CN103756939B - 一株土芽孢乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种土芽孢乳杆菌HKM-1，及利用其发酵生产D-乳酸的方法。本发明的土芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus terrae)HKM-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2013389，同时保藏于德国微生物菌种保藏中心，保藏号DSM No.27555。HKM-1能够利用廉价氮源-玉米浆干粉发酵生产D-乳酸，最高D-乳酸发酵产量为197g/L，对应的发酵周期仅为47h，发酵生产能力高达4.19g/L/h，远超过目前已公开报道的值；本发明所使用的菌株HKM-1，具有稳定的高产性能和产高光学纯度D-乳酸特点，所产的D-乳酸光学纯度达99.9%；发酵所用的原料来源广泛，价格低廉，发酵状态介于厌氧和微氧之间；利用本发明的方法发酵生产D-乳酸，能够节约成本，提高生产效率，具有重要的工业应用价值。

Description

一株土芽孢乳杆菌及其应用
技术领域
本发明公开了一株D-乳酸制备技术领域的菌株及其应用方法，具体是一种利用廉价氮源-玉米浆干粉作为有机氮源制备高光学纯度、高浓度D-乳酸的土芽孢乳杆菌及其应用方法。
背景技术
乳酸（lactic acid）又名α-羟基丙酸（α-hydroxypropionic acid），因旋光性不同，可以分为D-乳酸、L-乳酸和DL-乳酸。其生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法，化学法只能合成DL-乳酸，而发酵法根据所采用菌株的不同，可以合成单一的L-乳酸、D-乳酸或者DL-乳酸。目前，约90％的乳酸是通过微生物发酵法生产的。由于人体只有代谢L-乳酸的L-乳酸脱氢酶，L-乳酸作为食品添加剂等被广泛使用，加之L-乳酸在聚乳酸方面的应用，L-乳酸高产菌的选育及高效生产工艺已得到高度的开发，而D-乳酸的研究则相对较少。
D-乳酸作为一个重要的手性中间体，广泛的应用于医药、农药、化工等方面的多种手性物质合成。尤其是D-乳酸可作为下一代高强度生物可降解塑料聚乳酸的单体，引起全球大公司和科学家的高度关注。D-乳酸的全球需求量每年都以6～8％的速度增长，目前全世界D-乳酸的产量为1.6万吨，而D-乳酸的需求量约2.6万吨，由此可见，D-乳酸的市场前景广泛。
近年来，芳氧丙酸类除草剂在农业中的应用越来越广泛，这类除草剂是国际上最早实现工业化生产的一大类旋光性除草剂，此类除草剂中有一个手性碳原子，其中D(-)型的药性比L(+)型高出6～12倍，合成这类除草剂最重要的原料是R-(+)-2-氯丙酸。以D-乳酸为原料可以制备光学活性的R-(+)-2-氯丙酸，即D-乳酸是制备这类除草剂的光学活性前体。
随着新型生物材料的普及推广，L-乳酸、D-乳酸在新材料的应用方面有了很大的发展。例如，以乳酸为原料来制造聚乳酸类（PLA）生物降解塑料。聚乳酸以其良好的生物可降解性及其它优良的使用特性（如透明性、热塑性、产物安全性等）而被认为是理想的取代传统塑料的生物材料之一。聚乳酸（PLA）分为聚D-乳酸（PDLA）、聚L-乳酸（PLLA）和聚DL-乳酸（PDLLA）。由纯的D-乳酸、L-乳酸或者DL-乳酸聚合而成的聚乳酸具有更好的稳定性，其中，PDLA具有更好的热稳定性。聚乳酸具有良好的生物可降解性，在使用之后可以被自然界中微生物完全降解，不污染环境，对环境保护非常有利。
南京工业大学丁子建等于2004年首次报道利用芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)从葡萄糖发酵产D-乳酸的工艺，发酵72h后产酸40.7g/L，光学纯度96％；南京工业大学杨文革等在2006年发表组合发酵生产D-乳酸工艺(中国专利申请号CN200610097453.6)以乳杆菌(Lactobacillus)进行有氧、微氧、厌氧三段组合发酵技术，发酵时间25～38h，产酸达到75～131g/L；申请号为CN201010101421.5的中国发明专利公开了利用重组大肠杆菌以甘油为原料发酵制备D-乳酸的方法，但是菌株对酸的耐受性差，生产率低，使得大肠杆菌在D-乳酸实际应用当中受到限制；申请号为CN201010247826.X的中国发明公开了利用基因工程手段，成功构建了产高光学纯度D-乳酸的基因工程菌并利用其进行乳酸发酵生产，其D-乳酸产量达到40g/L以上，纯度为99％以上；申请号为CN201010235511.3的中国发明专利公开了利用同源重组的方法得到产纯D-乳酸的基因工程菌并用其进行乳酸发酵生产，其D-乳酸产量仅为20g/L以上，纯度为99％以上；申请号为CN201010235511.3的中国发明专利公开了利用同源重组的方法得到产纯D-乳酸的基因工程菌并用其进行乳酸发酵生产，其D-乳酸产量仅为20g/L以上，纯度为99％以上。