CN106995794A - 一种提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株及其构建方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株及其构建方法，包括：构建表达载体的构建、重组质粒以及产琥珀酸放线杆菌工程菌株的构建。本发明通过对产琥珀酸放线杆菌出发菌株，串联过量表达编码产琥珀酸放线杆菌产丁二酸过程的关键限速酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)及提高体内还原力水平的6‑磷酸葡萄糖激酶(G6PDH)的基因pepck及基因zwf，获得工程菌Actinobacillus succinogenes PZ，提高丁二酸产量，具有工业化生产应用的潜力。
Description
技术领域
本发明生物工程属于领域，具体涉及一种提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株及其构建方法与用途。
背景技术
丁二酸是许多严格厌氧菌和兼性厌氧菌代谢的重要中间产物。目前人们已经发现多种微生物可以通过发酵来生产琥珀酸，其中研究主要集中在产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)和大肠杆菌(E.coli)。此外，曼海姆产琥珀酸菌(Mannheimia succiniciproducens)，产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)和一些乳酸菌、丙酸产生菌及真菌等也可以产生少量的丁二酸。在众多的产琥珀酸的微生物中，产琥珀酸放线杆菌能够利用多种碳源(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖等)进行发酵，并且可以耐受葡萄糖和丁二酸的浓度分别高达158g/L和104g/L。因此，该菌以丁二酸产量高、耐受性强等优点，成为目前丁二酸最具工业化潜力的生产菌株之一。
目前，国内外对产琥珀酸放线杆菌发酵产丁二酸进行了一系列研究。中国专利ZL201210056568.6，ZL 201210122717.4等报道了产琥珀酸放线杆菌选育的方法，但丁二酸的发酵水平仅能达到30g/L左右，不能满足工业化生产的需要；中国专利ZL 201180011827.7，ZL 200910080815.4等对原料及发酵方法进行了研究，但其所用方法为随机筛选，工作量大且结果无法预测。
发明内容
有鉴于此，本发明的第一目的在于提供一种提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株(产琥珀酸放线杆菌PZ Actinobacillus succinogenes PZ)，保藏编号为CCTCCNO:M 2016396，保藏日期为2016年7月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
优选地，本发明所述的产琥珀酸放线杆菌工程菌株包含来自产琥珀酸放线杆菌的pepck基因及来源于大肠杆菌的zwf基因；更优选地，所述来自产琥珀酸放线杆菌的pepck基因及来源于大肠杆菌的zwf基因为串联表达。
本发明的另一目的在于提供一种提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
1)、表达载体的构建：PGZRS-18质粒的基础上添加pepck基因的启动子和大肠杆菌的ColE1复制子基因，构建适合产琥珀酸放线杆菌进行基因过量表达的载体PGZRS-E；
2)、重组质粒的构建：将pepck基因及zwf基因串联克隆至表达载体PGZRS-E，获得重组质粒pGZRS-pepck-zwf；
3)产琥珀酸放线杆菌工程菌株的构建：将重组质粒转化产琥珀酸放线杆菌，筛选阳性克隆细胞获得产琥珀酸放线杆菌工程菌株。
优选地，本发明所述提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株的构建方法中，所述步骤2)中所述pepck基因与所述zwf基因为化学合成获得；更优选地，所述步骤2)中所述pepck基因与所述zwf基因为PCR扩增获得。
本发明所述提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株的构建方法中，所述步骤3)中重组质粒转化产琥珀酸放线杆菌的方法可以为本领域中已知的基因转化方法；优选地，本发明所述提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株的构建方法中，所述步骤3)中重组质粒转化产琥珀酸放线杆菌的方法为电转化。
本发明还提供了上述方法制备获得的表达载体与重组质粒。
本发明的另一方面是提供上述产琥珀酸放线杆菌工程菌株在丁二酸发酵中的应用，包括将产琥珀酸放线杆菌工程菌株CCTCC M 2016397，接种发酵生产丁二酸。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)现有技术中产琥珀酸放线杆菌高产丁二酸的方法多使用随机诱变筛选的方法，一方面工作量大，筛选结果难以控制；另一方面，对产琥珀酸放线杆菌高产丁二酸的代谢途径无法准确控制，导致碳源转化率不高；
本发明通过对产琥珀酸放线杆菌GXAS137出发菌株，串联过量表达编码产琥珀酸放线杆菌产丁二酸过程的关键限速酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)及提高体内还原力水平的6-磷酸葡萄糖激酶(G6PDH)的基因pepck及基因zwf，获得工程菌Actinobacillus succinogenes PZ，提高了限速酶的活性，增加细胞内的还原了水平，从而减弱丁二酸合成途径中的限速步骤，增加碳代谢在C4支路的分配，从而达到了提高丁二酸产量的目的。
