KR101345160B1 - 화학품의 제조 방법 및 연속 발효 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미생물 또는 배양 세포의 배양액을 분리막에 의해 여과하고, 여과액으로부터 생산물을 회수하고, 또한, 미여과액을 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한, 발효 원료를 배양액에 추가하는 연속 발효에 있어서 분리막으로서 평균 세공 직경이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만인 다공성막을 사용하고, 막간 차압을 0.1~20kPa의 범위에서 여과 처리하는 화학품의 제조 방법이다. 본 발명에 의해 안정적으로 저비용으로 발효에 의한 화학품의 생산 효율을 현저하게 향상시키는 것이 가능하게 된다.
화학품

Description

화학품의 제조 방법 및 연속 발효 장치{METHOD OF PRODUCING CHEMICAL PRODUCT AND CONTINUOUS FERMENTATION APPARATUS}
본 발명은 화학품의 제조 방법 및 연속 발효 장치에 관한 것이다.
미생물이나 배양 세포의 배양을 수반하는 물질 생산 방법인 발효법은 크게 (1) 회분 발효법(Batch 발효법) 및 유가(流加) 발효법(Fed-Batch 발효법)과 (2) 연속 발효법으로 분류할 수 있다.
회분 및 유가 발효법은 설비적으로는 간소하며, 단시간에 배양이 종료되고, 잡균 오염에 의한 피해가 적다는 메리트가 있다. 그러나, 시간 경과와 함께 배양액 중의 생산물 농도가 높아지고, 침투압 또는 생산물 저해 등의 영향에 의해 생산성 및 수율이 저하된다. 이 때문에 장시간에 걸쳐 안정적으로 고수율 또한 고생산성을 유지하는 것이 곤란하다.
연속 발효법은 발효조 내에서 목적 물질이 고농도로 축적되는 것을 회피함으로써 장시간에 걸쳐 고수율 또한 고생산성을 유지할 수 있다는 특징이 있다. L-글루타민산이나 L-리신의 발효에 대해서 연속 배양법이 개시되어 있다(비특허 문헌 1). 그러나, 이들 예에서는 배양액에 원료의 연속적인 공급을 행함과 아울러, 미생물이나 세포를 함유한 배양액을 빼내기 위해서 배양액 중의 미생물이나 세포가 희 석된다는 점에서 생산 효율의 향상은 한정된 것이었다.
연속 발효법에 있어서 미생물이나 배양 세포를 분리막에 의해 여과하고, 여과액으로부터 생산물을 회수함과 동시에 여과된 미생물이나 배양 세포를 배양액에 유지 또는 환류시킴으로써 배양액 중의 미생물이나 세포 농도를 높게 유지하는 방법이 제안되어 있다.
예를 들면, 세라믹스막을 사용한 연속 발효 장치에 있어서 연속 발효되는 기술이 개시되어 있다(특허 문헌 1, 특허 문헌 2, 특허 문헌 3). 그러나, 개시된 기술은 세라믹스막의 눈 막힘에 의한 여과 유량이나 여과 효율의 저하에 문제가 있고, 눈 막힘 방지를 위해서 역세정 등을 행하고 있다.
분리막을 사용한 숙신산의 제조 방법이 개시되어 있다(특허 문헌 4). 이 기술에서는 막분리에 있어서 높은 여과압(약 200kPa)이 채용되어 있다. 높은 여과압은 비용적으로도 불리할 뿐만 아니라 여과 처리에 있어서 미생물이나 세포가 압력에 의해 물리적인 데미지를 받는다는 점에서 미생물이나 세포를 연속적으로 배양액으로 되돌리는 연속 발효법에 있어서는 적절하지는 않다.
종래의 연속 배양은 발효조에 신선 배지를 일정 속도로 공급하고, 이것과 동량의 배양액을 조 외부로 배출함으로써 발효조 내의 액량을 항상 일정하게 유지하는 배양법이다. 회분 배양에서는 초발 기질 농도가 소비되면 배양이 종료되지만 연속 배양에서는 이론적으로는 무한히 배양을 지속할 수 있다. 즉, 이론적으로는 무한히 발효할 수 있다.
한편, 상술한 종래의 연속 배양에서는 배양액과 함께 미생물도 조 외부로 배 출되어 발효조 내의 미생물 농도를 높게 유지하는 것은 어렵다. 여기에서, 발효 생산을 행하는 경우에는 발효를 행하는 미생물을 고농도로 유지할 수 있으면 발효 용적당 발효 생산 효율을 향상시킬 수 있다. 이를 위해서는 미생물을 발효조 내에 유지 또는 환류시킬 필요가 있다. 미생물을 발효조 내에 유지 또는 환류시키는 방법으로서는 배출된 배양액을 중력, 예를 들면, 원심 분리에 의해 고액(固液) 분리하고, 침전물인 미생물을 발효조로 반송하는 방법, 여과함으로써 고형분인 미생물을 분리하고, 배양액 상청부만을 조 외부로 배출하는 방법을 들 수 있다. 그러나, 원심 분리에 의한 방법은 동력비가 높아 현실적이지는 않다. 여과에 의한 방법은 상술한 바와 같이, 여과하기 위해서 높은 압력을 요한다는 점에서 실험실 레벨에서의 검토가 대부분이었다.
이렇게, 종래의 연속 발효법에는 여러가지 문제가 있어 산업적 응용이 어려웠다.
즉, 연속 발효법에 있어서 미생물이나 세포를 분리막에 의해 여과하고, 여과액으로부터 생산물을 회수함과 동시에 여과된 미생물이나 세포를 배양액에 환류시켜 배양액 중의 미생물이나 세포 농도를 향상시키고, 또한, 높게 유지시킴으로써 높은 물질 생산성을 얻는 것은 여전히 곤란하여 기술의 혁신이 요구되고 있었다.
특허 문헌 1: 일본 특허공개 평5-95778호 공보
특허 문헌 2: 일본 특허공개 소62-138184호 공보
특허 문헌 3: 일본 특허공개 평10-174594호 공보
특허 문헌 4: 일본 특허공개 2005-333886호 공보
비특허 문헌 1: Toshihiko Hirao et. al.(히라오 토시히코 등), Appl. Microbiol. Biotechnol.(어플라이드 마이크로바이얼 앤드 마이크로바이올로지), 32, 269-273(1989)
본 발명은 미생물 또는 배양 세포의 배양액을 분리막에 의해 여과하고, 여과액으로부터 생산물을 회수하고, 또한, 미여과액을 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한, 발효 원료를 배양액에 추가하는 연속 발효에 있어서 분리막으로서 평균 세공 직경은 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만인 다공성막을 이용해서 막간 차압을 0.1~20kPa의 범위에서 여과 처리하는 화학품의 제조 방법이다.
본 발명은 바람직하게는 다공성막의 순수 투과 계수는 2×10-9㎥/㎡/s/pa 이상 6×10-7㎥/㎡/s/pa 이하인 화학품의 제조 방법이다.
본 발명은 바람직하게는 다공성막의 평균 세공 직경은 0.01㎛ 이상 0.2㎛ 미만이며, 또한, 다공성막의 세공 직경의 표준 편차는 0.1㎛ 이하이다.
본 발명은 바람직하게는 다공성막의 막 표면 거칠기는 0.1㎛ 이하의 다공성막인 화학품의 제조 방법이다.
본 발명은 바람직하게는 다공성막은 다공질 수지층을 함유하는 다공성막인 화학품의 제조 방법이다.
본 발명의 연속 발효 장치는 미생물 또는 배양 세포의 발효 배양액을 분리막에 의해 여과하고, 여과액으로부터 생산물을 회수함과 아울러 미여과액을 상기 발효 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한, 발효 원료를 상기 발효 배양액에 추가하는 연속 발효에 의한 화학품의 제조 장치로서, 미생물 또는 배양 세포를 발효 배양시키기 위한 발효 반응조와, 그 발효 반응조에 발효 배양액 순환 수단을 통해 접속되어 내부에 분리막을 구비한 발효 배양액을 여과하기 위한 막분리조와, 분리막의 막간 차압을 0.1~20kPa의 범위로 제어하는 수단으로 이루어지고, 상기 분리막은 평균 세공 직경 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만의 다공성막인 연속 발효 장치이다.
또한, 본 발명의 다른 연속 발효 장치는 미생물 또는 배양 세포의 발효 배양액을 분리막에 의해 여과하고, 여과액으로부터 생산물을 회수함과 아울러 미여과액을 상기 발효 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한, 발효 원료를 상기 발효 배양액에 추가하는 연속 발효에 의한 화학품의 제조 장치로서, 미생물 또는 배양 세포를 발효시키기 위한 발효 반응조와, 그 발효 반응조 내부에 배치되어 분리막을 구비한 발효 배양액을 여과하기 위한 분리막 엘리먼트와, 그 분리막 엘리먼트에 접속되어 여과된 발효 생산물을 배출하기 위한 수단과, 상기 분리막의 막간 차압을 0.1~20kPa의 범위로 제어하기 위한 수단으로 이루어지고, 상기 분리막은 평균 세공 직경 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만의 세공을 갖는 다공성막인 연속 발효 장치이다.
도 1은 본 발명에서 이용되는 막분리형 연속 발효 장치의 예를 설명하기 위한 개략 측면도이다.
도 2는 본 발명에서 이용되는 다른 막분리형 연속 발효 장치의 예를 설명하기 위한 개략 측면도이다.
도 3은 본 발명에서 이용되는 분리막 엘리먼트의 예를 설명하기 위한 개략 사시도이다.
도 4는 본 발명에서 이용되는 다른 분리막 엘리먼트의 예를 설명하기 위한 단면 설명도이다.
도 5는 효모용 발현 벡터 pTRS11의 피지컬 맵(physical map)을 나타내는 도면이다.
(도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명)
1: 발효 반응조 2: 분리막 엘리먼트
3: 수두차 제어 장치 4: 기체 공급 장치
5: 교반기 6: 레벨 센서
7: 배지 공급 펌프 8: pH 조정 용액 공급 펌프
9: pH 센서·제어 장치 10: 온도 조절기
11: 발효액 순환 펌프 12: 막분리조
13: 지지판 14: 유로재
15: 분리막 16: 오목부
17: 집수 파이프 18: 분리막 다발
19: 상부 수지 밀봉층 20: 하부 수지 밀봉층
21: 지지 프레임 22: 집수 파이프
본 발명은 미생물 또는 배양 세포의 배양액을 분리막에 의해 여과하고, 여과 액으로부터 생산물을 회수하고, 또한, 미여과액을 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한, 발효 원료를 배양액에 추가하는 연속 발효에 있어서 분리막으로서 평균 세공 직경이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만인 다공성막을 이용해서 막간 차압을 0.1~20kPa의 범위에서 여과 처리하는 화학품의 제조 방법이다.
본 발명에 있어서 분리막으로서 이용되는 다공성막에 대해서 설명한다.
본 발명에서 분리막으로서 이용되는 다공성막의 구성에 대해서 설명한다. 본 발명에 있어서의 다공성막은 바람직하게는 피처리수의 수질이나 용도에 따른 분리 성능과 투수 성능을 갖는 것이다.
다공성막은 저지 성능 및 투수 성능이나 분리 성능, 예를 들면, 내오염성의 점에서 다공질 수지층을 함유하는 다공성막인 것이 바람직하다.
다공질 수지층을 함유하는 다공성막은 바람직하게는 다공질 기재의 표면에 분리 기능층으로서 작용하는 다공질 수지층을 갖고 있다. 다공질 기재는 다공질 수지층을 지지해서 분리막에 강도를 부여한다.
본 발명에서 이용되는 다공성막이 바람직하게는 다공질 기재의 표면에 다공질 수지층을 갖고 있는 경우, 다공질 기재에 다공질 수지층이 침투되어 있어도, 다공질 기재에 다공질 수지층이 침투되어 있지 않아도 어느 쪽이나 좋고, 용도에 따라 선택된다.
다공질 기재의 평균 두께는 바람직하게는 50㎛ 이상 3000㎛ 이하이다.
다공질 기재의 재질은 유기 재료 및/또는 무기 재료 등으로 이루어지고, 유기 섬유가 바람직하게 사용된다. 바람직한 다공질 기재는 셀룰로오스 섬유, 셀룰로 오스트리아세테이트 섬유, 폴리에스테르 섬유, 폴리프로필렌 섬유 및 폴리에틸렌 섬유 등의 유기 섬유를 사용하여 이루어지는 직포나 부직포이며, 보다 바람직하게는 밀도의 제어가 비교적 용이하며, 제조도 용이하고, 저렴한 부직포가 사용된다.
