CN102851224A - 产琥珀酸放线杆菌菌株及其筛选和发酵生产丁二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）GXAS-137，以及其筛选和发酵生产丁二酸的方法，该菌株从牛瘤胃富集、筛选获得，并利用该产琥珀酸放线杆菌菌株接入种子培养基中，在厌氧培养箱或普通培养箱中30-38℃静止培养24-36h，按1-10%的接种量接入发酵培养基中，调节pH在6.0-7.0，并在30-38℃发酵24-120h，即可得到丁二酸。并对不同原料和培养基中进行发酵研究，丁二酸产量能达到70g/L，具有工业化生产的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种琥珀酸放线杆菌菌株的筛选及其应用。
背景技术
丁二酸，又称琥珀酸（succsinic acid），是一种常见的天然有机酸，广泛存在于动、植物和微生物体内，是生物进行TCA循环的中间产物之一。它是一种重要的有机合成中间体，主要应用于食品、医药、生物降解塑料、表面活性剂、洗涤剂、和绿色溶剂等领域。此外，丁二酸还可以用作动物饲料添加剂和植物生长刺激剂等方面。目前，丁二酸生产主要是利用化学合成的方法，从丁烷通过顺式丁烯二酐生产琥珀酸，主要由石蜡氧化法、轻油氧化法、丁烷氧化法、丁二腈水解法、催化加氢等方法。以化学方法生产丁二酸，需要消耗大量不可再生的石化原料，生产成本高，环境污染严重，从而限制了琥珀酸的广泛应用。因此，人们开始将目标转向通过生物发酵法来生产琥珀酸。与传统的化学合成法相比，发酵法具有成本低、环境效益好等优点。目前，通过发酵法生产得到的琥珀酸，其价格大约为0.55～1.1﹩/kg。另外，据Bio-amber公司称，琥珀酸具有25亿欧元的市场，且生物法生产琥珀酸能够与石化的方法相竞争，并计划于2011前利用植物作为原料进行工业生产琥珀酸。
丁二酸是许多严格厌氧菌和兼性厌氧菌代谢的重要中间产物。目前人们已经发现多种微生物可以通过发酵来生产琥珀酸，其中研究主要集中在大肠杆菌（E. coli），曼海姆产琥珀酸菌(Mannheimia succiniciproducens)，产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens) 和产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）。此外，一些乳酸菌、丙酸产生菌及真菌等也可以产生少量丁二酸。在众多的产琥珀酸微生物中，瘤胃微生物产琥珀酸放线杆菌能够利用多种糖类进行发酵，并且可以耐受葡萄糖和琥珀酸的浓度分别高达158 g/L和104 g/L；同时，该菌以其高产量、高耐受性等优势，成为最具发展前景的琥珀酸产生菌之一。
国外在琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸研究方面研究较多，其中美国密歇根生物技术研究院（MEI）Zeikus等人课题组处于领先地位。他们在1996年筛选出一株高产丁二酸菌株130Z （Actinoabcillus succinogens ATCC 55618），并以130Z为出发菌株，筛选出对单氟乙酸抗性的自发突变株。在最适条件下，此抗性株发酵时间48h，发酵产物中的琥珀酸/乙酸比例高达85:1；琥珀酸/甲酸比例高达160:1，丁二酸产量可以达到80-110 g/L，得率高达97%，使丁二酸发酵获得了突破性进展（Applied and Environmental Microbiology. 2005, 71: 6651-6656；Int J Syst Bacteriol 1999, 49:207-216）。国内对琥珀酸酸放线杆菌发酵产丁二酸的研究也较多。较早的有天津大学的赵学明等人对购自国外的ATCC55618菌株发酵研究发现其琥珀酸产量在11.49g/L，并有乳酸等副产物存在，对该菌株诱变后产量亦无显著高。近期，江南大学的孙志浩等人，筛选出菌株Actinobacillus succinogens CGMCC1593，对其诱变选育后，SF-9在5L发酵罐上发酵36h琥珀酸产量达40.51g/L，但仍然存在乳酸、甲酸和乙酸等副产物。南京工业大学姜岷等通过对筛选得到的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113 (CGMCCNO. 1716)进行改造和发酵条件优化，丁二酸的产量可达的52 g/L。
