JP5217736B2 - D−乳酸の製造方法 - Google Patents
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(1)スポロラクトバチルス属(Genus Sporolactobacillus)に属する細菌を用いた発酵法によるD−乳酸の製造方法であって、0.6mg/L以上のシステインおよび0.1g/L以上0.5g/L以下のシステイン以外の窒素源を含む発酵原料を用いたD−乳酸の製造方法。
(2)前記細菌がスポロラクトバチルス・ラエボラクティカス(Sporolactobacillus laevolacticus)である(1)に記載のD−乳酸の製造方法。
培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、下記に示す条件でHPLC法により乳酸量を測定した。
・カラム:Shim−Pack SPR−H(株式会社島津製作所製)
・移動相:5mM p−トルエンスルホン酸(流速0.8mL/min)
・反応液:5mM p−トルエンスルホン酸、20mM ビストリス、0.1mM EDTA・2Na(流速0.8mL/min)
・検出方法:電気伝導度
・温度:45℃。
・カラム:TSK−gel Enantio L1(東ソー株式会社製)
・移動相 :1mM 硫酸銅水溶液
・流速:1.0ml/min
・検出方法 :UV254nm
・温度 :30℃。
・光学純度(%)=100×(D−L)/(L+D)
ここで、LはL−乳酸の濃度であり、DはD−乳酸の濃度を表す。
培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、下記に示す条件により測定した。
・装置:GC−2010(株式会社島津製作所製)
・カラム:TC−1;15m*0.53mm*1.5μm(ジーエルサイエンス社製)
・注入方法:スプリット(30:1)
・キャリアガス:ヘリウム
・メイクアップガス:ヘリウム
・気化室温度:200℃
・カラム温度:100℃
・検出器:FID
・検出器温度:200℃
・線速度:59.2cm/sec。
以下、本発明の実施例にシステイン以外の窒素源として使用した酵母エキス(BactoTM Yeast Extract(BD社))、ポリペプトンS(日本製薬社)、そして主にスクロースを含み、不純物として0.3重量%のタンパク質を含む原料糖(ムソー株式会社“優糖精”)におけるシステイン含量は、次に示す条件で次のアミノ酸分析計を用いて測定した。
上記の酵母エキスとポリペプトンSの前処理のため、各0.2201gと0.1229gを採取し、精製水に溶解して酵母エキスは12.01mlに、ポリペプトンSは12.29mlにした。その後、試料溶液450μlを別のチューブに採取し、その溶液に20%スルホサリチル酸50μlを添加して攪拌を行った。続いて、0.22μmのフィルターによりろ過して50μlを採取した。各サンプル濃度を更に10倍したものも用意し、それらを分析試料とし、L−8500形のアミノ酸分析計を用い、次の条件によりシステインの含量を測定した。
・アミノ酸分析計:L−8500形(株式会社日立製作所製)
・カラム:強酸性イオン交換樹脂 #2620M SC(株式会社日立製作所)4.6mm I.D.×8cm
・移動相:緩衝液PS−1、PS−3、PS−4及びPS−RG(L−8500形日立高速アミノ酸分析計用、和光純薬工業株式会社製)
・移動相流速:0.19mL/min
・反応溶液:ニンヒドリン試液−L8500セット(ニンヒドリン溶液、緩衝液)(L−8500形日立高速アミノ酸分析計用、和光純薬工業株式会社製)
・反応溶液流速:0.2mL/min
・化学反応槽温度:130℃
・反応時間:50秒
・検出波長:570nm、440nm
・試料注入量:50μl。
原料糖の前処理のため、水1Lに100gの原料糖を溶かし、180μlを採取して20%スルホサリチル酸20μlを添加して攪拌を行った。続いて、0.22μmのフィルターによりろ過して25μlを採取し、それを分析試料とし、L−8800A形のアミノ酸分析計を用い、次の条件によりシステインの含量を測定した。
・アミノ酸分析計:L−8800A形(株式会社日立製作所製)
・カラム:日立カスタムイオン交換樹脂 #2622(株式会社日立製作所製)6mm×25mm×2本
・アンモニアフィルタカラム:日立カスタムイオン交換樹脂#2650(株式会社日立製作所製)4.6mm×60mm
・移動相:L−8500緩衝液PF−1、PF−2、PF−3、PF−4、L−8500カラム再生液PF(L−8500形日立高速アミノ酸分析計用、和光純薬工業株式会社製)
・反応溶液:ニンヒドリン試液ワコーニンヒドリン試液−L8500セット(ニンヒドリン溶液、緩衝液)(L−8500形日立高速アミノ酸分析計用、和光純薬工業株式会社製)
・化学反応槽温度:135℃
・検出波長:570nm,440nm
・試料注入量:25μl。
スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ATCC23492株を、試験管で5mlの窒素ガスでパージしたGYC1倍地で24時間、30℃の温度で静置培養した(前培養)。前培養液を同培地で植菌し、37℃、120rpmで培養終了まで振とう培養した。
スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ATCC23492株を、試験管で5mlの窒素ガスでパージしたGYC2倍地で24時間、30℃の温度で静置培養した(前培養)。前培養液を同培地で植菌し、37℃、120rpmで培養終了まで振とう培養した。
スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ATCC23492株を、試験管で5mlの窒素ガスでパージしたGYC3倍地で24時間、30℃の温度で静置培養した(前培養)。前培養液を同培地で植菌し、37℃、120rpmで培養終了まで振とう培養した。
スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ATCC23492株を、試験管で5mlの窒素ガスでパージしたRSE倍地で24時間、30℃の温度で静置培養した(前培養)。前培養液を同培地で植菌し、37℃、120rpmで培養終了まで振とう培養した。
スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ATCC23492株を、試験管で5mlの窒素ガスでパージしたGPC倍地で24時間、30℃の温度で静置培養した(前培養)。前培養液を同培地で植菌し、37℃、120rpmで培養終了まで振とう培養した。
スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ATCC23492株を、試験管で5mlの窒素ガスでパージしたRSE培地で24時間、30℃の温度で静置培養した(前々培養)。前培養液を同培地で植菌し、37℃、120rpmで培養終了まで振とう培養した。残存総糖濃度を測り、残存糖の濃度が0.5g/Lになっていることを確認し、培養液200mlを、別の発酵槽で用意したRSC1培地800mlに植菌し、37℃、120rpmで培養終了まで振とう培養した。
スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス ATCC 23492株を、試験管で5mlの窒素ガスでパージしたRSE培地で24時間、30℃の温度で静置培養した(前々培養)。前培養液を同培地で植菌し、37℃、120rpmで培養終了まで振とう培養した。残存総糖濃度を測り、残存糖の濃度が0.5g/Lになっていることを確認し、培養液200mlを、別の発酵槽で用意したRSC2培地800mlに植菌し、37℃、120rpmで培養終了まで振とう培養した。
水1Lに100gのグルコースと0.5gの酵母エキスを溶かして作製したGY1培地を使用する他は、実施例1と同様にして、バッチ発酵試験を行った。添加した酵母エキス1gあたりに1.11mgのシステインが含まれることから、GY1培地には0.56mg/Lのシステインが含まれる。
水1Lに100gのグルコースと1gの酵母エキスを溶かして作製したGY2培地を使用する他は、実施例1と同様にして、バッチ発酵試験を行った。添加した酵母エキス1gあたりに1.11mgのシステインが含まれることから、GY2培地には1.11mg/Lのシステインが含まれる。
水1Lに100gのグルコースと5gの酵母エキスを溶かして作製したGY3培地を使用する他は、実施例1と同様にして、バッチ発酵試験を行った。添加した酵母エキス1gあたりに1.11mgのシステインが含まれることから、GY3培地には5.55mg/Lのシステインが含まれる。
図1に示す連続発酵装置を稼働させることにより、D−乳酸が連続発酵で得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地にはGYC1を用い、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜エレメントとしては図3に示される形態を採用し、分離膜には、WO2007/097260の参考例2に従って作製したポリフッ化ビニリデン(PVDF)を主成分とする多孔性膜、分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。この多孔性膜の特性を調べたところ、平均細孔径が0.1μmであり、純水透過係数が50×10-9m3/m2/s/paであった。この実施例8における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量:1.5(L)
・使用分離膜:PVDF濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積:120平方cm
・温度調整:35(℃)
・発酵反応槽通気量:100(mL/分)
・発酵反応槽攪拌速度:800(rpm)
・滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て121℃、20分のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・pH調整:8N 水酸化カルシウムによりpHを6.0に調整
・膜透過水量制御:膜分離槽水頭差により流量を制御(水頭差は2m以内で制御した。)。
図2に示す連続発酵装置を稼働させることにより、D−乳酸がで得られるかどうかを調べるため、同装置を用いた連続発酵試験を行った。培地にはGYC3を用い、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌処理して用いた。分離膜と分離膜エレメントは実施例8のものを使用した。この実施例9における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量:1.5(L)
・使用分離膜:PVDF濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積:120平方cm
・温度調整:37(℃)
・発酵反応槽通気量:100(L/分)
・発酵反応槽攪拌速度:800(rpm)
・滅菌:分離膜エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て121℃、20分のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・pH調整:8N 水酸化カルシウムによりpHを6.0に調整
・膜透過水量制御:膜分離槽水頭差により流量を制御(水頭差は2m以内で制御した。)。
実施例8で使用した多孔性膜の代わりに、分離膜としてWO2007/097260の参考例13に従って作製したポリフッ化ビニリデン(PVDF)を主成分とする中空糸膜を用いた。分離膜エレメントとしては図4に示される形態を採用した。またGPC培地を用いた他は、実施例8と同様にして、連続発酵試験を行った。
分離膜エレメントとして実施例10のものを使用し、RSC1培地を使用する他は、実施例9と同様にして、連続発酵試験を行った。
RSE培地を用いた他は、実施例11と同様にして、連続発酵試験を行った。500時間の発酵試験を行った結果、この連続発酵装置を用いることにより、安価で、且つ99%以上の高い光学純度の安定したD−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成されたが、副生産物の濃度は0.45g/Lと少なく、比較例と比べて1/3以上に削減することができた。
比較例1のGY1培地を使用する他は、実施例8と同様にして、連続発酵試験を行った。200時間の発酵試験を行った結果、光学純度が88%以下であり、発酵液中の糖も消費されず多くの糖が残存してしまった。副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成され、副生産物の濃度は1.5g/Lと多く生産されていた(表2)。
比較例2のGY2培地を使用する他は、実施例8と同様にして、連続発酵試験を行った。200時間の発酵試験を行った結果、光学純度が99%であり、発酵液中の糖も消費されず多くの糖が残存してしまった。副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成され、副生産物の濃度は1.7g/Lと多く生産されていた(表2)。
水1Lに100gの原料糖と1gの酵母エキスを溶かして作製したRSE1培地(システインを1.59mg/L含有する)を使用する他は、実施例8と同様にして、連続発酵試験を行った。200時間の発酵試験を行った結果、光学純度が99.2%であり、発酵液中の糖も消費されず多くの糖が残存してしまった。副生産物としてはピルビン酸、酢酸、ギ酸およびエタノールが生成され、副生産物の濃度は1.7g/Lと多く生産されていた。
2 分離膜エレメント
3 水頭差制御装置
4 気体供給装置
5 攪拌機
6 レベルセンサ
7 培地供給ポンプ
8 pH調整溶液供給ポンプ
9 pHセンサ・制御装置
10 温度調節器
11 発酵液循環ポンプ
12 膜分離槽
13 支持板
14 流路材
15 分離膜
16 凹部
17 集水パイプ
18 分離膜束
19 上部樹脂封止層
20 下部樹脂封止層
21 支持フレーム
22 集水パイプ
Claims (2)
- スポロラクトバチルス属(Genus Sporolactobacillus)に属する細菌を用いた発酵法によるD−乳酸の製造方法であって、0.6mg/L以上のシステインおよび0.1g/L以上0.5g/L以下のシステイン以外の窒素源を含む発酵原料を用いたD−乳酸の製造方法。
- 前記細菌がスポロラクトバチルス・ラエボラクティカス(Sporolactobacillus laevolacticus)である請求項1に記載のD−乳酸の製造方法。
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