上述现有技术中D-乳酸的产量普遍不高。继续检索发现：申请号为CN200810098908.5的中国发明专利公开了一株高光学纯度D-乳酸生产菌及其发酵生产D-乳酸的工艺，申请号为CN201210472413.0的中国发明专利公开了一株乳杆菌及利用其发酵生产D-乳酸的方法，申请号为CN201010208148.6的中国发明专利公开了一种采用花生粕同步酶解发酵生产高浓度D-乳酸的方法及其专用培养基。上述现有技术发酵时间过长，均在70h以上。这些公开的技术，与L-乳酸生产菌株和方法相比，D-乳酸生产菌株和方法存在发酵时间过长或者产D-乳酸浓度相对较低的缺点，需要进一步开发基于高效D-乳酸生产菌株的生产方法。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种用于制备D-乳酸的芽孢乳杆菌及其应用方法，可以直接利用六碳糖，如葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖等作为碳源；酵母粉、蛋白胨、花生粕、玉米浆干粉作为氮源发酵生产D-乳酸，发酵生产高浓度、高光学纯度的D-乳酸，在节约成本的同时提高生产效率，适合于工业生产中推广应用。所述芽孢乳杆菌为土芽孢乳杆菌(Sporolactobacillusterrae)HKM-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCCNO:M2013389，保藏日期为：2013年9月2日，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，分类命名：土芽孢乳杆菌Sporolactobacillus terrae。
本发明是通过以下技术方案实现的：本发明涉及上述用于制备D-乳酸的芽孢乳杆菌的应用方法：首先对芽孢乳杆菌进行种子培养获得种子培养液，然后以葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖作为碳源，酵母粉、蛋白胨、花生粕、玉米浆干粉作为氮源的发酵培养基进行发酵培养，得到D-乳酸。
具体包括如下步骤：
1）斜面培养
将土芽孢乳杆菌（HKM-1）菌种接种于含有20g/L琼脂的固体斜面培养基上，40～45℃条件下，培养24～48h；
2）种子培养
将经过斜面培养的芽孢乳杆菌在无菌条件下接种到种子培养基中，35～45℃条件下，静止培养24～36h，加入中和剂控制发酵液pH，制得种子培养液；
3）发酵培养
按5～20％体积比的接种量接入到发酵培养基中，在35℃～45℃环境下培养48～72h，温度优选42℃。
优选地，步骤2）所述的种子培养基每升中含有：葡萄糖100～120g，酵母粉8～12g，蛋白胨3～8g，碳酸钙50g，余量为水，优选含有：葡萄糖100g，酵母粉10g，蛋白胨5g，碳酸钙50g，余量为水；该种子培养基的pH为6.0。115℃灭菌15min。中和剂包括NaOH、NH4OH和Ca(OH)2中的一种或几种。
优选地，步骤3）中所述的发酵培养基的组分及其含量为：碳源40～120g/L、氮源添加量5～20g/L。
优选地，步骤3）中所述的发酵培养基的组分及其含量为：葡萄糖/蔗糖/麦芽糖/果糖40～120g/L、玉米浆干粉10～20g/L、酵母粉3～10g/L、蛋白胨3～10g/L、花生粕5～20g/L，用于调控培养基pH的中和剂(NH4OH、NaOH、Ca(OH)2)，余量为水。115℃灭菌15min。
优选地，步骤3）中所述的发酵工艺为补料流加工艺，该补料流加工艺是指：当发酵液中总还原糖含量低于20～30g/L时补加碳源，使总还原糖含量维持在30～70g/L，或达到50～70g/L。
优选地，所述的发酵培养基的pH为5.0～7.0。
以葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖作为碳源，酵母粉、蛋白胨、花生粕、玉米浆干粉作为氮源。上述原料可从商业途径获得。
本发明选用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖作为碳源，酵母粉、蛋白胨、花生粕、玉米浆干粉作为氮源，通过提供相应的发酵工艺条件，使得该D-乳酸生产工艺原料易得，成本低廉，D-乳酸产量最高可达197g/L，光学纯度大于99.9%，糖酸转化率最高可达0.94g/g，发酵生产能力4.19g/L/h。因此，利用本发明方法生产D-乳酸，能节约成本、简化操作流程，具有广阔的工业应用前景。
附图说明
图1为土芽孢乳杆菌（HKM-1）的16S rRNA系统进化树分析图。
图中：实线的水平距离（长度之和）代表菌株的进化距离，选取的参照菌是与本发明提供的土芽孢乳杆菌（HKM-1）亲缘关系较近的菌株，共10株。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，本发明的保护范围包括但不限于下述的实施例。
