiagen)纯化。PDC5sadB-片段B-片段U-片段C通过重叠PCR生成，通过混合PDC5sadB-片段B-片段U和PDC5片段C并用引物oBP536(SEQ ID NO：189)和oBP539(SEQ ID NO：192)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上纯化接着使用Gel Extraction kit(Qiagen)。所述PDC5A-sadB-BUC盒(SEQ ID NO：193)通过扩增PDC5sadB-片段B-片段U-片段C而生成，所用引物为oBP542(SEQ ID NO：194)，其包含与原生PDC5编码序列上游50个核苷酸同源的5′尾和oBP539(SEQ ID NO：192)。用PCR Purification kit(Qiagen)纯化PCR产物。
制备CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSm的感受态细胞，并用PDC5A-sadB-BUC PCR盒转化，所述转化使用Frozen-EZ Yeast Transformation IIkit(Zymo Research)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以1％的乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上。具有pdc5敲除-sadB整合的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP540(SEQ ID NO：195)和oBP541(SEQ ID NO：196)，所用的基因组DNA用Gentra PuregeneYeast/Bact kit(Qiagen)制备。来自分离物的PDC5基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，所用PDC5的编码区的特异性引物为oBP552(SEQ ID NO：197)和oBP553(SEQ ID NO：198)。正确的转化子被选为菌株CEN.PK113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSmΔpdc5：：sadB-URA3。
CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSmΔpdc5：：sadB-URA3过夜生长在YPD(0.1％乙醇)中并在30℃接种到合成完全培养基上，辅以乙醇(无葡萄糖)并包含包含5-氟-乳清酸(0.1％)，以选择失去了URA3标记的分离物。所述PDC5缺失、sadB整合以及标记去除是通过PCR确认的，所用引物为oBP540(SEQ ID NO：195)和oBP541(SEQ IDNO：196)，所用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。所述正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSmΔpdc5：：sadB并命名为BP913。
GPD2缺失
为删除内源的GPD2编码区，gpd2：：loxP-URA3-loxP盒(SEQ ID NO：131)进行PCR扩增，使用loxP-URA3-loxP PCR(SEQ ID NO：200)作为模板DNA。loxP-URA3-loxP包含来自(ATCC 77107)的URA3标记，其侧翼序列为loxP重组酶位点。PCR使用Phusion DNA聚合酶和引物LA512与LA513(SEQ ID NO：201和202)。所述每个引物的GPD2部分来源于GPD2编码区上游5′区和编码区下游3′区，使得loxP-URA3-loxP标记的整合导致GPD2编码区的替换。所述PCR产物转化到BP913并且转化子在缺乏尿嘧啶的辅以1％乙醇(无葡萄糖)的合成完全培养基上筛选。筛选的转化子的正确整合通过PCR来验证，所用引物为oBP582和AA270(SEQ IDNO：198和203)。
所述URA3标记的循环是通过转化pRS423：：PGAL1-cre(SEQ ID NO：204)并在30℃接种到缺乏组氨酸，辅以1％的乙醇的合成完全培养基上。将转化体划线接种到辅以1％乙醇的，并包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上，并且在30℃孵育以选择失去了URA3标记的转化子的分离物。抗5-氟-乳清酸的分离物生长在YPE(1％乙醇)上以移除pRS423：：PGAL1-cre质粒。通过PCR确认缺失和标记移除，所述PCR具有引物oBP582(SEQ IDNO：198)和oBP591(SEQ ID NO：205)。正确的分离物被选为菌株CEN.PK 113-7DΔura3：：loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1：：ilvDSmΔpdc5：：sadBΔgpd2：：loxP并命名为PNY1503(BP1064)。
用质粒pYZ090(SEQ ID NO：134)和pLH468(SEQ ID NO：135)转化BP1064以形成菌株NGCI-070(BP1083；PNY1504)。
pYZ090基于pHR81(ATCC 87541，Manassas，VA)主链被构建成包含具有得自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的alsS基因编码区的嵌合基因(nt位点457-2172)，它从酵母CUP1启动子(nt 2-449)开始表达并后接CYC1终止子(nt 2181-2430)以表达，并且具有得自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的ilvC基因编码区的嵌合基因(nt 3634-4656)，它从酵母ILV5启动子(2433-3626)开始表达并后接ILV5终止子(nt 4682-5304)以表达KARI。pLH468质粒(SEQ ID NO：2)被构建用于在酵母中表达DHAD、KivD、和HADH，并被描述于美国专利申请公布20090305363，该文献以引用方式并入本文。
实例2
构建啤酒糖酵母(Saccharomvces cerevisiae)菌株BP1135和PNY1507和生产异丁 醇的衍生物
这个实例的目的是构建酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)株BP1135和PNY1507。这些菌株来源于PNY1503(BP1064)。PNY1503来源于CEN.PK 113-7D(CBS 8340；Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre，Netherlands)。上文描述了PNY1503(BP1064)的构建。BP1135包含附加的FRA2基因缺失。PNY1507来源于BP1135，其具有附加的ADH1基因缺失，以及将来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的kivD基因(其经密码子优化以在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达)整合到ADH1基因座中。
通过与PCR片段的同源重组而构建了缺失(其一般去除整个编码序列)，所述PCR片段包含靶基因的上游和下游同源区以及用于选择转化子的URA3基因。通过同源重组除去URA3基因以产生无痕缺失。已类似的方式产生了基因的整合。
所述无痕缺失方法是修改自Akada等人，Yeast 23：399，2006。一般来讲，每个无痕缺失的PCR盒是通过重叠PCR组合四个片段，A-B-U-C，得到的。在某些情况下，对于缺失/整合过程，在通过PCR扩增整个盒之前，各个片段首先被克隆进质粒。所述PCR盒包含一个选择/反选标记，URA3(片段U)，包括原生CEN.PK 113-7D URA3基因，连同启动子(URA3基因上游250bp)和终止子(URA3基因下游150bp)区。片段A和C每个一般长500bp，它们对应于紧接靶基因上游的500bp(片段A)和靶基因3′的500bp(片段C)。片段A和C用于通过同源重组将盒整合到染色体中。片段B(500bp长)对应于紧接靶基因上游的500bp并且用于通过同源重组，从染色体上切除URA3标记和片段C，在盒与染色体的整合时生成作为对应于片段B的直接重复序列。
使用PCR产物ABUC盒，首先将URA3标记整合进基因组，然后通过同源重组从基因组中切除。初始整合删除了除3′的500bp之外的基因。在切除时，也删除了所述基因3′的500bp区域。对于使用这个方法的基因整合，将要整合的基因包含在PCR和的片段A和B之间。
FRA2缺失
