CN103937733A - 一株利用蔗糖产丁二酸基因工程菌株及其发酵生产丁二酸的方法 - Google Patents
一株利用蔗糖产丁二酸基因工程菌株及其发酵生产丁二酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，涉及一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法，具体是一株能够高效利用蔗糖和糖蜜生长并产丁二酸重组菌株。本发明的产丁二酸基因工程菌菌株分类命名为大肠埃希氏菌BA501，其保藏号登记号为CCTCCNO:M2014014。其构建过程主要包括以以缺乏乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因活性和染色体ptsG基因发生自发突变的大肠杆菌AFP111为出发菌株，表达外源蔗糖通透酶、蔗糖水解酶及果糖激酶基因后，经连续驯化培养，得到一株高效利用蔗糖和糖蜜生长并产丁二酸的菌株，大幅度提高了丁二酸的合成效率。其发酵方法采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法，具体是一株高效利用蔗糖和糖蜜生长并产丁二酸重组菌株及利用该菌株发酵生产丁二酸的方法。
背景技术
丁二酸(succinic acid)又称琥珀酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。
丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可再生资源，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO2，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，今年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重组谷氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌。其中利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。而重组大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。
现有产丁二酸重组大肠杆菌的构建思路主要包括失活副产物生成途径的关键酶(如丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶)、增强丁二酸合成途径中酶(如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)的活性以及外源导入可以引导合成丁二酸的酶(如丙酮酸羧化酶)提高其对葡萄糖的利用率以及生产速率。其中，E.coli NZN111由于同时失活了丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶，NADH不能及时再生为NAD+，引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡(NADH/NAD+比例超过2)，最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖。其自发突变株E.coli AFP111由于突变了葡萄糖专性转运系 统中的ptsG基因，降低了在EMP途径中NADH的产生速率，恢复了NAD(H)平衡，使得菌株在厌氧条件下能够利用葡萄糖，且产物主要为丁二酸，在有氧厌氧两阶段发酵培养AFP111过程中，丁二酸质量收率达到96％，生产强度为1.21g L-1·h-1。
作为生产生物化工产品的原料，蔗糖比葡萄糖具有经济和环境优势。蔗糖是由葡萄糖和果糖组成的二糖，是光合作用的主要产物，广泛分布于植物体内，特别是甜菜、甘蔗和水果中含量极高。由于生产原料和工艺的优势，蔗糖的价格远远低于葡萄糖的价格。
除此以外，蔗糖也可以保护细胞免受氧化、温度、酸、压力的影响，所以作为碳源发酵可以提高生物产品的形成(Lee,Jeong Wook,et al.2010)。
糖蜜是工业制糖过程中，蔗糖结晶后，剩余的不能结晶，但仍含有较多糖的液体残留物，其中主要含有大量的可发酵糖(主要为蔗糖)，因而是很好的发酵原料。按制糖原料不同可分为甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜等。各种糖蜜的营养成分有差异。一般甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜以转换糖量表示，其总糖量分别为48.0％、49.0％；水分25.0％、23.0％；粗蛋白质3.0％、6.5％。所以蔗糖和糖蜜是极其丰富且廉价的碳源。