다공질 수지층은 유기 고분자막을 바람직하게 사용할 수 있다. 유기 고분자막의 재질로서는 예를 들면, 폴리에틸렌계 수지, 폴리프로필렌계 수지, 폴리염화비닐계 수지, 폴리불화비닐리덴계 수지, 폴리술폰계 수지, 폴리에테르술폰계 수지, 폴리아크릴로니트릴계 수지, 셀룰로오스계 수지 및 셀룰로오스트리아세테이트계 수지 등을 들 수 있다. 유기 고분자막은 이들 수지를 주성분으로 하는 수지의 혼합물이어도 좋다. 여기에서 주성분이란, 그 성분이 50중량% 이상, 바람직하게는 60중량% 이상 함유하는 것을 말한다. 유기 고분자막의 재질은 용액에 의한 제막이 용이하며, 물리적 내구성이나 내약품성도 우수한 폴리염화비닐계 수지, 폴리불화비닐리덴계 수지, 폴리술폰계 수지, 폴리에테르술폰계 수지 및 폴리아크릴로니트릴계 수지가 바람직하고, 폴리불화비닐리덴계 수지 또는 그것을 주성분으로 하는 수지가 가장 바람직하게 사용된다.
여기에서, 폴리불화비닐리덴계 수지로서는 불화비닐리덴의 단독 중합체가 바람직하게 사용된다. 또한, 폴리불화비닐리덴계 수지는 불화비닐리덴과 공중합 가능한 비닐계 단량체의 공중합체도 바람직하게 사용된다. 불화비닐리덴과 공중합 가능한 비닐계 단량체로서는 테트라플루오로에틸렌, 헥사플루오로프로필렌 및 3염화불화에틸렌 등이 예시된다.
본 발명에서 사용되는 다공성막은 평균 세공 직경이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만인 것이 중요하다. 다공성막의 평균 세공 직경이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만이면 발효에 사용되는 미생물에 의한 눈 막힘이 일어나기 어렵고, 또한, 여과 성능이 장기간 안정적으로 계속되는 성능을 갖는다. 또한, 다공성막의 평균 세공 직경이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만이면 미생물 또는 배양 세포가 리킹(leaking)되지 않는 높은 배제율과, 높은 투수성을 양립시킬 수 있고, 투수성을 장시간 유지하는 것을 보다 높은 정밀도와 재현성으로 실시할 수 있다.
생물 또는 배양 세포의 크기에 가까우면 이들이 직접 구멍을 막아 버리는 경우가 있으므로 다공성막의 평균 세공 직경은 1㎛ 미만이다. 다공성막의 평균 세공 직경은 미생물 또는 배양 세포의 누출, 즉, 배제율이 저하되는 문제의 발생을 방지하기 위해서 미생물 또는 배양 세포의 크기와 비교해서 너무 크지 않은 것이 바람직하다. 미생물 또는 배양 세포 중, 세포가 작은 세균 등을 사용하는 경우에는 평균 세공 직경으로서 0.4㎛ 이하가 바람직하고, 0.2㎛ 미만이면 보다 바람직하게 실시할 수 있다.
또한, 미생물 또는 배양 세포가 목적으로 하는 화학품 이외의 물질, 예를 들면, 단백질, 다당류 등 응집되기 쉬운 물질을 생산하는 경우가 있고, 또한, 배양액 중의 미생물 또는 배양 세포의 일부가 사멸됨으로써 세포의 파쇄물이 생성되는 경우가 있고, 이들 물질에 의해 다공성막이 폐색되는 것으로부터 회피하기 위해서 평균 세공 직경이 0.1㎛ 이하인 것이 바람직하다.
일반적으로 다공성막의 평균 세공 직경은 0.4㎛ 이하가 바람직하고, 0.2㎛ 미만 또는 0.1㎛ 이하가 보다 바람직하다.
평균 세공 직경이 너무 작으면 다공성막의 투수 성능이 저하되고, 막이 더러워져 있지 않아도 효율적인 운전을 할 수 없게 되기 때문에 본 발명에 있어서의 다공성막의 평균 세공 직경은 0.01㎛ 이상이다. 다공성막의 평균 세공 직경은 바람직하게는 0.02㎛ 이상이며, 0.04㎛ 이상인 것이 더욱 바람직하다.
여기에서, 평균 세공 직경은 배율 10,000배의 주사형 전자 현미경 관찰에 있어서의 9.2㎛×10.4㎛의 범위 내에서 관찰할 수 있는 세공 전체의 직경을 측정하고, 평균함으로써 구할 수 있다. 평균 세공 직경은 또는 막 표면을 주사형 전자 현미경을 이용해서 배율 10,000배로 사진 촬영하고, 10개 이상, 바람직하게는 20개 이상의 세공을 무작위로 선택하여 이들 세공의 직경을 측정하고, 수평균해서 구할 수도 있다. 세공이 원상이 아닌 경우, 화상 처리 장치 등에 의해 세공이 갖는 면적과 동일한 면적을 갖는 원(등가원)을 구하고, 등가원 직경을 세공의 직경으로 하는 방법에 의해 구해진다.
본 발명에 사용하는 다공성막의 평균 세공 직경의 표준 편차 σ는 0.1㎛ 이하인 것이 바람직하다. 평균 세공 직경의 표준 편차는 작으면 작을수록 바람직하다. 평균 세공 직경의 표준 편차 σ는 상술한 9.2㎛×10.4㎛의 범위 내에서 관찰할 수 있는 세공수를 N으로 하고, 측정한 각각의 직경을 Xk로 하고, 세공 직경의 평균을 X(ave)로 한 하기의 (식 1)에 의해 산출된다.
Figure 112008067238378-pct00001
본 발명에서 사용되는 다공성막에 있어서는 배양액의 투과성이 중요한 성능 중 하나이다. 다공성막의 투과성의 지표로서 사용 전의 다공성막의 순수 투과 계수를 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 다공성막의 순수 투과 계수는 역침투막에 의한 25℃의 온도의 정제수를 사용해서 헤드 높이 1m에서 투수량을 측정하여 산출했을 때, 2×10-9㎥/㎡/s/pa 이상인 것이 바람직하고, 순수 투과 계수가 2×10-9㎥/㎡/s/pa 이상 6×10-7㎥/㎡/s/pa 이하이면 실용적으로 충분한 투과수량이 얻어진다.
본 발명에서 이용되는 다공성막에 있어서는 표면 거칠기란, 표면에 대해서 수직 방향의 높이의 평균값이다. 막 표면 거칠기는 분리막 표면에 부착된 미생물 또는 배양 세포가 교반이나 순환 펌프에 의한 액류에 의한 막면 세정 효과에 의해 박리되기 쉽게 하기 위한 인자 중 하나이다. 다공성막의 표면 거칠기는 0.1㎛ 이하인 것이 바람직하다. 표면 거칠기가 0.1㎛ 이하이면 막에 부착된 미생물 또는 배양 세포가 박리되기 쉽다.
더욱 바람직하게는 다공성막의 막 표면 거칠기가 0.1㎛ 이하이며, 평균 세공 직경이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만인 직경과, 다공성막의 순수 투과 계수가 2×10-9㎥/㎡/s/pa 이상인 막을 사용함으로써 막면 세정에 필요한 동력을 과도하게 필요로 하지 않는 운전이 보다 용이하게 가능한 것을 알 수 있었다. 다공성막의 표면 거칠기를 0.1㎛ 이하로 함으로써 미생물 또는 배양 세포의 여과에 있어서 막 표면에서 발생되는 전단력을 저하시킬 수 있고, 미생물의 파괴가 억제되고, 다공성막의 눈 막힘도 억제됨으로써 장기간 안정적인 여과가 보다 용이하게 가능하게 된다. 다공성막 의 표면 거칠기를 0.1㎛ 이하로 함으로써 보다 낮은 막간 차압으로 연속 발효를 실시할 수 있으며, 막이 눈 막힘된 경우라도 높은 막간 차압으로 운전한 경우에 비해서 세정 회복성이 양호하여 바람직하다. 눈 막힘을 억제함으로써 안정적인 연속 발효가 가능하게 된다는 점에서 다공성막의 표면 거칠기는 작으면 작을수록 바람직하다.
여기에서, 막 표면 거칠기는 하기의 원자간력 현미경 장치(AFM)를 사용해서 하기의 조건으로 측정했다.
장치 원자간력 현미경 장치{Digital Instruments(주)제 Nanoscope IIIa}
조건
탐침 SiN 캔틸레버{Digital Instruments(주)제}
주사 모드 콘택트 모드(기중 측정)
수중 태핑 모드(수중 측정)
주사 범위 사방 10㎛, 25㎛(기중 측정)
사방 5㎛, 10㎛(수중 측정)
주사 해상도 512×512
시료 조제 측정에 있어서 막 샘플은 상온에서 에탄올에 15분 침지한 후, RO수 중에 24시간 침지하여 세정한 후, 바람으로 건조시켜 사용했다.
막 표면 거칠기 drough는 상기 원자간력 현미경 장치(AFM)에 의해 각 포인트의 Z축 방향의 높이로부터 하기의 (식 2)에 의해 산출했다.
Figure 112008067238378-pct00002
본 발명에서 이용되는 다공성막의 형상은 바람직하게는 평막이다. 다공성막의 형상이 평막인 경우, 그 평균 두께는 용도에 따라 선택된다. 다공성막의 형상이 평막인 경우의 평균 두께는 바람직하게는 20㎛ 이상 5000㎛ 이하이며, 보다 바람직하게는 50㎛ 이상 2000㎛ 이하이다.
본 발명에서 이용되는 다공성막의 형상은 바람직하게는 중공사막이다. 다공성막이 중공사막인 경우, 중공사의 내경은 바람직하게는 200㎛ 이상 5000㎛ 이하이며, 막두께는 바람직하게는 20㎛ 이상 2000㎛ 이하이다. 또한, 유기 섬유 또는 무기 섬유를 통형상으로 한 직물이나 편물을 중공사의 내부에 함유하고 있어도 좋다.
본 발명에서 이용되는 다공성막의 작성법의 개요를 예시해서 설명한다.
우선, 다공성막 중, 평막의 작성법의 개요에 대해서 설명한다.
다공질 기재의 표면에 수지와 용매를 함유하는 원액의 피막을 형성함과 아울러, 그 원액을 다공질 기재에 함침시킨다. 그 후, 피막을 갖는 다공질 기재의 피막측 표면만을 비용매를 함유하는 응고욕과 접촉시켜 수지를 응고시킴과 아울러 다공질 기재의 표면에 다공질 수지층을 형성한다.
원액은 수지를 용매에 용해시켜 조정한다. 원액의 온도는 제막성의 관점에서 통상, 5~120℃의 범위 내에서 선정하는 것이 바람직하다. 용매는 수지를 용해하는 것이며, 수지에 작용해서 이들이 다공질 수지층을 형성하는 것을 촉진시키는 것이다. 용매로서는 N-메틸피롤리디논(NMP), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸술폭시드(DMSO), N-메틸-2-피롤리돈, 메틸에틸케톤, 테트라히드로푸란, 테트라메틸요소, 인산트리메틸, 시클로헥사논, 이소포론, γ-부티로락톤, 메틸이소아밀케톤, 프탈산디메틸, 프로필렌글리콜메틸에테르, 프로필렌카보네이트, 디아세톤알코올, 글리세롤트리아세테이트, 아세톤 및 메틸에틸케톤 등을 사용할 수 있다. 그 중에서도 수지의 용해성이 높은 N-메틸피롤리디논(NMP), N,N-디메틸아세트아미드(DMAc), N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸술폭시드(DMSO)를 바람직하게 사용할 수 있다. 이들을 단독으로 사용해도 좋고, 2종류 이상을 혼합해서 사용해도 좋다.
예를 들면, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 글리세린 등의 용매 이외의 성분을 용매에 첨가해도 좋다. 용매에 비용매를 첨가할 수도 있다. 비용매는 수지를 용해하지 않는 액체이다. 비용매는 수지의 응고 속도를 제어해서 세공의 크기를 제어하도록 작용한다. 비용매로서는 물이나 메탄올 및 에탄올 등의 알코올류를 사용할 수 있다. 그 중에서도 비용매로서 가격의 점에서 물이나 메탄올이 바람직하다. 용매 이외의 성분 및 비용매는 혼합물이어도 좋다.
