CN110964754A - 一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法 - Google Patents

一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，包括将菌种活化扩繁后的菌种发酵培养，接种量为体积比5～15％，所述发酵培养基中添加有亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐，添加量为1g/L～20g/L。本发明在产琥珀酸放线杆菌发酵产丁二酸的过程中添加亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐，通过与胞内生成的中间产物乙酰磷酸发生加成反应，阻碍其进一步转化为乙酸，可在不影响丁二酸产量的情况下，大幅降低乙酸副产物的含量。该工艺操作过程简单,成本较低,具有工业化应用价值。

Description

一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，具体地说，是涉及一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法。
背景技术
丁二酸，又称琥珀酸，是一种C4二元羧酸，天然存在于动植物、人体和微生物细胞中，丁二酸，是参与细胞代谢过程——三羧酸循环(TCA)的重要中间产物。丁二酸可作为多种化学物质合成的前体或中间产物，在食品、医药、化工、香料等领域具有广泛的应用。例如，丁二酸是合成1,4-丁二醇、γ-丁内酯、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮、己二酸等重要化合物的前体物质。此外，丁二酸还是一种可生物降解材料—聚丁二酸丁二醇酯(PBS)合成的重要原料。
工业上生产丁二酸主要采用化学合成法，该法以不可再生的石化资源为原料，存在生产成本高、环境污染严重等问题，不符合低碳环保、节能减排战略要求。与化学合成法相比，微生物发酵法具有以下优点：(1)原料价格低廉，为可再生生物质资源；(2)发酵过程中可吸收大量二氧化碳，绿色环保；理论上，每生产1kg的丁二酸，将会有0.37kg的二氧化碳被固定，可减少温室气体的排放；(3)发酵条件温和，为酶促反应，与化学合成法相比，可节能30～40％。因此，开展微生物发酵可再生资源高效合成丁二酸的研究，有利于提升产业竞争力和拓展下游产业链，因而备受人们的关注。
在众多的丁二酸天然高产菌株中，产琥珀酸放线杆菌(A.succinogenes)由于具有能利用多种碳源(葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、维二糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖、木糖等)并能够耐受高浓度的丁二酸盐和葡萄糖、发酵主要产物为丁二酸等优点，被认为是最具工业化潜力的丁二酸生产菌株之一。在自然条件下，产琥珀酸放线杆菌以葡萄糖为碳源进行发酵时，主产物主要为丁二酸和乙酸，此外还有少量的甲酸、乳酸和乙醇；而且由于积累的丁二酸浓度不高以及副产物乙酸的大量存在，导致产琥珀酸放线杆菌野生菌株并不能满足工业化生产需求，因此需要对菌株进行选育、改良以及发酵工艺优化。在国外，美国密西根生物技术研究院(MEI)Zeikus课题组在产琥珀酸放线杆菌发酵产丁二酸方面，在1996年筛选出一株高产丁二酸菌株130Z，并以130Z为出发菌株，筛选出高抗单氟乙酸自发突变株，并在最适条件下，使用该抗性株发酵48h，发酵产物中的琥珀酸/乙酸比例高达85:1，琥珀酸/甲酸比例高达160:1，丁二酸产量可以达到80～110g/L，得率高达97％，使丁二酸发酵获得了突破性进展。在国内，姜岷课题组通过对牛瘤胃中的微生物菌群在含富马酸二钠的培养基中富集培养，然后进行分类，得到一株高产丁二酸的放线杆菌NJ113，该菌株产丁二酸最高可达48g/L，同时副产物乙酸、甲酸、乳酸较多；申乃坤等也采用类似的方法从牛瘤胃中筛选到一株高产丁二酸的放线菌株GXAS-137，该菌株在后续发酵中能积累高达70g/L的丁二酸，但乙酸、甲酸、乳酸等副产物仍比较多；江南大学的孙志浩课题组，筛选出菌株Actinobacillus succinogens CGMCC1593，并对其诱变选育得到菌株SF-9，该菌株在5L发酵罐上发酵36h丁二酸产量达40.51g/L，但仍然存在乳酸、甲酸和乙酸等副产物。潘丽军等利用低拷贝质粒PLG338对产琥珀酸放线杆菌的乙醇脱氢酶(ADH)进行敲除失活，使碳代谢流发生变化，ADH酶活降低了90％，最终丁二酸产量达到了65.7g/L。