中国专利文献：琥珀酸放线杆菌菌种改组、选育方法以及用其发酵生产丁二酸的方法，申请号：CN200810146688，申请日：2008-09-05，发明人：孙志浩；倪晔；郑 璞；董晋军； 专利权人：江南大学。该发明涉及一株具有较强钠离子耐受性和产酸性能的琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC 2653(即F3-10)，该菌株的选育方法及用其发酵生产丁二酸的方法。以琥珀酸放线杆菌CGMCC 1593作为出发菌株，分别对其进行X-射线、紫外线诱变和硫酸二乙酯(EMS)、亚硝基胍(NTG)化学诱变，筛选得到具有改良的发酵产酸性能，特别是钠离子耐受性有改良三株菌株X-8、UV-17、SE-6，和具有氟乙酸抗性的高产菌株SF-9，将它们用基因组改组方法选育得到高产、耐钠、抗氟乙酸的菌株F3-10。该菌株F3-10以甘蔗糖蜜为原料，采用Na2CO3控制发酵pH，在5L发酵罐中进行补料分批发酵，48h产丁二酸53.96g/L，对消耗糖产率89.2％，糖利用率94.0％，丁二酸比杂酸为6.58∶1，较出发菌CGMCC1593有显著提高。
综上所述，目前由于国外的技术封锁，国外的菌种难以获得，即使购买到国外菌种，也会由于具体技术条件难以得知，产量也不高，根本达不到文献报道的产量；国内丁二酸菌株生产方面与国外还有一定的差距，目前国内最高产的也就是50 g/L左右的丁二酸。因此，筛选丁二酸更高产的微生物菌株和研究出一种能够生产更高浓度丁二酸的方法是很有必要的。
发明内容
本发明的目的就是国内生产丁二酸菌株产量不高的现状，提供一种丁二酸产量能达到70 g/L的琥珀酸放线杆菌，以及其筛选和生产丁二酸的方法。
本发明是这样实现的：
一株产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes菌株，分类属巴斯德菌科（pasteurellaceae）放线杆菌属（Actinobacillus）的产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）GXAS-137，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学邮编430072，保藏时间保存编号为CCTCC NO:M2011399，保藏时间为2011年11月18日，并于2011年11月25 日检测结果为存活。
以上所述的产琥珀酸放线杆菌菌株的筛选方法，根据产丁二酸菌株能够利用富马酸产生丁二酸的特点，设计以富马酸钠为唯一碳源富集培养基和选择平板，此外通过添加莫能菌素可有效抑制产乳酸菌和产甲烷菌等杂菌生长，在筛选平板中添加适量的丁二酸钠，可以抑制提高筛选菌株对丁二酸的耐受性，可以有效筛选产琥珀酸放线杆菌菌株，具体步骤如下：
（1）将新鲜牛的瘤胃内容物悬浮于适量生理盐水中，用无菌纱布过滤去除粗纤维等固体物质；
（2）将过滤得到的悬浮液接种于 50-150ml富集培养基的250ml三角瓶中，30-37℃厌氧箱中培养16-30h；所述的富集培养基为含有富马酸盐作为唯一碳源并添加氮源、无机盐和莫能菌素的培养基，详细配方如下：富马酸钠10-30g/L，酵母粉5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，K2HPO41-5g/L，CaCl20.1-1g/L，NaCl 0.5-2g/L，(NH4)2SO40.5-2g/L，MgCl20.1-1g/L，莫能菌素0.1-0.2g/L，将前述原料混匀即可得到富集培养基。
（3）转接2次后，培养物按照梯度稀释后，涂布在筛选培养基的平板上，于厌氧箱培养30-48h，挑选菌落较大菌株于发酵培养基中，培养结束后，HPLC测定每个样品丁二酸含量，选取丁二酸产量浓度大于10g/L菌株进行复筛，选取复筛后丁二酸产量高、副产物少的菌株，即可得到权利要求1所述的产琥珀放线杆菌菌株。所述的筛选培养基为在富集培养基基础上添加30-100 g/L丁二酸钠，平板培养时加入15-20 g/L琼脂粉。
将经过上述筛选到的菌株（在此命名为GXAS137）进行16S rDNA基因序列测定和生理生化鉴定，结果如下：