원액에는 개공제(開孔劑)를 첨가할 수도 있다. 개공제는 응고욕에 침지되었을 때에 추출되고, 수지층을 다공질로 하는 작용을 갖는 것이다. 개공제를 첨가함으로써 평균 세공 직경의 크기를 제어할 수 있다. 개공제는 응고욕에의 용해성이 높은 것이 바람직하다. 개공제로서는 예를 들면, 염화칼슘이나 탄산칼슘 등의 무기염을 사용할 수 있다. 또한, 개공제로서 폴리에틸렌글리콜이나 폴리프로필렌글리콜 등의 폴리옥시알킬렌류나 폴리비닐알코올, 폴리비닐부티랄 및 폴리아크릴산 등의 수용성 고분자 화합물이나 글리세린을 사용할 수 있다.
이어서, 다공성막 중, 중공사막의 작성법의 개요에 대해서 설명한다.
중공사막은 수지와 용매로 이루어지는 원액을 이중관식 구금의 외측 관으로부터 토출함과 아울러, 중공부 형성용 유체를 이중관식 구금의 내측 관으로부터 토출하고, 냉각욕 안에서 냉각 고화해서 제작할 수 있다.
원액은 상술한 평막의 작성법에서 설명한 수지를 20중량% 이상 60중량% 이하의 농도로 상술한 평막의 생성법에서 설명한 용매에 용해시킴으로써 조정할 수 있다. 또한, 중공부 형성용 유체에는 통형상 기체 또는 액체를 사용할 수 있다. 또한, 얻어진 중공사막의 외측 표면에 새로운 다공성 수지층을 코팅(적층)할 수도 있다. 적층은 중공사막의 성질, 예를 들면, 친수·소수성, 세공 직경 등을 소망의 성질로 변화시키기 위해서 행할 수 있다. 적층되는 새로운 다공성 수지층은 수지를 용매에 용해시킨 원액을 비용매를 함유하는 응고욕과 접촉시켜 수지를 응고시킴으로써 제작할 수 있다. 그 수지의 재질은 예를 들면, 상술한 유기 고분자막의 재질과 동일한 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 적층 방법은 특별히 한정되지 않고, 원액에 중공사막을 침지해도 좋고, 중공사막의 표면에 원액을 도포해도 좋고, 적층 후, 부착된 원액의 일부를 스크래핑하거나 에어 나이프를 이용해서 날려버림으로써 적층량을 조정할 수도 있다.
본 발명에서 이용되는 다공성막은 수지 등의 부재를 이용해서 중공사막의 중공부를 접착·밀봉하고, 지지체에 설치함으로써 분리막 엘리먼트로 할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 다공성막은 지지체와 조합함으로써 분리막 엘리먼트로 할 수 있다. 지지체로서 지지판을 사용하고, 상기 지지판의 적어도 편면에 본 발명에서 이용되는 다공성막을 배치한 분리막 엘리먼트는 본 발명에서 이용되는 다공성막을 갖는 분리막 엘리먼트의 바람직한 형태의 하나이다. 투수량을 크게 하기 위해서 지지판의 양면에 다공성막을 배치하는 것도 분리막 엘리먼트의 바람직한 형태이다.
본 발명의 화학품의 제조 방법은 막간 차압을 0.1~20kPa의 범위에서 여과 처리한다. 발효 배양액을 여과하기 위해서 20kPa보다 높은 막간 차압으로 여과 처리하면 압력을 가하기 위한 동력이 필요하며, 화학품을 제조할 때의 경제 효과가 저하된다. 20kPa보다 높은 막간 차압을 가함으로써 미생물 또는 배양 세포가 파쇄되는 경우가 있고, 화학품을 생산하는 능력이 저하된다. 본 발명의 화학품의 제조 방법은 여과 압력인 막간 차압이 0.1~20kPa의 범위이며, 수두차에 의해 막간 차압을 얻을 수 있다는 점에서 특별히 발효조 내를 가압 상태로 유지할 필요가 없고, 화학품을 생산하는 능력이 저하되지 않는다. 또한, 특별히 발효조 내를 가압 상태로 유지할 필요가 없다는 점에서 다공성막을 발효조 내부에 설치하는 형태도 가능하게 되어 발효 장치를 컴팩트화할 수 있는 이점도 들 수 있다. 본 발명의 화학품의 제조 방법에서는 막간 차압을 바람직하게는 0.1~2kPa의 범위에서 여과 처리한다.
본 발명의 화학품의 제조 방법은 발효 원료를 사용한다. 본 발명에서 사용하 는 발효 원료로서는 배양하는 미생물의 생육을 촉진시키고, 목적으로 하는 발효 생산물인 화학품을 양호하게 생산시킬 수 있는 것이면 좋다.
본 발명에서 사용하는 발효 원료는 탄소원, 질소원, 무기 염류 및 필요에 따라 아미노산, 비타민 등의 유기 미량 영양소를 적당히 함유하는 통상의 액체 배지가 좋다. 탄소원으로서는 글루코오스, 수크로오스, 프룩토오스, 갈락토오스, 락토오스 등의 당류, 이들 당류를 함유하는 전분 당화액, 고구마 당밀, 사탕무 당밀, 하이테스트 당밀, 초산 등의 유기산, 에탄올 등의 알코올류, 글리세린 등이 사용된다. 질소원으로서는 암모니아 가스, 암모니아수, 암모늄염류, 요소, 질산염류, 기타 보조적으로 사용되는 유기 질소원, 예를 들면, 유박류, 대두 가수분해액, 카세인 분해물, 기타 아미노산, 비타민류, 콘 스팁 리커(corn steep liquor), 효모 또는 효모 엑스트랙트, 육류 엑스트랙트, 펩톤 등의 펩티드류, 각종 발효균체 및 그 가수분해물 등이 사용된다. 무기 염류로서는 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염 등을 적당히 첨가할 수 있다.
본 발명에 사용하는 미생물이 생육을 위해서 특정의 영양소를 필요로 하는 경우에는 그 영양물을 표품 또는 그것을 함유하는 천연물로서 첨가한다. 또한, 소포제를 필요에 따라 사용한다. 본 발명에 있어서 배양액이란, 발효 원료에 미생물 또는 배양 세포가 증식된 결과 얻어지는 액을 말한다. 추가하는 발효 원료의 조성은 목적으로 하는 화학품의 생산성이 높게 되도록 배양 개시시의 발효 원료 조성으로부터 적당히 변경해도 좋다.
본 발명에서는 배양액 중의 당류 농도는 5g/l 이하로 유지되는 것이 바람직 하다. 배양액 중의 당류 농도는 5g/l 이하로 유지하는 것이 바람직한 이유는 배양액의 인발에 의한 당류의 유실을 최소한으로 하기 때문이다.
미생물의 배양은 통상, pH4-8, 온도 20-40℃의 범위에서 행해진다. 배양액의 pH는 무기 또는 유기의 산, 알칼리성 물질, 또한, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 가스 등에 의해 통상, pH4-8 범위 내의 미리 정해진 값으로 조절한다. 산소의 공급 속도를 높일 필요가 있으면 공기에 산소를 첨가해서 산소 농도를 21% 이상으로 유지하거나 또는 배양을 가압하거나 교반 속도를 높이거나 통기량을 높인다는 등의 수단을 사용할 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에서는 배양 초기에 Batch 배양 또는 Fed-Batch 배양을 행하여 미생물 농도를 높게 한 후에 연속 배양(인발)을 개시해도 좋다. 본 발명의 화학품의 제조 방법에서는 미생물 농도를 높게 한 후에 고농도의 균체를 시딩(seeding)하고, 배양 개시와 함께 연속 배양을 행해도 좋다. 본 발명의 화학품의 제조 방법에서는 적당한 시기로부터 원료 배양액의 공급 및 배양물의 인발을 행할 수 있다. 원료 배양액 공급과 배양물의 인발 개시 시기는 반드시 동일할 필요는 없다. 또한, 원료 배양액의 공급과 배양물의 인발은 연속적이어도 좋고, 간헐적이어도 좋다.
원료 배양액에는 균체 증식에 필요한 영양소를 첨가하여 균체 증식이 연속적으로 행해지도록 하면 좋다. 배양액 중의 미생물 또는 배양 세포의 농도는 배양액의 환경이 미생물 또는 배양 세포의 증식에 있어서 부적절하게 되어 사멸하는 비율이 높게 되지 않는 범위에서 높은 상태로 유지하는 것이 효율적인 생산성을 얻는데 에 바람직하다. 배양액 중의 미생물 또는 배양 세포의 농도는 일례로서 건조 중량으로서 5g/L 이상으로 유지함으로써 양호한 생산 효율이 얻어진다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에서는 필요에 따라 발효조 내로부터 미생물 또는 배양 세포를 인발할 수 있다. 예를 들면, 발효조 내의 미생물 또는 배양 세포 농도가 너무 높아지면 분리막의 폐색이 발생되기 쉬워진다는 점에서 인발함으로써 폐색으로부터 회피할 수 있다. 또한, 발효조 내의 미생물 또는 배양 세포 농도에 의해 화학품의 생산 성능이 변화되는 경우가 있고, 생산 성능을 지표로 해서 미생물 또는 배양 세포를 인발함으로써 생산 성능을 유지시키는 것도 가능하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에서는 발효 생산 능력이 있는 프레시한 균체를 증식시키면서 행하는 연속 배양 조작은 균체를 증식하면서 생산물을 생성하는 연속 배양법이면 발효조의 수는 상관없다. 본 발명의 화학품의 제조 방법에서는 연속 배양 조작은 통상, 단일 발효조에서 행하는 것이 배양 관리상 바람직하다. 발효조의 용량이 작다는 등의 이유에서 복수의 발효조를 사용하는 것도 가능하다. 이 경우, 복수의 발효조를 배관으로 병렬 또는 직렬로 접속해서 연속 배양을 행해도 발효 생산물의 고생산성은 얻어진다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포에 대해서 설명한다. 본 발명의 화학품의 제조 방법에서 사용되는 미생물이나 배양 세포에 대해서는 제한은 없다. 본 발명에서 사용되는 미생물이나 배양 세포는 예를 들면, 발효 공업에 있어서 잘 사용되는 빵 효모 등의 효모, 대장균, 코리네형 세균등의 박테리아, 사상균, 방선균, 동물 세포, 곤충 세포 등을 들 수 있다. 사용하는 미생물이나 세포는 자연 환경으로부터 단리된 것이라도 좋고, 또한, 돌연 변이나 유전자 재조합에 의해 일부 성질이 개변된 것이어도 좋다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 제조되는 화학품으로서는 상기 미생물이나 세포가 배양액 중에 생산하는 물질이면 제한은 없다. 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 제조되는 화학품은 알코올, 유기산, 아미노산, 핵산 등 발효 공업에 있어서 대량 생산되고 있는 물질을 들 수 있다. 예를 들면, 알코올로서는 에탄올, 1,3-프로판디올, 1,4-부탄디올, 글리세롤 등, 유기산으로서는 초산, 유산, 피루빈산, 숙신산, 말산, 이타콘산, 구연산, 핵산이면 이노신, 구아노신 등의 뉴클레오시드, 이노신산, 구아닐산 등의 뉴클레오티드, 또한, 카다베린 등의 디아민 화합물을 들 수 있다. 또한, 본 발명은 효소, 항생 물질, 재조합 단백질과 같은 물질의 생산에 적용하는 것도 가능하다.