FRA2缺失被设计为从编码序列3′端删除250个核苷酸，保留FRA2编码序列的最初113个核苷酸不动。一个阅读框终止密码子出现在去除下游7个核苷酸的位置。所述用于无痕FRA2缺失的PCR盒的四个片段的扩增，使用Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs；Ipswich，MA)和CEN.PK 113-7D基因组DNA作为模板，用GentraPuregene Yeast/Bact kit(Qiagen Valencia，CA)制备。FRA2片段A的扩增所用引物为oBP594(SEQ ID NO：99)和引物oBP595(SEQ ID NO：100)，其包含与FRA2片段B的5′端同源的5′尾。FRA2片段B扩增所用引物为oBP596(SEQ ID NO：101)，其包含与FRA2片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP597(SEQ ID NO：102)，其包含与FRA2片段U的5′端同源的5′尾。FRA2片段U扩增所用引物为oBP598(SEQ ID NO：103)，其包含与FRA2片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP599(SEQ ID NO：104)，其包含与FRA2片段C的5′端同源的5′尾。FRA2片段C扩增所用引物为oBP600(SEQ ID NO：105)，其包含与FRA2片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP601(SEQ IDNO：106)。PCR产物用PCR Purification kit(Qiagen)纯化。FRA2片段AB通过重叠PCR生成，通过混合FRA2片段A和FRA2片段B并用引物oBP594(SEQ ID NO：99)和oBP597(SEQ ID NO：102)进行扩增。FRA2片段UC通过重叠PCR生成，通过混合FRA2片段U和FRA2片段C并用引物oBP598(SEQ ID NO：103)和oBP601(SEQ ID NO：106)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后通过Gel Extraction kit(Qiagen)纯化。FRA2ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合FRA2片段AB和FRA2片段UC并用引物oBP594(SEQ ID NO：99和oBP601(SEQ ID NO：106)进行扩增。用PCR Purification kit(Qiagen)纯化PCR产物。
制备PNY1503的感受态细胞并用FRA2ABUCPCR盒转化，使用Frozen-EZ YeastTransformation II kit(Zymo Research；Orange，CA)。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以1％的乙醇的合成完全培养基上。具有fra2敲除的转化子用PCR进行筛选，所用引物为oBP602(SEQ ID NO：107)和oBP603(SEQ ID NO：108)，所用的基因组DNA用GentraPuregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。正确的转化子生长于YPE(酵母提取物、蛋白质胨、1％乙醇)中，并在30℃涂板到包含5-氟-乳清酸(0.1％)的合成完全培养基上以选择失去了URA3标记的分离物。所述缺失和标记移除通过PCR确认，所用引物为oBP602(SEQ IDNO：107)和oBP603(SEQ ID NO：108)，所用的基因组DNA用Gentra Puregene Yeast/Bactkit(Qiagen)制备。来自分离物的FRA2基因的缺乏通过PCR阴性结果来证明，所用FRA2的缺失编码区的特异性引物为oBP605(SEQ ID NO：109)和oBP606(SEQ ID NO：110)。所述正确的分离物被选择为菌株CEN.PK 113-7D MATa ura3Δ：：loxP his3Δ pdc6Δ pdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDClt pdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ：：loxP fra2Δ并命名为PNY1505(BP1135)。这一菌株用异丁醇途径质粒(pYZ090，SEQ ID NO：134)和pLH468(美国临时专利申请61/246,709，提交于2009年9月29日)进行转化，并且将一个克隆称为BP1168(PNY1506)。
ADH1的缺失和kivD Ll(y)的整合
ADH1基因被删除，并被来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的kivD编码区替代，所述kivD编码区是针对在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达经过密码子优化的。将ADH1缺失-kivD_Ll(y)整合无痕盒首先克隆进质粒pUC19-URA3MCS中，如美国专利申请61/356379所述，该申请提交于2010年6月18日，以引用方式并入本文。
来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的经密码子优化以在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的kivD编码区使用pLH468(美国临时专利申请61/246,709，其提交于2009年9月29日)作为模板进行扩增，所用引物为oBP562(SEQ ID NO：111)，其包含PmeI限制性位点，和引物oBP563(SEQ ID NO：112)，其包含与ADH1片段B的5′端具有同源的5′尾。ADH1片段B从如上制备的基因组DNA中进行扩增，所用引物为oBP564(SEQID NO：113)，其包含与kivD_Ll(y)的3′端具有同源的5′尾，和引物oBP565(SEQ ID NO：114)，其包含FseI限制性位点。用PCR Purification kit(Qiagen)纯化了PCR产物。kivD_Ll(y)-ADH1片段B通过重叠PCR生成，通过混合kivD_Ll(y)和ADH1片段BPCR产物并用引物oBP562(SEQ ID NO：111)和oBP565(SEQ ID NO：114)扩增。所得到的PCR产物用PmeI和FseI消化，用T4DNA连接酶连到用适合的酶消化过的pUC19-URA3MCS的对应的位点上。ADH1片段A从基因组DNA中进行扩增，使用引物oBP505(SEQ ID NO：115)，其包含SacI限制性位点，和引物oBP506(SEQ ID NO：116)，其包含AscI限制性位点。ADH1片段A的PCR产物用SacI和AscI消化并用T4DNA连接酶连接到包含kivD_Ll(y)-ADH1片段B的质粒的相应位点中。ADH1片段C从基因组DNA中进行扩增，使用的引物为oBP507(SEQ ID NO：117)，其包含PacI限制性位点，和引物oBP508(SEQ ID NO：118)，其包含SalI限制性位点。ADH1片段C PCR产物用PacI和SalI消化并用T4DNA连接酶连接到包含ADH1片段A-kivD_Ll(y)-ADH1片段B的质粒的相应位点中。杂合启动子UAS(PGK1)-PFBA1从载体pRS316-UAS(PGK1)-PFBA1-GUS(下文所述；SEQ ID NO：206)中进行扩增，所用引物为oBP674(SEQ ID NO：119)，其包含AscI限制性位点，和引物oBP675(SEQ ID NO：120)，其包含PmeI限制性位点。用PacI和SalI消化了UAS(PGK1)-PFBA1PCR产物，并用T4DNA连接酶连接至包含kivD_Ll(y)-ADH1片段ABC的质粒的相应位点。这个整合盒从所得质粒中进行扩增，使用引物oBP505(SEQ ID NO：115)和oBP508(SEQ IDNO：118)，并且用PCR Purification kit(Qiagen)纯化。
制备了PNY1505的感受态细胞，并使用Frozen-EZ Yeast Transformation II kit(Zymo Research)，用以上构建的ADH1-kivD_Ll(y)PCR盒转化了感受态细胞。转化混合物在30℃接种到缺乏尿嘧啶辅以1％的乙醇的合成完全培养基上。转化体在YPE(1％乙醇)中生长并且被接种到合成完全培养基上，所述培养基包含5-氟代-乳清酸(0.1％)，在30℃选择丢失了URA3标记的分离物。ADH1的缺失和kivD_Ll(y)的整合通过PCR进行确认，其使用引物oBP495(SEQ ID NO：121)和oBP496(SEQ ID NO：122)并使用kivD_Ll(y)特异性引物oBP562(SEQ ID NO：111)和外部引物oBP496(SEQ ID NO：122)，所用的基因组DNA用GentraPuregene Yeast/Bact kit(Qiagen)制备。正确的分离物被选择为菌株CEN.PK 113-7DMATa ura3Δ：：loxP his3Δ pdc6Δ pdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1tpdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ：：loxP fra2Δ adh1Δ：：UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)-ADHlt，并被命名为PNY1507(BP1201)。PNY1507用异丁醇途径质粒pYZ090(SEQ ID NO：134)和pBP915(下文所述)进行转化。下文描述了通过这些衍生物的异丁醇生产。
pRS316-UAS(PGK1)-FBA1p-GUS载体的构建