2)本发明构建的产琥珀酸放线杆菌的表达载体、重组质粒可以适合其他高产出发菌株的构建，可以对已有高产菌株进行有目的再次基因工程改造，具有工业化生产应用的潜力。
说明书附图
图1为本发明的一个实施例中表达载体与重组质粒的构建过程示意图；
图2为本发明的一个实施例中表达载体pGZRS-E与原始载体pGZRS-18XbaI单酶切产物电泳分析图；
图3为本发明的一个实例中利用重叠PCR获得pepck-zwf基因片段电泳图
图4为本发明的一个实施例中重组质粒pGZRS-pepck-zwf的XbaI和SacI双酶切产物电泳图；
图5为工程菌株PZ与对照菌株GXAS37的相关酶活分析图；
图6为重组菌株GXAS137-pepck-zwf与对照菌株的发酵结果图。
具体实施方式
在本发明的一个实施例中，提供了产琥珀酸放线杆菌工程菌株Actinobacillussuccinogenes PZ，保藏编号为CCTCC NO M 2016396，保藏日期为2016年7月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。所述的产琥珀酸放线杆菌工程菌株包含来自产琥珀酸放线杆菌的pepck基因及来源于大肠杆菌的zwf基因；更优选地，所述来自产琥珀酸放线杆菌的pepck基因及来源于大肠杆菌的zwf基因为串联表达。
在本发明的另一个实施例中提供了提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
1)、表达载体的构建：PGZRS-18质粒的基础上添加pepck基因的启动子和大肠杆菌的ColE1复制子基因，构建适合产琥珀酸放线杆菌进行基因过量表达的载体PGZRS-E；
2)、重组质粒的构建：将pepck基因及zwf基因串联克隆至表达载体PGZRS-E，获得重组质粒pGZRS-pepck-zwf；
3)产琥珀酸放线杆菌工程菌株的构建：将重组质粒转化产琥珀酸放线杆菌，筛选阳性克隆细胞获得产琥珀酸放线杆菌工程菌株。
优选地，在本发明的另一个实施例中，所述步骤2)中所述pepck基因与所述zwf基因为化学合成获得；更优选地，所述步骤2)中所述pepck基因与所述zwf基因为PCR扩增获得。
在本发明的实施例中，所述提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株的构建方法中，所述步骤3)中重组质粒转化产琥珀酸放线杆菌的方法可以为本领域中已知的基因转化方法；优选地，在本发明的一个实施例中，所述步骤3)中重组质粒转化产琥珀酸放线杆菌的方法为电转化。
本发明的另一个实施例还提供了上述方法制备获得的表达载体PGZRS-E与重组质粒pGZRS-pepck-zwf。
本实施例中产琥珀酸放线杆菌的发酵方法为：
将平板上的产琥珀酸放线杆菌单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中37℃培养16h，菌数达3亿以上，再按照5％(V/V)接种量进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；按5％(V/V)的接种量将液态种子接种到装有发酵培养基的250mL厌氧瓶中，装液量为150mL，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5-7.0，在充满N2的环境中，转速100r/min，温度为37℃，分批发酵30h，即得丁二酸。
所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。
所述发酵培养基的成分及浓度为：葡萄糖30-100g/L，氮源5-20g/L，磷酸二氢钾2g/L，碳酸氢钠2g/L，氯化钙0.3g/L，氯化镁0.3g/L。
所述发酵培养基的氮源为玉米浆和酵母粉以任意比例混合。
所述pH调节剂是碱式碳酸镁和碳酸钠以任意比例混合，浓度为30-100g/L。
本发明发酵液中产品分析方法：
样品处理：发酵液在室温下12000r/min，离心10min，取上清，然后用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤，用高效液相色谱(HPLC)检测发酵液丁二酸及残还原糖浓度。
有机酸测定：HPLC法，戴安Utimat3000，自动进样器，色谱柱：Rezex ROA-organicacid 300×7.8mm，流动相2.5mmol/L H2SO4，pH 2.5，柱温45℃，进样量10uL，流速0.6mL/min，紫外检测器波长210nm。
生物量测定：采用分光光度计(DU 800UV/VIS Spectrophotometer,Beckman,USA)在660nm进行测定，样品先用0.2M HCl进行处理，溶解所含的MgCO3，12000r/min离心10min，再用蒸馏水洗三次，以除去所含的色素及杂质。
相关酶活测定方法：主要参照相关试剂盒的说明书进行。
丁二酸产率(％)定义为：每消耗1g葡萄糖糖所产生丁二酸的克数。
丁二酸生产强度定义为：单位时间内可发酵生产丁二酸的浓度，单位为g/(L·h)。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1表达载体构建