1. 经过对GXAS137菌株的16S rDNA（附图1）基因序列比对，与Actinobacillus succinogenes 130Z的序列同源性最高，为94%。具体DNA基因序列为：
0001 ATTGAAGAGT TTGATCATGA CTCAGATTGA CGATAACGAG TGAAAAGCTT GCTATCCATG
0061 CTGAAGAGTG GCGAACGAGT GAGTAATGCT TGAGAATCTG GCTTATGAAG GAGAATAACG
0121 AAGAGAAAAT GTCGCTAATA CCGCGATGTC TAAGAACTAA AGAGTGAGAT TATCGAACCG
0181 CCCGCCATAA GATGAGCCCA AGTGAGATTA GATAGTTGAT GAGATAAAGA AGCCCAAGTG
0241 GAATTAGATA GTTGATGAGA TAAAGAACTA CCAAGCCGAA GATCTCTAGC TGATCTGAGA
0301 GAATGAACAG CCAAAATGAA AATGAGAAAA GATCCAGAAT CCTAAGAGAG GCAGCAGTGA
0361 GAAGAAGCAA CGAATAACTC CGTGCCAGCA GCCGCGATAA TAAGAAGAGT GCGAGCGTTA
0421 TTCCCGAGCC AAGTTCTTTC TTGTAAAAAA AAGAAGAATA AGTTAACAGC TATGATTCAT
0481 GAAGTTAGCC AAAGAAGAAG CAACGAATAA CTCCGTGCCA GCAGCCGCGA TAATAAGAAG
0541 GATGCGAGCG TTAATCGAAA TAACTGAGCG TAAAGAGCAA GCAGAAGAAT ATATAAGTGA
0601 ATCGAAATAA CTGAGCGTAA AGAGCAAGCA GAAGAATGAA TGAGATCAAG GAATTCGTAA
0661 TGAGTTGTAA GTAGAATTCC AAGTGTAGCG GTGAAATGCG TAGAGATGTG GAGAAATAAC
0721 GAAGAAGAAG GCAGCCCCTT GAGAACGTAA TGAAGCTCAT GTGCGAAAGC GTGAGAAGCA
0781 AACATGAGAG GATAACCTGA TAGTCCAAGC TGTAAAAGCT GTCGATATGA GAATTGAGCG
0841 ATAAGCCTGA TGCCCGAAGC TAACGTGATA AATCGAACGC CTGAGAAGTA CGAACGCAAG
0901 GTTAAAACTC AAATGAATTG AAGAGAGCCC CATAACAAGA TGAAGCATGT GATATAATTC
0961 GATGCAACGC GAAGAACCTT AACTAATCTT GAAATCCTCA GAATCCGATA GAGATATCGA
1021 AGTGCCTTCG GAAAATGAGA GAAAGATGCT GCATGAATGT CGTCAGCTCG TGTTGTGAAA
1081 TGTTGAGTTA AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTTATCCTT TGTTGCCAGC ATGTAGAGAT
1141 GAGAACTCAA AGAAGAATGC CGATGATAAA CCGAAGAAAG GTGAGAATGA CGTCAAGTCA
1201 TCATGAACCT TAAGAGTAGA GCTAAAAAAG TGCTAAAATG GCGTATAAAG AGAGAAAAGA
1261 ATGAGAACTC AAAGAAGAAT GCCGATGATA AACCGAAGAA AGATGAGAAT GAAGTCAAGT
1321 CATCATGAAC CTTAAGAGTA GAGCTAAAAA CGTGCTAAAA TGAAGTATAA AGAGAGAAAA
1381 GAGCCTGCGA GAGAGAGTGA ATCTCAGAAA GTGCGTCGTA GTCCGAATTG GAGTCTGCAA
1441 ATCGAATCCA TGAAGTCGAA ATCGCTAGTA ATCGCGAATC AGCATGTCGC AGTTCTATCG