大肠杆菌广泛应用于工业，但目前大多数大肠杆菌由于缺少蔗糖利用基因，从而不能利用蔗糖。但大肠杆菌原始菌中E.coli W、EC3132和O157：H7可以以蔗糖为唯一碳源生长。蔗糖利用系统主要分为PTS蔗糖利用系统和非PTS蔗糖利用系统。E.coli W中蔗糖主要通过非PTS系统被利用的，其中包括cscBKAR四个基因。具体而言，基因cscR编码阻遏蛋白(CscR)，基因cscA编码蔗糖水解酶(CscA)，基因cscK基因编码果糖激酶(CscK)，基因cscB编码蔗糖通透酶(CscB)。cscR会影响蔗糖的利用，所以将E.coli W中的非PTS蔗糖利用系统引入到不能利用蔗糖的大肠杆菌时，不需要引入cscR。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株高效利用蔗糖和糖蜜生长并产丁二酸大肠杆菌菌株，并利用该菌株厌氧发酵生产丁二酸，达到菌株的方法简单方便，得到的菌株发酵方法简单可行，易于工业化，产酸能力强的目的，从而大大降低生产成本，提高经济效益。
为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案：
一、本发明提供一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌BA501(Escherichia coli BA501)，其保藏号登记号为CCTCC NO:M2014014。
二、本发明所述的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA501的构建方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性且磷酸转移酶系统的ptsG染色体发生自发突变的大肠杆菌为出发菌株，利用表达外源蔗糖通透酶、蔗糖水解酶及果糖激酶基因后，经连续驯化培养，得到能够高效利用蔗糖和糖蜜生长并产丁二酸大肠埃希氏菌BA501；
进一步地，所述的具体步骤如下：
(1)利用CaCl2法制备缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性和磷酸转移酶系统的ptsG染色体发生自发突变的E.coli感受态菌株；
(2)纯化扩增出包含蔗糖通透酶(cscB)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)以及自身启动子的一个片段(具体见图示2)，构建得到表达蔗糖通透酶(cscB)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)的表达质粒；
(3)将步骤(2)所述的质粒利用热击法导入步骤(1)得到的感受态菌株，获得阳性转化子；
(4)利用步骤(3)的阳性转化子表达蔗糖通透酶(cscB)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)，得到一株能够利用蔗糖生长并产丁二酸大肠埃希氏菌BA500(Escherichia coli BA500)。
(5)大肠埃希氏菌BA500经连续驯化培养后，利用以蔗糖为单一性碳源的固体培养基平板，筛选得到可以快速生长的突变株，再经过厌氧摇瓶发酵筛选获得可以高效利用蔗糖和糖蜜产丁二酸的菌株为目标菌株大肠埃希氏菌BA501(Escherichia coli BA501)。
三、利用本发明所述的大肠埃希氏菌BA501发酵生产丁二酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。
进一步地，具体步骤如下：
将大肠埃希氏菌BA501按1％(v/v)接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，有氧培养菌体至OD600＝3时，按接种量10％转接至含有厌氧阶段发酵培养基的血清瓶中，充CO2两分钟，并在37℃，200r/min厌氧发酵48小时
或者将大肠埃希氏菌BA501按10％的接种量将种子液接入装有1.5L发酵培养基的3L发酵罐中，37℃有氧培养至菌体生长达到稳定期，37℃、200r/min以0.5L/min的速率持续通入CO2，进行厌氧发酵，优选的，其中有氧有氧阶段发酵培养基是以蔗糖为碳源的合成培养基。
进一步地，所述的厌氧阶段发酵培养基是以蔗糖或糖蜜为碳源的产丁二酸大肠杆菌用发酵培养基。
本发明的有益效果在于：本发明以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性和磷酸转移酶系统的ptsG自发突变的大肠杆菌AFP111为出发菌株，表达外源蔗糖通透酶、蔗糖水解酶及果糖激酶基因后经连续驯化得到能够高效利用蔗糖和糖蜜生长并产丁二酸的菌株(代谢途径见图1)。这种通过分子生物学及微生物驯化手段，使原先不能利用蔗糖的大肠杆菌AFP111能够高效利用蔗糖和糖蜜产丁二酸的方法未见公开，而这种应用将大大推进丁二酸产业的进步和发展。另外，该发明所构建的质粒可以导入到任意大肠杆菌中，优先考虑本身不具备蔗糖利用能力的大肠杆菌，并且优选工业上发酵性能好的大肠杆菌，所以该发明可以扩大本身不具有蔗糖利用能力的大肠杆菌的用途。
附图说明
图1大肠杆菌中蔗糖非PTS利用途径。
图2csc蔗糖利用基因及其自身启动子图示。
图3重组质粒pMD19-T-cscBKA的构建图谱。
图4PCR产物cscBKA凝胶电泳鉴定图。
图5质粒pMD19-T-cscBKA单酶切凝胶电泳鉴定图。
