CN103627698A - 乙偶姻高耐受性菌株的选育和用该菌株发酵生产乙偶姻 - Google Patents

Abstract

本发明阐述了乙偶姻高耐受性菌株的选育和用该菌株发酵生产乙偶姻，属于生物工程技术领域(微生物领域)。本发明包括如下过程：(1)亚硝基胍诱变：将本实验室筛选并保藏的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens FMME044作为出发菌株制备菌悬液，并将其与不同浓度的亚硝基胍反应，一段时间后，终止反应再进行后培养。(2)驯化：在驯化培养基里添加不同浓度的乙偶姻，制成不同浓度的乙偶姻发酵液，逐步提高乙偶姻浓度进行驯化培养。将上述驯化所得的菌悬液直接涂布到含高浓度乙偶姻的平板上。(3)筛选：在高浓度乙偶姻平板上能够长出的单菌落即为能耐高浓度乙偶姻的菌株。然后，挑取单菌落进行发酵验证并将高产菌株进行二次验证，筛选出一株比出发菌株产更高浓度乙偶姻的菌株，命名为B.amyloliquefaciens E-11。本发明同时公开一种采用该菌株生产乙偶姻的方法，采用本方法发酵40h乙偶姻产量为63g/L。

Description

乙偶姻高耐受性菌株的选育和用该菌株发酵生产乙偶姻

技术领域

乙偶姻高耐受性菌株的选育和用该菌株发酵生产乙偶姻，属于生物工程领域。

背景技术

3-羟基丁酮(乙偶姻)是一种应用广泛、令人喜爱的食用香料，是国际上常用的香料品种，主要用作奶油、酸奶等香料的生产，国家标准GB2760-86规定其为允许使用的食品香料。80％含量的3-羟基丁酮俗称″醋嗡″，是酒类调香中一个极其重要的品种。在制药工业中，3-羟基丁酮作为具有手性的化合物可以用来合成稀有药物和药物中间体，如4-氯-4，5-二甲基-1，3二氧杂环戊烷-2-酮(CDMDO)和伦氨苄西林盐酸盐。CDMDO是一种重要的医药中间体，主要用于青霉素、氨苄青霉素等抗生素类药物的修饰，以合成具有光学活性的手性药物，从而较大程度地提高药效，减轻药物的副作用。另外，含有3-羟基丁酮和2，3-丁二酮的混合物还可以用来治疗乳腺炎。

3-羟基丁酮生产方法有：化学合成法、酶转化法和微生物发酵法，目前主要通过化学合成生产，已经实现工业化；化学合成法虽然操作简单易行，但污染重、成本高、原料受石油制约、产品质量难以达到食用香料的要求。微生物发酵法生产3-羟基丁酮的还未见工业化生产的报道。3-羟基丁酮是多种微生物的糖代谢的中间代谢产物，以糖质为原料利用微生物发酵可以生产3-羟基丁酮，与化学合成法及酶转化法相比，微生物发酵法具有生产成本低廉、对环境友好、产品纯度高、反应条件温和等优势，能解决化学合成法和酶转化法所面临的环境、资源、产品质量等问题受到越来越多的关注。

发明内容

本发明的目的是提供乙偶姻高耐受性菌株的选育和用该菌株发酵生产乙偶姻。

本发明技术方案：

1、乙偶姻高耐受性菌株的选育：

(1)亚硝基胍诱变

将本实验室筛选并保藏的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens FMME044作为出发菌株制备菌悬液，并将其与不同浓度的亚硝基胍反应，一段时间后，终止反应再进行后培养。

(2)驯化

在驯化培养基里添加不同浓度的乙偶姻，制成不同浓度的乙偶姻发酵液，将上述后培养的菌悬液添加到含有低浓度乙偶姻的培养基中，培养一段时间后再转接到相同乙偶姻浓度的培养基中，每个浓度转接三次之后，再转接到含有高浓度乙偶姻的培养基中，重复此操作，直到培养基中乙偶姻浓度达到80g/L。将上述驯化所得的菌悬液直接涂布到含高浓度乙偶姻的平板上。

(3)筛选并鉴定

，在高浓度乙偶姻平板上能够长出的单菌落即为能耐高浓度乙偶姻的菌株。然后，挑取单菌落进行发酵验证并将高产菌株进行二次验证，筛选出一株比出发菌株高产且能耐受高浓度乙偶姻的菌株，经生理生化鉴定并命名为B.amyloliquefaciens E-11。

2、根据权利要求1所述乙偶姻高耐受性菌株的选育，其筛选得到耐高浓度乙偶姻并高产乙偶姻菌株的鉴定方法如下：

1)形态学鉴定

菌落形态、细胞形态、革兰氏染色、芽孢染色；

2)生理生化鉴定

接触酶试验，V.P.及M.R.试验，明胶液化及淀粉水解，耐盐耐酸试验，硝酸盐还原试验；

通过形态学、生理生化鉴定确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，并命名为B.amyloliquefaciensE-11。