以下实施例涉及的土芽孢乳杆菌(HKM-1)的分离、筛选和鉴定方法如下：
一、菌株的分离、筛选
该实施例中所用的培养基的组成如下：
营养液体培养基：葡萄糖80g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨3g/L，碳酸钙35g/L，pH为6。
营养琼脂培养基：葡萄糖40g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5%，碳酸钙2g/L，琼脂粉20g/L，pH为6。115℃灭菌15min。
菌株筛选培养基：葡萄糖120g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，碳酸钙50g/L，pH为6。115℃灭菌15min。
该实施例的具体操作过程如下：
采集自云南的土壤，称取2g溶于40mL营养液体培养基中，42℃富集培养24h。然后用无菌的生理盐水稀释培养液，分别稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍后涂布到含营养琼脂培养基的培养皿中，42℃培养48h。待长出单菌落后，挑选菌落面积和产酸透明圈面积大的菌落，接种到发酵培养基中，42℃静止培养48h，测定D-乳酸的产量，经过多次筛选，挑取一株D-乳酸产量较高的菌株。
将上述菌株多次在营养琼脂平板上划线分离纯化，然后再进行10个循环的发酵测试，10次循环发酵产生的D-乳酸产量和转化率基本保持原有水平，证明上述菌株即是目标菌株，名称为HKM-1。
二、菌株的鉴定
1.菌株HKM-1的生理生化鉴定：
生理生化鉴定在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）完成，具体生理生化鉴定如表1、表2所示。
2.菌株HKM-116S rRNA系统进化树分析
对菌株HKM-1进行培养，当OD600为2～5时，抽提菌株HKM-1的全基因组，然后扩增菌株HKM-1的16S rRNA的DNA序列。选取的参照菌是与本发明提供的菌株亲缘关系较近的菌株，共10株，菌株HKM-1的系统进化树分析图见图1。
表1土芽孢乳杆菌HKM-1(革兰氏阳性菌)生理生化特性–利用碳源产酸
+：阳性，-：阴性，w：弱阳性
表2菌株HKM-1生理生化特性-酶活、碳源同化
+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应
根据上述检测结果，结合16S rRNA诊断区分析，将菌株HKM-1鉴定为土芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus terrae），并将其保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏号为DSM No.27555；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2013389。
3.土芽孢乳杆菌HKM-1与已经公开的菌株DSM11697的比较
虽然土芽孢乳杆菌HKM-1与DSM11697两株菌经16SrRNA的DNA序列比对，相似性为100%，但根据文献Yanagida F,Suzuki K I,Kozaki M,et al.Proposal of Sporolactobacillus nakayamae subsp.nakayamae sp.nov.,subsp.nov.,Sporolactobacillus nakayamae subsp.racemicus subsp.nov.,Sporolactobacillusterrae sp.nov.,Sporolactobacillus kofuensis sp.nov.,and Sporolactobacilluslactosus sp.nov[J].International journal of systematic bacteriology,1997,47(2):499-504.报道的信息，与表1“菌株HKM-1生理生化特性–利用碳源产酸”部分进行对比，发现这两株菌有六种糖的利用存在明显的差异，如表3所示：
表3土芽孢乳杆菌HKM-1与菌株DSM11697生理生化特性–利用碳源产酸比较
+：阳性，–：阴性
gyrB基因为DNA促旋酶中B亚单位蛋白的基因，该基因序列在区分和鉴定细菌近缘种方面，比非蛋白编码基因16S rDNA具有更高的分辨率。土芽孢乳杆菌HKM-1的gyrB保守基因序列如序列表（二），长1,920bp，与DSM11697的gyrB基因序列相比，有两个碱基的差异。
据此，可以认为土芽孢乳杆菌HKM-1不同于之前报道的土芽孢乳杆菌的模式菌DSM11697，为一株新的土芽孢乳杆菌。