图6大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA501利用蔗糖发酵产丁二酸结果。
图7大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA501利用糖蜜发酵产丁二酸结果。
本发明的微生物的分类命名为大肠埃希氏菌BA501(Escherichia coli BA501)，其保藏日期为2014年1月10日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，简称为CCTCC，保藏编号：CCTCC NO:M2014014。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
本发明所述的E.coli W基因组的来源是：购自ATCC。
本发明所述的质粒用pMD19-T的来源是：购自Takara公司。
本发明所述的出发菌株：E.coli AFP111的感受态菌株的来源有两处：
(1)Applied and environmental microbiology,2001,67(1):148-154.申请人首先通过查阅到该生物材料的上述文献出处，并联系了发表人系美国芝加哥大学的David P.Clark教授，并邮件请求其赠与该生物材料，并免费获得了该生物材料；且申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料。
(2)该生物材料还在中国专利(申请号CN96198547，申请日1996.10.31，授权日为2003年1月1日，授权公告号为CN1097632C)的专利文献中公开并获得授权。
本发明所述的引物来源是：自行设计并外包金斯瑞生物技术公司合成。
实施例1
本实施例说明构建大肠埃希氏菌BA500的方法。表达外源蔗糖通透酶、蔗糖水解酶及果糖激酶基因的表达质粒。
(1)利用LB培养基，于37℃、有氧条件下培养大肠杆菌AFP111至OD600＝0.5～0.6，利用CaCl2法制备缺乏乳酸脱氢酶基因(ldhA)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)活性且磷酸转移酶系统的ptsG基因染色体自发突变的大肠杆菌AFP111感受态菌株；
LB培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L。
(2)合成不带酶切位点的引物，
上游引物：5’-CCGGTTGAGGGATATAGAGCTATCGAC-3’；
下游引物：5’-CTGTTGATCCGTTGTTCCACCTGAT-3’。
提取E.coli W基因组，以E.coli W基因组为模板，PCR扩增目的基因片段，具体反应条件为：94℃，10min；(94℃45s，60℃45s，72℃4min，35个循环)；72℃，10min。纯化扩增出包含蔗糖通透酶(cscB)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)以及自身启动子的一个片段(具体见图示2)。PCR产物cscBKA鉴定如图4所示。
以PCR回收产物为模板，加上一定量的酶、缓冲液、dNTP，72℃20分钟反应，最终片段平滑末端分别加“A”碱基。经过加A反应后的片段，与pMD19-T 载体进行TA连接获得重组质粒pMD19-T-cscBKA(连接图示见图3)。构建得到利用片段自身启动子表达蔗糖通透酶(cscB)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)的表达质粒。质粒pMD19-T-cscBKA的单酶切鉴定如图5所示。
(3)将步骤(2)所述的质粒利用热击法导入步骤(1)得到的感受态菌株，获得阳性转化子；
(4)利用步骤(3)的阳性转化子表达蔗糖通透酶(cscB)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)，得到一株能够高效利用蔗糖和糖蜜生长并产丁二酸大肠埃希氏菌BA500。
实施例2
本实施例说明将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA500进行连续培养驯化的方法。
将实施例1中构建得到的大肠埃希氏菌BA500作为出发菌株。1％(v/v)接种量从冻存管接入试管中，37℃，200rpm培养过夜，再以1％(v/v)接种量接入三角瓶中，37℃、200rpm培养6-8h得到对数生长期的菌液；将对数生长期的菌液以10％(v/v)的接种量接种到装有300mL发酵培养基的500mL连续培养装置中，37℃水浴加热，通入过滤除菌的CO2维持厌氧环境，并以1.5mL/h的速率向培养装置中流加新鲜的发酵培养基。定时取样检测培养装置中菌体的密度，当反应器中菌体密度达到OD600＝2～3，并保持48h无较大变化，说明表示菌体在该流加速度下生长稳定，获得突变株，此时驯化过程完成一个循环。将新鲜发酵培养基的流加速度加倍，进行下一个循环的连续培养。直至发酵培养基的流加速度达到12mL/h，突变菌株生长性能在该条件下维持稳定。