为了克隆盒UAS(PGK1)-FBA1p(SEQ ID NO：129)，从CEN.PK的基因组DNA中PCR扩增前602bp FBA1启动子(FBA1p)，所用引物为T-FBA1(SalI)(SEQ ID NO：123)和B-FBA1(SpeI)(SEQ ID NO：124)，并在用SalI/SpeI消化质粒除去PGK1p启动子后，将其克隆进在质粒pWS358-PGK1p-GUS(SEQ ID NO：130)上的SalI和SpeI位点中，生成pWS358-FBA1p-GUS。通过将PGK1p和β-葡糖醛酸糖苷酶基因(GUS)DNA片段插入来源于pRS423载体(Christianson等人，Gene 110：119-122，1992)的pWS358的多克隆位点，产生了pWS358-PGK1p-GUS质粒。第二，用SalI和SacI消化了所得到的pWS358-FBA1p-GUS质粒，凝胶纯化了包含FBA1p启动子、GUS基因、和FBAt终止子的DNA片段，并克隆至pRS316的SalI/SacI位点以构建pRS316-FBA1p-GUS。第三，从CEN.PK的基因组DNA PCR扩增了包含位于3-磷酸甘油酸激酶(PGK1)开放阅读框上游-519和-402位点之间的上游活化序列(UAS)的118bp DNA片段，即UAS(PGK1)，扩增使用了引物T-U/PGK1(KpnI)(SEQ ID NO：125)和B-U/PGK1(SalI)(SEQ ID NO：126)。用KpnI和SalI消化了PCR产物，并克隆至pRS316-FBA1p-GUS上的KpnI/SalI位点以构建pRS316-UAS(PGK1)-FBA1p-GUS。
实例3
构建PNY2204和生产异丁醇的衍生物
这个实例的目的是为了描述载体的构建以将编码乙酰乳酸合酶的基因整合到天然存在的在染色体XII中的PDC1和TRX1编码序列之间的基因间区域。
整合载体pUC19-kan：：pdc1：：FBA-alsS：：TRX1的构建
FBA-alsS-CYCt盒通过将1.7kb BbvCI/PacI片段从pRS426：：GPD：：alsS：：CYC(美国专利申请公布20070092957)移动到pRS426：：FBA：：ILV5：：CYC(美国专利申请公布20070092957，其之前用BbvCI/PacI消化以释放ILV5基因)进行构建。连接反应被转化至大肠杆菌(E.coli)TOP10细胞，并通过PCR筛选了转化子，所使用的引物为N98SeqF1(SEQ IDNO：91)和N99SeqR2(SEQ ID NO：93)。FBA-alsS-CYCt盒使用BglII和NotI分离自所述载体，用于克隆到pUC19-URA3：：ilvD-TRX1(如美国专利申请61/356379所述，其提交于2010年6月18日，以引用方式并入本文，克隆“B”；本文为SEQ ID NO：243)的AflII位点中(Klenow片段用于制造适合连接的末端)。获得在载体中两个方向上包含alsS盒的转化体并通过PCR确认，所述PCR对于构型“A”使用引物N98SeqF4(SEQ ID NO：92)和N1111(SEQ ID NO：97)，并且对于构型“B”使用N98SeqF4(SEQ ID NO：92)和N1110(SEQ ID NO：96)。然后，“A”构型的载体的遗传霉素选择型通过移除URA3基因(1.2kb NotI/Nael片段)和添加遗传霉素盒(本文为SEQ ID NO：244；以前描述于美国专利申请61/356379，提交于2010年6月18日，以引用方式并入本文)进行制备，将其保持在pUC19载体中(在SmaI位点克隆)。所述kan基因的分离是通过首先用KpnI消化pUC19，用Klenow片段(NEB，目录号M212)除去3′伸出的DNA，用HidcII消化，然后胶纯化1.8kb的基因片段(ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit，目录号D4001，ZymoResearch，Orange，CA；SEQ ID NO：245)。Klenow片段被用于制备全部的适合用于连接的末端，并通过PCR筛选了转化子以选择以与之前的URA3标记相同的取向具有遗传霉素抗性基因的克隆，所使用的引物为BK468(SEQ ID NO：90)和N160SeqF5(SEQ ID NO：94)。所得到的克隆被称为pUC19-kan：：pdc1：：FBA-alsS：：TRX1(克隆A)(SEQ ID NO：131)。
构建alsS整合子菌株和生产异丁醇的衍生物
用PmeI使上文所述的pUC19-kan：：pdc1：：FBA-alsS整合载体线性化，并转入了(如实例1所述)PNY1507。PmeI在克隆的pdc1-TRX1基因间区域内内切载体并因此导致在该位点的靶向整合(Rodney Rothstein，Methods in Enzymology，1991，第194卷，第281-301页)。在添加了50μg/mL G418的YPE上选择了转化子。通过PCR筛选整合事件的转化体菌斑，所述PCR使用引物N160SeqF5(SEQ ID NO：94)和oBP512(SEQ ID NO：98)。通过评估菌株制造异丁醇的能力，针对乙酰乳酸合酶功能对两个转化子进行了间接测试。为了进行该测试，在大肠杆菌-酵母穿梭载体(pYZ090ΔalsS和pBP915，描述于下文中)上提供了附加的异丁醇途径基因。一个克隆，菌株MATa ura3Δ：：loxP his3Δ pdc6Δ pdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDClt-pUC19-loxP-kanMX-loxP-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t pdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ：：loxP fra2Δ adh1Δ：：UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)-ADH1t被命名为PNY2204。不含质粒的亲本菌株称为PNY2204。PNY2204基因座(pdc1Δ：：ilvD：：pUC19-kan：：FBA-alsS：：TRX1)在图5中示出。
异丁醇途径质粒(pYZ090ΔalsS和pBP915)
用SpeI和NotI消化pYZ090(SEQ ID NO：134)以移除大部分CUP1启动子以及全部的alsS编码序列和CYC终止子。在用Klenow片段处理之后使载体自连，并转入大肠杆菌(E.coli)Stbl3细胞，针对氨苄青霉素抗性进行选择。两个独立克隆的DNA区域的去除通过包括连接部分的DNA测序进行确认，所述测序通过使用引物N191(SEQ ID NO：95)的PCR进行。所得质粒称为pYZ090ΔalsS(SEQ ID NO：132)。
从pLH468(SEQ ID NO：124)中构建pBP915，所述构建通过删除kivD基因和kivD的TDH3启动子上游的957个碱基对进行。pLH468用SwaI消化并且大片段(12896bp)按照GelExtraction kit(Qiagen；Valencia，CA)在琼脂糖凝胶电泳上纯化。用T4DNA连接酶使所分离的DNA自连，并用于转化电感受态的TOP10大肠杆菌(Invitrogen；Carlsbad，CA)。分离了来自转化体的质粒，并通过用SwaI限制性酶进行限制性分析，针对正确的缺失进行了检查。分离物也用引物oBP556(SEQ ID NO：127)和oBP561(SEQ ID NO：128)对包括缺失位点的区域测序。带有正确的缺失的一个克隆被命名为pBP915(pLH468ΔkivD)(SEQ ID NO：133)。
实例4
在具有kivD基因整合拷贝的菌株中的异丁醇生产
这个实例的目的是为了显示在具有kivD基因整合拷贝的菌株中的异丁醇生产，并将其与具有基因携带的kivD的菌株进行比较。无kivD整合的菌株携带质粒YZ090和pLH468，将它们与携带质粒pYZ090和pBP915的整合菌株PNY1507进行比较。所有培养基组分得自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO。菌株在合成培养基(无氨基酸酵母氮源和无尿嘧啶、组氨酸、色氨酸、和亮氨酸的缺陷型酵母合成补充培养基)上生长，所述培养基补充有76mg/L色氨酸，380mg/L亮氨酸，100mM MES pH5.5，20mg/L烟酸，20mg/L盐酸硫胺，0.2％葡萄糖，和0.2％乙醇。过夜培养物生长在125mL的通气Erlenmeye烧瓶中的8mL培养基里，温度为30℃，New Brunswick Scientific I24摇床转速为250RPM。125mL紧密封口的Erlenmeyer烧瓶中，19ml培养基接种了过夜培养物至OD600值为0.5，并且在30℃下生长8小时，New BrunswickScientific I24摇床转速为250RPM。加入葡萄糖至2％(时间是0时)。在48小时后，培养物上清液(收集采用了Spin-X离心管过滤单位，Costar目录号8169)用HPLC，按照美国专利申请公布20070092957描述的方法进行分析。结果示于表3中。具有kivD基因整合拷贝的菌株与具有质粒携带的kivD的菌株相比具有相似的异丁醇滴度。
表3：在具有整合的或质粒携带的kivD基因的菌株中的异丁醇滴度
菌株 异丁醇滴度(g/L)
PNY1506(BP1168) 1.7+/-0.3(n＝2*)
PNY1507/pYZ090/pBP915 1.8+/-0.1(n＝2#)
*生物学平行测定
#独立转化体
实例5
在具有alsS基因整合拷贝的菌株中的异丁醇生产