1501 ATGATGAGAA AGAAGAATGT TAACAGCTTA TTCGATTGAA GTTAGCCAAA
2. GXAS137菌株为革兰氏阴性菌，兼性厌氧菌，细胞成杆状或球杆状，不运动，无芽孢，也不产生孢子。生长温度为20-40 ℃，最适35-38℃，生长pH4.5-8.0，最适6.5-7.5。
3. GXAS137菌株可以发酵以下底物产酸：葡萄糖，蔗糖，果糖，麦芽糖，D-木糖，乳糖，果糖，甘露糖，D-阿拉伯糖，甘露醇，D-山梨醇等糖类或醇类，以及糖质原料如甘蔗汁、甜菜汁、糖蜜等和淀粉质及纤维素原料的水解液。
4. GXAS137菌株的代谢产物：该菌代谢产物以丁二酸为主，其他副产物由乙酸、甲酸、乳酸、丙酮酸、苹果酸和富马酸。当提供较高CO2时，菌体生产较快，丁二酸快速积累，其他副产物较少。
由以上16S rDNA基因序列测定和生理生化特性结果，可以认定GXAS-137菌株属于巴斯德菌科（pasteurellaceae）放线杆菌属（Actinobacillus）的产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes），现已保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为CCTCC NO:M2011399，保藏时间为2011年11月18日，并于2011年11月25日检测结果为存活。
运用以上所述产琥珀放线杆菌菌株发酵产丁二酸的方法：将产琥珀放线杆菌菌株接入种子培养基中，在厌氧培养箱或普通培养箱中30-38℃静止培养24-36h，按1-10%的接种量接入发酵培养基中，调节pH在6.0-7.0，并在30-38℃发酵24-120h，即可得到丁二酸，所述的调节pH用的是碳酸盐、氨水、NaOH，所述的碳酸盐为碱式碳酸镁，所述的发酵条件为有氧或通入N2或CO2。优选方案为碱式碳酸镁调节pH，通入CO2；如采用氨水、NaOH等碱性调节，必须通入CO2。
以上所述的种子培养基的成分及其浓度为：糖类10-20 g/L，酵母粉5-10 g/L，蛋白胨5-10 g/L， K2HPO4 1-5 g/L，CaCl2 0.5-1 g/L，NaCl 0.5-2 g/L，(NH4)2SO4 0.5-2 g/L，MgCl2 0.5-1 g/L，碱式碳酸镁10-20 g/L。
以上所述的发酵培养基的成分及其浓度为：糖类40-100 g/L，氮源 10-40 g/L， K2HPO4 1-5 g/L，CaCl2 0.5-1 g/L，NaCl 0.5-2 g/L，(NH4)2SO4 0.5-2 g/L，MgCl2 0.5-1 g/L。
以上所述的糖类包括：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖，甘蔗、甜菜、糖蜜中所含的糖；木薯、玉米、甘薯淀粉质原料水解释放出的糖；纤维素的水解物中的一种或多种的组合。
以上所述的氮源包括有机氮源和无机氮源；所述的有机氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米浆、豆饼粉，所述的无机氮源包括尿素、硫酸铵。
本发明的优点和有益效果：
（1）本发明采用添加中间代谢物富集和产物抑制，筛选到一株丁二酸产量可达70 g/L菌株CCTCC M 2011399（GXAS137），具有工业化生产的潜力。
（2）该菌株还可以发酵木糖产生丁二酸，因此，可以充分利用自然界中丰富的纤维素资源，保证原料廉价、可持续供应，可以解决丁二酸化学合成的化石资源紧张，污染环境的问题。
（3）该菌株可以采用木薯、玉米粉或纤维素等可再生生物质原料，是一种利用可再生原料的生产方法，可缓解化学合成丁二酸的石化资源紧张问题，对环境友好，而且这些原料中还含有一些可供微生物利用的氮源、维生素等其他营养成份，可显著提高丁二酸产量和降低生产成本。
附图说明
图1 产琥珀酸放线杆菌CCTCC M 2011399电镜照片。
具体实施方式
以下是琥珀酸放线杆菌菌株CCTCC M 20113997筛选、鉴定及发酵生产丁二酸的具体实施实例。但对本发明没有限制。
实施例1
琥珀酸放线杆菌菌株的筛选与鉴定：