本实施例得到一株可以利用玉米浆干粉作为氮源生成D-乳酸的菌株。
所述的菌株为革兰氏阳性菌，细胞直杆，营养细胞的菌体大小为（0.8～0.9）μm×（3.0～5.0）μm。形成内生孢子。在含有葡萄糖、酵母粉和蛋白胨的琼脂平板上形成表面光滑、乳白色、边缘整齐的圆形菌落；该菌形成细小、淡乳白色、边缘整齐的圆形菌落。
以下实施例涉及的利用土芽孢乳杆菌HKM-1发酵生产D-乳酸方法的步骤如下：
（1）斜面培养：将土芽孢乳杆菌HKM-1菌种接种于含有20g/L琼脂的固体斜面培养基上，40～45℃条件下，培养24～48h。
（2）种子培养：将步骤（1）的斜面培养物，在无菌条件下接种到40mL种子培养基中，35～45℃条件下，静止培养24～36h，加入中和剂控制发酵液pH，制得种子培养液。
（3）发酵培养：以5～20％体积比的接种量，将种子培养液接种于发酵培养基中，35～45℃条件下培养48～72h。
其中，步骤（1）、（2）、（3）中所述的菌体培养温度优选是42℃。
其中，步骤（2）、（3）所述的培养过程中加入的中和剂为碳酸钙，控制pH。
上述发酵培养过程中，每5个小时取发酵液，先用12,000rpm离心5min，取上清，沸水浴加热10min，再用12,000rpm离心5min，取上清液检测发酵液中L-乳酸浓度、D-乳酸浓度、葡萄糖浓度，计算糖酸转化率、D-乳酸发酵生产能力和D-乳酸光学纯度。
总还原糖的测定方法为DNS法。葡萄糖的测定方法为，发酵液稀释后离心，采用生物传感分析仪SBA-40D（山东省科学院）测定。生物传感分析仪SBA-40D是以固定化酶为传感器的分析仪器，葡萄糖与氧气、水在酶的催化下生成双氧水。反应放出的双氧水与白金－银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与葡萄糖浓度成线性比例关系，通过测定电流信号强度可得出葡萄糖浓度。
L-乳酸的测定方法为，采用生物传感分析仪SBA-40D，发酵液稀释100倍，用针管吸取25μL稀释液快速注入生物传感分析仪SBA-40D中，可直接读出L-乳酸的含量。
D-乳酸的测定使用Agilent1100液相色谱仪，配备手性分离柱（日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS10W(3μ)4.6ID×50mm，光学异体分离用）。具体操作条件为：0.005mol/L硫酸铜作为流动相，流量0.7mL/min，进样量5μl，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25℃。利用D-乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中D-乳酸的含量。
本发明中，作为标准品的D-乳酸为德国Sigma-Aldrich公司的产品，其货号为L0625-25MG。在如上色谱条件下，D-乳酸保留时间为6.5min。
光学纯度（optical purity）是衡量旋光性样品中一个对映体超过另一个对映体的量的量度，它可用对映体过量值（enantiomeric excess，ee）表示。本发明中L-乳酸的光学纯度（ee）按以下公式计算：[(D-乳酸产量（g/L）－L-乳酸产量（g/L）)÷(D-乳酸产量＋L-乳酸产量)]×100％。
糖酸转化率定义为（g/g）：D-乳酸产量（g）÷底物消耗量（g）。
D-乳酸生产速率（g/L/h）为：L-乳酸产量（g/L）÷发酵时间（h）。
实施例1
利用土芽孢乳杆菌(HKM-1)在三角瓶中以葡萄糖为碳源，玉米浆干粉作为氮源分批发酵生产D-乳酸
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基每升中含有：葡萄糖30～50g，酵母粉5～10g，蛋白胨2～8g，碳酸钙50g，琼脂粉15～25g，余量为水。所述斜面培养基的pH为6.0。115℃灭菌15min。
种子培养基每升中含有：葡萄糖40～120g，酵母粉5～10g，蛋白胨2～8g，碳酸钙50g，余量为水。所述种子培养基的pH为5.0～7.0。115℃灭菌15min。
发酵培养基每升中含有：葡萄糖60～120g，玉米浆干粉20g，碳酸钙50g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～6.5。115℃条件下灭菌15min。
本实施例所述发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
（1）斜面培养：将土芽孢乳杆菌(HKM-1)接种于斜面培养基上，42℃培养24h；
（2）种子培养：将步骤（1）培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有40mL种子培养基的100mL三角瓶中，42℃静止培养24h，制得种子培养液；