这个实例的目的是为了显示当从质粒中除去乙酰乳酸合酶并整合到酵母基因组中时提高的异丁醇产量。无alsS整合的菌株(携带质粒YZ090和pBP915的PNY1507)与整合菌株(PNY2204，其携带质粒pYZ090DalsS和pBP915)进行比较。所有菌株在缺乏组氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基上，其包含0.3％的葡萄糖和0.3％的乙醇作为碳源(在125mL通气Erlenmeye烧瓶中的10mL培养基(VWR目录号89095-260)。在过夜培养后(30℃，在250rpm的40New Brunswick Scientific Shaker中)，在包含2％葡萄糖和0.05％乙醇的合成完全培养基中(在125mL紧密封口的Erlenmeyer烧瓶中的20mL培养基(VWR目录号89095-260))将培养物稀释到0.2OD(Eppendorf BioPhotometer测量)。在培养48小时后(30℃，在250rpm的40New Brunswick Scientific Shaker中)，培养物上清液(使用Spin-X离心管过滤单位，Costar目录号8169收集)用HPLC，按照美国专利申请公布20070092957所述的方法进行分析。结果示于表4中。具有alsS基因整合拷贝的菌株的异丁醇滴度显著大于无alsS整合的菌株的异丁醇滴度。
表4：在具有或不具有alsS基因整合的菌株中的异丁醇滴度
菌株 异丁醇滴度(g/L)
PNY1507/pYZ090/pBP915 1.5+/-0.2(n＝3*)
PNY2204/pYZ090ΔalsS/pBP915(PNY2205) 2.6+/-0.1(n＝3*)
*生物学平行测定
实例6
在具有alsS基因整合拷贝的菌株中的异丁醇生产
这个实例的目的是为了显示当从质粒中除去乙酰乳酸合酶并整合到酵母基因组中时提高的异丁醇细胞密度和产量。无alsS整合的菌株(PNY1504，如美国专利申请61/379,546所述，该申请提交于2010年9月2日，以引用方式并入本文，以及PNY1506)与整合菌株PNY2205(用pYZ090ΔalsS和pBP915质粒转化并具有alsS整合的PNY2204)进行比较。
种菌和生物反应器培养基
制备酵母种菌培养基(1L)，其包含6.7g酵母氮源w/o氨基酸(Difco 0919-15-3)；2.8g不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的缺陷型酵母合成补充培养基(Sigma Y2001)；20mL 1％(w/v)L-亮氨酸；4mL 1％(w/v)L-色氨酸；0.8mL麦角固醇&Tween溶液；3g乙醇；和3g葡萄糖。对于10mL麦角固醇&Tween溶液，100mg麦角固醇溶解在5mL 100％乙醇和5mLTween 80中。溶剂在70℃下加热10分钟。
通过用移液管移取全部小瓶培养物(大约1ml)到10mL种菌培养基中，从冷冻小瓶直接接种125mL的烧瓶。烧瓶在260rpm和30℃条件下培养。菌株过夜生长至OD为约1.0。在HEλIOSα分光光度计(Thermo Electron Corporation，USA)中测定在λ＝600nm的OD。此时，从过夜培养物接种2L的摇瓶，其包含110mL的种菌培养基。在2L烧瓶中的起始OD为0.1。烧瓶在260rpm和30℃条件下培养。到摇瓶中的OD达到约1.0时，将20mL 1M MES缓冲液，20mL 10x酵母提取物和蛋白胨(YEP)，最终浓度至多为30g/L的葡萄糖和约160mL的油醇(90-95％，Cognis，Cincinnati OH，USA)加到摇瓶中。24小时后，除去油醇并接种生物反应器。
通过在水中溶解100g酵母提取物和200蛋白胨至最终体积为1L，制备10x YEP溶液。
制备生物反应器培养基(1L)，其包含：
(i)盐：硫酸铵5.0g，磷酸二氢钾2.8g，硫酸镁七水合物1.9g，硫酸锌七水合物0.2g；
(ii)维生素：生物素(D-)0.40mg，D(+)泛酸钙8.00mg，肌醇200.00mg，盐酸吡哆醇8.00mg，对氨基苯甲酸1.60mg，核黄素1.60mg，叶酸0.02mg，烟酸30.0mg，和硫胺素30mg；
(iii)氨基酸：缺陷型酵母合成补充培养基，其无组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶(Sigma Y2001)2.8g，1％(w/v)L-亮氨酸20mL，和1％(w/v)L-色氨酸4mL；以及
(iv)痕量元素：EDTA(Titriplex III7)99.38mg，硫酸锌七水合物29.81mg，无水氯化锰5.57mg，氯化钴(II)六水合物1.99mg，硫酸铜(II)五水合物1.99mg，Di-无水钼酸钠2.65mg，无水氯化钙29.81mg，硫酸亚铁七水合物19.88mg，硼酸。
生物反应器实验设计
在得自Sartorius(USA)的2L BIOSTAT B-DCU Tween2L生物反应器中进行实验。在用80mL种菌接种后将发酵罐直接连接到得自Thermo Electron Corporation(USA)的质谱上，发酵罐中的体积为约800mL，将溶氧浓度(DOT)控制在10％，将pH控制在5.25，将通风速率控制在0.5L/分钟，加入0.8L油醇。油醇用于从培养液中提取异丁醇。
用于分析培养实验的方法
通过用移液管移取一孔混合培养液样品到合适的比色杯(CS500VWRInternational，Germany)中，使用分光光度计测定在λ＝600nm的光密度(OD)。如果样品的生物质浓度超过分光光度计(通常OD值为0.000至0.600)的线性吸收范围，用0.9％的氯化钠溶液稀释样品以生成在线性范围内的值。
在培养基中的代谢物和产物使用GC方法和得自Phenomenex(Torrance，CA)的ZB-WAXplus柱(30m×0.25mm ID，0.25μm的膜)进行分析和定量。使用的载气是2.3mL/分钟恒定流速的氦气；注射分流比在250℃为1∶20；炉温为70℃1分钟，以10℃/分钟从70℃升温至160℃，以30℃/分钟从160℃升温至240℃。火焰离子化检测器(FID)在260℃、40mL/分钟的氦气补气条件下使用。在注射前先通过0.2μm旋转过滤器对培养物肉汤样品进行过滤。使用0.5μl的注射体积。生成异丁醇的校准标准曲线。
通过高效液相色谱法(HPLC)，使用本领域已知的方法进行葡萄糖和发酵副产物分析。一种使用Shodex SH-1011柱和Shodex SH-G保护柱(二者均可购自WatersCorporation，Milford，MA)并联合折射率(RI)检测的HPLC方法。用0.01N的H2SO4作为流动相，以0.5mL/分钟流量和50℃的柱温实现色谱分离。异丁醇保留时间为47.6分钟。
通过HPLC方法测定在培养上清液中的异丁醇浓度。通过GC方法测定在油醇相中的异丁醇浓度。通过如上所述的质谱方法测定在废气样品中的异丁醇浓度。
结果
表5提供了在发酵约46小时时的光密度(OD)、异丁醇生产速率(R)、每升培养液生产的异丁醇(异丁醇滴度，T)、和每消耗葡萄糖(Y)的异丁醇产量的测量值。PNY2205菌株与PNY1504和PNY1506菌株相比生长至更高的细胞密度并达到更高的滴度和速率，但是产量相似。
表5：在PNY1504、PNY1506和PNY2205菌株中的光密度、异丁醇生产速率、滴度和产 量
实例7
比较菌株PNY1504和PNY2205在相同反应性液体提取条件下的性能
使用的原液
前种子培养基
在室温下轻轻搅拌混合下列试剂：6.7g无氨基酸的酵母氮源(Difco 0919-15-3)；2.8g不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的缺陷型酵母合成补充培养基(Sigma Y2001)；20mL 1％(w/v)L-亮氨酸；4mL 1％(w/v)L-色氨酸；3g乙醇；3g葡萄糖和足量的水，用于制备总计1L的溶液。
种子烧瓶培养基
在室温下轻轻搅拌混合下列试剂：6.7g无氨基酸的酵母氮源(Difco 0919-15-3)；2.8g不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的缺陷型酵母合成补充培养基(Sigma Y2001)；20mL 1％(w/v)L-亮氨酸；4mL 1％(w/v)L-色氨酸；3g乙醇；30g葡萄糖；38g MES缓冲液(Sigma-Aldrich YXXX)和足量的水，用于制备总计1L的溶液。在混合后，溶液进行过滤除菌。
麦角固醇溶液
混合0.2g麦角固醇、10mL 200无水乙醇和10mL Tween 80的溶液并加热到70℃保持10分钟。
Distillase原液
混合0.9mL Distilase L 400和49.1mL过滤除菌的自来水的溶液。
Lipolase 100L原液
混合并过滤除菌2.12mL Lipolase 100L(Sigma Aldrich L0777)和40g pH6.8的磷酸盐缓冲溶液的溶液。
维生素原液
在500mL过滤除菌的去离子水中混合5g烟酸和1g硫胺素。
玉米醪
将玉米醪加到30L液化罐中。接下来，将16910g自来水加到30L液化罐中，同时在120rpm下搅拌。所述罐配备有双叶片斜叶桨，DB/DT＝～0.25。接下来，加入14091g玉米粉(在配有1微米筛网的锤磨机中碾碎)，并将所述醪加热到55℃并保持30分钟。通过加入5.4g17％的氢氧化钠水溶液将pH调节到5.8。混合1986g自来水和19.5g得自Genencor的SpezymeFred L制备α-淀粉酶溶液，并使所得溶液通过0.2微米的过滤器过滤除菌。将2004g这一溶液加到30L液化罐中并保持在55℃附加的60分钟。然后将所述溶液加热至95℃并保持在该温度120分钟。在用于发酵前将所述溶液冷却至30℃。
PNY1504方法
前种子生长