이어서, 본 발명의 화학품의 제조 방법에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포에 대해서 구체적인 화학품을 예시하면서 설명한다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 있어서 L-유산의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 L-유산을 생산할 수 있는 미생물이면 제한은 없다. 본 발명의 화학품의 제조 방법에 있어서 L-유산의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 바람직하게는 유산균을 사용할 수 있다. 여기에서, 유산균이란, 소비된 글루코오스에 대해서 대당수율로서 50% 이상의 유산을 산생하는 원핵 미생물로서 정의할 수 있다. 바람직한 유산균으로서는 예를 들면, 락토바실러스속(Genus Lactobacillus), 페디오코커스속(Genus Pediococcus), 테트라게노코커스 속(Genus Tetragenococcus), 카르노박테리움속(Genus Carnobacterium), 바고코커스속(Genus Vagococcus), 류코노스톡속(Genus Leuconostoc), 오에노코커스속(Genus Oenococcus), 아토포비움속(Genus Atopobium), 스트렙토코커스속(Genus Streptococcus), 엔테로코커스속(Genus Enterococcus), 락토코커스속(Genus Lactococcus) 및 바실러스속(Genus Bacillus)에 속하는 유산균을 들 수 있다. 이들 중에서도 유산의 대당수율이 높은 유산균을 선택해서 유산의 생산에 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 있어서는 유산 중에서도 L-유산의 대당수율이 높은 유산균을 선택해서 유산의 생산에 더욱 바람직하게 사용할 수 있다. L-유산이란, 유산의 광학 이성체의 1종이며, 그 경상체인 D-유산과 명확하게 구별할 수 있다. L-유산의 대당수율이 높은 유산균으로서는 예를 들면, 락토바실러스 야마나시엔시스(Lactobacillus yamanashiensis), 락토바실러스 아니말리스(Lactobacillus animalis), 락토바실러스 아길리스(Lactobacillus agilis), 락토바실러스 아비아리에스(Lactobacillus aviaries), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbruekii), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 루미니스(Lactobacillus ruminis), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 샤피(Lactobacillus sharpeae), 락토바실러스 덱스트리니쿠스(Pediococcus dextrinicus) 및 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis) 등을 들 수 있고, 이들을 선택해서 L-유산의 생산에 사용 할 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-유산을 제조하는 경우, 인위적으로 유산 생산 능력을 부여하거나 또는 증강된 미생물 또는 배양 세포를 사용할 수 있다. 예를 들면, L-유산 탈수소 효소 유전자(이하, L-LDH라고 하는 경우가 있음)를 도입해서 L-유산 생산 능력을 부여하거나 또는 증강된 미생물 또는 배양 세포를 사용할 수 있다. L-유산 생산 능력을 부여하거나 또는 증강시키는 방법으로서는 종래 알려져 있는 약제 변이에 의한 방법도 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 미생물이 L-LDH를 도입함으로써 L-유산 생산 능력이 증강된 재조합 미생물을 들 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-유산을 제조하는 경우, 재조합 미생물의 숙주로서는 원핵 세포인 대장균, 유산균 및 진핵 세포인 효모 등이 바람직하고, 특히 바람직하게는 효모이다. 효모 중 바람직하게는 사카로마이세스속(Genus Saccharomyces)에 속하는 효모이며, 더욱 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)이다.
본 발명에서 사용하는 L-LDH로서는 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NADH)와 피루빈산을 산화형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NAD+)와 L-유산으로 변환하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하고 있으면 한정되지 않는다. 예를 들면, L-유산의 대당수율이 높은 유산균 유래의 L-LDH를 사용할 수 있다. 바람직하게는 포유류 유래 L-LDH를 사용할 수 있다. 이 중 호모 사피엔스(Homo sapiens) 유래 및 개구리 유래의 L-LDH를 사용할 수 있다. 개구리 중에서도 피파과(Pipidae)에 속하는 개구리 유래의 L-LDH를 사용하는 것이 바람직하고, 피파과에 속하는 개구리 중에서도 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis) 유래의 L-LDH를 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명에 이용되는 인간 또는 개구리 유래의 L-LDH에는 유전적 다형성이나 변이 유발 등에 의한 변이형의 유전자도 포함된다. 유전적 다형성이란, 유전자 상의 자연 돌연 변이에 의해 유전자의 염기 배열이 일부 변화되어 있는 것이다. 또한, 변이 유발이란, 인공적으로 유전자에 변이를 도입하는 것을 말한다. 변이 유발은 예를 들면, 부위 특이적 변이 도입용 키트{Mutan-K(타카라바이오사제)}를 사용하는 방법이나 랜덤 돌이 도입용 키트{BD Diversify PCR Random Mutagenesis(CLONTECH사제)}를 사용하는 방법 등이 있다. 또한, 본 발명에서 사용하는 인간 또는 개구리 유래의 L-LDH는 NADH와 피루빈산을 NAD+와 L-유산으로 변환하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하고 있으면 염기 배열의 일부에 결실 또는 삽입이 존재하고 있어도 상관없다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-유산을 제조하는 경우, 제조된 여과·분리 발효액에 함유되는 L-유산의 분리·정제는 종래 알려져 있는 농축, 증류 및 정석 등의 방법을 조합해서 행할 수 있다. 예를 들면, 여과·분리 발효액의 pH를 1 이하로 하고 나서 디에틸에테르나 초산에틸 등에 의해 추출하는 방법, 이온 교환 수지에 흡착 세정한 후에 용출하는 방법, 산촉매의 존재하에서 알코올과 반응시켜 에스테르로 해서 증류하는 방법 및 칼슘염이나 리튬염으로서 정석하는 방법 등을 들 수 있다. 바람직하게는 여과·분리 발효액의 수분을 증발시킨 농축 L-유산 용액을 증류 조작에 가할 수 있다. 여기에서, 증류할 때에는 증류 원액의 수분 농도가 일정해지도록 수분을 공급하면서 증류하는 것이 바람직하다. L-유산 수용액의 증류 후에는 수분을 가열 증발시킴으로써 농축하여 목적으로 하는 농도의 정제 L-유산을 얻을 수 있다. 증류액으로서 에탄올이나 초산 등의 저비점 성분을 함유하는 L-유산 수용액을 얻은 경우에는 저비점 성분을 L-유산 농축 과정에 의해 제거하는 것이 바람직한 형태이다. 증류 조작 후, 증류액에 대해서 필요에 따라 이온 교환 수지, 활성탄 및 크로마토 분리 등에 의한 불순물 제거를 행하여 더욱 고순도의 L-유산을 얻을 수도 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 D-유산을 제조하는 경우, D-유산 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 D-유산을 생산할 수 있는 미생물이면 제한은 없다. D-유산 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 예를 들면, 야생형주에서는 D-유산을 합성하는 능력을 갖는 락토바실러스속(Lactobacillus), 바시러스속(Bacillus) 및 페디오코커스(Pediococcus)에 속하는 미생물을 들 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 D-유산을 제조하는 경우, 야생형주의 D-유산 데히드로게나아제(이하, D-LDH라고도 하는 경우가 있음.)의 효소 활성을 증강시키고 있는 것이 바람직하다. 효소 활성을 증강시키는 방법으로서는 종래 알려져 있는 약제 변이에 의한 방법도 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 미생물이 D-유산 데히드로게나아제를 코딩하는 유전자를 도입함으로써 D-유산 데히드로게나아제의 효소 활성을 증강시킨 재조합 미생물을 들 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 D-유산을 제조하는 경우, 재조합 미생 물의 숙주로서는 원핵 세포인 대장균, 유산균 및 진핵 세포인 효모 등이 바람직하고, 특히 바람직하게는 효모이다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 D-유산을 제조하는 경우, D-유산 데히드로게나아제를 코딩하는 유전자가 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) 및 바실러스 라에보락티커스(Bacillus laevolacticus) 유래의 유전자인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 바실러스 라에보락티커스(Bacillus laevolacticus) 유래의 유전자이다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 D-유산을 제조하는 경우, 여과·분리 발효액에 함유되는 D-유산의 분리·정제는 종래 알려져 있는 농축, 증류 및 정석 등의 방법을 조합해서 행할 수 있다. 예를 들면, 여과·분리 발효액의 pH를 1 이하 로 하고 나서 디에틸에테르나 초산 에틸 등에 의해 추출하는 방법, 이온 교환 수지에 흡착 세정한 후에 용출하는 방법, 산촉매의 존재하에서 알코올과 반응시켜 에스테르로 해서 증류하는 방법 및 칼슘염이나 리튬염으로서 정석하는 방법 등을 들 수 있다. 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 D-유산을 제조하는 경우, 바람직하게는 여과·분리 발효액의 수분을 증발시킨 농축 D-유산 용액을 증류 조작에 가할 수 있다. 여기에서, 증류할 때에는 증류 원액의 수분 농도가 일정하게 되도록 수분을 공급하면서 증류하는 것이 바람직하다. D-유산 수용액의 증류 후에는 수분을 가열 증발시킴으로써 농축하여 목적으로 하는 농도의 정제 D-유산을 얻을 수 있다. 증류액으로서 저비점 성분(에탄올, 초산 등)을 함유하는 D-유산 수용액을 얻은 경우에 는 저비점 성분을 D-유산 농축 과정에 의해 제거하는 것이 바람직한 형태이다. 증류 조작 후, 증류액에 대해서 필요에 따라 이온 교환 수지, 활성탄 및 크로마토 분리 등에 의한 불순물 제거를 행하여, 더욱 고순도의 D-유산을 얻을 수도 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 에탄올을 제조하는 경우, 에탄올의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 피루빈산을 생산할 수 있는 미생물 또는 배양 세포이면 제한은 없다. 에탄올의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 예를 들면, 사카로미세스속(Genus Saccharomyces), 클루이베로마이세스속(Genus Kluyveromyces), 시조사카로미세스속(Genus Schizosaccharomyces)에 속하는 효모를 사용할 수 있다. 이 중 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 시조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)를 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 락토바실러스속(Genus Lactobacillus), 자이모모나스속(Genus Zymomonas)에 속하는 세균도 바람직하게 사용할 수 있다. 이 중, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)를 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 에탄올의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 인위적으로 에탄올 생산 능력을 높인 미생물 또는 배양 세포이어도 좋다. 본 발명에 있어서의 에탄올의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 구체적으로는 돌연 변이나 유전자 재조합에 의해 일부 성질이 개변된 것이어도 좋다. 일부 성질이 개변된 것의 일례로서는 리조퍼스속에 속하는 곰팡이의 글루코아밀라아제 유전자를 도입하여 생전분의 자화 능력을 획득한 효모를 들 수 있다{미생물, 3:555-564(1987)}. 또한, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 여과·분리 발효액에 함유되는 에탄올의 분리·정제는 예를 들면, 증류법에 의한 정제법이나 NF, RO막 또는 제올라이트제의 분리막을 사용한 농축·정제법을 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 피루빈산을 제조하는 경우, 피루빈산의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 피루빈산을 생산하는 것이 가능한 미생물 또는 배양 세포이면 제한은 없다. 피루빈산의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 슈도모나스속(Genus Pseudomonas), 코리네박테리움속(Genus Corynebacterium), 에쉐리시아속(Genus Escherichia), 아시네토박터(Genus Acinetobacter)에 속하는 세균을 바람직하게 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 슈도모나스 플루오레에센스(Pseudomonas fuluorescens), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 에쉐리시아 콜리(Escherichia coli) 등의 세균을 사용할 수 있다. 이들 세균을 돌연 변이나 유전자 재조합에 의해 일부 성질이 개변된 것을 사용해도 좋다. 예를 들면, 산화적 인산화에 의한 ATP 생산에 직접 관여하는 ATPase 유전자를 변이 또는 결실시킨 세균도 바람직하게 사용된다. 또한, 곰팡이, 효모 등도 바람직하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 사카로미세스속(Genus Saccharomyces), 토룰롭시스속(Genus Toluropusis), 칸디다속(Genus Candida), 시조필룸속(Genus Schizophyllum)에 속하는 곰팡이, 효모를 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 콥시스(Saccharomyces copsis), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 리폴 리티카(Candida lipolytica), 토룰롭시스 글라브라타(Toluropusis glabrata), 시조필룸 콤네(Schizophyllum commune) 등의 곰팡이, 효모를 이용해서 피루빈산을 제조할 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 피루빈산을 제조하는 경우, 여과·분리 발효액에 함유되는 피루빈산의 분리·정제는 음이온 교환 칼럼을 사용한 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 일본 특허공개 평6-345683에 나타내어지는 약염성 이온 교환체를 사용한 정제법을 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 숙신산을 제조하는 경우, 숙신산의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 숙신산을 생산할 수 있는 미생물이면 특별히 제한은 없다. 숙신산의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 아나에로비오스피릴룸(Anaerobiospirillum)속이나 액티노바실러스(Actinobacillus)속에 속하는 세균을 바람직하게 이용할 수 있다. 구체적으로는 미국 특허 제 5143833호 명세서에 기재된 아나에로비오스피릴룸 석시니시프로듀센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens)나 James B. Mckinlay(제임스 B. 맥킨리) 등이 개시하고 있는 액티노바실러스 석시노게네스(Actinobacillus succinogenes)를 들 수 있다(Appl. Microbiol. Biotechnol.(어플라이드 마이크로바이얼 앤드 마이크로바이올로지), 71, 6651-6656(2005). 또한, 코리네박테리움(Corynebacterium)속이나 브레비박테리움(Brevibacterium)속 등의 코리네형 세균(Coryneform bacterium) 및 대장균(Escherichia) 등도 이용할 수 있다. 코리네형 세균에서는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 브레비박테 리움 플라범(Brevibacterium flavum) 및 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum) 등이 바람직하다.