如图1所示，在原始质粒PGZRS-18(哈尔滨兽医所王春来教授惠赠，图1A)的基础上添加pepck基因的启动子(克隆自产琥珀酸放线杆菌基因组，SEQ ID NO1所示序列，即tcgataaattgaaaatgcagcaatagaggaaacacggtttgtttgagtgaaaacagccgtgttttttcatttaccgccataaaaatttgaaacggatcacaaatcatgaaaaaaatacgttcaaattagaactaattatcgaaaatttgatctagttaacattttttaggtataaatagttttaaaatagatctagtttggatttttaattttaaattatcaatgaggtga)到载体PGZRS-18-pro(图1B)和大肠杆菌的ColE1复制子基因(克隆自pUC18载体GenBank:L08752.1)，构建适合产琥珀酸放线杆菌进行基因过量表达的载体PGZRS-E(图1C)。
表达载体pGZRS-E与原始载体pGZRS-18，使用XbaI单酶切产物电泳分析的结果如图2所示，其中M：λ/HindIII DNA分子量标记；1：表达载体pGZRS-E；2：pGZRS-18载体，结果显示：pepck基因的启动子和大肠杆菌的ColE1复制子基因已成功克隆至载体pGZRS-18。
实施例2表达基因获得及表达载体与转基因工程菌的构建
1)串联表达基因pepck基因(GenBank:EU253567.1)及zwf基因(GenBank:BA000007.2)为通过化学合成的方法合成获得(基因合成公司合成)；
2)串联表达基因也可通过重叠PCR方式获得。
引物如下：
P1：5’-GCGTCTAGAATGACTGACTTAAACAAACT-3’(SEQ ID NO 2)
P2：5’-TACCGCCATTGCGTTTGTCGTCTAGATGCTTTTGGACCG
GCGCCAAC-3’(SEQ ID NO3)
P3：5’-TTGGCGCCGGTCCAAAAGCAATGGCGGTAACGCAAAC
AGC-3’(SEQ ID NO 4)
P4：5’-TGCGAGCTCTTACTCAAACTCATTCCAGG-3’(SEQ ID NO 5)
PCR反应体系
PCR参数
结果如下：
(1)以引物P1、P2扩增pepck基因；P3、P4扩增zwf基因。
(2)利用产物纯化试剂盒对pepck、zwf基因PCR产物进行纯化。
(3)以pepck、zwf共同的模板，P1和P4为引物，扩增得到pepck+zwf基因，电泳结果如图3所示，其中，M1：λ/Hind III DNA分子量标记；M2：DL2000DNA分子量标记；1：zwf与pepck基因串联后的PCR产物。从图3可以看出：获得的PCR产物大小约为3.2Kb，符合两个基因串联大小，说明我们获得了pepck、zwf这两个基因串联的片段。
3)将来源于产琥珀酸放线杆菌的pepck基因及来源于大肠杆菌的zwf基因通过酶切、连接至实施例1获得的表达载体PGZRS-E，获得重组质粒pGZRS-pepck-zwf，进行双酶切验证。
如图4所示，对重组质粒pGZRS-pepck-zwf使用XbaI和SacI双酶切产物的电泳图，其中，M：λ/HindIII DNA分子量标记；1：pGZRS-E质粒；2：重组质粒pGZRS-pepck-zwf。
从图4可以看出：双酶切后出现3.2kb和5.4kb两个片段，与表达载体PGZRS-E及串联表达基因pepck-zwf大小一致，说明我们获得了将串联表达基因克隆至表达载体的重组质粒pGZRS-pepck-zwf。
4)电转化至产琥珀酸放线杆菌GXAS137(本实验室筛选得到，保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为CCTCC M 2011399，该菌株已申请国家发明专利CN201210017288.4)，利用抗性筛选获得工程菌株Actinobacillus succinogenes PZ。
电转化方法为：
(1)电转化条件：电压2500V、电阻400Ω、电容25μF。
(2)电击完成后立即加入0.5mL预冷的种子液，37℃静置培养1h，取适当体积涂布到含有抗性的筛选平板上培养，培养48h后，挑选筛选平板上长出的单菌落进行验证。
筛选培养基：在种子培养基平板上添加60ug/ml氨苄青霉素
实验结果：在筛选平板上共长出12个克隆，挑选单克隆于试管中进行液体培养16h(添加60ug/ml氨苄青霉素)，提取质粒验证全部正确，进行发酵试验，获得丁二酸产量最高的工程菌株，命名为Actinobacillus succinogenes PZ。
实施例3工程菌株相关酶活测定
将实施例2获得的工程菌株产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenesPZ)及对照菌株产琥珀酸放线杆菌GXAS137进行液体发酵培养：
将平板上的产琥珀酸放线杆菌单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中37℃培养16h，菌数达3亿以上，再按照5％(V/V)接种量进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；按5％(V/V)的接种量将液态种子接种到装有发酵培养基的250mL厌氧瓶中，装液量为150mL，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5-7.0，在充满N2的环境中，转速100r/min，温度为37℃，分批发酵30h，即得丁二酸。
所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO41.55g/L。
所述发酵培养基的成分及浓度为：葡萄糖30-100g/L，氮源5-20g/L，磷酸二氢钾2g/L，碳酸氢钠2g/L，氯化钙0.3g/L，氯化镁0.3g/L。
所述发酵培养基的氮源为玉米浆和酵母粉以任意比例混合。
所述pH调节剂是碱式碳酸镁和碳酸钠以任意比例混合，浓度为30-100g/L。
菌液离心收集菌体，超生破胞后制得粗酶液，按照相关酶活的测定方法对相关的磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK)、丙酮酸激酶(PK)、苹果酸脱氢酶(MDH)及葡萄糖-6-磷酸激酶(G6PDH)的酶活进行测定，结果如图5。