将30mL前种子培养基加到250mL带挡板的通气摇瓶中。接下来，将菌株PNY1504总体积约1.5mL的2个冷冻种子小瓶加到相同烧瓶中。然后所述培养物在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
种子烧瓶阶段1
将15mL前种子培养物加到在2L带挡板的通气摇瓶中的300mL种子烧瓶培养基中。所述烧瓶在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
种子烧瓶阶段2
然后将30mL酵母提取物蛋白胨和300mL无菌油醇加到烧瓶中。所述烧瓶在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
1L生产发酵罐
在121℃下将用水覆盖探针的1L发酵罐灭菌30分钟。将水排出并加入520mL无菌玉米醪培养基。接下来，在发酵罐中无菌加入下列物质：3.8mL乙醇，0.6mL 1％麦角固醇溶液，6mL烟酸，/硫胺素溶液和4.8mL Liplolase 100L原液。接下来，加入60mL种子烧瓶阶段2的水相，随后加入2mL Distillase原液。此后立即加入96mL玉米油脂肪酸。在12小时后，加入2mL Distillase原液。在接种后24小时，再加入2mL Distillase原液。然后在pH 5.2、温度30℃和设定值为3％的pO2(溶解氧分压)条件下孵育所述溶液。将风量设为0.2slpm(每分钟标准升数)并通过搅拌控制pO2。用20％w/v的KOH溶液控制pH，并且在整个发酵期间不需要加入酸。在整个发酵期间取样并分析。
PNY2205方法
前种子生长
将30mL前种子培养基加到250mL带挡板的通气摇瓶中。接下来，将菌株PNY2205总体积约1.5mL的2个冷冻种子小瓶加到相同烧瓶中。随后所述烧瓶在30℃的培养振荡器上以250rpm保持24小时。
种子烧瓶阶段1
将300mL种子烧瓶培养基加到2L带挡板的通气摇瓶中。将15mL前种子培养物加到烧瓶中并在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
种子烧瓶阶段2
将30mL酵母提取物蛋白胨和300mL无菌油醇加到烧瓶中，并且所述烧瓶在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
1L生产发酵罐
在121℃下将用水覆盖探针的1L发酵罐灭菌30分钟。将水排出并加入520mL无菌玉米醪培养基。接下来，在发酵罐中无菌加入下列物质：3.8mL乙醇，0.6mL 1％麦角固醇溶液，6mL烟酸/硫胺素溶液和4.8mL Liplolase 100L原液。接下来，加入60mL种子烧瓶阶段2的水相，随后加入2mL Distillase原液。此后立即加入96mL玉米油脂肪酸。在接种后12小时，加入2mL Distillase原液。在接种后24小时，还加入2mL Distillase原液。所述溶液在pH5.2、温度30℃和pO2设定值为3％的条件下孵育。将风量设为0.2slpm并通过搅拌控制pO2。用20％w/v的KOH溶液控制pH，并且在整个发酵期间不需要加入酸。在整个发酵期间取样并分析。
用于分析培养实验的方法
使用分光光度计测量在λ＝600nm的所得培养物的光密度(OD)。首先，一孔混合培养液样品用移液管移取到合适的比色杯中。当样品的生物质浓度超过分光光度计(通常OD值为0.000至0.600)的线性吸收范围时，用0.9％的氯化钠溶液稀释样品以生成在线性范围内的值。通过离心在预称重的离心管中的5mL细胞培养液，随后用蒸馏水洗涤、在80℃烘箱中干燥至恒重并测定重量差值来测定细胞悬浮液的干重。
在培养基中的代谢物和产物使用GC方法和得自Phenomenex(Torrance，CA)的ZB-WAXplus柱(30m×0.25mm ID，0.25μm的膜)进行分析和定量。载气是2.3mL/分钟恒定流速的氦气；注射分流比在250℃为1∶20；炉温为70℃1分钟，以10℃/分钟从70℃升温至160℃，并以30℃/分钟从160升温至240℃。在260℃以40mL/分钟补充氦气，采用FID检测。在注射前先通过0.2μm旋转过滤器对培养物肉汤样品进行过滤。使用异丁醇(w-甲基-1-丙醇)的校准标准曲线。
通过YSI进行葡萄糖分析(YSI 2700Select生物化学分析仪，其利用酶电极技术快速测量葡萄糖浓度。
结果
表6提供了异丁醇生产速率、每升培养液的异丁醇滴度(有效滴度)、和每消耗葡萄糖的异丁醇产量。PNY2205菌株与PNY1504菌株相比具有较高的生产速率和滴度，但是产量相似。
表6：PNY2205与PNY1504相比较的光密度和异丁醇产量
52-56小时的结果 PNY1504 PNY2205
速率，g/L-h 0.50 0.64
有效滴度(g/L) 26.3 35.5
产量/葡萄糖g/g 0.27 0.27
实例8
比较菌株PNY1504和PNY2205在相同反应性液体提取条件下的性能
使用的原液
前种子培养基
在室温下轻轻搅拌混合下列试剂：6.7g无氨基酸的酵母氮源(Difco 0919-15-3)；2.8g不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的缺陷型酵母合成补充培养基(Sigma Y2001)；20mL 1％(w/v)L-亮氨酸；4mL 1％(w/v)L-色氨酸；3g乙醇；3g葡萄糖和足量的水，用于制备总计1L的溶液。
种子烧瓶培养基
在室温下轻轻搅拌混合下列试剂：6.7g无氨基酸的酵母氮源(Difco 0919-15-3)；2.8g不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的缺陷型酵母合成补充培养基(Sigma Y2001)；20mL 1％(w/v)L-亮氨酸；4mL 1％(w/v)L-色氨酸；3g乙醇；30g葡萄糖；38g MES缓冲液(Sigma-Aldrich YXXX)和足量的水，用于制备总计1L的溶液。在混合后，溶液进行过滤除菌。
麦角固醇溶液
混合0.2g麦角固醇、10mL 200无水乙醇和10mL Tween 80的溶液并加热到70℃保持10分钟。
Distillase原液
混合0.9mL Distilase L 400和49.1mL过滤除菌的自来水的溶液。
Lipolase 100L原液
混合并过滤除菌2.12mL Lipolase 100L(Sigma Aldrich L0777)和40g pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液的溶液。
维生素原液
在500mL过滤除菌的去离子水中混合5g烟酸和1g硫胺素的溶液。
玉米醪
将玉米醪加到30L液化罐中。接下来，将16910g自来水加到30L液化罐中，同时在120rpm下搅拌。所述罐配备有双叶片斜叶桨，DB/DT＝～0.25。接下来，加入14091g玉米粉(在配有1微米筛网的锤磨机中碾碎)，并将所述醪加热到55℃并培养30分钟。通过加入5.4g17％的氢氧化钠水溶液将pH调节到5.8。混合1986g自来水和19.5g得自Genencor的SpezymeFred L制备α-淀粉酶溶液，并使所得溶液通过0.2微米的过滤器过滤除菌。将2004g这一溶液加到30L液化罐中并在55℃培养附加的60分钟。随后，将所述溶液加热至95℃并保持120分钟。随后在用于发酵前将所述溶液冷却至30℃。
PNY1504方法
前种子生长
将30mL前种子培养基加到250mL带挡板的通气摇瓶中。接下来，将菌株PNY1504总体积约1.5mL的2个冷冻种子小瓶加到相同烧瓶中。所述培养物在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
种子烧瓶阶段1
将300mL种子烧瓶培养基加到2L带挡板的通气摇瓶中。将15mL前种子转移到烧瓶中。然后所述烧瓶在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
种子烧瓶阶段2
将30mL酵母提取物蛋白胨和300mL无菌油醇加到烧瓶中，并且所述烧瓶在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
1L生产发酵罐
在121℃下将用水覆盖探针的1L发酵罐灭菌30分钟。将水排出并加入520mL无菌玉米醪培养基。接下来，在发酵罐中无菌加入下列物质：3.8mL乙醇，0.6mL 1％麦角固醇溶液，6mL烟酸/硫胺素溶液和4.8mL Liplolase100L原液。接下来，加入60mL种子烧瓶阶段2的水相，随后加入2mL Distillase原液。此后立即加入141mL玉米油脂肪酸。在接种后12小时，加入2mL Distillase原液。在接种后24小时，还加入2mL Distillase原液。然后所述溶液在pH5.2、温度30℃和pO2设定值为3％的条件下孵育。将风量设为0.2slpm并通过搅拌控制pO2。用20％w/v的KOH溶液控制pH，并且在整个发酵期间不需要加入酸。在整个发酵期间取样并分析。
PNY2205方法
前种子生长
将30mL前种子培养基加到250mL带挡板的通气摇瓶中。接下来，将菌株PNY2205总体积约1.5mL的2个冷冻种子小瓶加到相同烧瓶中。然后所述烧瓶在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
种子烧瓶阶段1
将300mL种子烧瓶培养基加到2L带挡板的通气摇瓶中。将15mL前种子培养物加烧瓶中并在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
种子烧瓶阶段2