또한, 미생물로서는 유전자 재조합에 의해 숙신산의 생산 능력이 개선된 미생물을 사용할 수 있고, 이것에 의해 숙신산의 생산성을 향상시키는 것도 가능하다. 이러한 미생물로서는 예를 들면, 일본 특허공개 2005-27533호 공보에 기재된 유산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)가 결손된 브레비박테리움 플라범 MJ233AB-41(FERM BP-1498)이나 비특허 문헌 1에 기재된 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 미국 특허 제 5770435호 명세서에 기재된 피루빈산 포름산 개열 효소(pyruvate formate lyase)와 유산 탈수소 효소(lactate dehydrogenase)의 결손주인 대장균 AFP111주 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 숙신산을 제조하는 경우, 숙신산의 분리·정제는 통상의 숙신산의 정제법을 적용할 수 있다. 예를 들면, 일본 특허공개 2005-333886호 공보에 나타내어져 있는 수분해 전기 투석 처리와 감압 농축·정석을 조합한 정제법을 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 이타콘산을 제조하는 경우, 이타콘산의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 이타콘산을 생산할 수 있는 미생물이면 제한은 없다. 이타콘산의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 곰팡이 또는 효모를 바람직하게 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 아스페르길루스속(Genus Aspergillus) 또는 우스틸라고속(Genus Ustilago)에 속하는 곰팡이 및 칸디다속(Genus Candida), 로도토룰라속(Genus Rhodotorula)에 속하는 효모를 사용한 이타콘산의 생산을 들 수 있다. 그 중에서도 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 이타코니쿠스(Aspergillus itaconicus), 우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis), 우스틸라고 시노돈티스(Ustilago cynodontis) 및 우스틸라고 라벤호르스티나(Ustilago rabenhorstina)의 곰팡이 또는 칸디다 안타르크티카(Candia antarctica)를 이타콘산의 생산에 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 이타콘산을 제조하는 경우, 이타콘산의 분리·정제는 바람직하게는 한외 여과나 전기 투석을 이용해서 행할 수 있다. 예를 들면, 일본 특허공고 소-50958호 공보에 나타내어지는 한외 여과 및 염형 양이온 교환 수지막을 사용한 전기 투석에 의한 정제법을 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 1,3-프로판디올을 제조하는 경우, 1,3-프로판디올의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 1,3-프로판디올을 생산할 수 있는 미생물이면 특별히 제한은 없다. 1,3-프로판디올의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 예를 들면, 야생형주에서는 글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 합성하는 능력을 갖는 클렙시엘라(Klebsiella)속, 클로스트리디움(Clostridium)속, 락토바실러스(Lactobacillus)속에 속하는 미생물을 들 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 1,3-프로판디올을 제조하는 경우, 미생물은 (a) 글리세롤데히드라타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 1 개의 유전자; (b) 글리세롤데히드라타아제 재활성화 인자를 코딩하는 적어도 1개의 유전자; 및 (c) 3-히드록시프로피온알데히드를 1,3-프로판디올로 전환하는 비-특이적 촉매 활성을 코딩하는 적어도 1개의 유전자를 함유하고 있는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 더욱 바람직하게는 미생물은 재조합 미생물에 의해 1,3-프로판디올을 생산 가능하게 하는 것을 들 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 1,3-프로판디올을 제조하는 경우, 글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 합성하는 능력을 갖는 미생물은 바람직하게는 클렙시엘라(Klebsiella), 클로스트리디움(Clostridium), 락토바실러스(Lactobacillus), 시트로박터(Cytrobacter), 엔테로박터(Enterobacter), 에어로박터(Aerobacter), 아스페르길루스(Aspergillus), 사카로미세스(Saccharomyces), 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 지고사카로미세스(Zygosaccharomyces), 피치아(Pichia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 데바리오미세스(Debaryomyces), 무코르(Mucor), 토룰롭시스(Torulopsis), 메틸로박터(Methylobacter), 살모넬라(Salmonella), 바실러스(Bacillus), 에어로박터(Aerobacter), 스트렙토미세스(Streptomyces), 에쉐리시아(Eschericia) 및 슈도모나스(Pseudomonas)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 재조합 미생물이며, 더욱 바람직하게는 에쉐리시아 콜리이다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 1,3-프로판디올을 제조하는 경우, 재조합 미생물은 글루코오스로부터 효율적으로 1,3-프로판디올을 생산할 수 있도록 하는 개량을 행하는 편이 바람직하다. 재조합 미생물은 예를 들면, (a) 글리세롤- 3-인산 데히드로게나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 유전자; 및 (b) 글리세롤-3-포스파타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 1개의 유전자를 함유한 재조합 미생물인 것이 바람직하다. 또한, 글리세롤데히드라타아제 재활성화 인자가 dha 레귤론으로부터 단리되는 orfX 및 orfZ에 의해 코딩되는 유전자를 함유한 재조합 미생물인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 재조합 미생물은 글리세롤 키나아제 활성 및/또는 글리세롤 데히드로게나아제 활성 및/또는 트리오스인산 이소메라아제 활성이 결실된 재조합 미생물인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 1,3-프로판디올을 제조하는 경우, 여과·분리 발효액에 함유되는 1,3-프로판디올의 분리·정제는 농축, 정석시켜서 행할 수 있다. 예를 들면, 일본 특허공개 평-35785호 공보에 나타내어지는 감압 농축·정석을 사용한 정제법을 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 카다베린을 제조하는 경우, 카다베린의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 카다베린을 생산할 수 있는 미생물이면 제한은 없다. 카다베린의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 예를 들면, 미생물이 리신 탈탄산 효소 및/또는 리신 카다베린안티포터의 효소 활성을 증강시키고 있는 미생물이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 미생물이 리신 탈탄산 효소 및/또는 리신 카다베린안티포터를 코딩하는 유전자를 도입한 재조합 미생물을 들 수 있다. 더욱 바람직하게는 재조합 미생물이 리신 탈탄산 효소를 코딩하는 유전자가 1 또는 2종류 이상 도입되어 있는 미생물을 들 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 카다베린을 제조하는 경우, 재조합 미 생물로서는 대장균 및 코리네형 세균이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 리신 탈탄산 효소 활성을 갖고, 또한, 호모세린 영양 요구성 또는 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 내성의 적어도 어느 1개의 특징을 갖고 있는 코리네형 세균이다. 또한, 호모세린 데히드로게나아제 활성이 결손되어 있는 것이 바람직하고, 유전자 삽입 변이 생성에 의해 호모세린 데히드로게나아제 활성이 결손되어 있는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명에서는 코리네형 세균의 속이 코리네박테리움속 및 브레비박테리움속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 속인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 코리네박테리아 글루타미컴(Corynebacuterium gulutamicum)이다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 카다베린을 제조하는 경우, 여과·분리 발효액에 함유되는 카다베린의 분리·정제는 농축, 증류 및 정석 등의 종래 알려져 있는 방법을 조합해서 행할 수 있다. 예를 들면, 일본 특허공개 2004-222569호 공보에 나타내어지는 정석을 사용한 정제법을 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명에서는 연속 배양시에 이용되는 산에 의해 여러가지 폴리머 원료로 할 수 있고, 호순도(好純度)가 요구되는 폴리머 원료 용도에서는 정석에 의한 정제 방법이 바람직하게 사용된다. 염산에 의해 배양액의 pH를 유지하면 그 여과액으로부터 정석 공정에 의해 카다베린2염산염을 회수할 수 있다. 더욱 바람직하게는 연속 배양시에 디카르복실산에 의해 배양액의 pH를 유지하고, 그 여과액으로부터 정석 공정에 의해 카다베린 디카르복실산염을 회수하는 것을 들 수 있다. 더욱 바람직하게는 그 디카르복실산은 관능기로서는 2개의 카르복실기만을 갖는 지방족 및/또는 방향족의 디카르복실산이다. 더욱 바람직하게는 상기 디카르복실산으로서 아디핀산, 세 바신산, 1,12-도데칸디카르복실산, 숙신산, 이소프탈산 또는 테레프탈산 중 어느 하나를 들 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 핵산을 제조하는 경우, 핵산의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 핵산을 생산할 수 있는 미생물이면 제한은 없다. 핵산의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 원래 핵산의 생산 능력이 높은 것을 자연계로부터 분리해도 좋고, 인위적으로 생산 능력을 높인 원핵 미생물이어도 좋다. 구체적으로는 돌연 변이나 유전자 재조합에 의해 일부 성질이 개변된 것이어도 좋다.
여기에서 일부 성질의 개변에 관해서 설명한다. 핵산을 효율적으로 생산하기 위해서는 핵산을 생합성해서 축적하여 생체 외부로 방출할 필요가 있다. 그 때문에 핵산의 생합성계로에 관여하는 효소의 증강, 핵산의 분해로에 관여하는 효소 활성저하, 또한, 핵산의 생체 외부 방출에 관계되는 단백질 또는 생체막 조성 등의 개변 등, 미생물 또는 배양 세포의 성질을 바꿈으로써 효율적으로 핵산을 생산하는 미생물 또는 배양 세포를 작출할 수 있다.
구체적으로는 일부 성질 중, 이노신을 생산하는 경우에는 아데닐로숙신산 신테타아제 활성을 갖지 않거나 미약한 것이 바람직하다. 또한, 이노신산 데히드로게나아제 활성을 갖지 않거나 미약한 것이 바람직하다. 또한, 뉴클레오시다아제 활성을 갖지 않거나 미약한 것이 바람직하다. 구아노신을 생산하는 경우에는, 아데닐로숙신산 신테타아제 활성을 갖지 않거나 미약한 것이 바람직하다. 또한, 구아닐산 리덕타아제 활성을 갖지 않거나 미약한 것이 바람직하다. 또한, 뉴클레오시다아제 활성을 갖지 않거나 미약한 것이 바람직하다. 또한, 뉴클레오티다아제 활성을 갖지 않거나 미약한 것이 바람직하다. 우리딘을 생산하는 경우에는 우리딘포스포릴라아제 활성을 갖지 않거나 미약한 것이 바람직하다. 시티딘을 생산하는 경우에는 시티딘데아미나아제 활성을 갖지 않거나 미약한 것이 바람직하고, 호모세린 데히드로게나아제 활성을 갖지 않거나 미약한 것이 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 핵산을 제조하는 경우, 그 미생물 또는 배양 세포 중에서 더욱 바람직하게는 코리네형 세균 및 고초균을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이노신을 생산하는 경우에는 코리네형 세균으로서 코리네박테리움속(Genus Corynebacterium)에 속하는 세균을 들 수 있다. 코리네박테리움속 중에서도 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 구아노파시엔스(Corynebacterium guanofaciens) 및 코리네박테리움 페트로필리움(Corynebacterium petrophilium)이 바람직하게 사용된다. 또한, 고초균으로서 바실러스속(Genus Bacillus)에 속하는 세균을 들 수 있다. 바실러스속 중에서도 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 라이케니포르미스(Bacillus liqueniformis) 및 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)가 바람직하게 사용된다. 또한, 구아노신을 생산하는 경우에는 코리네형 세균으로서 코리네박테리움속(Genus Corynebacterium)에 속하는 세균을 들 수 있다. 코리네박테리움속 중에서도 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)이 바람직하고, 고초균으로서는 예를 들면, 바실러스속(Genus Bacillus)에 속하는 세균을 들 수 있다. 바실러스속 중에서도 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 라이케니포르미스(Bacillus liqueniformis), 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)가 바람직하게 사용된다. 또한, 우리딘을 생산하는 경우에는 고초균을 사용할 수 있고, 고초균 중에서도 바실러스속(Genus Bacillus)에 속하는 세균이 바람직하게 사용된다. 바실러스속 중에서도 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)가 바람직하게 사용된다. 시티딘을 생산하는 경우에는 고초균을 사용할 수 있고, 고초균 중에서도 바실러스속(Genus Bacillus)에 속하는 세균이 바람직하게 사용된다. 바실러스속 중에서도 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)가 바람직하게 사용된다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 핵산을 제조하는 경우, 여과·분리 발효액에 함유되는 핵산의 분리·정제는 바람직하게는 이온 교환 수지 처리법, 농축 냉각 정석법, 막분리법 및 기타 방법을 조합함으로써 행해진다. 불순물을 제거하기 위해서는 상법의 활성탄 흡착법 및 재결법(再結法)을 이용해서 정제해도 좋다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 아미노산을 제조하는 경우, 아미노산의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포로서는 아미노산을 생산할 수 있는 미생물이면 제한은 없다. 아미노산의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 원래 아미노산의 생산 능력이 높은 것을 자연계로부터 분리해도 좋고, 인위적으로 생산 능력을 높인 미생물 또는 배양 세포이어도 좋다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 아미노산을 제조하는 경우, 아미노산은 바람직하게는 L-트레오닌, L-리신, L-글루타민산, L-트립토판, L-이소류신, L-글루타민, L-아르기닌, L-알라닌, L-히스티딘, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-아스파 라긴산, L-티로신, 메티오닌, 세린, 발린, 류신을 들 수 있다.