从图5可以看出：与对照菌株相比，工程菌株PZ的PEPCK及G6PDH的酶活力显著增加，分别提高了25.3％和34％，而PK、MDH及ADH酶活略有降低，但影响并不显著(p>0.05)。由此可知基因pepck及zwf在产琥珀酸放线杆菌体内得到过表达，且对代谢通路中的相关酶活产生了一定的影响。
实施例4工程菌株丁二酸发酵测定
将实施例2获得的工程菌株产琥珀酸放线杆菌PZ及对照菌株产琥珀酸放线杆菌GXAS37接种发酵，发酵条件见实施例3，初糖浓度为75g/L，发酵时间为48h，发酵结束后测定发酵产物及生物量，结果见图6。
由图6发酵结果可知：与对照菌株GXAS137丁二酸产量为49.4g/L相比，工程菌株产琥珀酸放线杆菌PZ丁二酸产量达到55.68g/L，产量增加约12.71％，但细胞生长受到一定的影响，细胞生物量下降10.7％，对副产物乙酸及甲酸的影响不显著(p>0.05)，对照菌株的丁二酸产率为65.87％，生产强度为1.03g/(L·h)；而工程菌株的丁二酸产率为74.24％，生产强度为1.16g/(L·h)。以上结果表明获得的工程菌株具有工业化应用的潜力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广西科学院
<120> 一种提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株及其构建方法与用途
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 231
<212> DNA
<213> Actinobacillus succinogenes
<400> 1
tcgataaatt gaaaatgcag caatagagga aacacggttt gtttgagtga aaacagccgt 60
gttttttcat ttaccgccat aaaaatttga aacggatcac aaatcatgaa aaaaatacgt 120
tcaaattaga actaattatc gaaaatttga tctagttaac attttttagg tataaatagt 180
tttaaaatag atctagtttg gatttttaat tttaaattat caatgaggtg a 231
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcgtctagaa tgactgactt aaacaaact 29
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taccgccatt gcgtttgtcg tctagatgct tttggaccgg cgccaac 47
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttggcgccgg tccaaaagca atggcggtaa cgcaaacagc 40
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgcgagctct tactcaaact cattccagg 29
Claims (10)
1.一种提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株，保藏编号为CCTCC NO:M2016396。
2.根据权利要求1所述的产琥珀酸放线杆菌工程菌株，其特征在于，所述产琥珀酸放线杆菌工程菌株包含来自产琥珀酸放线杆菌的pepck基因及来源于大肠杆菌的zwf基因。
3.根据权利要求1所述的产琥珀酸放线杆菌工程菌株，其特征在于，所述来自产琥珀酸放线杆菌的pepck基因及来源于大肠杆菌的zwf基因为串联表达。
4.一种提高丁二酸产量的产琥珀酸放线杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、表达载体的构建：PGZRS-18质粒的基础上添加pepck基因的启动子和大肠杆菌的ColE1复制子基因，构建适合产琥珀酸放线杆菌进行基因过量表达的载体PGZRS-E；
2)、重组质粒的构建：将pepck基因及zwf基因串联克隆至表达载体PGZRS-E，获得重组质粒pGZRS-pepck-zwf；
3)产琥珀酸放线杆菌工程菌株的构建：将重组质粒转化产琥珀酸放线杆菌，筛选阳性克隆细胞获得产琥珀酸放线杆菌工程菌株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中所述pepck基因与所述zwf基因为化学合成获得。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中所述pepck基因与所述zwf基因为PCR扩增获得。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中重组质粒转化产琥珀酸放线杆菌的方法为电转化。
8.一种根据权利要求4～6任意一项所述的方法制备获得的表达载体。
9.一种根据权利要求4～6任意一项所述的方法制备获得的重组质粒。
10.一种如权利要求1或2所述的产琥珀酸放线杆菌工程菌株在丁二酸发酵中的应用，其特征在于，所述应用将如权利要求1或2所述的产琥珀酸放线杆菌工程菌株，接种发酵生产丁二酸。
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| CN106995794B (zh) | 2020-09-18 |
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