其中，所述的种子培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L。
所述发酵培养基的配方为：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，20.0mgL-1VB1,2.0mg L-1生物素，蔗糖30-40g/L。
实施例3
本实施例说明筛选得到优良大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA501的方法。筛选步骤：
1、固体平板初筛
在无菌操作条件下，从连续培养装置中取出2-4mL菌液，用无菌水稀释1×104倍，取100μL涂布在含有2％蔗糖的固体平板上，37℃培养12h，挑选出挑选生长速度快，较为饱满的突变株单菌落。
2、固体平板复筛
将筛选到的突变菌株在平板上反复转点培养，最终得到了菌株BA501、BA516，BA528显示了较强的生长速率和生长稳定性。
3、摇瓶发酵筛选
将突变株BA500、BA501、BA516和BA528接入种子培养基中培养，37℃，200r/min，培养12h，再以1％(v/v)接种量接入含有50mL培养基的三角瓶中，37℃、200rpm生长6-8h。然后接种到发酵培养基中，100mL厌氧血清瓶装液量30mL，接种量10％(v/v)，充二氧化碳2min，37℃，200r/min，培养48h。
其中，所使用的培养基配方如下：
固体平板培养基：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，20.0mg L-1VB1,2.0mg L-1生物素，琼脂15-20g/L，蔗糖20g/L。
种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L。
发酵培养基：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，20.0mg L-1VB1,2.0mg L-1生物素，碱式碳酸镁24-36g/L，蔗糖30-45g/L。
表1筛选得到的优良菌株和出发菌株的生长及产酸比较
发酵结果如表1所示。从该表可以看出出发菌株AFP111不可以利用蔗糖，分子改造后的BA500可以利用蔗糖，但其生长缓慢并且丁二酸产量低。但经连续培养装置驯化后得到的菌株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA501，在发酵培养基中的生长速度较快，丁二酸的产量比较高，达到了36g/L。
实施例4
本实施例说明大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA501利用蔗糖发酵产丁二酸的能力。
大肠埃希氏菌BA501按1％(v/v)接种量从冻存管接入试管中，37℃，200rpm培养过夜，再以1％(v/v)接种量接入含有LB培养基的三角瓶中，37℃、200rpm生长。当有氧培养菌体OD600至3左右时，按接种量10％转接至含有厌氧发酵培养基的血清瓶中厌氧发酵，充CO2两分钟，并在37℃，200r/min厌氧发酵48小时。
有氧阶段培养基为：LB(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L)+Amp(氨苄青霉素100μg/mL)+Chl(氯霉素25μg/mL)+Kar(卡那霉素30μg/mL)
厌氧阶段培养基为：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，20.0mg L-1VB1,2.0mg L-1生物素+蔗糖(42g/L)+碱式碳酸镁34g/L+Amp(氨苄青霉素100μg/mL)+Chl(氯霉素25μg/mL)+Kar(卡那霉素30μg/mL)。
发酵结果表2所示，发酵培养48h后检测到丁二酸的产量为36g/L，丁二酸转化率为87％，发酵过程证明BA501在合成培养基中可以高效利用蔗糖。
表2大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA501利用蔗糖发酵产丁二酸的能力
实施例5
本实施例说明大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA501利用蔗糖发酵产丁二酸的能力。
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA501按10％的接种量将种子液接入装有1.5L发酵培养基的3L发酵罐中，培养基中含有30g/L的蔗糖。37℃有氧培养至培养基中的残糖小于0.5g/L,37℃、200r/min以0.5L/min的速率持续通入CO2，进行厌氧发酵。
种子培养基：LB(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L)+Amp(氨苄青霉素100μg/mL)+Chl(氯霉素25μg/mL)+Kar(卡那霉素30μg/mL)
发酵培养基：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，20.0mg·L-1VB,2.0mg·L-1生物素+蔗糖(60g/L)+Amp(氨苄青霉素100μg/mL)+Chl(氯霉素25μg/mL)+Kar(卡那霉素30μg/mL)