将30mL酵母提取物蛋白胨和300mL无菌油醇加到烧瓶中，并且所述烧瓶在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
1L生产发酵罐
在121℃下将用水覆盖探针的1L发酵罐灭菌30分钟。将水排出并加入520mL无菌玉米醪培养基。接下来，在发酵罐中无菌加入下列物质：3.8mL乙醇，0.6mL 1％麦角固醇溶液，6mL烟酸/硫胺素溶液和4.8mL Liplolase100L原液。接下来，加入60mL种子烧瓶阶段2的水相，随后加入2mL Distillase原液。此后立即加入96mL玉米油脂肪酸。在接种后12小时，加入2mL Distillase原液。在接种后24小时时还加入2mL Distillase原液，并且所述溶液在pH 5.2、温度30℃和pO2设定值为3％的条件下孵育。将风量设为0.2slpm并通过搅拌控制pO2。用20％w/v的KOH溶液控制pH，并且在整个发酵期间不需要加入酸。在整个发酵期间取样并分析。
结果
表7提供了异丁醇生产速率、每升培养液的异丁醇滴度(有效滴度)、和每消耗葡萄糖的异丁醇产量。PNY2205菌株与PNY1504菌株相比具有较高的生产速率和滴度，但是产量相似。
表7：PNY2205与PNY1504相比较的光密度和异丁醇产量
实例9
比较菌株PNY1504和PNY2205在相同反应性液体提取条件下的性能
使用的原液
前种子培养基
在室温下轻轻搅拌混合下列试剂：6.7g无氨基酸的酵母氮源(Difco 0919-15-3)；2.8g不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的缺陷型酵母合成补充培养基(Sigma Y2001)；20mL 1％(w/v)L-亮氨酸；4mL 1％(w/v)L-色氨酸；3g乙醇；3g葡萄糖和足量的水，用于制备总计1L的溶液。
种子烧瓶培养基
在室温下轻轻搅拌混合下列试剂：6.7g无氨基酸的酵母氮源(Difco 0919-15-3)；2.8g不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的缺陷型酵母合成补充培养基(Sigma Y2001)；20mL 1％(w/v)L-亮氨酸；4mL 1％(w/v)L-色氨酸；3g乙醇；30g葡萄糖；38g MES缓冲液(Sigma-Aldrich YXXX)和足量的水，用于制备总计1L的溶液。在混合后，溶液进行过滤除菌。
麦角固醇溶液
混合0.2g麦角固醇、10mL 200无水乙醇和10mL Tween 80的溶液并加热到70℃保持10分钟。
Distillase原液
混合0.9mL Distilase L 400和49.1mL过滤除菌的自来水的溶液。
Lipolase 100L原液
混合并过滤除菌2.12mL Lipolase 100L(Sigma Aldrich L0777)和40g pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液的溶液。
维生素原液
在500mL过滤除菌的去离子水中混合5g烟酸和1g硫胺素的溶液。
玉米醪
将玉米醪加到30L液化罐中。接下来，将16910g自来水加到30L液化罐中，同时在120rpm下搅拌。所述罐配备有双叶片斜叶桨，DB/DT＝～0.25。接下来，加入14091g玉米粉(在配有1微米筛网的锤磨机中碾碎)，并将所述醪加热到55℃并培养30分钟。通过加入5.4g17％的氢氧化钠水溶液将pH调节到5.8。混合1986g自来水和19.5g得自Genencor的SpezymeFred L制备α-淀粉酶溶液，并使所得溶液通过0.2微米的过滤器过滤除菌。将2004g这一溶液加到30L液化罐中并在55℃培养附加的60分钟。随后，将所述溶液加热至95℃并保持120分钟。随后在用于发酵前将所述溶液冷却至30℃。
PNY1504方法
前种子生长
将30mL前种子培养基加到250mL带挡板的通气摇瓶中。接下来，将菌株PNY1504总体积约1.5mL的2个冷冻种子小瓶加到相同烧瓶中。所述培养物在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
种子烧瓶阶段1
将300mL种子烧瓶培养基加到2L带挡板的通气摇瓶中。将15mL前种子转移到烧瓶中。然后所述烧瓶在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
种子烧瓶阶段2
将30mL酵母提取物蛋白胨和300mL无菌油醇加到烧瓶中，并且所述烧瓶在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
1L生产发酵罐
在121℃下将用水覆盖探针的1L发酵罐灭菌30分钟。将水排出并加入520mL无菌玉米醪培养基。接下来，在发酵罐中无菌加入下列物质：3.8mL乙醇，0.6mL 1％麦角固醇溶液，6mL烟酸/硫胺素溶液和4.8mL Liplolase 100L原液。接下来，加入60mL种子烧瓶阶段2的水相，随后加入2mL Distillase原液。此后立即加入141mL玉米油脂肪酸。在接种后12小时，加入2mL Distillase原液。在接种后24小时，还加入2mL Distillase原液。然后所述溶液在pH5.2、温度30℃和pO2设定值为3％的条件下孵育。将风量设为0.2slpm并通过搅拌控制pO2。用20％w/v的KOH溶液控制pH，并且在整个发酵期间不需要加入酸。在整个发酵期间取样并分析。
PNY2205方法
前种子生长
将30mL前种子培养基加到250mL带挡板的通气摇瓶中。接下来，将菌株PNY2205总体积约1.5mL的2个冷冻种子小瓶加到相同烧瓶中。然后所述烧瓶在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
种子烧瓶阶段1
将300mL种子烧瓶培养基加到2L带挡板的通气摇瓶中。将15mL前种子培养物加烧瓶中并在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
种子烧瓶阶段2
将30mL酵母提取物蛋白胨和300mL无菌油醇加到烧瓶中，并且所述烧瓶在30℃的培养振荡器上以250rpm培养24小时。
1L生产发酵罐
在121℃下将用水覆盖探针的1L发酵罐灭菌30分钟。将水排出并加入520mL无菌玉米醪培养基。接下来，在发酵罐中无菌加入下列物质：3.8mL乙醇，0.6mL 1％麦角固醇溶液，6mL烟酸/硫胺素溶液和4.8mL Liplolase 100L原液。接下来，加入60mL种子烧瓶阶段2的水相，随后加入2mL Distillase原液。此后立即加入96mL玉米油脂肪酸。在接种后12小时，加入2mL Distillase原液。在接种后24小时时还加入2mL Distillase原液，并且所述溶液在pH 5.2、温度30℃和pO2设定值为3％的条件下孵育。将风量设为0.2slpm并通过搅拌控制pO2。用20％w/v的KOH溶液控制pH，并且在整个发酵期间不需要加入酸。在整个发酵期间取样并分析。
结果
表8提供了异丁醇生产速率、每升培养液的异丁醇滴度(有效滴度)、和每消耗葡萄糖的异丁醇产量。PNY2205菌株与PNY1504菌株相比具有较高的生产速率和滴度，但是产量相似。
表8：PNY2205与PNY1504相比较的异丁醇产量
实例10
构建啤酒糖酵母菌株PNY2211
以多步骤从酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株PNY1507(实例2)中构建PNY2211，如下列段落所述。首先所述菌株经修改以包含磷酸酮(醇)酶基因。磷酸酮(醇)酶基因盒和整合菌株的构建以前在提交于2010年6月18日的美国专利申请61/356,379中进行了描述。接下来，使用在实例3中描述的整合载体将乙酰乳酸合酶基因(alsS)加入菌株。最后，使用同源重组除去磷酸酮(醇)酶基因和整合载体序列，导致alsS无痕插入到在pdc1Δ：：ilvD(以前在美国专利申请61/356,379中描述的PDC1ORF缺失/插入，该申请提交于2010年6月18日；参见本文实例1)和染色体XII的天然TRX1基因之间。所得基因型PNY2211是MATa ura3Δ：：loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1tpdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5t gpd2Δ：：1oxP fra2Δ adh1Δ：：UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Ll(y)-ADH1t。