1、富集培养基的制备：含有富马酸盐为唯一碳源并添加氮源、无机盐和莫能菌素的培养基。详细配方如下（g/L）：富马酸钠 10-30，酵母粉5-20，蛋白胨5-20，K2HPO4 1-5，CaCl2 0.1-1，NaCl 0.5-2，(NH4)2SO4 0.5-2，MgCl2 0.1-1，莫能菌素0.1-0.2，将前述原料混匀即可得到富集培养基。经试验验证，前述富集培养基原料配方内的任一浓度组合制备的富集培养基均可筛选出本发明的GXAS137菌株。
2.、平板筛选培养基的制备：在富集培养基的基础上添加丁二酸钠和琼脂粉。详细配方如下（g/L）：富马酸钠 10-30，酵母粉5-20，蛋白胨5-20，K2HPO4 1-5，CaCl2 0.1-1，NaCl 0.5-2，(NH4)2SO4 0.5-2，MgCl2 0.1-1，丁二酸钠30-100，琼脂粉15-20，将前述原料混匀即可得到筛选培养基。经试验验证，前述筛选培养基原料配方内的任一浓度组合制备的筛选培养基均可筛选出本发明的GXAS137菌株。
3.、琥珀酸放线杆菌菌株的筛选：
（1）从南宁市某肉联厂新鲜牛胃中采样，将新鲜牛的瘤胃内容物悬浮于适量生理盐水中，用无菌纱布过滤去除粗纤维等固体物质；
（2）将过滤得到的悬浮液接种于含50-150ml制备好的富集培养基的250ml三角瓶中，37℃厌氧箱中培养（若无厌氧箱也可用血清瓶代替三角瓶）24h，厌氧箱通入N2:CO2:H2=85：10：5的混合气。
（3）按5%接种量转接2次后，，培养物按照梯度稀释后，涂布在分离培养基的平板上，厌氧箱培养30-48h，挑选菌落较大菌株于装有发酵培养基的试管中发酵，培养结束后；
（4）HPLC测定每个样品丁二酸含量，选出产丁二酸菌株357株，经过进一步三角瓶放大发酵复筛，筛选出18株丁二酸产量较高菌株，其中一株GXAS137遗传稳定性好（详见表1），丁二酸产量高，副产物较少，将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为CCTCC M 2011399。
HPLC测定：戴安Utimat3000，自动进样器，色谱柱：AminexHPX-87H 300×7.8mm，流动性5 mmol/LH2SO4，pH2.5，柱温45℃，进样量10uL，流速0.6mL/min，紫外检测器波长210nm。
表1 复筛后产丁二酸较高的菌株产酸及副产物情况
| 序号 | 菌株编号 | 丁二酸（g/L） | 乙酸（g/L） | 乳酸（g/L） | 序号 | 菌株编号 | 丁二酸（g/L） | 乙酸（g/L） | 乳酸（g/L） |
| 1 | 15 | 17.21 | 1.14 | 2.46 | 12 | 123 | 11.48 | 4.27 | 3.28 |
| 2 | 23 | 12.56 | 3.30 | 3.68 | 13 | 131 | 7.57 | 8.36 | 4.71 |
| 3 | 24 | 5.34 | 3.69 | 8.99 | 14 | 137 | 26.45 | 2.12 | 0.15 |
| 4 | 33 | 6.86 | 4.27 | 6.32 | 15 | 146 | 16.31 | 4.25 | 1.05 |
| 5 | 65 | 7.58 | 5.55 | 4.48 | 16 | 205 | 11.96 | 5.37 | 3.46 |
| 6 | 67 | 16.02 | 2.68 | 1.67 | 17 | 223 | 8.65 | 6.45 | 2.13 |
| 7 | 73 | 14.67 | 4.12 | 2.45 | 18 | 265 | 17.32 | 2.43 | 0.38 |
| 8 | 82 | 4.28 | 6.57 | 6.97 | 19 | 301 | 10.14 | 5.24 | 0.77 |
| 9 | 91 | 15.19 | 3.26 | 1.03 | 20 | 320 | 7.99 | 4.38 | 3.89 |
| 10 | 104 | 13.26 | 5.17 | 0.64 | 21 | 345 | 6.58 | 3.98 | 2.57 |
| 11 | 110 | 17.18 | 2.64 | 0.35 |
4、琥珀酸放线杆菌菌株的鉴定：
将经过上述筛选到的菌株（在此命名为GXAS137）进行16S rDNA基因序列测定和生理生化鉴定，结果如下：
（1）经过对GXAS137菌株的16S rDNA（附图1）基因序列比对，与Actinobacillus succinogenes 130Z的序列同源性最高，为94%。具体DNA基因序列为：