（3）发酵培养：将5mL步骤（2）制得的种子培养液接入装有40mL发酵培养基的100mL三角瓶中，42℃静止培养，当D-乳酸的变化速率为0时，视为发酵结束。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中D-乳酸浓度和总还原糖浓度，计算糖酸转化率及生产速率。
该实验共设3次重复，结果见表4。
表4以葡萄糖为碳源D-乳酸的生成情况
实施例2
利用土芽孢乳杆菌(HKM-1)在三角瓶中以蔗糖为碳源，玉米浆干粉为氮源，分批发酵生产D-乳酸：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：蔗糖60～120g，玉米浆干粉20g，碳酸钙50g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.0～7.0。115℃条件下灭菌15min。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
（1）斜面培养：同实施例1；
（2）种子培养：同实施例1；
（3）发酵培养：将5mL步骤（2）制得的种子培养液接入装有40mL发酵培养基的100mL三角瓶中，42℃静止培养，当D-乳酸的变化速率为0时，视为发酵结束。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中D-乳酸浓度和总还原糖浓度，计算糖酸转化率及生产速率。
该实验共设3次重复，结果见表5。
表5以蔗糖为碳源D-乳酸的生成情况
实施例3
利用土芽孢乳杆菌(HKM-1)在三角瓶中以麦芽糖为碳源，玉米浆干粉为氮源，42℃摇瓶静止发酵生产D-乳酸。当葡萄糖和D-乳酸含量保持稳定时，结束发酵。
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：麦芽糖60～120g，玉米浆干粉20g，碳酸钙100g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.0～7.0。115℃条件下灭菌15min。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
（1）斜面培养：同实施例1。
（2）种子培养：同实施例1。
（3）发酵培养：将5mL步骤（2）制得的种子培养液接入装有40mL发酵培养基的100mL三角瓶中，42℃静止培养，当D-乳酸的变化速率为0时，视为发酵结束。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中D-乳酸浓度和总还原糖浓度，计算糖酸转化率及生产速率。
该实验共设3次重复。结果如表6：
表6以木糖为碳源D-乳酸的生成情况
实施例4
利用土芽孢乳杆菌(HKM-1)在三角瓶中以果糖为碳源，玉米浆干粉为氮源，42℃摇瓶静止发酵生产D-乳酸。当葡萄糖和D-乳酸含量保持稳定时，结束发酵。
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：阿拉伯糖60～120g，玉米浆干粉20g，碳酸钙100g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.0～7.0。115℃条件下灭菌15min。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
（1）斜面培养：同实施例1。
（2）种子培养：同实施例1。
（3）发酵培养：将5mL步骤（2）制得的种子培养液接入装有40mL发酵培养基的100mL三角瓶中，42℃静止培养，当D-乳酸的变化速率为0时，视为发酵结束
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中D-乳酸浓度和总还原糖浓度，计算糖酸转化率及生产速率。
该实验共设3次重复。结果如表7：
表7以果糖为碳源D-乳酸的生成情况
实施例5
利用土芽孢乳杆菌(HKM-1)在三角瓶中分别选用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖为碳源，酵母粉、蛋白胨、花生粕粉、玉米浆干粉为氮源，42℃摇瓶静置发酵生产D-乳酸。当D-乳酸含量保持稳定时，结束发酵。
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖60～120g，酵母粉3～10g、蛋白胨3～10g、花生粕粉5～20g、玉米浆干粉5～20g，碳酸钙100g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.0～7.0。115℃条件下灭菌15min。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