이어서, 구체적인 아미노산을 예시하면서 아미노산의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포에 대해서 설명한다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-트레오닌을 제조하는 경우, L-트레오닌의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 에쉐리시아속(Genus Escherichia), 프로비덴시아속(Genus Providencia), 코리네박테리움속(Genus Corynebacterium), 브레비박테리움속(Genus Brevibacterium) 또는 세라티아속(Genus Serratia) 중 어느 하나에 속하는 세균을 사용할 수 있다. 그 중에서 특히 바람직한 세균은 에쉐리시아 콜리(Escherichia coli), 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri), 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 브레비박테리움 플라범(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum) 또는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)이다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-리신을 제조하는 경우, L-리신의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 코리네박테리움 글루타미컴, 브레비박테리움 플라범 또는 브레비박테리움 락토퍼멘텀이 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-글루타민산을 제조하는 경우, L-글루타민산의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 코리네박테리움 글루타미컴, 브레비박테리움 플라범 또는 브레비박테리움 락토퍼멘텀이 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-트립토판을 제조하는 경우, L-트립 토판의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 코리네박테리움 글루타미컴, 브레비박테리움 플라범, 브레비박테리움 락토퍼멘텀, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리케파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 또는 에쉐리시아 콜리가 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-이소류신을 제조하는 경우, L-이소류신의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 코리네박테리움 글루타미컴, 브레비박테리움 플라범, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 또는 세라티아 마르세센스가 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-글루타민을 제조하는 경우, L-글루타민의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 코리네박테리움 글루타미컴, 브레비박테리움 플라범, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 또는 플라보박테리움 리겐스(Flavobacterium rigense)가 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-아르기닌을 제조하는 경우, L-아르기닌의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 코리네박테리움 글루타미컴, 브레비박테리움 플라범, 세라티아 마르세센스, 에쉐리시아 콜리 또는 바실러스 서브틸리스가 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-알라닌을 제조하는 경우, L-알라닌의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 브레비박테리움 플라범 또는 아르트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans)가 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-히스티딘을 제조하는 경우, L-히스 티딘의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 코리네박테리움 글루타미컴, 브레비박테리움 플라범, 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes), 세라티아 마르세센스, 에쉐리시아 콜리, 바실러스 서브틸리스 또는 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor)가 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-프롤린을 제조하는 경우, L-프롤린의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 코리네박테리움 글루타미컴, 쿠르티아 카테나포르마(Kurthia catenaforma), 세라티아 마르세센스 또는 에쉐리시아 콜리가 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-페닐알라닌을 제조하는 경우, L-페닐알라닌의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 코리네박테리움 글루타미컴, 브레비박테리움 플라범, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 또는 에쉐리시아 콜리가 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-아스파라긴산을 제조하는 경우, L-아스파라긴산의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 브레비박테리움 플라범, 바실러스 메가테리움(Bacillus megatherium), 에쉐리시아 콜리 또는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)가 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-티로신을 제조하는 경우, L-티로신의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 코리네박테리움 글루타미컴, 브레비박테리움 플라범, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 또는 에쉐리시아 콜리가 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 메티오닌을 제조하는 경우, 메티오닌의 생산에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 코리네박테리움 글루타미컴이 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 세린을 제조하는 경우, 세린의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 코리네박테리움 글루타미컴, 브레비박테리움 플라범, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 또는 아르트로박터 옥시단스가 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 발린을 제조하는 경우, 발린의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 브레비박테리움 락토퍼멘텀, 세라티아 마르세센스 또는 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae)가 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 류신을 제조하는 경우, 류신의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 코리네박테리움 글루타미컴, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 또는 세라티아 마르세센스가 바람직하다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 아미노산을 제조하는 경우, 아미노산의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 예시한 미생물 또는 배양 세포에 대해서 인위적으로 생산 능력을 높인 미생물 또는 배양 세포이어도 좋다. 아미노산의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포는 돌연 변이나 유전자 재조합에 의해 일부 성질이 개변된 것이어도 좋다. 일부 성질이 개변된 아미노산의 제조에 사용할 수 있는 미생물 또는 배양 세포의 일례로서는 일본 특허공개 H2-219582에 기재되어 있는 L-트레오닌 생산성이 향상된 프로비덴시아 레트게리나 일 본 특허공표 평3-500486에 기재되어 있는 L-알라닌 생산성이 향상된 코리네박테리움 글루타미컴 등이 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 따라 연속 발효를 행한 경우, 종래의 회분 발효와 비교해서 높은 체적 생산 속도가 얻어져 매우 효율이 좋은 발효 생산이 가능하게 된다. 여기에서, 연속 배양에 있어서의 생산 속도는 다음 식(3)에 의해 계산된다.
Figure 112008067238378-pct00003
또한, 회분 배양에서의 발효 생산 속도는 원료 탄소원을 모두 소비한 시점의 생산물량(g)을 탄소원의 소비에 요한 시간(h)과 그 시점의 배양액량(L)으로 나눠서 구해진다.
이어서, 본 발명의 연속 발효 장치에 대해서 설명한다. 본 발명의 연속 발효 장치는 에탄올, 1,3-프로판디올, 1,4-부탄디올, 글리세롤 등의 알코올, 초산, 유산, 피루빈산, 숙신산, 말산, 이타콘산, 구연산 등의 유기산, L-트레오닌, L-리신, L-글루타민산, L-트립토판, L-이소류신, L-글루타민, L-아르기닌, L-알라닌, L-히스티딘, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-아스파라긴산, L-티로신, 메티오닌, 세린, 발린, 류신 등의 아미노산, 이노신, 구아노신등 핵산, 카다베린 등의 디아민 화합물, 효소, 항생 물질, 재조합 단백질의 생산에 적용할 수 있다.
본 발명의 연속 발효 장치는 미생물 또는 배양 세포의 발효 배양액을 분리막에 의해 여과하고, 여과액으로부터 생산물을 회수함과 아울러 미여과액을 상기 발 효 배양액에 유지하거나 또는 환류하고, 또한, 발효 원료를 상기 발효 배양액에 추가하는 연속 발효에 의한 화학품의 제조 장치이다.
본 발명의 연속 발효 장치는 미생물 또는 배양 세포를 발효 배양시키기 위한 발효 반응조를 갖는다.
본 발명의 연속 발효 장치 중 하나의 형태는 발효 반응조에 발효 배양액 순환 수단을 통해 접속되어 내부에 분리막을 구비한 발효 배양액을 여과하기 위한 막분리조와, 분리막의 막간 차압을 0.1~20kPa의 범위로 제어하는 수단으로 이루어지고, 상기 분리막이 평균 세공 직경 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만의 다공성막이다.
본 발명의 연속 발효 장치의 다른 형태는 발효 반응조 내부에 배치되고, 분리막을 구비한 발효 배양액을 여과하기 위한 분리막 엘리먼트와, 그 분리막 엘리먼트에 접속되어 여과된 발효 생산물을 배출하기 위한 수단과, 상기 분리막의 막간 차압을 0.1~20kPa의 범위로 제어하기 위한 수단으로 이루어지고, 상기 분리막이 평균 세공 직경 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만의 세공을 갖는 다공성막이다.
본 발명의 연속 발효 장치는 바람직하게는 다공성막의 순수 투과 계수가 2×10-9㎥/㎡/s/pa 이상 6×10-7㎥/㎡/s/pa 이하이다.
본 발명의 연속 발효 장치는 바람직하게는 다공성막의 평균 세공 직경이 0.01㎛ 이상 0.2㎛ 미만이며, 또한, 다공성막의 세공 직경의 표준 편차가 0.1㎛ 이하이다.
본 발명의 연속 발효 장치는 바람직하게는 다공성막의 막 표면 거칠기가 0.1 ㎛ 이하인 다공성막이다.
본 발명의 연속 발효 장치는 바람직하게는 다공성막이 다공질 수지층을 함유하는 다공성막이다. 본 발명의 연속 발효 장치는 보다 바람직하게는 다공질 수지층이 유기 고분자로 이루어지는 다공질 수지층이다. 본 발명의 연속 발효 장치는 더욱 더 바람직하게는 유기 고분자막의 재질이 폴리불화비닐리덴이다.
이어서, 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 이용되는 연속 발효 장치에 대해서 도면을 사용하여 설명한다.
도 1은 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 이용되는 막분리형 연속 발효 장치의 예를 설명하기 위한 개요 측면도이다. 도 1은 분리막 엘리먼트가 발효 반응조의 외부에 설치된 대표적인 예이다.
도 1에 있어서 막분리형 연속 발효 장치는 발효 반응조(1)와 막분리층(12)과 수두차 제어 장치(3)에 의해 기본적으로 구성되어 있다. 여기에서, 분리막 엘리먼트(2)에는 다공성막이 장착되어 있다. 이 다공성막으로서는 예를 들면, 국제 공개 제 2002/064240호 팸플릿에 개시되어 있는 분리막 및 분리막 엘리먼트를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 막분리조(12)는 발효액 순환 펌프(11)를 통해 발효 반응조(1)에 접속되어 있다.
도 1에 있어서 배지 공급 펌프(7)에 의해 배지를 발효 반응조(1)에 투입하고, 필요에 따라 교반기(5)에 의해 발효 반응조(1) 내의 발효액을 교반하고, 또한, 필요에 따라 기체 공급 장치(4)에 의해 필요로 하는 기체를 공급할 수 있다. 이 때, 공급된 기체를 회수 리사이클해서 다시 기체 공급 장치(4)에 의해 공급할 수 있다. 또한, 필요에 따라 pH 센서·제어 장치(9) 및 pH 조정 용액 공급 펌프(8)에 의해 발효액의 pH를 조정하고, 또한, 필요에 따라 온도 조절기(10)에 의해 발효액의 온도를 조절함으로써 생산성이 높은 발효 생산을 행할 수 있다. 또한, 장치 내의 발효액은 발효액 순환 펌프(11)에 의해 발효 반응조(1)와 막분리조(12) 사이를 순환한다. 발효 생산물을 함유하는 발효액은 분리막 엘리먼트(2)에 의해 미생물과 발효 생산물에 여과·분리되어 장치계로부터 인출할 수 있다. 또한, 여과·분리된 미생물은 장치계 내에 머무름으로써 장치계 내의 미생물 농도를 높게 유지할 수 있고, 생산성이 높은 발효 생산을 가능하게 하고 있다. 여기에서, 분리막 엘리먼트(2)에 의한 여과·분리에는 막분리조(12)의 수면과의 수두차압에 의해 행하여 특별한 동력을 필요로 하지 않는다. 필요에 따라 레벨 센서(6) 및 수두차압 제어 장치(3)에 의해 분리막 엘리먼트(2)의 여과·분리 속도 및 장치계 내의 발효액량을 적당히 조절할 수 있다. 필요에 따라 기체 공급 장치(4)에 의해 필요로 하는 기체를 막분리조(12) 내에 공급할 수 있다. 이 때, 공급된 기체를 회수 리사이클해서 다시 기체 공급 장치(4)에 의해 공급할 수 있다. 분리막 엘리먼트(2)에 의한 여과·분리는 필요에 따라 펌프 등에 의한 흡인 여과 또는 장치계 내를 가압함으로써 여과·분리할 수도 있다. 또한, 배양조에서 연속 발효로 미생물 또는 배양 세포를 배양하고, 필요에 따라 발효조 내에 공급할 수 있다. 배양조에서 연속 발효로 미생물 또는 배양 세포를 배양하고, 필요에 따라 발효조 내에 공급함으로써 항상 프레시하고, 화학품의 생산 능력이 높은 미생물 또는 배양 세포에 의한 연속 발효가 가능하게 되고, 높은 생산 성능을 장기간 유지한 연속 발효가 가능하게 된다.