0001 ATTGAAGAGT TTGATCATGA CTCAGATTGA CGATAACGAG TGAAAAGCTT GCTATCCATG
0061 CTGAAGAGTG GCGAACGAGT GAGTAATGCT TGAGAATCTG GCTTATGAAG GAGAATAACG
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1081 TGTTGAGTTA AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTTATCCTT TGTTGCCAGC ATGTAGAGAT
1141 GAGAACTCAA AGAAGAATGC CGATGATAAA CCGAAGAAAG GTGAGAATGA CGTCAAGTCA
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1261 ATGAGAACTC AAAGAAGAAT GCCGATGATA AACCGAAGAA AGATGAGAAT GAAGTCAAGT
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1441 ATCGAATCCA TGAAGTCGAA ATCGCTAGTA ATCGCGAATC AGCATGTCGC AGTTCTATCG
1501 ATGATGAGAA AGAAGAATGT TAACAGCTTA TTCGATTGAA GTTAGCCAAA
（2）GXAS137菌株为革兰氏阴性菌，兼性厌氧菌，细胞成杆状或球杆状（附图2），不运动，无芽孢，也不产生孢子。生长温度为20-40 ℃，最适35-38℃，生长pH4.5-8.0，最适6.5-7.5。
（3）GXAS137菌株可以发酵以下底物产酸：葡萄糖，蔗糖，果糖，麦芽糖，D-木糖，乳糖，果糖，甘露糖，D-阿拉伯糖，甘露醇，D-山梨醇等糖类或醇类，以及糖质原料如甘蔗汁、甜菜汁、糖蜜等和淀粉质及纤维素原料的水解液。
（4）GXAS137菌株的代谢产物：该菌代谢产物以丁二酸为主，其他副产物由乙酸、甲酸、乳酸、丙酮酸、苹果酸和富马酸。当提供较高CO2时，菌体生产较快，丁二酸快速积累，其他副产物较少。
5、运用产琥珀放线杆菌菌株发酵产丁二酸的方法，其步骤如下
（1）种子培养基制备：将如下浓度的成分和混合，即可得到种子培养基：糖类10-20 g/L，酵母粉5-10 g/L，蛋白胨5-10 g/L， K2HPO4 1-5 g/L，CaCl2 0.5-1 g/L，NaCl 0.5-2 g/L，(NH4)2SO4 0.5-2 g/L，MgCl2 0.5-1 g/L，碱式碳酸镁10-20 g/L。
（2）发酵培养基制备：将如下浓度的成分和混合，即可得到发酵培养基：糖类40-100 g/L，氮源 10-40 g/L， K2HPO4 1-5 g/L，CaCl2 0.5-1 g/L，NaCl 0.5-2 g/L，(NH4)2SO4 0.5-2 g/L，MgCl2 0.5-1 g/L。
上述的糖类包括：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖，甘蔗、甜菜、糖蜜中所含的糖；木薯、玉米、甘薯淀粉质原料水解释放出的糖；纤维素的水解物中的一种或多种的组合；上述所述的氮源包括有机氮源和无机氮源；有机氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米浆、豆饼粉，无机氮源包括尿素、硫酸铵。
（3）发酵生产丁二酸
将产琥珀放线杆菌菌株接入种子培养基中，在厌氧培养箱或普通培养箱中30-38℃静止培养24-36h，按1-10%的接种量接入发酵培养基中，调节pH在6.0-7.0，并在30-38℃发酵24-70h，最高可产70g/L的丁二酸。若采用碳酸盐调节发酵pH值，可以在有氧或通入N2或CO2的条件下发酵，优选方案为碱式碳酸镁调节pH，通入CO2；如采用氨水、NaOH等碱性调节，必须通入CO2。
厌氧箱培养条件：厌氧箱（Don Whitley Scientific DG250 anaerobic workstation ），混合气N2：CO2：H2=8.5：1.0：0.5，温度37℃.