综上所述，产琥珀酸放线杆菌在发酵产丁二酸过程中，副产物在发酵液中所占的比重偏高，很大程度上限制了丁二酸的规模化应用，因此有必要采取相应的技术手段降低副产物生成。传统的筛选—诱变—筛选模式存在步骤繁琐、耗时过长、具有盲目性等问题，而且随着传代次数的增加，回复突变的风险也相应增加；此外，虽然利用基因工程技术改造菌株具有针对性强等特点，但是同样受到操作手段相对繁琐、实验周期相对较长的限制，加之敲除内源基因或者引入外源基因过量表达均可能导致整个代谢网络路径的扰动，从而影响目标代谢路径物质流和能量流分配。因此，寻找一种更为简单且有效降低丁二酸发酵副产物的方法尤为重要。基于产琥珀酸放线杆菌胞内产生的中间体——乙酰磷酸与主要副产物乙酸的生成密切关联，因此，改变胞内乙酰磷酸的累积量或存在形态可能会导致副产物乙酸生成量的改变。已有研究表明，在酿酒酵母发酵培养过程中添加亚硫酸盐或亚硫酸氢盐，使之与胞内产生的乙醛发生加成反应，可阻止乙醛转化成乙醇，进而促进甘油的积累。目前，国内外尚未见利用亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐应用在丁二酸的发酵生产中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的目的是针对丁二酸发酵生产中副产物所占比例过高的问题，提供一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，所用的菌株为产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogens)PZ，保藏日期为2016年7月19日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC N0：M2016396。
本发明按体积比为5-15％的接种量将菌种活化扩繁得到的二级种子接种到发酵培养基中并在发酵进行0～10h之后，往发酵培养基中添加过滤除菌的亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐溶液。
根据权利要求1所述的一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，其特征在于，所述亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐溶液的加入量为1g/L-20g/L。
具体地，所述菌种扩繁的方法包括将菌种在厌氧箱于37℃下培养48h后接入液体种子培养基中，于37℃厌氧箱中培养16h，菌种数达3亿以上，得到一级种子；按体积比为5％的接种量将一级种子转接至种子培养基中进行二级扩繁培养8-10h，得到二级种子。
具体地，所述的发酵条件为在充满CO2的环境中，利用碱式碳酸镁调节发酵pH维持在6.5～7.0，并在转速为100～200r/min、温度为36～38℃条件下发酵60～72h。
具体地，所述的亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐包括偏重亚硫酸钠、偏重亚硫酸钾、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾中的一种或多种。
具体地，所述的亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐添加方式为批次补加或者间歇流加的方式。
具体地，所述的发酵培养基的配方按照质量比为：包括葡萄糖50～70，酵母提取物10，玉米浆15，NaHCO3 6，(NH4)2SO4 2，MgCl2.6H2O 0.8，CaCl2 1，MnCl2 0.06，ZnSO4 0.06，碱式碳酸镁40～60。
具体地，种子培养基成分及浓度的配方按照质量比为：葡萄糖20，酵母提取物10，玉米浆5，NaCl 2，NaHCO3 4，NaH2PO4 8.5，K2HPO4 15.5，pH 7.0。
本发明的有益效果在于：
本发明有效降低主要副产物乙酸的积累浓度。该工艺成本较低、工艺简单、易于控制，具有工业化应用价值，本发明的方法成本低、工艺简单，乙酸副产物含量降低幅度高达87％。
说明书附图
图1为批次添加亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐对丁二酸发酵的影响条状图；
具体实施方式
结合具体实施例对本发明进一步说明：
本发明涉及的产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)，命名为Actinobacillus succinogenes PZ。保藏日期为2016年7月19日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保藏单位地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC N0：M2016396。
实施例1
一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，包括以下步骤：
(1)培养基的配制
种子培养基的成分及浓度(g/L)：葡萄糖20，酵母提取物10，玉米浆5，NaCl 2，NaHCO3 2，NaH2PO4 8.5，K2HPO4 15.5，115℃灭菌20min；
发酵培养基的成分及浓度(g/L)：葡萄糖50，酵母提取物10，玉米浆15，NaHCO3 4，(NH4)2SO4 2，MgCl2.6H2O 1，CaCl2 0.3，MnCl2 0.08，ZnSO4 0.08，碱式MgCO3 40，115℃灭菌20min；
(2)种子培养
