CN111676252A - 一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法 - Google Patents

一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，该方法是在产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）利用不同碳源（葡萄糖、淀粉水解液、纤维素水解液）发酵丁二酸过程中添加一定量的亚硫酸氢钠，可显著降低副产物乙酸的生成。以葡萄糖为原料发酵丁二酸时，添加亚硫酸氢钠后乙酸产量由17.85 g/L降低至8.18 g/L，降幅高达54.17%。本发明的方法解决了微生物发酵产丁二酸过程中，副产物乙酸偏高的问题，降低了丁二酸分离纯化成本，有利于促进微生物发酵法生产丁二酸产业的发展。

Description

一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法
技术领域
本发明属于工业微生物发酵技术领域，特别涉及一种降低定儿孙发酵副产物乙酸生成的方法。
背景技术
丁二酸（Succinicacid），又称琥珀酸（butanedioic acid），是一种常见的天然有机酸，最初1546年由Georgius从琥珀中分离发现，因而得名。丁二酸的分子式为C4H6O4，分子量为118.09，味酸，相对密度为1.572，熔点为188℃，沸点235℃（分解温度）。
丁二酸是一种重要的C4平台化合物，是1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、N-甲基吡咯烷酮、己二酸等重要大宗化学品和专用化学品的基本原料，广泛应用于食品、塑料、医药、香料等工业，可以取代苯合成250种以上的化工产品。其中最具有发展前景的领域为合成塑料，它是合成聚丁二酸丁二醇酯（PBS）、聚乙二醇丁二酸酯（PES）、聚丙二醇丁二酸酯（PPS）等可生物降解高分子材料的主要原料。
目前，丁二酸的主要生产方法是以石油为原料化学法合成，不仅需要消耗大量不可再生的石化原料，生产成本较高，而且环境污染严重。
与化学合成法相比，微生物发酵法具有以下优点：（1）原料为价格低廉、可再生的生物质资源；（2）发酵过程中可吸收大量CO2，绿色环保；（3）发酵条件温和。因此，微生物发酵法近年来备受瞩目，成为近年来国内外的研究热点。
产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）因产量高、可利用多种碳源、耐受性强等优点，是目前最具潜力工业化生产的菌种之一。但目前制约A. succinogenes大规模生产丁二酸除生产成本高、分离纯化困难外，副产物乙酸（可占丁二酸产量的1/3左右）偏高也是制约因素之一，大量乙酸生成不仅降低丁二酸产量和原料利用率，而且增加了丁二酸后期分离纯化成本。因此，副产物乙酸偏高成为丁二酸微生物发酵法工业化生产的制约因素之一。
目前，为了降低副产物乙酸生成，通常采用理化诱变、代谢工程改造等手段选育优良菌株，或通过提高碳源浓度、增加CO2的通气量、添加中性红或H2做为电子载体等发酵工艺控制技术，使细胞内的碳源代谢通量更多流向产物丁二酸，也可以降低副产物乙酸的生成，但降低幅度往往有限，一般不超过20%。
发明内容
针对现有发酵生产丁二酸存在副产物乙酸产量高的缺陷，本发明提供一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，包括以下步骤：
（1）将平板上的产琥珀酸放线杆菌GXAS137单菌落接种至种子培养基中，于36～38℃下培养16～20h至菌数达3亿以上，得到扩大培养菌种；
（2）按照5%（V/V）接种量，将扩大培养菌种进行二级扩繁培养8h至菌数达3亿以上，即得到液态种子；
（3）按5～15%(V/V)的接种量，将液态种子接种到发酵培养基中，在接种后的0～12h添加0.05～2g/L的亚硫酸氢钠，利用pH缓冲剂调节发酵液的pH维持在6.5～7.0，然后在充满N2或CO2的环境中，于转速100～200r/min、温度为36～38℃条件下，分批发酵或分批补料发酵30～72h，得到含有丁二酸的发酵液，将发酵液分离纯化后即得到丁二酸。
本发明使用的菌株为产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）GXAS137，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2011399，保藏日期为2011年11月18日。
