CN112574925A - 一株耐受糠醛的产琥珀酸放线杆菌gxas-137fm及其选育方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一株耐受糠醛的产琥珀酸放线杆菌GXAS‑137FM及其选育方法与应用。本发明利用产琥珀酸放线杆菌GXAS137作为初发菌株，通过生物驯化的方法得到了一株能够耐受1.6g/L糠醛浓度的菌株GXAS‑137FM。此菌株可以用于工业大规模生产丁二酸，并且无污染、成本低。

Description

一株耐受糠醛的产琥珀酸放线杆菌GXAS-137FM及其选育方法 与应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一株耐受糠醛的产琥珀酸放线杆菌GXAS-137FM及其选育方法与应用。
背景技术
丁二酸(succinic acid)是一种重要的C4平台化合物，在美国能源部2004 年公布的十二种最有潜力可以从生物质法生产的大宗化学品中，丁二酸排在其中的第一位，广泛应用于化工、食品、医药等领域，还可以用于合成生物降解塑料，如聚丁二醇丁二酸酯(PBS)、聚乙二醇丁二酸酯(PES)、聚丙二醇丁二酸酯(PPS)及PBS与己二酸共聚的PBSA等。
目前，商品化的丁二酸主要以石油等资源为原料由化学法合成，但存在成本高、污染严重等一系列问题，严重抑制了其发展的潜力。与化学合成法相比，微生物发酵法具有以下优点：(1)原料价格低廉、为可再生的生物质资源；(2)发酵过程中可吸收大量CO2，绿色环保；(3)发酵条件温和。因此，微生物发酵法生产丁二酸以其具有节约大量的石油资源并且可以降低由石化方法产生的污染等优点，而受到广泛关注，成为国内外研究的热点。
2011年全球丁二酸的市场达约4万吨，其中97％的丁二酸来源于石油基原料，而生物基丁二酸仅占3％。在丁二酸发酵生产制备的过程中，原料成本占有极其重的比例，原料价格的波动将直接影响生物基丁二酸与化学基丁二酸的竞争，已成为限制中国生物化工产业发展的瓶颈。
木质纤维素为世界最大的可再生资源，对其开发利用已成为近30年来世界各国的研究重点和热点，可以将其中的纤维素(由葡萄糖构成)和半纤维素(主要由木糖构成)转化为单糖，再通过生物转化以满足人类社会今后对生物基化学品丁二酸的需求，是提高现代生物炼制经济可行的潜在途径。
虽然已有较多关于琥珀酸放线杆菌利用木质纤维素的报道，但主要集中在原料的预处理，脱毒和发酵工艺优化方面。木质纤维素在转化成糖化液的过程中，必须经过一定的预处理，从而导致水解液中含有一定量的发酵抑制物(呋喃类、弱酸类、酚类等)。呋喃醛类抑制物主要指糠醛和5-羟甲基糠醛(HMF)，二者分别来自于预处理过程中戊糖和己糖的过度降解(脱水反应)，与其他抑制物相比，呋喃醛类抑制物含量较高、毒性较强，且能够与其他抑制物形成协同抑制作用，是近年来抑制物研究的热点，高的硫醇活性使得糠醛比HMF具有更强的毒性，会影响细胞糖酵解及生物合成途径关键酶的活性，破坏细胞膜组分及通透性，抑制细胞生长。有研究显示，糠醛浓度较高时，细胞在无氧条件下会出现大量的死亡，对后续的微生物发酵过程有非常严重的抑制作用。黄秀梅等利用活性炭和Ca(OH)2去除玉米秸秆水解液中的发酵抑制物(糠醛及羟甲基糠醛)，再用A.succinogenes进行发酵，结果发现脱毒后发酵的丁二酸产量达到66.23g/L，比未脱毒的提高了24.81 g/L，虽然脱毒一定程度能减缓对发酵微生物的抑制作用，但操作繁琐，成本高，不利于工业化生产，另外，有些脱毒过程还会污染环境。因此，增加发酵微生物的糠醛抗逆性和在胁迫环境下的生产效率极为必要，对木质纤维高效转化丁二酸具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株耐受糠醛的产琥珀酸放线杆菌 GXAS-137FM及其选育方法与应用。本发明耐受糠醛的产琥珀酸放线杆菌用于产丁二酸中对环境无污染，并且能够提高丁二酸的生产效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株耐受糠醛的产琥珀酸放线杆菌GXAS-137FM，所述 GXAS-137FM分类为Actinobacillus succinogenes，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学保藏中心，保藏日期为2020年11月5日，保藏编号为CCTCC NO.M 2020617。