通过同源重组将磷酸酮(醇)酶基因盒导入PNY1507中。如下生成整合构建体。质粒pRS423：：CUP1-alsS+FBA-budA(如美国专利申请公布2009/0305363 A1所述)用NotI和XmaI消化以除去1.8kb的FBA-budA序列，并且所述载体在用Klenow片段处理后再连接。接下来，用TEF1启动子变体取代CUP1启动子(M4变体，如Nevoigt等人Appl.Environ.Microbiol.2006.72(8)：5266-5273所述)，所述取代经由DNA2.0(MenloPark，CA)的DNA合成和载体构建服务完成。所得质粒pRS423：：TEF(M4)-alsS用StuI和MluI酶切(除去包含部分alsS基因和CYC1终止子的1.6kb的部分)，然后与4kb的PCR产物混合，所述PCR产物从pRS426：：GPD-xpk1+ADH-eutD(描述于美国专利申请61/356,379，该申请提交于2010年6月18日；本文为SEQ ID NO：246)中使用引物N1176(SEQ ID NO：207)和N1177(SEQID NO：208)生成，并且使用引物N822(SEQ ID NO：209)和N1178(SEQ ID NO：210)从酵母基因组DNA(ENO1启动子区域)生成0.8kb的PCR产物，并将其转化到酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株BY4741(ATCC 201388；空位修复克隆方法，参见Ma和Botstein)中。通过将细胞接种到无组氨酸的合成完全培养基上获得转化体。期望质粒(pRS423：：TEF(M4)-xpk1+ENO1-eutD，SEQ ID NO：211)的正确装配通过PCR(引物N821(SEQ ID NO：212)和N1115(SEQ ID NO：213))和限制性消化(BglI)进行确认。随后对两个克隆测序。通过用SacI和NotI消化分离3.1kb的TEF(M4)-xpk1基因并将其克隆到pUC19-URA3：：ilvD-TRX1载体中(如美国专利申请61/356,379所述，该申请提交于2010年6月18日，本文为SEQ ID NO：243)Clone A，用AflII酶切)。克隆片段用Klenow片段处理以生成平末端用于连接。将连接反应产物转化到大肠杆菌Stbl3细胞中，选择氨苄青霉素抗性。TEF(M4)-xpk1的插入通过PCR(引物N1110(SEQ IDNO：214)和N1114(SEQ ID NO：215))确认。所述载体用线性化AflII并用Klenow片段处理。1.8kb的KpnI-HincII抗遗传霉素盒(如美国专利申请61/356,379所述，该申请提交于2010年6月18日；本文为SEQ ID NO：245)通过在Klenow片段处理后的连接进行克隆。将连接反应产物转化到大肠杆菌Stbl3细胞中，选择氨苄青霉素抗性。遗传霉素盒的插入通过PCR(引物N160SeqF5(SEQ ID NO：216)和BK468(SEQ ID NO：217))确认。提供的质粒序列为SEQ IDNO：218(pUC19-URA3：：pdc1：：TEF(M4)-xpk1：：kan)。
分离所得整合盒(pdc1：：TEF(M4)-xpk1：：KanMX：：TRX1)(AscI和NaeI消化产生的5.3kb条带，其进行凝胶纯化)并将其转化到PNY1507中(实例2)，所述转化使用ZymoResearch Frozen-EZ Yeast Transformation Kit(目录号T2001)。通过接种到YPE加50μg/ml G418上选择转化体。在期望基因座的插入通过PCR(引物N886(SEQ ID NO：219)和N1214(SEQ ID NO：220))确认。接下来，使用编码Cre重组酶的质粒pRS423：：GAL1p-Cre除去loxP-fianked KanMX盒(载体和方法如本文所述)。所述盒的正确去除通过PCR(引物oBP512(SEQID NO：221)和N160SeqF5(SEQ ID NO：222))确认。最后，使用包括的遗传霉素选择标记将本文所述的alsS整合质粒(pUC19-kan：：pdc1：：FBA-alsS：：TRX1，克隆A)转化到这个菌株中。两个整合子的乙酰乳酸合酶活性测试通过使用质粒pYZ090ΔalsS和pBP915(本文所述质粒，使用“Methods in Yeast Genetics”2005.Amberg、Burke和Strathern中的方案2转化)的转化并评估在包含葡萄糖的培养基中的生长和异丁醇生产(生长和异丁醇测量的方法在本文和提交于2005年10月26日的美国专利申请60/730,290以及美国专利公布2007/0092957 A1中描述)进行。两个克隆中的一个是阳性的并且称为PNY2218。包含质粒pYZ090ΔalsS和pBP915的分离物PNY2218称为PNY2209。
PNY2218用Cre重组酶处理，并且筛选所得丢失xpk1基因和pUC19整合载体序列的克隆，所述筛选通过PCR(引物N886(SEQ ID NO：219)和N160SeqR5(SEQ ID NO：222))进行。在整合载体插入期间重组xpk1的DNA上游和导入的同源DNA后，这仅留下整合到pdc1-TRX1基因间区域的alsS基因(为“无痕”插入，因为载体、标记基因和loxP序列丢失，参见图6)。虽然这种重组可在任何点上发生，载体整合似乎在无遗传霉素选择的情况下是稳定的，并且仅在导入Cre重组酶后观察到所述重组事件。一个克隆称为PNY2211。
实例11
比较菌株PNY2205和PNY2211在相同反应性液体提取条件下的性能
具有无痕整合的分离物(具体地讲，两个克隆“B”和“M”)用pYZ090ΔalsS和pBP915进行转化以与PNY2205比较异丁醇产量。在包含1％乙醇作为碳源的合成完全培养基(不含组氨酸和尿嘧啶)上选择整合子。将整合子涂布到相同培养基上，并且将细胞菌斑再次涂布到包含2％葡萄糖加上0.05％乙醇作为碳源的板上。在两天后，菌斑用于接种液体培养基(在125mL通气烧瓶中的10mL不含组氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基，具有2％的葡萄糖和0.05％的乙醇)。在过夜培养后(30℃，250rpm)，将培养物稀释到OD 0.2(在125mL紧密封盖的烧瓶中的20mL培养基)。在48小时后，取样以测定异丁醇产量。新菌株背景提供了类似于PNY2205的异丁醇产量。选择用于进一步工程化的克隆M称为PNY2211。用质粒pYZ090DalsS和pBP915转化的克隆M7称为PNY2213。
表9提供了PNY2205、克隆B和克隆M的每升培养液异丁醇产量(有效滴度g/L)。克隆B和M菌株与PNY2205相比具有相似的异丁醇滴度。
表9：PNY2205与PNY2211相比较的异丁醇产量
菌株 异丁醇滴度(g/L)
PNY2205 4.0
克隆B菌株(n＝3) 3.8+/-0.5
克隆M菌株(n＝3)(PNY2213) 4.0+/-0.5

Claims (47)

1.重组宿主细胞，包含异丁醇生物合成途径，其中所述途径包括由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码的多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，并且其中所述途径包括由质粒上的多核苷酸编码的多肽催化的乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸的底物至产物的转化，并且其中与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述异丁醇生产的滴度是提高的。
2.重组宿主细胞，包含2,3-丁二醇、2-丁醇或2-丁酮生物合成途径，其中所述途径包括由整合到染色体中的异源性多核苷酸编码的多肽催化的丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，并且其中所述途径包括至少一种由质粒上的多核苷酸编码的多肽催化的底物至产物的转化。
3.根据权利要求1或2所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞选自：细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自下列属的成员：梭菌属（Clostridium）、发酵单胞菌属（Zymomonas）、埃希氏菌属（Escherichia）、沙门氏菌属（Salmonella）、红球菌属（Rhodococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、节杆菌属（Arthrobacter）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、短杆菌属（Brevibacterium）、毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）、汉逊酵母属（Hansenula）、伊萨酵母属（Issatchenkia）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）和糖酵母属（Saccharomyces）。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌（Escherichia coli）。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述多肽是在所述宿主细胞胞质溶胶中表达的。
7.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
8.根据权利要求1至2中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
9.根据权利要求1或3至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：2,3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；α-酮异戊酸至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇。
10.根据权利要求1或2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：2,3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；α-酮异戊酸至异丁酰-CoA；异丁酰-CoA至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇。