丁二酸及副产物测定方法（HPLC测定HPLC测定）：戴安Utimat3000，自动进样器，色谱柱：AminexHPX-87H 300×7.8mm，流动性5 mmol/LH2SO4，pH2.5，柱温45℃，进样量10uL，流速0.6mL/min，紫外检测器波长210nm。
实施例2
按照实施例1中产琥珀放线杆菌菌株发酵产丁二酸的方法，将保藏编号CCTCC M 2011399的菌株的平板在厌氧箱培养48h后，用接种环接一环至30mL种子培养基中，37℃培养20h，按照5%接种量接入不同碳源（以葡萄糖计的含量为65 g/L）的发酵培养基（250mL三角瓶，装液量为150mL），静止培养48h，采用HPLC测定丁二酸及主要副产物含量，结果见表2.
表2 不同碳源对CCTCC M 2011399产丁二酸影响
| 碳源 | 丁二酸含量（g/L） | 乙酸含量（g/L） | 乳酸含量（g/L） |
| 葡萄糖 | 47.98 | 10.68 | 1.63 |
| 蔗糖 | 50.31 | 8.36 | 0.91 |
| 果糖 | 40.34 | 9.27 | 1.39 |
| 麦芽糖 | 49.67 | 10.83 | 1.50 |
| 阿拉伯糖 | 54.76 | 7.24 | 1.37 |
| 木糖 | 41.13 | 7.23 | 0 |
| 甘露醇 | 52.33 | 9.05 | 0 |
| 山梨醇 | 50.08 | 8.27 | 0 |
由表2可以看出：以阿拉伯糖为碳源时，丁二酸产量较高，可达54.76g/L，对糖的利用率84.25%,而且副产物较少。
实施例3
按照实施例1中产琥珀放线杆菌菌株发酵产丁二酸的方法，将保藏编号CCTCC M 2011399的菌株的平板在厌氧箱培养48h后，用接种环接一环至30mL种子培养基，37℃培养20h，按照5%接种量接入不同原料（以葡萄糖计的含量为75 g/L）的发酵培养基（250mL三角瓶，装液量为150mL），静止培养48h，采用HPLC测定丁二酸及主要副产物含量，结果见表3.
表3 不同原料对CCTCC M 2011399产丁二酸影响
| 碳源 | 丁二酸含量（g/L） | 乙酸含量（g/L） | 乳酸酸含量（g/L） |
| 木薯粉 | 70.17 | 10.77 | 1.46 |
| 玉米粉 | 53.81 | 12.34 | 2.01 |
| 甘蔗糖蜜 | 49.37 | 7.26 | 1.17 |
| 甘蔗汁 | 58.67 | 8.91 | 1.64 |
由表3可以看出：以木薯粉为碳源时，丁二酸产量最高，可达69.17g/L,糖的利用率为92.22%。
实施例4
按照实施例1中产琥珀放线杆菌菌株发酵产丁二酸的方法，1L发酵罐培养时培养基装液量为700 mL，通入100% CO2，通气量为0.2 mL/min，发酵温度为37℃，将保藏编号CCTCC M 2011399的菌株在发酵罐培养48h后，用接种环接一环至50mL种子培养基中，37℃培养20h，按照5%接种量接入不同pH缓冲剂的发酵培养基（碳源为葡萄糖，浓度为75 g/L），同期培养48h，采用HPLC测定丁二酸及主要副产物含量，结果见表4。
表4 不同pH缓冲剂对CCTCC M 2011399产丁二酸影响
| 缓冲剂 | 丁二酸含量（g/L） | 乙酸含量（g/L） | 乳酸酸含量（g/L） |
| 碱式碳酸镁 | 64.53 | 10.41 | 1.73 |
| 碳酸钠 | 57.31 | 11.07 | 1.42 |
| 氢氧化钠 | 43.14 | 9.53 | 1.99 |
| 氨水 | 29.11 | 7.32 | 1.83 |
由表4可知：以碱式碳酸镁为pH缓冲剂时，丁二酸产量最高，可达64.53 g/L。这是因为添加碱式碳酸镁固体，能够将pH维持在适宜的水平，而且在丁二酸合成途径中的关键酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PEPCK）的激活剂是Mg2+，因此，菌体在发酵过程中表现出较高的代谢活性从而产生更多的代谢产物。
Claims (9)