将平板上的产琥珀酸放线杆菌PZ接入种子培养基中，于37℃厌氧箱中或普通培养箱中培养16h，菌数达3亿以上，得到一级种子；再按体积比为5％的接种量转接至种子培养基中进行二级扩繁培养8～10h，得到二级种子；
(3)发酵培养
按体积比为10％的接种量将二级种子接入装有150mL发酵培养基的250mL厌氧瓶中，在充满CO2的环境中发酵，利用碱式碳酸镁调节发酵pH维持在6.5～7.0，摇床转速设为200r/min、发酵温度为37℃；并在发酵进行0h时分别加入终浓度为5g/L的亚硫酸氢钾、偏重亚硫酸钠、偏重亚硫酸钾和亚硫酸氢钠，发酵72h后取样检测，考察亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐对产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵的影响，发酵结果见图1，添加终浓度为5g/L的亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐，在丁二酸产量几乎不受影响的情况下，乙酸含量与对照(8.28g/L)相比分别下降了61.4％、61.7％、61.0％和56.0％。
本发明分析方法
(1)样品处理：发酵液在室温下12,000r/min，离心10min，取上清液，然后用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤，稀释适当倍数用高效液相色谱(HPLC)检测发酵液中的有机酸浓度。
(2)有机酸测定：采用高效液相色谱仪(戴安Utimat3000)测定有机酸含量，色谱柱为Rezex ROA-Organic Acid H+(8％)(300mm×7.8mm)，柱温50℃，流动相为2.5mmol/LH2SO4(pH2.5)，流速为0.6mL/min，紫外(UV)检测器，检测波长为210nm。
实施例2
对照组：不添加亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐的发酵
(1)～(2)同实施例1步骤(1)～(2)；
(3)按体积比为10％的接种量将二级种子接入装有150mL发酵培养基的250mL厌氧瓶中，在充满CO2的环境中发酵，利用碱式碳酸镁调节发酵pH维持在6.5～7.0，并在转速为200r/min、温度为37℃条件下进行发酵60h，发酵结束后取样检测有机酸含量，发酵结果如图图1所示。
实施例3
一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，包括以下步骤：
(1)培养基的配制
种子培养基的成分及浓度(g/L)：葡萄糖20，酵母提取物10，玉米浆5，NaCl 2，NaHCO3 2，NaH2PO4 8.5，K2HPO4 15.5，115℃灭菌20min；
发酵培养基的成分及浓度(g/L)：葡萄糖70，酵母提取物10，玉米浆15，NaHCO3 4，(NH4)2SO4 2，MgCl2.6H2O 1，CaCl2 0.3，MnCl2 0.08，ZnSO4 0.08，碱式MgCO3 60，115℃灭菌20min；
(2)种子培养
将平板上的产琥珀酸放线杆菌PZ接入种子培养基中，于37℃厌氧箱中或普通培养箱中培养16h，菌数达3亿以上，得到一级种子；再按体积比为5％的接种量转接至种子培养基中进行二级扩繁培养8～10h，得到二级种子；
(3)按体积比为5％的接种量将二级种子接入装有1.4L发酵培养基的2L发酵罐中，发酵温度为37℃，搅拌转速为100r/min，通气为100％CO2，通气比率为0.2vvm；并在发酵进行0h后，开始间歇流加浓度为250g/L的亚硫酸氢钠，并控制其加入的总量为15g/L，发酵72h后取样检测有机酸含量，发酵结果见表1。
表1间歇流加亚硫酸氢钠对丁二酸发酵的影响
Figure BDA0002352094330000071
实施例4
一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，包括以下步骤：
(1)～(2)同实施例3步骤(1)～(2)；
(3)按体积比为10％的接种量将二级种子接入装有1.4L发酵培养基的2L发酵罐中，发酵温度为36℃，搅拌转速为200r/min，通气为100％CO2，通气比率为0.2vvm；并在发酵进行8h后，开始间歇流加浓度为500g/L的偏重亚硫酸钠，并控制其加入的总量为12g/L，发酵72h后取样检测有机酸含量，发酵结果见表2。
表2间歇流加偏重亚硫酸钠对丁二酸发酵的影响
Figure BDA0002352094330000072
实施例5
一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，包括以下步骤：
(1)～(2)同实施例3步骤(1)～(2)；
(3)按体积比为15％的接种量将二级种子接入装有1.4L发酵培养基的2L发酵罐中，发酵温度为38℃，搅拌转速为150r/min，通气为100％CO2，通气比率为0.2vvm；并在发酵进行6h后，开始流加浓度为200g/L的偏重亚硫酸钾，并控制其加入的总量为10g/L，发酵72h后取样检测有机酸含量，发酵结果见表3。
表3间歇流加偏重亚硫酸钾对丁二酸发酵的影响
Figure BDA0002352094330000081