发酵结果如图6所示，发酵培养36h后检测到丁二酸的产量为51g/L，丁二酸转化率为87％，发酵过程证明BA501在合成培养基中可以高效利用蔗糖。
实施例6
本实施例说明大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA501利用糖蜜发酵产丁二 酸的能力。
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BA501按10％的接种量将种子液接入装有1.5L发酵培养基的3L发酵罐中，培养基中含有总糖为30g/L的糖蜜。37℃有氧培养至培养基中的残糖小于0.5g/L,37℃、200r/min以0.5L/min的速率持续通入CO2，进行厌氧发酵。
种子培养基：LB(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L)+Amp(氨苄青霉素100μg/mL)+Chl(氯霉素25μg/mL)+Kar(卡那霉素30μg/mL)
发酵培养基：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，20.0mg·L-1VB,2.0mg·L-1生物素+糖蜜(总糖为60g/L)+Amp(氨苄青霉素100μg/mL)+Chl(氯霉素25μg/mL)+Kar(卡那霉素30μg/mL)
需要说明的是总糖为60g/L的糖蜜中含有40.8g/L的蔗糖、9.6g/L的葡萄糖、9.6g/L的果糖。
发酵结果如图7所示，发酵培养36h后检测到丁二酸的产量为53g/L，丁二酸转化率为88％，发酵过程证明BA501在合成培养基中可以高效利用糖蜜。
Claims (8)
1.一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌 BA501（Escherichia coli BA501），其保藏号登记号为CCTCC NO：M2014014。
2.权利要求1所述的大肠埃希氏菌BA501（Escherichia coli BA501）的构建方法，其特征在于：以缺乏乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因活性和染色体ptsG基因发生自发突变的大肠杆菌 AFP111为出发菌株，表达外源蔗糖通透酶、蔗糖水解酶及果糖激酶基因后，经连续驯化培养，得到能够高效利用蔗糖和糖蜜生长并产丁二酸大肠埃希氏菌 BA501。
3.根据权利要求2所述的大肠埃希氏菌BA501构建方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）利用CaCl2法制备缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性和磷酸转移酶系统的ptsG染色体发生自发突变的E.coli感受态菌株； （2）纯化扩增出包含蔗糖通透酶、蔗糖水解酶、果糖激酶及其自身启动子的一个片段，构建得到表达蔗糖通透酶、蔗糖水解酶、果糖激酶的表达质粒；
（3）将步骤（2）所述的质粒利用热击法导入步骤（1）得到的感受态菌株，获得阳性转化子；
（4）利用步骤（3）的阳性转化子表达蔗糖通透酶、蔗糖水解酶、果糖激酶，得到一株能够利用蔗糖和糖蜜生长并产丁二酸大肠埃希氏菌BA500（Escherichia coli BA500）；
（5）将步骤（4）所得的大肠埃希氏菌BA500经连续驯化培养后，利用以蔗糖为单一性碳源的固体培养基平板，筛选得到可以快速生长的突变菌株，再经过厌氧摇瓶发酵筛选获得可以高产丁二酸的菌株为目标菌株BA501。
4.利用权利要求2所述的大肠埃希氏菌 BA501发酵生产丁二酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于将大肠埃希氏菌BA501按体积比1%接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体至OD600 = 3时，按接种量10% 转接至含有厌氧阶段发酵培养基的血清瓶中，充CO2两分钟，并在37℃，200 r/min厌氧发酵48小时。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于将大肠埃希氏菌 BA501按10％的接种量将种子液接入装有1.5 L发酵培养基的3 L发酵罐中，37 ℃有氧培养至菌体生长至OD600 = 30，37℃、200 r/min以0.5 L/min的速率持续通入CO2，进行厌氧发酵。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述的厌氧阶段发酵培养基是以蔗糖或糖蜜为碳源的合成培养基。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的有氧阶段发酵培养基是以蔗糖为碳源的合成培养基。
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