本发明在产琥珀酸放线杆菌发酵产丁二酸的过程中添加亚硫酸氢钠，使亚硫酸氢钠与中间代谢产物乙醛结合成为难溶的磺化羟基乙醛，导致乙醛不能作为受氢体转化为乙酸，从而减少了副产物乙酸的生成，提高了丁二酸的纯度，降低后续纯化提取丁二酸的成本。
作为本发明的进一步改进，所述的亚硫酸氢钠添加时间优选为接种后的6～8h。
作为本发明的进一步改进，所述的亚硫酸氢钠添加量优选为0.1～0.5g/L。
亚硫酸氢钠的添加时间和添加量是影响产琥珀酸放线杆菌GXAS137发酵产乙酸的重要因素，因为亚硫酸氢钠对细胞有一定的毒性作用，如果添加时间过早，菌体生长受到抑制，从而影响菌体生长量，进而影响丁二酸的生成；如果亚硫酸氢钠添加时间过晚，副产物乙酸已经大量生成。同理如亚硫酸氢钠添加量过低，中间产物乙醛形成难溶性沉淀较少，仍会有大量乙酸生成；而亚硫酸氢钠添加量过多时，对菌株产生毒害作用，会使细胞活性下降，甚至死亡，从而导致发酵产物丁二浓度较低。本发明经过试验，确定亚硫酸氢钠最佳的添加时间和添加量分别为接种后的6～8h、0.1～0.5g/L。
作为本发明的进一步改进，所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO3 4g/L，NaH2PO4 9.6g/L，K2HPO4 1.55g/L。
作为本发明的进一步改进，所述的发酵培养基的成分及浓度为：初始总糖30～40g/L，氮源5～20g/L，磷酸二氢钾2～10g/L，碳酸氢钠2～10g/L，氯化钙0.3～1.0g/L，氯化镁0.3～1.0g/L。
作为本发明的进一步改进，所述的分批补料发酵过程中，间歇流加总糖浓度为200～300g/L的母液，控制发酵液的总糖为30～35g/L。
作为本发明的进一步改进，所述的初始总糖（即碳源）为糖类、含糖类原料、淀粉质原料的糖化液或纤维原料的水解液中的一种或一种以上以任意比例混合；
所述的糖类为葡萄糖、蔗糖、木糖中的一种；
所述的含糖类原料为甘蔗糖蜜、木糖母液中的一种；
所述的淀粉质原料为木薯粉、玉米粉、小麦粉中的一种；
所述的纤维原料为玉米秸秆、甘蔗渣、稻草中的一种。
作为本发明的进一步改进，所述的氮源为玉米浆、酵母粉、大豆粉、花生饼粉中的一种或几种以任意比例混合。
作为本发明的进一步改进，所述pH缓冲剂为碱式碳酸镁、碳酸钠、氢氧化镁、氢氧化钠中的一种或几种以任意比例混合，总浓度为20～80g/L。
本发明的有益效果：
本发明通过添加一定量的亚硫酸氢钠来显著降低副产物乙酸的生成，克服现有技术通过选育优良菌株或调控发酵条件来降低丁二酸发酵中副产物生成，但降低幅度有限的不足，对提高原料利用率，降低后期丁二酸分离纯化成本具有重要意义，有利于促进生物质丁二酸产业的发展。
附图说明
图1为本发明实施例9以不同碳源进行发酵，添加亚硫酸氢钠后丁二酸及其副产物乙酸的产量图，其中CK为对照组，NaHSO3为添加NaHSO3组。
图2为本发明产琥珀酸放线杆菌的代谢途径简图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例中丁二酸和乙酸产量的分析方法如下：
样品处理：发酵液在室温下12000 r/min，离心10 min，取上清液，然后用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤，用高效液相色谱（HPLC）检测发酵液丁二酸及残还原糖浓度。
有机酸测定：HPLC法，戴安Utimat3000，自动进样器，色谱柱：Rezex ROA-organicacid 300×7.8 mm，流动相2.5 mmol/L H2SO4，pH2.5，柱温45℃，进样量10uL，流速0.6mL/min，紫外检测器波长210 nm。
生物量测定：采用分光光度计(DU 800 UV/VIS Spectrophotometer, Beckman,USA)在660nm进行测定，样品先用0.2M的HCl进行处理，溶解所含的MgCO3，12000r/min离心10min，再用蒸馏水洗三次，以除去所含的色素及杂质。
实施例1
一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，包括以下步骤：
（1）将平板上的产琥珀酸放线杆菌GXAS137单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中37℃培养16h，菌数达3亿以上，得到扩大培养菌种；