实施例6，与实施例3基本相同，但所述的亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐为亚硫酸氢钾与偏重亚硫酸钾各50％。
实施例7，与实施例3基本相同，但所述的亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐为亚硫酸氢钾与偏重亚硫酸钠各50％。
实施例8，与实施例3基本相同，但所述的亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐为亚硫酸氢钾和亚硫酸氢钠各50％。
实施例9，与实施例3基本相同，但所述的亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐为亚硫酸氢钠和偏重亚硫酸钾各50％。
实施例10，与实施例3基本相同，但所述的亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐为亚硫酸氢钠和偏重亚硫酸钠。
实施例11，与实施例3基本相同，但所述的亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐为偏重亚硫酸钠和偏重亚硫酸钾各50％。
实施例12，与实施例3基本相同，但所述的亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐为亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、偏重亚硫酸钾和偏重亚硫酸钠各25％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，其特征在于：按体积比为5-15％的接种量将菌种活化扩繁得到的二级种子接种到发酵培养基中并在发酵进行0～10h之后，往发酵培养基中添加过滤除菌的亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐溶液，
2.根据权利要求1所述的一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，其特征在于，所述亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐溶液的加入量为1g/L-20g/L。
3.根据权利要求1所述的一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，其特征在于，所述菌种为丁二酸厌氧发酵的微生物，产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)PZ，保藏编号为CCTCC N0：M2016396。
4.根据权利要求1所述的一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，其特征在于，所述菌种扩繁的方法包括将菌种在厌氧箱于37℃下培养48h后接入液体种子培养基中，于37℃厌氧箱中培养16h，菌种数达3亿以上，得到一级种子；按体积比为5％的接种量将一级种子转接至种子培养基中进行二级扩繁培养8-10h，得到二级种子；
5.根据权利要求1所述的一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，其特征在于，所述的发酵条件为在充满CO2的环境中发酵，调节发酵pH维持在6.5～7.0，并在转速为100～200r/min、温度为36～38℃条件下发酵60～72h。
6.根据权利要求1所述的一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，其特征在于，所述的亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐包括偏重亚硫酸钠、偏重亚硫酸钾、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾中的一种或多种。
7.根据权利要求1或2所述的一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，其特征在于，所述的亚硫酸氢盐或偏重亚硫酸盐添加方式为批次补加或者间歇流加的方式。
8.根据权利要求1所述的一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的配方按照质量比为：包括葡萄糖50～70，酵母提取物10，玉米浆15，NaHCO36，(NH4)2SO42，MgCl2.6H2O 0.8，CaCl21，MnCl20.06，ZnSO40.06，碱式碳酸镁40～60。
9.根据权利要求1所述的一种降低产琥珀酸放线杆菌丁二酸发酵副产物比例的方法，其特征在于，种子培养基成分及浓度的配方按照质量比为：葡萄糖20，酵母提取物10，玉米浆5，NaCl 2，NaHCO34，NaH2PO48.5，K2HPO415.5，pH 7.0，115℃灭菌20min。
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