이어서, 도 2는 본 발명에서 이용되는 다른 막분리형 연속 발효 장치의 예를 설명하기 위한 개요 측면도이다. 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 이용되는 연속 발효 장치 중, 분리막 엘리먼트가 발효 반응조의 내부에 설치된 대표적인 일례를 도 2의 개요도에 나타낸다.
도 2에 있어서 막분리형 연속 발효 장치는 발효 반응조(1)와 수두차 제어 장치(3)에 의해 기본적으로 구성되어 있다. 발효 반응조(1) 내의 분리막 엘리먼트(2)에는 다공성막이 장착되어 있다. 이 다공성막으로서는 예를 들면, 국제 공개 제 2002/064240호 팸플릿에 개시되어 있는 분리막 및 분리막 엘리먼트를 사용할 수 있다. 분리막 엘리먼트에 관해서는 추후에 상세하게 설명한다.
이어서, 도 2의 막분리형 연속 발효 장치에 의한 연속 발효의 형태에 대해서 설명한다.
배지 공급 펌프(7)에 의해 배지를 발효 반응조(1)에 연속적 또는 단속적으로 투입한다. 배지는 투입 전에 필요에 따라 가열 살균, 가열 멸균 또는 필터를 사용한 멸균 처리를 행할 수 있다. 발효 생산시에는 필요에 따라 발효 반응조(1) 내의 교반기(5)에 의해 발효 반응조(1) 내의 발효액을 교반한다. 발효 생산시에는 필요에 따라 기체 공급 장치(4)에 의해 필요로 하는 기체를 발효 반응조(1) 내에 공급할 수 있다. 발효 생산시에는 필요에 따라 pH 센서·제어 장치(9) 및 pH 조정 용액공급 펌프(8)에 의해 발효 반응조(1) 내의 발효액의 pH를 조정하고, 필요에 따라 온도 조절기(10)에 의해 발효 반응조(1) 내의 발효액의 온도를 조절함으로써 생산성이 높은 발효 생산을 행할 수 있다. 여기에서는 계장·제어 장치에 의한 발효액 의 물리 화학적 조건의 조절에 pH 및 온도를 예시했지만 필요에 따라 용존 산소나 ORP의 제어, 온라인 케미멀 센서 등의 분석 장치에 의해 발효액 중의 화학품의 농도를 측정하고, 발효액 중의 화학품의 농도를 지표로 한 물리 화학적 조건의 제어를 행할 수 있다. 또한, 배지의 연속적 또는 단속적 투입은 바람직하게는 상기 계장 장치에 의한 발효액의 물리 화학적 환경의 측정값을 지표로 해서 배지 투입량 및 속도를 적당히 조절한다.
도 2에 있어서 발효액은 발효 반응조(1) 내에 설치된 분리막 엘리먼트(2)에 의해 미생물과 발효 생산물이 여과·분리되어 발효 생산물이 장치계로부터 인출된다. 또한, 여과·분리된 미생물이 장치계 내에 머무름으로써 장치계 내의 미생물 농도를 높게 유지할 수 있고, 생산성이 높은 발효 생산을 가능하게 하고 있다. 여기에서, 분리막 엘리먼트(2)에 의한 여과·분리는 발효 반응조(1)의 수면과의 수두차압에 의해 행하여 특별한 동력을 필요로 하지 않는다. 또한, 필요에 따라 레벨 센서(6) 및 수두차압 제어 장치(3)에 의해 분리막 엘리먼트(2)의 여과·분리 속도 및 발효 반응조(1) 내의 발효액량을 적당히 조절할 수 있다. 상기 분리막 엘리먼트에 의한 여과·분리에는 필요에 따라 펌프 등에 의한 흡인 여과 또는 장치계 내를 가압함으로써 여과·분리할 수도 있다. 또한. 배양조에서 연속 발효로 미생물 또는 배양 세포를 배양하고, 필요에 따라 발효조 내에 공급할 수 있다. 배양조에서 연속 발효로 미생물 또는 배양 세포를 배양하고, 필요에 따라 발효조 내에 공급함으로써 항상 프레시하며, 화학품의 생산 능력이 높은 미생물 또는 배양 세포에 의한 연속 발효가 가능하게 되고, 높은 생산 성능을 장기간 유지한 연속 발효가 가능하게 된 다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 이용되는 연속 발효 장치에서 바람직하게 이용되는 분리막 엘리먼트에 대해서 설명한다.
도 3에 나타내는 분리막 엘리먼트에 대해서 설명한다. 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 이용되는 연속 발효 장치에서는 바람직하게는 국제 공개 제 2002/064240호 팸플릿에 개시되어 있는 분리막 및 분리막 엘리먼트를 사용할 수 있다. 분리막 엘리먼트는 도 3에 나타내는 바와 같이, 강성을 갖는 지지판(13)의 양면에 유로재(14)와 상기 분리막(15)을 이 순서로 배치해서 구성되어 있다. 지지판(13)은 양면에 오목부(16)를 갖고 있다. 분리막(15)은 발효액을 여과한다. 유로재(14)는 분리막(15)에 의해 여과된 투과수를 효율적으로 지지판(13)에 흘리기 위한 것이다. 지지판(13)에 흐른 투과수는 지지판(13)의 오목부(16)를 통과하고, 집수 파이프(17)를 통해 발효 배양조 외부로 인출된다. 투과수를 인출하기 위한 동력으로서 수두차압, 펌프, 액체나 기체 등에 의한 흡인 여과 또는 장치계 내를 가압한다는 등의 방법을 사용할 수 있다.
이어서, 도 4에 나타내는 분리막 엘리먼트에 대해서 설명한다. 분리막 엘리먼트는 도 4에 나타내는 바와 같이, 중공사막에 의해 구성된 분리막 다발(18)과 상부 수지 밀봉층(19), 하부 수지 밀봉층(20)에 의해 주로 구성된다. 분리막 다발은 상부 수지 밀봉층(19) 및 하부 수지 밀봉층(20)에 의해 다발상으로 접착·고정화되어 있다. 하부 수지 밀봉층에 의한 접착·고정화는 중공사막의 중공부를 밀봉하고 있어 발효 배양액의 누출을 방지하는 구조로 되어 있다. 한편, 상부 수지 밀봉 층(19)은 중공사막의 내부 구멍을 밀봉하고 있지 않고, 집수 파이프(22)에 투과수가 흐르는 구조로 되어 있다. 이 분리막 엘리먼트는 지지 프레임(21)을 통해 연속 발효 장치 내에 설치할 수 있다. 분리막 다발(18)에 의해 여과된 투과수는 중공사막의 중공부를 통과하고, 집수 파이프(22)를 통해 발효 배양조 외부로 인출된다. 투과수를 인출하기 위한 동력으로서 수두차압, 펌프, 액체나 기체 등에 의한 흡인 여과 또는 장치계 내를 가압한다는 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 이용되는 연속 발효 장치의 분리막 엘리먼트를 구성하는 부재는 고압 증기 멸균 조작에 내성인 부재인 것이 바람직하다. 발효 장치 내가 멸균 가능하면 연속 발효시에 바람직하지 않은 미생물에 의한 오염의 위험을 회피할 수 있어 보다 안정적인 연속 발효가 가능하게 된다. 분리막 엘리먼트를 구성하는 부재는 고압 증기 멸균 조작의 조건인 121℃에서 15분간에 내성인 것이 바람직하다. 분리막 엘리먼트 부재는 예를 들면, 스테인레스, 알루미늄 등의 금속, 폴리아미드계 수지, 불소계 수지, 폴리카보네이트계 수지, 폴리아세탈계 수지, 폴리부틸렌테레프탈레이트계 수지, PVDF, 변성 폴리페닐렌에테르계 수지, 폴리설폰계 수지 등의 수지를 바람직하게 선정할 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 이용되는 연속 발효 장치에서는 분리막 엘리먼트는 발효조 외부에 설치해도 좋고, 발효조 내에 설치해도 좋다. 발효조 외부에 설치하는 경우에는 별도로 막분리조를 설치해서 그 내부에 분리막 엘리먼트를 설치할 수 있고, 발효조와 막분리조 사이에 발효액을 순환시키면서 분리막 엘리먼트에 의해 발효액을 연속적으로 여과할 수 있다.
본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 이용되는 연속 발효 장치에서는 막분리조는 고압 증기 멸균 가능한 것이 바람직하다. 막분리조가 고압 증기 멸균 가능하면 잡균에 의한 오염 회피가 용이하다.
(실시예)
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해서 상기 화학품으로서 L-유산, D-유산, 에탄올, 피루빈산, 숙신산, 1,3-프로판디올, 이타콘산, 카다베린, 핵산 및 아미노산을 선정하고, 각각의 화학품을 생산할 능력이 있는 미생물 또는 배양 세포에 의한 도 1 및 도 2의 개요도에 나타내는 장치를 사용한 연속 발효의 구체적인 실시형태에 대해서 실시예를 예로 들어 설명한다.
참고예 1 L-유산 생산 능력을 갖는 효모주의 제작
L-유산 생산 능력을 갖는 효모주를 하기와 같이 조성했다. 인간 유래 LDH 유전자를 효모 게놈 상의 PDC1 프로모터의 하류에 연결함으로써 L-유산 생산 능력을 갖는 효모주를 조성했다. 폴리메라아제 체인 리액션(PCR)에는 La-Taq(타카라슈조) 또는 KOD-Plus-polymerase(토요보)를 사용하고, 부속의 취급 설명에 따라 행했다.
인간 유암 주화 세포(MCF-7)를 배양 회수한 후, TRIZOL Reagent(Invitrogen) 를 이용해서 total RNA를 추출하여 얻어진 total RNA를 주형으로 하고, SuperScript Choice System(Invitrogen)을 사용한 역전 사진 반응에 의해 cDNA의 합성을 행했다. 이들 조작의 상세는 각각 부속의 프로토콜에 따랐다. 얻어진 cDNA를 계속되는 PCR의 증폭 주형으로 했다.
상기 조작에 의해 얻어진 cDNA를 증폭 주형으로 하고, 배열 번호 1 및 배열 번호 2로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 한 KOD-Plus-polymerase에 의한 PCR에 의해 L-ldh 유전자의 클로닝(cloning)을 행했다. 각 PCR 증폭 단편을 정제하고, 말단을 T4 Polynucleotide Kinase(TAKARA사제)에 의해 인산화한 후, pUC118 벡터(제한 효소 HincII에 의해 절단하고, 절단면을 탈인산화 처리한 것)에 라이게이션(ligation)했다. 라이게이션은 DNA Ligation Kit Ver.2(TAKARA사제)를 사용해서 행했다. 라이게이션 플라스미드 산물에 의해 대장균 DH5α를 형질 전환하고, 플라스미드 DNA를 회수함으로써 각종 L-ldh 유전자(배열 번호 3)가 서브클로닝된 플라스미드를 얻었다. 얻어진 L-ldh 유전자가 삽입된 pUC118 플라스미드를 제한 효소 XhoI 및 NotI에 의해 소화하고, 얻어진 각 DNA 단편을 효모 발현용 벡터 pTRS11(도 5)의 XhoI/NotI 절단 부위에 삽입했다. 이렇게 해서 인간 유래 L-ldh 유전자 발현 플라스미드 pL-ldh5(L-ldh 유전자)를 얻었다. 또한, 인간 유래의 L-ldh 유전자 발현 벡터인 상기 pL-ldh5는 플라스미드 단독으로 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라키현 츠쿠바시 토 1-1-1 츄오 다이 6)에 FERM AP-20421로서 기탁했다{기탁일: 평성 17년(2005년) 2월 21일}.
인간 유래 LDH 유전자를 함유하는 플라스미드 pL-ldh5를 증폭 주형으로 하고, 배열 번호 4 및 배열 번호 5로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 1.3kb의 인간 유래 LDH 유전자 및 사카로미세스 세레비시에 유래의 TDH3 유전자의 터미네이터 배열을 함유하는 DNA 단편을 증폭했다. 또한, 플라스미드 pRS424를 증폭 주형으로 하고, 배열 번호 6 및 배열 번호 7로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 1.2kb의 사카로미세스 세 레비시에 유래의 TRP1 유전자를 함유하는 DNA 단편을 증폭했다. 각각의 DNA 단편을 1.5% 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리, 상법에 따라 정제했다. 여기에서 얻어진 1.3kb 단편, 1.2kb 단편을 혼합한 것을 증폭 주형으로 하고, 배열 번호 4 및 배열 번호 7로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 한 PCR법에 의해 얻어진 산물을 1.5% 아가로스 겔 전기 영동하고, 인간 유래 LDH 유전자 및 TRP1 유전자가 연결된 2.5kb의 DNA 단편을 상법에 따라 조정했다. 이 2.5kb의 DNA 단편에 의해 출아 효모 NBRC10505주를 상법에 따라 트립토판 비요구성으로 형질 전환했다.