（2）再按照5%（V/V）接种量，将扩大培养菌种进行二级扩繁培养8h至菌数达3亿以上，即得到液态种子；
（3）按5%(V/V)的接种量，将液态种子接种到装有发酵培养基的250mL厌氧瓶中，装液量为150mL，同时添加0.05g/L的亚硫酸氢钠，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5～7.0，然后在充满N2的环境中，于转速100r/min、温度为37℃的条件下，分批发酵30h，得到含有丁二酸的发酵液，将发酵液分离纯化后即得到丁二酸。
所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO4 9.6g/L，K2HPO4 1.55g/L。
所述发酵培养基的成分及浓度为：葡萄糖30g/L，氮源5g/L，磷酸二氢钾2g/L，碳酸氢钠2g/L，氯化钙0.3g/L，氯化镁0.3g/L。
所述发酵培养基的氮源为玉米浆、酵母粉、大豆粉、花生饼粉以任意比例混合。
所述pH缓冲剂为碱式碳酸镁和碳酸钠以任意比例混合，总浓度为20g/L。
本实施例丁二酸的产量为22.73g/L，乙酸产量为3.79 g/L，丁二酸产率为75.77%。
丁二酸产率（%）定义为：每消耗1g葡萄糖所产生丁二酸的克数。
实施例2
一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，包括以下步骤：
（1）将平板上的产琥珀酸放线杆菌GXAS137单菌落接入种子培养基中，在普通培养箱中38℃培养20h，菌数达3亿以上，得到扩大培养菌种；
（2）再按照5%（V/V）接种量，将扩大培养菌种进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；
（3）按15%(V/V)的接种量，将液态种子接种到装有发酵培养基的250mL厌氧瓶中，装液量为150mL，接种后12h添加2g/L的亚硫酸氢钠，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5～7.0，在充满CO2的环境中，于转速200r/min、温度为38℃的条件下，分批发酵72h，得到含有丁二酸的发酵液，将发酵液分离纯化后即得到丁二酸。
所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO4 9.6g/L，K2HPO4 1.55g/L。
所述发酵培养基的成分及浓度为：葡萄糖80g/L，氮源20g/L，磷酸二氢钾10g/L，碳酸氢钠10g/L，氯化钙1.0g/L，氯化镁1.0g/L。
所述发酵培养基的氮源为玉米浆和酵母粉以任意比例混合。
所述pH缓冲剂为碱式碳酸镁、碳酸钠、氢氧化镁、氢氧化钠以任意比例混合，总浓度为80g/L。
本实施例丁二酸的产量为57.87g/L，乙酸产量为9.24g/L，丁二酸产率为72.34%。
实施例3
一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，包括以下步骤：
（1）将平板上的产琥珀酸放线杆菌GXAS137单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中37℃培养16h，菌数达3亿以上，得到扩大培养菌种；
（2）再按照5%（V/V）接种量，将扩大培养菌种进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；
（3）按5%(V/V)的接种量，将液态种子接种到发酵培养基中，采用2L发酵罐发酵，装液量为1200mL，接种后6h添加0.3g/L的亚硫酸氢钠，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5～7.0，在充满N2的环境中，于转速100r/min、温度为36℃的条件下，分批补料发酵50h，得到含有丁二酸的发酵液，将发酵液分离纯化后即得到丁二酸。
所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO4 9.6g/L，K2HPO4 1.55g/L。
所述发酵培养基的成分及浓度为：葡萄糖60g/L，氮源5g/L，磷酸二氢钾2g/L，碳酸氢钠2g/L，氯化钙0.3g/L，氯化镁0.3g/L，发酵过程中间歇流加总糖浓度为200g/L的葡萄糖母液，控制发酵液的总糖为30g/L。
所述发酵培养基的氮源为玉米浆和大豆粉以任意比例混合。