（1）斜面培养：同实施例1。
（2）种子培养：同实施例1。
（3）发酵培养：将5mL步骤（2）制得的种子培养液接入装有40mL发酵培养基的100mL三角瓶中，42℃静止培养，当D-乳酸的变化速率为0时，视为发酵结束。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中D-乳酸浓度。
该实验共设3次重复。结果如表8：
表8以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖为碳源；酵母粉、蛋白胨、玉米浆干粉、花生粕粉为氮源D-乳酸的生成情况
实施例6
利用土芽孢乳杆菌(HKM-1)在5升全自动发酵罐中以120g/L的葡萄糖为碳源，20g/L的玉米浆干粉，10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，40g/L花生粕粉为氮源，补料（糖）流加发酵生产D-乳酸。
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：葡萄糖120g，玉米浆干粉20g，酵母粉10g，蛋白胨10g，花生粕粉40g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～6.5。115℃条件下灭菌15min。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
（1）斜面培养：同实施例1；
（2）种子培养：将步骤（1）培养的菌株在无菌条件下用接种环接2环于装有40mL种子培养基的40mL三角瓶中，42℃静止培养24h，制得种子培养液1；将5mL种子培养液1在无菌条件下接入装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，42℃静止培养24h，制得种子培养液2。
（3）发酵培养：将400mL步骤（2）制得的种子培养液2在无菌条件下接入装有3.6L发酵培养基的发酵罐中，42℃、70rpm搅拌培养，每10个小时取样一次，测定发酵液中的残糖量，当葡萄糖浓度降到20～30g/L时，流加葡萄糖，使葡萄糖浓度达到50～70g/L，共计补糖2次。当发酵过程中葡萄糖消耗速率趋于0时，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中D-乳酸浓度。
该发酵实验共设3次重复，结果见表9。
表9以葡萄糖为碳源，花生粕粉、酵母粉、蛋白胨、玉米浆干粉作为氮源时D-乳酸的生成情况、糖转化率及生产速率
实施例7
利用土芽孢乳杆菌(HKM-1)在5升全自动发酵罐中以120g/L的葡萄糖为碳源，5g/L的玉米浆干粉，0.9g/L的磷酸氢二钾，3.5g/L的柠檬酸三胺，接种量20%，补料（糖）流加发酵生产D-乳酸。
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：葡萄糖120g，玉米浆干粉5g，磷酸氢二钾0.9g，柠檬酸三胺3.5g，余量为水；所述发酵培养基的pH为5.5～6.5。115℃条件下灭菌15min。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
（1）斜面培养：同实施例1；
（2）种子培养：将步骤（1）培养的菌株在无菌条件下用接种环接2环于装有40mL种子培养基的40mL三角瓶中，42℃静止培养24h，制得种子培养液1；将5mL种子培养液1在无菌条件下接入装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，42℃静止培养24h，制得种子培养液2。
（3）发酵培养：将800mL步骤（2）制得的种子培养液2在无菌条件下接入装有3.2L发酵培养基的发酵罐中，42℃、70rpm搅拌培养，每10个小时取样一次，测定发酵液中的残糖量，当葡萄糖浓度降到20～30g/L时，流加葡萄糖，使葡萄糖浓度达到50～70g/L，共计补糖2次。当发酵过程中葡萄糖消耗速率趋于0时，结束发酵。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中D-乳酸浓度。
该发酵实验共设3次重复，74h发酵结束，D-乳酸产量为152±3g/L、生产速率2.05g/L/h、糖酸转化率0.79g/g。
实施例8
利用土芽孢乳杆菌(HKM-1)在5升全自动发酵罐中以初糖浓度为120g/L的葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖、麦芽糖为碳源，20g/L的玉米浆干粉为氮源，10mol/L的NaOH、250g/L NH4OH、250g/L的碳酸钙为中和剂，补料（糖）流加发酵生产D-乳酸。
本实施例中所使用的各培养基的组成如下：
斜面培养基和种子培养基同实施例1。