本发明还提供了一种所述的GXAS-137FM的选育方法，将初发菌株接种到糠醛发酵培养基中驯化得到。
作为优选，所述初发菌株为产琥珀酸放线杆菌GXAS137，拉丁文为Actinobacillussuccinogenes，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学保藏中心，保藏日期为2011年11月18日，保藏编号为CCTCC NO. M2011399。
作为优选，所述接种为按v/v的8～15％的接种量进行接种。
作为优选，所述糠醛发酵培养基中糠醛的浓度≤1.6g/L。
作为优选，所述糠醛发酵培养基还包括以下质量体积比的组分：葡萄糖 35～45g/L，木糖15～25g/L，酵母提取物8～12g/L，玉米浆8～12g/L，碳酸氢钠2～10g/L，磷酸二氢钾2～10g/L，氯化钙0.3～1.0g/L，氯化镁0.3～1.0g/L，碱式MgCO340～60g/L。
作为优选，所述糠醛发酵培养基的pH值为6.5～7.0。
作为优选，所述发酵培养的转速为100～200r/min，温度为30～38℃，发酵时间为0～72h。
作为优选，所述驯化为按照糠醛发酵培养基中糠醛的浓度从低浓度到高浓度依次进行驯化培养，每个浓度驯化3～5次。
本发明还提供了一种所述的GXAS-137FM在琥珀酸生产中的应用。
本发明提供的一株耐受糠醛的产琥珀酸放线杆菌GXAS-137FM及其筛选方法与应用的技术方案具有如下优点：
(1)本发明通过在发酵培养基中添加糠醛抑制剂，筛选到一株可耐 1.6g/L糠醛的产琥珀酸放线杆菌菌株GXAS-137FM，具有工业化应用的潜力。
(2)该菌株可利用自然界中丰富的纤维素资源发酵生产丁二酸，保证原料可持续，有助于降低生产成本及对化石资源的依赖，解决环境污染问题，经济效益和社会效益都非常显著。
附图说明
图1为不同糠醛浓度下GXAS137菌体的生物量。
图2为不同糠醛浓度下GXAS137菌产丁二酸的量。
图3为不同糠醛浓度下GXAS-137FM菌体的生物量及产丁二酸的量。
具体实施方式
本发明提供了一株耐受糠醛的产琥珀酸放线杆菌GXAS-137FM，所述 GXAS-137FM分类为Actinobacillus succinogenes，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学保藏中心，保藏日期为2020年11月5日，保藏编号为CCTCC NO.M 2020617。
本发明还提供了一种所述的GXAS-137FM的选育方法，将初发菌株接种到糠醛发酵培养基中驯化得到。
在本发明中，所述初发菌株为产琥珀酸放线杆菌GXAS137，拉丁文为Actinobacillus succinogenes，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学保藏中心，保藏日期为2011年11月18日，保藏编号为CCTCC NO. M2011399。
在本发明中，所述接种的初发菌株经过种子培养后再进行接种发酵。
(1)在本发明中，所述接种的初发菌株种子培养为将初发菌株接入种子培养基中，培养得到。
在本发明中，所述种子培养基包括质量体积比为15～25g/L的葡萄糖，优选为20g/L。
在本发明中，所述种子培养基包括质量体积比为8～12g/L的酵母粉，优选为10g/L。
在本发明中，所述种子培养基包括质量体积比为3～7g/L的玉米浆，优选为5g/L。
在本发明中，所述种子培养基包括质量体积比为1～3g/L的碳酸氢钠，优选为2g/L。
在本发明中，所述种子培养基包括质量体积比为7～11g/L的磷酸二氢钠，优选为9g/L。
在本发明中，所述种子培养基包括质量体积比为14～17g/L的磷酸氢钾，优选为15.5g/L。
在本发明中，所述培养为在厌氧培养箱或普通培养箱中培养。
在本发明中，所述培养温度为36～38℃，优选为37℃。
在本发明中，所述培养时间为16～20h，优选为18h。
在本发明中，所述培养得到的种子液的菌数≧3亿。