所述pH缓冲剂为碱式碳酸镁和氢氧化镁以任意比例混合，总浓度为20g/L。
本实施例丁二酸的产量为73.95g/L，乙酸产量为12.67 g/L，丁二酸产率为82.17%。
实施例4
一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，包括以下步骤：
（1）将平板上的产琥珀酸放线杆菌GXAS137单菌落接入种子培养基中，在普通培养箱中36℃培养18h，菌数达3亿以上，得到扩大培养菌种；
（2）再按照5%（V/V）接种量，将扩大培养菌种进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；
（3）按10%(V/V)的接种量将液态种子接种到装有发酵培养基的250mL厌氧瓶中，装液量为150mL，接种后4h添加0.1g/L的亚硫酸氢钠，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5～7.0，在充满CO2的环境中，于转速200r/min、温度为37℃的条件下，分批发酵40h，得到含有丁二酸的发酵液，将发酵液分离纯化后即得到丁二酸。
所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO34g/L，NaH2PO4 9.6g/L，K2HPO4 1.55g/L。
所述发酵培养基的成分及浓度为：木薯糖化醪总糖40g/L，氮源12g/L，磷酸二氢钾6g/L，碳酸氢钠6g/L，氯化钙0.6g/L，氯化镁0.7g/L。
所述发酵培养基的氮源为玉米浆。
所述pH缓冲剂是碱式碳酸镁，总浓度为40g/L。
本实施例丁二酸的产量为33.30g/L，乙酸产量为5.57 g/L，丁二酸产率为83.25%。
实施例5
一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，包括以下步骤：
（1）将平板上的产琥珀酸放线杆菌GXAS137单菌落接入种子培养基中，在普通培养箱中38℃培养20h，菌数达3亿以上，得到扩大培养菌种；
（2）再按照5%（V/V）接种量，将扩大培养菌种进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；
（3）按15%(V/V)的接种量将液态种子接种到装有发酵培养基的250mL厌氧瓶中，装液量为150mL，接种后8h添加0.3g/L的亚硫酸氢钠，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5～7.0，在充满CO2的环境中，于转速200r/min、温度为38℃的条件下，分批发酵72h，得到含有丁二酸的发酵液，将发酵液分离纯化后即得到丁二酸。
所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO3 4g/L，NaH2PO4 9.6g/L，K2HPO4 1.55g/L。
所述发酵培养基的成分及浓度为：甘蔗糖蜜总糖75g/L，氮源20g/L，磷酸二氢钾10g/L，碳酸氢钠10g/L，氯化钙1.0g/L，氯化镁1.0g/L，所述甘蔗总糖浓度为48%（W:V）。
所述发酵培养基的氮源为玉米浆和酵母粉以任意比例混合。
所述pH缓冲剂为碱式碳酸镁、碳酸钠、氢氧化镁、氢氧化钠以任意比例混合，总浓度为70g/L。
本实施例丁二酸的产量为61.50g/L，乙酸产量为9.63g/L，丁二酸产率为80.2%。
实施例6
一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，包括以下步骤：
（1）将平板上的产琥珀酸放线杆菌GXAS137单菌落接入种子培养基中，在厌氧培养箱中37℃培养16h，菌数达3亿以上，得到扩大培养菌种；
（2）再按照5%（V/V）接种量，将扩大培养菌种进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；
（3）按5%(V/V)的接种量将液态种子接种到发酵培养基中，采用2L发酵罐发酵，装液量为1200mL，接种后6h添加0.2g/L的亚硫酸氢钠，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5～7.0，在充满N2的环境中，于转速100r/min、温度为36℃的条件下，分批补料发酵50h，得到含有丁二酸的发酵液，将发酵液分离纯化后即得到丁二酸。