发酵培养基每升中含有：葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖120g，玉米浆干粉20g，余量为水；20g/L的玉米浆干粉为氮源，所述发酵培养基的pH为5.0～7.0。115℃条件下灭菌15min。
该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
（1）斜面培养：同实施例1；
（2）种子培养：将步骤（1）培养的菌株在无菌条件下用接种环接2环于装有40mL种子培养基的100mL三角瓶中，42℃静止培养24h，制得种子培养液1；将40mL种子培养液1在无菌条件下接入装有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，42℃静止培养24h，制得种子培养液2；继续以相同方式扩大种子培养，得到400mL种子培养液3。
（3）发酵培养：将4mL步骤（2）制得的种子培养液3在无菌条件下接入装有3.6L发酵培养基的5升全自动发酵罐（上海百伦）中，42℃、50～100rpm搅动培养。每10个小时取样一次，测定发酵液中的残糖量和D-乳酸浓度，当碳源浓度降到20～30g/L时，流加补糖，使糖浓度达到50～70g/L。48h时，结束发酵，测定D-乳酸的浓度。
发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中D-乳酸浓度。
该发酵实验共设3次重复，结果见表10。
表10以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖为碳源；250g/L的NH4OH、10mol/L的NaOH、250g/L的Ca(OH)2为中和剂，D-乳酸的生成情况、生产速率：
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种芽孢乳杆菌，其特征在于，所述芽孢乳杆菌为土芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus terrae)HKM-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013389。
2.根据权利要求1所述的土芽孢乳杆菌HKM-1在发酵制备D-乳酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以六碳糖作为碳源，以酵母粉、玉米浆干粉、蛋白胨和花生粕中的一种或多种作为氮源，进行发酵后得到D-乳酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述六碳糖为葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖中的一种或多种。
5.一种制备D-乳酸的方法，包括如下步骤：
1)斜面培养
将保藏编号为CCTCC NO:M 2013389的土芽孢乳杆菌HKM-1菌种接种于含有20g/L琼脂的固体斜面培养基上，40～45℃条件下，培养24～48h；
2)种子培养
将经过斜面培养的土芽孢乳杆菌在无菌条件下接种到种子培养基中，35～45℃条件下，静止培养24～36h，加入中和剂控制发酵液pH，制得种子培养液；
3)发酵培养
按5～20％体积比的接种量接入到发酵培养基中，在35℃～45℃环境下培养48～72h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2)所述的种子培养基每升中含有：葡萄糖100～120g，酵母粉8～12g，蛋白胨3～8g，碳酸钙30～60g。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述的发酵培养基的组分及其含量包括：碳源40～120g/L、氮源添加量5～20g/L。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述的发酵培养基的组分及其含量包括：碳源40～120g/L、玉米浆干粉10～20g/L、酵母粉3～10g/L、蛋白胨3～10g/L、花生粕5～20g/L。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述的发酵工艺为补料流加工艺，该补料流加工艺是指：当发酵液中总还原糖含量低于20～30g/L时补加碳源，使总还原糖含量维持在30～70g/L。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的中和剂包括NaOH、NH4OH和Ca(OH)2中的一种或几种，培养体系pH控制在5.0～7.0。
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