11.根据权利要求1或2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：2,3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸；α-酮异戊酸至缬氨酸；缬氨酸至异丁胺；异丁胺至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇。
12.根据权利要求2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至2,3-丁二醇；以及2,3-丁二醇至2-丁酮。
13.根据权利要求2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至2,3-丁二醇；2,3-丁二醇至2-丁酮；以及2-丁酮至2-丁醇。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化的多肽是乙酰乳酸合酶。
15.根据权利要求14所述的重组宿主，其中所述乙酰乳酸合酶与选自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16或18的氨基酸序列具有至少约80%的同一性。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞中丙酮酸脱羧酶的表达是降低的或基本上消除的。
17.根据权利要求1至15中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含内源性多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换，所述内源性多核苷酸编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸被整合到内源性多核苷酸中，所述多核苷酸编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽，所述内源性多核苷酸编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞中甘油-3-磷酸脱氢酶的表达是降低的或基本上消除的。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞中Fra2的表达是降低的或基本上消除的。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述多核苷酸被整合到染色体中PDC1-TRX1基因间区域处。
22.重组宿主细胞，包含：
(a) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化丙酮酸至乙酰乳酸的底物至产物的转化，其中所述多核苷酸被整合到染色体中；
(b) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸的底物至产物的转化，其中所述多核苷酸在质粒上；
(c) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化2,3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的底物至产物的转化；和
(d) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化；
其中所述宿主细胞基本上不具有丙酮酸脱羧酶活性；并且
其中所述宿主细胞产生异丁醇。
23.方法，包括：
(a) 提供权利要求1至22中任一项或它们的任何组合的重组宿主细胞；以及
(b) 在产生生物合成途径产物的条件下，使所述宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。
24.根据权利要求23所述的方法，还包括使所述发酵液体培养基与提取剂接触以产生两相发酵混合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述提取剂包括脂肪酸。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述脂肪酸来源于玉米油或大豆油。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述提取剂包括与水不混溶的有机提取剂，所述有机提取剂选自：C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛和C12-C22脂肪酰胺。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述生物合成途径产物是醇，并且其中所述方法还包括使所述发酵液体培养基与有机酸和酶接触，所述酶能够用所述有机酸酯化所述醇。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述生物合成途径产物是醇，并且其中所述方法还包括蒸发所述发酵液体培养基的至少一部分以形成包含水和醇的蒸气流。
30.根据权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述生物合成途径产物是丁醇。
31.根据权利要求23至30中任一项所述的方法，其中所述生物合成途径产物是异丁醇。
32.根据权利要求30至31中任一项所述的方法，其中与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述丁醇生产的速率提高至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。
33.根据权利要求30至31中任一项所述的方法，其中与编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的重组宿主细胞相比，所述丁醇生产的滴度提高至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约2倍、至少约3倍或至少约4倍。
34.根据权利要求32至33中任一项所述的方法，其中所述丁醇是异丁醇。
35.提高催化生物合成途径步骤的非整合重组多核苷酸的拷贝数或表达的方法，包括：
在产生生物合成途径产物的条件下，使权利要求1至22中任一项的重组宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。
36.提高利用丙酮酸的生物合成途径的流量的方法，包括：
(a) 提供权利要求1至22中任一项或它们的任何组合的重组宿主细胞；以及
(b) 在提高所述宿主细胞中利用丙酮酸的生物合成途径的流量的条件下，使所述宿主细胞与可发酵碳底物接触以形成发酵液体培养基。
37.提高2,3-丁二醇、异丁醇、2-丁醇或2-丁酮生物合成途径产物的形成的方法，包括：
(i) 提供权利要求1至22中任一项或它们的任何组合的重组宿主细胞；以及
(ii) 使所述宿主细胞在形成利用丙酮酸的途径产物的条件下生长；
其中由所述重组宿主细胞形成的产物量大于由编码催化丙酮酸至乙酰乳酸的转化的多肽的多核苷酸没有被整合到染色体中的宿主细胞形成的产物量。
38.组合物，包含：
(i) 权利要求1至23中任一项或它们的任何组合的宿主细胞；
(ii) 丁醇；和
(iii) 提取剂。
39.组合物，包含：
(i) 权利要求1至23中任一项或它们的任何组合的宿主细胞；
(ii) 丁醇；
(iii) 提取剂；和
(iv) 酯化酶。
40.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述提取剂包括脂肪酸。
41.根据权利要求41所述的组合物，其中所述脂肪酸来源于玉米油或大豆油。
42.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述提取剂是与水不混溶的有机提取剂，所述有机提取剂选自：C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛和C12-C22脂肪醛。
43.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述提取剂包括油醇。
44.权利要求1或3至23中任一项的宿主细胞或权利要求38至43中任一项的组合物在生产异丁醇的方法中的用途。
45.权利要求1或3至23中任一项的宿主细胞或权利要求38至43中任一项的组合物在生产包含异丁醇的燃料组合物的方法中的用途。
46.根据权利要求2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至3-氨基-2-丁醇；3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸；以及3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮。
47.根据权利要求2至8中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列底物至产物的转化：乙酰乳酸至乙偶姻；乙偶姻至3-氨基-2-丁醇；3-氨基-2-丁醇至3-氨基-2-丁醇磷酸；3-氨基-2-丁醇磷酸至2-丁酮。
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