所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO3 4g/L，NaH2PO4 9.6g/L，K2HPO4 1.55g/L。
所述发酵培养基的成分及浓度为：甘蔗糖蜜初始总糖为50g/L，氮源5g/L，磷酸二氢钾2g/L，碳酸氢钠2g/L，氯化钙0.3g/L，氯化镁0.3g/L，发酵过程中间歇流加总糖浓度为200g/L的甘蔗糖蜜母液，控制发酵液的总糖为30g/L，所述甘蔗总糖浓度为48%（W:V）。
所述发酵培养基的氮源为玉米浆和大豆粉以任意比例混合。
所述pH缓冲剂为碱式碳酸镁和氢氧化镁以任意比例混合，总浓度为70g/L。
本实施例丁二酸的产量为70.44g/L，乙酸产量为11.25g/L，丁二酸产率为80.2%。
实施例7
一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，包括以下步骤：
（1）将平板上的产琥珀酸放线杆菌GXAS137单菌落接入种子培养基中，在普通培养箱中38℃培养20h，菌数达3亿以上，得到扩大培养菌种；
（2）再按照5%（V/V）接种量，将扩大培养菌种进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；
（3）按15%(V/V)的接种量将液态种子接种到装有发酵培养基的250mL厌氧瓶中，装液量为150mL，接种后10h添加0.4g/L的亚硫酸氢钠，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5～7.0，在充满CO2的环境中，于转速200r/min、温度为38℃的条件下，分批发酵72h，得到含有丁二酸的发酵液，将发酵液分离纯化后即得到丁二酸。
所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO3 4g/L，NaH2PO4 9.6g/L，K2HPO4 1.55g/L。
所述发酵培养基的成分及浓度为：甘蔗渣水解液总糖50g/L，氮源20g/L，磷酸二氢钾10g/L，碳酸氢钠10g/L，氯化钙1.0g/L，氯化镁1.0g/L，所述甘蔗总糖浓度为48%（W:V）。
所述发酵培养基的氮源为玉米浆和酵母粉以任意比例混合。
所述pH缓冲剂为碱式碳酸镁、碳酸钠、氢氧化镁、氢氧化钠以任意比例混合，总浓度为50g/L。
本实施例丁二酸的产量为 30.66g/L，乙酸产量为5.42 g/L，丁二酸产率为61.33%。
实施例8
一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，包括以下步骤：
（1）将平板上的产琥珀酸放线杆菌GXAS137单菌落接入种子培养基中，在普通培养箱中38℃培养20h，菌数达3亿以上，得到扩大培养菌种；
（2）再按照5%（V/V）接种量，将扩大培养菌种进行二级扩繁培养8h，菌数达3亿以上，即得到液态种子；
（3）按15%(V/V)的接种量将液态种子接种到发酵培养基中，采用2L发酵罐发酵，装液量为1200mL，接种后8h添加0.1g/L的亚硫酸氢钠，利用pH缓冲剂调节发酵液pH维持在6.5～7.0，在充满CO2的环境中，于转速200r/min、温度为37℃的条件下，分批补料发酵72h，得到含有丁二酸的发酵液，将发酵液分离纯化后即得到丁二酸。
所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO3 4g/L，NaH2PO4 9.6g/L，K2HPO4 1.55g/L。
所述发酵培养基的成分及浓度为：甘蔗渣水解液初始总糖为40g/L，氮源20g/L，磷酸二氢钾10g/L，碳酸氢钠10g/L，氯化钙1.0g/L，氯化镁1.0g/L，发酵过程中间歇流加总糖浓度为300g/L的木糖母液，控制发酵液的总糖为35g/L，最终发酵液的总糖浓度达到80g/L，所述甘蔗渣水解液总糖浓度为20%（W:V）。
所述发酵培养基的氮源为玉米浆、酵母粉、大豆粉和花生饼粉以任意比例混合。
所述pH缓冲剂为碱式碳酸镁、碳酸钠、氢氧化镁、氢氧化钠以任意比例混合，总浓度为80g/L。
本实施例丁二酸的产量为94.34g/L，乙酸产量为17.86 g/L，丁二酸产率为78.62%。
实施例9
不同碳源添加亚硫酸氢钠进行发酵试验。
按照实施例2中的方法，分别采用葡萄糖、甘蔗糖蜜、木薯粉糖化醪及甘蔗渣水解液为碳源，初始总糖浓度为80g/L，接种量为8%（V/V），接种到装有发酵培养基的250mL厌氧瓶中，装液量为150mL，利用80g/L碳酸镁为pH缓冲剂调节pH在6.5～7.0，然后置于培养箱中37℃下培养6h后，添加0.2g/L的亚硫酸氢钠，发酵60h，测定丁二酸及乙酸含量，结果见图1。