3、本发明公开的一种乙偶姻的生产方法，其特征是采用B.amyloliquefaciens FMME044为出发菌株，经过亚硝基胍诱变，驯化，筛选和发酵培养。以筛选固体培养基，筛选液体培养基，种子培养和液体发酵进行筛选和发酵生产乙偶姻。

(1)筛选固体培养：

固体培养基以g/L计：乙偶姻浓度30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L和80g/L，葡萄糖20g/L，大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，氯化钠，5g/L，琼脂，20g/L，初始pH7.0；

培养条件：恒温培养箱中37℃培养1-3天。

(2)筛选液体培养基：

筛选培养基以g/L计：乙偶姻浓度30、40、50、60、70和80，葡萄糖130，大豆蛋白胨12.5，酵母粉12.5，KH₂PO₄3，K₂HPO₄3，MgSO₄·7H₂O0.4；

培养条件：温度37℃、摇床转速200rpm条件下，培养12-14h。

(3)种子培养：

种子培养基以g/L计：葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白胨5，初始pH7.0；

培养条件：温度37℃、摇床转速200rpm条件下，培养10-12h；

(4)液体发酵培养：

发酵培养基以g/L计：葡萄糖140，蛋白胨12.5，酵母粉12.5，KH₂PO₄3，K₂HPO₄3，MgSO₄·7H₂O0.4，初始pH7.0；

发酵条件：接种量10％(v/v)，温度37℃、摇床转速200rpm条件下，发酵60-72h。

(5)7L发酵罐发酵培养：

发酵培养基以g/L计：葡萄糖140，蛋白胨12.5，酵母粉12.5，KH₂PO₄3，K₂HPO₄3，MgSO₄·7H₂O0.4，初始pH7.0；

7L发酵罐中发酵培养基装液量为4L，接种量10％(v/v)，温度为37℃，搅拌转速为400r/min，通气量为1.0vvm，过程中控制pH6.5，培养时间60h。

3、乙偶姻产量的测定

取发酵液10000rpm离心10min，收集上清液，并以乙偶姻作为标准品，配制1、2、3、4、5、6、7g/L的标准溶液。将上清液与标准溶液经0.45μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定乙偶姻的含量。

色谱条件：

色谱柱：Aminex HPX-87H；

流动相：5mmol/L稀硫酸，用0.45μm滤膜过滤；

柱温：60℃；

检测波长：290nm；

进样量：20μL

流速：0.6ml/min。

标准曲线在1-7g/L之间呈现良好的线性关系(图1)，回归方程：y＝0.3517x，R²＝0.9992。据此得到40h乙偶姻的产量为63g/L，如图1。

附图说明

图1乙偶姻标准曲线

图2色谱检测结果，A3g/L乙偶姻标样，B40h发酵液

具体实施方式

以下是乙偶姻高耐受性菌株的选育和用该菌株发酵生产乙偶姻的实施例。

实施例1

(1)亚硝基胍诱变：

①制备菌悬液

将原始菌株Bacillus amyloliquefaciens FMME044取0.2mL接入50mL种子培养基中，37℃摇床培养14h至对数中后期，再以30％接种量接入新的培养基6h，使细胞同步培养。分别取培养液10mL于50mL离心管中，离心收集菌体，用0.1mol/LpH6.0的磷酸缓冲液洗涤3次，最后加入7mL缓冲液，重悬菌体。取菌悬液0.7mL添加到5mL的离心管中，共8支，备用。

②诱变反应

吸取0.3mLNTG母液分别加入5mL含有0.7mL菌悬液的离心管中混匀，静置30min、45min。

③终止反应

将含有处理液的离心管在10000r/min离心5min，倒掉上清液，再加入3mL的生理盐水，10000r/min离心5min，倒掉上清液，重复以上操作2次，最后加入3mL种子培养基振荡混匀。

④后培养

将混合均匀的菌悬液转入含有50mL的种子培养基，37℃、200r/min振荡培养12h，经细胞分裂，使突变性状能稳定遗传。

(2)驯化。

①将上述后培养的菌液取5mL转接到含50mL驯化培养基的500mL摇瓶中(乙偶姻浓度为0g/L)，37℃、200r/min培养12h后，再取5mL菌液转接到含50mL驯化培养基的500mL摇瓶中(乙偶姻浓度为30g/L)，37℃、200r/min培养12h，重复转接乙偶姻浓度为30g/L的驯化培养基3次，再取第三次培养12h后的菌液5mL转接到含50mL驯化培养基的500mL摇瓶中(乙偶姻浓度为40g/L)，重复转接乙偶姻浓度为40g/L的驯化培养基3次。重复此操作，逐步提高培养基中乙偶姻的浓度，分别为50、60、70和80g/L进行培养。