在本发明中，所述接种为按v/v的8～15％的接种量进行接种，优选为 10～13％的接种量，进一步优选为12％的接种量。
在本发明中，所述糠醛发酵培养基中糠醛的浓度≤1.6g/L。
在本发明中，所述糠醛发酵培养基还包括质量体积比为35～45g/L的葡萄糖，优选为40g/L。
在本发明中，所述糠醛发酵培养基还包括质量体积比为15～25g/L的木糖，优选为20g/L。
在本发明中，所述糠醛发酵培养基还包括质量体积比为8～12g/L的酵母提取物，优选为10g/L。
在本发明中，所述糠醛发酵培养基还包括质量体积比为8～12g/L的玉米浆，优选为10g/L。
在本发明中，所述糠醛发酵培养基还包括质量体积比为2～10g/L的碳酸氢钠，优选为4～8g/L，进一步优选为6g/L。
在本发明中，所述糠醛发酵培养基还包括质量体积比为2～10g/L的磷酸二氢钾，优选为4～8g/L，进一步优选为6g/L。
在本发明中，所述糠醛发酵培养基还包括质量体积比为0.3～1.0g/L的氯化钙，优选为0.5～0.8g/L，进一步优选为0.7g/L。
在本发明中，所述糠醛发酵培养基还包括质量体积比为0.3～1.0g/L的氯化镁，优选为0.5～0.8g/L，进一步优选为0.7g/L。
在本发明中，所述糠醛发酵培养基还包括质量体积比为40～60g/L的碱式MgCO3，优选为45～55g/L，进一步优选为50g/L。
在本发明中，所述糠醛发酵培养基的pH值为6.5～7.0，优选为pH值为 6.8。
在本发明中，所述糠醛发酵培养基为经过过滤除菌的发酵培养基。
在本发明中，所述发酵培养的转速为100～200r/min，优选为150r/min。
在本发明中，所述发酵温度为30～38℃，优选为32～36℃，进一步优选为34℃。
在本发明中，所述发酵时间为0～72h，优选为24～48h，进一步优选为 36h。
在本发明中，所述驯化为按照糠醛发酵培养基中糠醛的浓度从低浓度到高浓度依次进行驯化培养，每个浓度驯化3～5次，优选为4次。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将产琥珀酸放线杆菌GXAS137单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中37℃培养18h，菌数达到3.5亿，按照5％(V/V)接种量进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿，即得接种的初发菌株；按10％(V/V)的接种量将初发菌株接种到含有0g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L的糠醛发酵培养基中。利用碱式碳酸镁调节发酵培养基的pH至6.8，并在转速为110r/min、 36℃发酵72h。分别在16h、18h、22h、38h、44h、60h和72h，取样，测定不同糠醛浓度发酵培养基中GXAS137菌体的生物量以及丁二酸的浓度。菌体生物量结果见图1；丁二酸浓度见图2。
所述发酵培养基中菌体生物量测定采用可见光/紫外分光光度计(DU800 UV/VISSpectrophotometer，Beckman，USA)，样品先用0.2M HCl进行预处理，溶解所含的碱式碳酸镁，然后12000r/min离心10min，再用蒸馏水洗涤去除所含的色素和杂质。所述发酵培养基中丁二酸浓度的测定采用戴安 Utimat3000，自动进样器，色谱柱：Rezex ROA-OrganicAcid H+(8％) 300×7.8mm，流动相pH2.5，5mmol/LH2SO4，柱温50℃，进样量10uL，流速0.6mL/min，紫外检测器波长210nm。
由图1、图2可以看出，当发酵培养基中糠醛浓度达到0.8g/L时， GXAS137菌体增长明显迟滞，发酵60h，菌体生长浓度比0g/L菌株下降了 75.4％，菌株的丁二酸产量只有5.32g/L。当糠醛浓度增加到1.0g/L时，菌体生长已完全被抑制，培养基中也检测不到丁二酸，说明此时的菌体既不生长，也不产酸，停止代谢活动。
实施例2