1.一种发酵产丁二酸的微生物菌株，其分类属巴斯德菌科（pasteurellaceae）放线杆菌属（Actinobacillus）的产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）GXAS-137，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为CCTCC M 2011399。
2.一种权利要求1所述的产琥珀酸放线杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：将新鲜牛的瘤胃内容物悬浮于适量生理盐水中，用无菌纱布过滤去除固体物质，将过滤得到的悬浮液接种于富集培养基中，30-37℃厌氧培养16-30h，转接2次后，培养物按照梯度稀释后，涂布在含筛选培养基的平板上，厌氧培养30-48h，挑选菌落较大菌株于发酵培养基中，培养结束后，HPLC测定每个样品丁二酸含量，选取丁二酸浓度大于10g/L菌株进行复筛，选取复筛后丁二酸产量高、副产物少的菌株，即可得到权利要求1所述的产琥珀酸放线杆菌菌株。
3.根据权利要求2所述的产琥珀酸放线杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：所述的富集培养基为含有富马酸盐作为唯一碳源并添加氮源、无机盐和莫能菌素的培养基，详细配方如下：富马酸钠10-30g/L，酵母粉5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，K2HPO41-5g/L，CaCl20.1-1g/L，NaCl 0.5-2g/L，(NH4)2SO40.5-2gL，MgCl20.1-1g/L，莫能菌素0.1-0.2g/L，将前述原料混匀即可得到富集培养基。
4.根据权利要求2所述的产琥珀酸放线杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：所述的筛选培养基为在富集培养基基础上添加30-100g/L丁二酸钠，平板培养时加入15-20g/L琼脂粉。
5.一种运用权利要求1所述产琥珀酸放线杆菌菌株发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：将产琥珀酸放线杆菌菌株接入种子培养基中，在厌氧培养箱或普通培养箱中30-38℃静止培养24-36h，按1-10%的接种量接入发酵培养基中，调节pH在6.0-7.0，并在30-38℃发酵24-70h，即可产生丁二酸，所述的pH调节剂是碳酸盐、氨水、NaOH，所述的碳酸盐为碱式碳酸镁，所述发酵的条件为有氧或通入N2或CO2。
6.根据权利要求5所述产琥珀酸放线杆菌菌株发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：所述的种子培养基的成分及其浓度为：糖类10-20g/L，酵母粉5-10g/L，蛋白胨5-10g/L，K2HPO41-5g/L，CaCl20.5-1g/L，NaCl 0.5-2g/L，(NH4)2SO40.5-2g/L，MgCl20.5-1g/L，碱式碳酸镁10-20g/L。
7.根据权利要求6所述产琥珀酸放线杆菌菌株发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：所述的发酵培养基的成分及其浓度为：糖类40-100g/L，氮源10-40g/L，K2HPO41-5g/L，CaCl20.5-1g/L，NaCl 0.5-2g/L，(NH4)2SO40.5-2g/L，MgCl20.5-1g/L。
8.根据权利要求6或7所述产琥珀酸放线杆菌菌株发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：所述的糖类包括：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖，甘蔗、甜菜、糖蜜中所含的糖； 木薯、玉米、甘薯淀粉质原料水解释放出的糖；纤维素的水解物中的一种或多种的组合。
9.根据权利要求6或7所述产琥珀酸放线杆菌菌株发酵生产丁二酸的方法，其特征在于：所述的氮源包括有机氮源和无机氮源；所述的有机氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米浆和豆饼粉，所述的无机氮源包括尿素、硫酸铵。
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