②将经过逐级驯化后得到的菌液稀释涂布于选择培养基上(乙偶姻浓度分别为0、30、40、50、60、70和80g/L)，37℃培养箱培养1-3天。

(3)筛选

①从含有不同浓度乙偶姻的平板上挑取单菌落，然后进行摇瓶验证，选取乙偶姻高产菌株进行保藏。

②初次筛选得到的菌株经过发酵验证后，挑选产量比出发菌株高的菌株再次进行摇瓶发酵验证，筛选出产量较高的菌株。

③将上述分离纯化得到的菌种接种于种子培养基中，然后转接到发酵培养基中，培养48h后离心收集发酵液，发酵液经过预处理并采用内标法经高效液相色谱进行定性分析，使得乙偶姻标准品峰高增高的菌株即为产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌。筛选出35株高产乙偶姻的菌株，其中菌株E-11产乙偶姻的能力最强。

实施例2

对筛选的FMME044菌株按《微生物分类学》进行生理生化特性鉴定(见下表1、2)：

表1菌株(FMME044)与枯草芽孢杆菌菌落形态特征对比

表2菌株(FMME044)生理生化鉴定结果

实施例3

步骤1：培养基制备

种子培养基(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白胨5，氯化钠5，初始PH7.0；

发酵培养基(g/L)：葡萄糖140，蛋白胨12.5，酵母粉12.5，KH₂PO₄3，K₂HPO₄3，MgSO₄·7H₂O0.4，初始pH7.0；

步骤2：种子制备

500mL三角瓶中种子培养基为50mL，121℃灭菌15min。菌株保藏于终浓度为15％的甘油管中，取200μL保藏菌液接入50mL种子培养基中进行种子培养，37℃，200rpm培养12h。

步骤3：摇瓶发酵培养

种子培养基以10％的接种量接入50mL发酵培养基进行发酵培养。在37℃，200rpm条件下发酵48h，取发酵液离心，收集上清液用HPLC测定发酵液中的乙偶姻的含量。产量为59g/L。

实施例3

步骤1：同实施例2

步骤2：同实施例2

步骤3：7L发酵罐发酵培养

7L发酵罐中发酵培养基装液量为4L，接种量为10％(v/v)，培养温度为37℃，搅拌转速为400r/min，通气量为1.0vvm，控制pH6.5，培养时间40h取发酵液离心，收集上清液用HPLC测定发酵液中的乙偶姻的含量。产量为63g/L。

Claims (3)

1.乙偶姻高耐受性解淀粉芽孢杆菌的选育，包括以下步骤：

(1)亚硝基胍诱变

将本实验室筛选并保藏的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens FMME044作为出发菌株制备菌悬液，并将其与不同浓度的亚硝基胍反应，一段时间后，终止反应再进行后培养；

(2)驯化

在驯化培养基里添加不同浓度的乙偶姻，制成不同浓度的乙偶姻发酵液，将上述后培养的菌悬液添加到含有低浓度乙偶姻的培养基中，培养一段时间后再转接到相同乙偶姻浓度的培养基中，每个浓度转接三次之后，再转接到含有相对高浓度乙偶姻的培养基中，重复此操作，直到培养基中乙偶姻浓度达到80g/L；将上述驯化所得的菌悬液直接涂布到含高浓度乙偶姻的平板上；

(3)筛选

在高浓度乙偶姻平板上能够长出的单菌落即为能耐高浓度乙偶姻的菌株；然后，挑取单菌落进行发酵验证并将高产菌株进行二次验证，筛选出35株比出发菌株高产且能耐受高浓度乙偶姻的菌株，其中菌株E-11生产乙偶姻的能力最强。

2.根据权利要求1所述，其筛选得到生产乙偶姻菌株，经形态学、生理生化鉴定为解淀粉芽孢杆菌，并命名为B.amyloliquefaciens E-11。

3.一种乙偶姻的生产方法，其特征是采用B.amyloliquefaciens E-11为出发菌株，以种子培养和液体发酵生产乙偶姻；

1)种子培养：

种子培养基以g/L计：葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白胨5，初始PH7.0；

培养条件：温度37℃、摇床转速200rpm条件下，培养12h；

2)液体发酵培养：

发酵培养基以g/L计：葡萄糖140，蛋白胨12.5，酵母粉12.5，NaCl 5，K₂HPO₄3，MgSO₄·7H₂O0.4，初始pH7.0；

发酵条件：接种量10％(v/v)，温度37℃、摇床转速200rpm条件下，发酵60-72h；

3)7L发酵罐发酵培养：

发酵培养基以g/L计：葡萄糖140，蛋白胨12.5，酵母粉12.5，NaCl 5，K₂HPO₄3，MgSO₄·7H₂O0.4，初始pH7.0；

7L发酵罐中发酵培养基装液量为4L，接种量10％(v/v)，温度为37℃，搅拌转速为400r/min，通气量为1.0vvm，过程中不控制pH，培养时间32-48h。

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