产琥珀酸放线杆菌GXAS137单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中36℃培养18h，菌数达3.6亿。按照8％(V/V)接种量转接到含糠醛的发酵培养基中进行驯化，当生长繁殖至稳定期时，依次按照发酵培养基含糠醛1.0 g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L的浓度递增进行下一轮的驯化，重复进行实验，获得较好的糠醛耐受性菌株Actinobacillussuccinogenes GXAS-137FM。
实施例3
将实施例2获得的GXAS-137FM接入种子培养基中，在厌氧培养箱中38℃培养20h，菌数达4亿，再按照5％(V/V)接种量进行二级扩繁培养10h，菌数达3.4亿后，按12％(V/V)的接种量分别接种到加入1.0g/L、1.2g/L、 1.4g/L和1.6g/L的糠醛发酵培养基中进行发酵，发酵条件见实施例1，发酵时间为48h，发酵结束后，按实施例1的测定方法测定发酵培养基中菌体的生物量以及丁二酸的含量。结果见图3。
由图3可知：GXAS-137FM菌株在1.2g/L、1.4g/L和1.6g/L糠醛浓度的发酵培养基下，都有生长，在1.2g/L糠醛浓度条件下，生长至稳定期时，丁二酸的产量达到38.16g/L，在1.4g/L糠醛浓度条件下生长至稳定期时，菌体生长浓度OD600可达约1.96，丁二酸的浓度达到37.35g/L，表明驯化后菌株的糠醛耐受性及发酵丁二酸的能力得到提高。
由以上实施例可知，本发明提供了一株耐受糠醛的产琥珀酸放线杆菌 GXAS-137FM及其选育方法与应用。本发明通过在发酵培养基中添加糠醛抑制剂，选育到一株可耐1.6g/L糠醛的产琥珀酸放线杆菌菌株GXAS-137FM，具有工业化应用的潜力。该菌株可利用自然界中丰富的纤维素资源发酵生产丁二酸，保证原料可持续，有助于降低生产成本及对化石资源的依赖，解决环境污染问题，经济效益和社会效益都非常显著。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株耐受糠醛的产琥珀酸放线杆菌GXAS-137FM，其特征在于，所述GXAS-137FM分类为Actinobacillus succinogenes，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学保藏中心，保藏日期为2020年11月5日，保藏编号为CCTCC NO.M 2020617。
2.一种权利要求1所述的GXAS-137FM的选育方法，其特征在于，将初发菌株接种到糠醛发酵培养基中驯化得到。
3.根据权利要求2所述的选育方法，其特征在于，所述初发菌株为产琥珀酸放线杆菌GXAS137，拉丁文为Actinobacillus succinogenes，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学保藏中心，保藏日期为2011年11月18日，保藏编号为CCTCC NO.M2011399。
4.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于，所述接种为按v/v的8～15％的接种量进行接种。
5.根据权利要求4所述的选育方法，其特征在于，所述糠醛发酵培养基中糠醛的浓度≤1.6g/L。
6.根据权利要求5所述的选育方法，其特征在于，所述糠醛发酵培养基还包括以下质量体积比的组分：葡萄糖35～45g/L，木糖15～25g/L，酵母提取物8～12g/L，玉米浆8～12g/L，碳酸氢钠2～10g/L，磷酸二氢钾2～10g/L，氯化钙0.3～1.0g/L，氯化镁0.3～1.0g/L，碱式MgCO3 40～60g/L。
7.根据权利要求6所述的选育方法，其特征在于，所述糠醛发酵培养基的pH值为6.5～7.0。
8.根据权利要求7所述的选育方法，其特征在于，所述发酵培养的转速为100～200r/min，温度为30～38℃，发酵时间为0～72h。
9.根据权利要求2～8任意一项所述的选育方法，其特征在于，所述驯化为按照糠醛发酵培养基中糠醛的浓度从低浓度到高浓度依次进行驯化培养，每个浓度驯化3～5次。
10.一种权利要求1所述的GXAS-137FM在琥珀酸生产中的应用。
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