由图1可以看出：不同碳源发酵产丁二酸过程中添加亚硫酸氢钠后，副产物乙酸具有显著下降，但丁二酸增加幅度较小，这与菌株体内氧化还原力水平失衡有关，产琥珀酸放线杆菌具体代谢途径如图2所示，产琥珀酸放线杆菌将1mol葡萄糖生成2mol PEP，同时生成2mol NADH，但是2mol PEP生成2mol丁二酸的同时需消耗4mol NADH，也就是说，丁二酸合成过程中存在还原力不足的现象，每生成1mol丁二酸需要额外提供1mol NADH；而在合成副产物乙酸、甲酸等过程中不需要消耗NADH，菌株通过产生一定量的副产物来维持胞内的氧化还原力的平衡，添加亚硫酸氢钠后，亚硫酸氢钠与中间代谢产物乙醛结合成为难溶的磺化羟基乙醛，导致乙醛不能作为受氢体转化为乙酸，从而减少了副产物乙酸的生成，但是不影响丁二酸代谢路径。由此可知，添加亚硫酸氢钠后，乙酸产量降低，丁二酸纯度提高，后续分离纯化工艺成本降低，从而显著降低丁二酸的生产成本。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将平板上的产琥珀酸放线杆菌GXAS137单菌落接种至种子培养基中，于36～38℃下培养16～20h至菌数达3亿以上，得到扩大培养菌种；
（2）按照5%（V/V）接种量，将扩大培养菌种进行二级扩繁培养8h至菌数达3亿以上，即得到液态种子；
（3）按5～15%(V/V)的接种量，将液态种子接种到发酵培养基中，在接种后的0～12h添加0.05～2g/L的亚硫酸氢钠，利用pH缓冲剂调节发酵液的pH维持在6.5～7.0，然后在充满N2或CO2的环境中，于转速100～200r/min、温度为36～38℃条件下，分批发酵或分批补料发酵30～72h，得到含有丁二酸的发酵液，将发酵液分离纯化后即得到丁二酸。
2.根据权利要求1所述的降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，其特征在于：所述的亚硫酸氢钠添加时间优选为接种后的6～8h。
3.根据权利要求1所述的降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，其特征在于：所述的亚硫酸氢钠添加量优选为0.1～0.5g/L。
4.根据权利要求1所述的降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，其特征在于：所述种子培养基的成分及浓度为：葡萄糖8g/L，酵母粉12g/L，玉米浆4g/L，NaHCO3 4g/L，NaH2PO49.6g/L，K2HPO4 1.55g/L。
5.根据权利要求1所述的降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，其特征在于：所述的发酵培养基的成分及浓度为：初始总糖30～40g/L，氮源5～20g/L，磷酸二氢钾2～10g/L，碳酸氢钠2～10g/L，氯化钙0.3～1.0g/L，氯化镁0.3～1.0g/L。
6.根据权利要求1所述的降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，其特征在于：所述的分批补料发酵过程中，间歇流加总糖浓度为200～300g/L的母液，控制发酵液的总糖为30～35g/L。
7.根据权利要求5所述的降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，其特征在于：所述的初始总糖为糖类、含糖类原料、淀粉质原料的糖化液或纤维原料的水解液中的一种或一种以上以任意比例混合；
所述的糖类为葡萄糖、蔗糖、木糖中的一种；
所述的含糖类原料为甘蔗糖蜜、木糖母液中的一种；
所述的淀粉质原料为木薯粉、玉米粉、小麦粉中的一种；
所述的纤维原料为玉米秸秆、甘蔗渣、稻草中的一种。
8.根据权利要求5所述的降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，其特征在于：所述的氮源为玉米浆、酵母粉、大豆粉、花生饼粉中的一种或几种以任意比例混合。
9.根据权利要求1～8任一所述的降低丁二酸发酵副产物乙酸生成的方法，其特征在于：所述pH缓冲剂为碱式碳酸镁、碳酸钠、氢氧化镁、氢氧化钠中的一种或几种以任意比例混合，总浓度为20～80g/L。
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