얻어진 형질 전환 세포가 인간 유래 LDH 유전자를 효모 게놈 상의 PDC1 프로모터의 하류에 연결되어 있는 세포인 것의 확인은 하기와 같이 행했다. 우선, 형질 전환 세포의 게놈 DNA를 상법에 따라서 조제하고, 이것을 증폭 주형으로 한 배열 번호 8 및 배열 번호 9로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 0.7kb의 증폭 DNA 단편이 얻어짐으로써 확인했다. 또한, 형질 전환 세포가 유산 생산 능력을 갖는지의 여부는 SC 배지(METHODS IN YEAST GENETICS 2000 EDITION, CSHL PRESS)에 의해 형질 전환 세포를 배양한 배양 상청부에 유산이 함유되어 있는 것을 하기에 나타내는 조건으로 HPLC법에 의해 유산량을 측정함으로써 확인했다.
칼럼: Shim-Pack SPR-H(시마즈사제)
이동상: 5mM p-톨루엔술폰산(유속 0.8mL/min)
반응액: 5mM p-톨루엔술폰산, 20mM 비스트리스, 0.1mM EDTA·2Na(유속 0.8mL/min)
검출 방법: 전기 전도도
온도: 45℃.
또한, L-유산의 광학 순도 측정은 이하의 조건으로 HPLC법에 의해 측정했다.
칼럼: TSK-gel Enantio L1(토소사제)
이동상: 1mM 황산동 수용액
유속: 1.0ml/min
검출 방법: UV 254㎚
온도: 30℃.
또한, L-유산의 광학 순도는 다음 식에 의해 계산된다.
광학 순도(%)=100×(L-D)/(L+D)
여기에서, L은 L-유산의 농도, D는 D-유산의 농도를 나타낸다.
HPLC 분석 결과, 4g/L의 L-유산이 검출되고, D-유산은 검출 한계 이하였다. 이상의 검토에 의해 이 형질 전환체가 L-유산 생산 능력을 갖는 것을 확인했다. 얻어진 형질 전환 세포를 효모 SW-1주로 해서 계속되는 실시예에 사용했다.
참고예 2 다공성막의 제작(그 1)
수지로서 폴리불화비닐리덴(PVDF) 수지와, 용매로서 N,N-디메틸아세트아미드를 각각 사용하고, 이들을 90℃의 온도하에서 충분히 교반하여 다음 조성을 갖는 원액을 얻었다.
폴리불화비닐리덴: 13.0중량%
N,N-디메틸아세트아미드: 87.0중량%
이어서, 상기 원액을 25℃의 온도로 냉각시킨 후, 미리 유리판 상에 부착해둔 밀도가 0.48g/㎤, 두께가 220㎛인 폴리에스테르 섬유제 부직포에 도포하고, 즉시 다음 조성을 갖는 25℃의 온도의 응고욕 안에 5분간 침지해서 다공질 수지층이 형성된 다공질 기재를 얻었다.
물: 30.0중량%
N,N-디메틸아세트아미드: 70.0중량%.
이 다공질 기재를 유리판으로부터 박리한 후, 80℃의 온도의 열수에 3회 침지해서 N,N-디메틸아세트아미드를 씻어내어 분리막을 얻었다.
다공질 수지층 표면의 9.2㎛×10.4㎛의 범위 내를 배율 10,000배로 주사형 전자 현미경 관찰을 행했다. 관찰할 수 있는 세공 전체 직경의 평균은 0.1㎛였다.
이어서, 상기 분리막에 대해서 순수 투과 계수를 평가했다. 50×10-9㎥/㎡·s·Pa이었다. 순수 투과 계수의 측정은 역침투막에 의한 25℃의 정제수를 사용하고, 헤드 높이 1m에서 행했다.
또한, 평균 세공 직경의 표준 편차는 0.035㎛, 막 표면 거칠기는 0.06㎛였다. 이렇게 해서 제작한 다공성막은 본 발명에 바람직하게 사용할 수 있었다.
참고예 3 다공성막의 제작(그 2)
수지로서 폴리불화비닐리덴(PVDF) 수지와, 개공제로서 분자량이 약 20,000인 폴리에틸렌글리콜(PEG)과, 용매로서 N,N-디메틸아세트아미드와, 비용매로서 순수를 각각 사용하고, 이들을 90℃의 온도하에서 충분히 교반하여 다음 조성을 갖는 원액 을 얻었다.
폴리불화비닐리덴: 13.0중량%
폴리에틸렌글리콜: 5.5중량%
N,N-디메틸아세트아미드: 78.0중량%
순수: 3.5중량%.
이어서, 상기 원액을 25℃로 냉각시킨 후, 밀도가 0.48g/㎤, 두께가 220㎛인 폴리에스테르 섬유제 부직포에 도포하고, 도포 후, 즉시 25℃의 순수 중에 5분간 침지하고, 80℃의 열수에 3회 더 침지해서 N,N-디메틸아세트아미드 및 폴리에틸렌글리콜을 씻어내어 분리막을 얻었다.
이 분리막의 원액을 도포한 측에 있어서의 다공질 수지층 표면의 9.2㎛×10.4㎛의 범위 내를 배율 10,000배로 주사형 전자 현미경 관찰을 행했다. 관찰할 수 있는 세공 전체 직경의 평균은 0.02㎛였다.
이 분리막에 대해서 순수 투과 계수를 평가했다. 순수 투과 계수는 2×10-9㎥/㎡·s·Pa이었다. 순수 투과 계수의 측정은 역침투막에 의한 25℃의 정제수를 사용하고, 헤드 높이 1m에서 행했다.
평균 세공 직경의 표준 편차는 0.0055㎛, 막 표면 거칠기는 0.1㎛였다. 이렇게 해서 제작한 다공성막은 본 발명에 바람직하게 사용할 수 있었다.
참고예 4 다공성막의 제작(그 3)
이하에 나타내는 조성의 원액을 사용한 외에는 참고예 3과 마찬가지로 해서 분리막을 얻었다.
폴리불화비닐리덴: 13.0중량%
폴리에틸렌글리콜: 5.5중량%
N,N-디메틸아세트아미드: 81.5중량%.
이 분리막의 원액을 도포한 측에 있어서의 다공질 수지층 표면의 9.2㎛×10.4㎛의 범위 내를 배율 10,000배로 주사형 전자 현미경 관찰을 행했다. 관찰할 수 있는 세공 전체 직경의 평균은 0.19㎛였다.
이 분리막에 대해서 순수 투과 계수를 평가한 결과, 100×10-9㎥/㎡·s·Pa이었다. 순수 투과 계수의 측정은 역침투막에 의한 25℃의 정제수를 사용하고, 헤드 높이 1m에서 행했다.
또한, 평균 세공 직경의 표준 편차는 0.060㎛, 막 표면 거칠기는 0.08㎛였다. 이렇게 해서 제작한 다공성막은 본 발명에 바람직하게 사용할 수 있었다.
참고예 5 다공성막의 제작(그 4)
수지로서 폴리불화비닐리덴(PVDF) 수지와, 용매로서 N,N-디메틸아세트아미드를 각각 사용하고, 이들을 90℃의 온도하에서 충분히 교반하여 다음 조성을 갖는 원액을 얻었다.
폴리불화비닐리덴: 15.0중량%
N,N-디메틸아세트아미드: 85.0중량%
이어서, 상기 원액을 25℃의 온도로 냉각시킨 후, 미리 유리판 상에 부착해 둔 밀도가 0.48g/㎤, 두께가 220㎛인 폴리에스테르 섬유제 부직포에 도포하고, 즉시 다음 조성을 갖는 25℃의 온도의 응고욕 안에 5분간 침지하여 다공질 수지층이 형성된 다공질 기재를 얻었다.
물: 100.0중량%
이 다공질 기재를 유리판으로부터 박리한 후, 80℃의 온도의 열수에 3회 침지해서 N,N-디메틸아세트아미드를 씻어내어 분리막을 얻었다. 다공질 수지층 표면의 9.2㎛×10.4㎛의 범위 내를 배율 10,000배로 주사형 전자 현미경 관찰을 행한 결과, 관찰할 수 있는 세공 전체 직경의 평균은 0.008㎛였다. 이어서, 상기 분리막에 대해서 순수 투수량을 평가한 결과, 0.3×10-9㎥/㎡·s·Pa이었다. 투수량의 측정은 역침투막에 의한 25℃의 정제수를 사용하고, 헤드 높이 1m에서 행했다. 또한, 평균 세공 직경의 표준 편차는 0.002㎛, 막 표면 거칠기는 0.06㎛였다.
실시예 1 효모를 사용한 연속 발효에 의한 L-유산의 제조(그 1)
도 1의 연속 발효 장치와 표 1에 나타내는 조성의 효모 유산 발효 배지를 사용하여 L-유산의 제조를 행했다. 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재로서는 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 실시예 1에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
반응조 용량: 2(L)
막분리조 용량: 0.5(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 60㎠
온도 조정: 30(℃)
반응조 통기량: 0.05(L/min)
막분리조 통기량: 0.3(L/min)
반응조 교반 속도: 100(rpm)
pH 조정: 1N NaOH에 의해 pH5로 조정
유산 발효 배지 공급 속도: 50~300ml/hr.의 범위에서 가변 제어
발효액 순환 장치에 의한 순환액량: 0.1(L/min)
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~200시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
200시간~300시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
미생물로서 참고예 1에서 조성한 효모 SW-1주를 사용하고, 배지로서 표 1에 나타내는 조성의 유산 발효 배지를 사용하고, 생산물인 유산의 농도 평가에는 참고예 1에 나타낸 HPLC를 사용하고, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코준야쿠)를 사용했다.
Figure 112008067238378-pct00004
우선, SW-1주를 시험관에서 5ml의 유산 발효 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 유산 발효 배지 100ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크(진탕 플라스크)에서 24시간, 30℃에서 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 1에 나타내는 연속 발효 장치의 1.5L의 유산 발효 배지에 접종하고, 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 교반하고, 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도 조정, pH 조정을 행하고, 발효액 순환 펌프(10)를 가동시키지 않고, 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 발효액 순환 펌프(10)를 가동시키고, 전 배양시의 운전 조건에 추가해서 막분리조(2)를 통기하고, 유산 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 막분리형 연속 발효 장치의 발효액량을 2L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 L-유산의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 L-유산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다.
300시간의 연속 발효 시험을 행한 결과를 표 2에 나타낸다. 도 1에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 L-유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 2 효모를 사용한 연속 발효에 의한 L-유산의 제조(그 2)
분리막으로서는 참고예 3에서 제작한 다공성막을 사용하여 실시예 1과 동일한 L-유산 연속 발효 시험을 행했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 그 결과, 안정적인 L-유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 3 효모를 사용한 연속 발효에 의한 L-유산의 제조(그 3)
분리막으로서는 참고예 4에서 제작한 다공성막을 사용하고, 실시예 1과 동일한 L-유산 연속 발효 시험을 행했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 그 결과, 안정적인 L-유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 4 효모를 사용한 연속 발효에 의한 L-유산의 제조(그 4)
도 2에 나타내는 연속 발효 장치와 표 1에 나타내는 조성의 유산 발효 배지를 사용하여 L-유산의 제조를 행했다. 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재로서는 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 1에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 30(℃)
발효 반응조 통기량: 0.05(L/min)
유산 발효 배지 공급 속도: 50~300ml/hr.의 범위에서 가변 제어
발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
pH 조정: 1N NaOH에 의해 pH5로 조정
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(연속 발효 개시 후~80시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
80시간~160시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
160시간~240시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어)
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균.
미생물로서 참고예 1에서 조성한 효모 SW-1주를 사용하고, 배지로서 표 1에 나타내는 조성의 유산 발효 배지를 사용하고, 생산물인 L-유산의 농도의 평가에는 참고예 1에 나타낸 HPLC를 사용하고, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다.
우선, SW-1주를 시험관에서 5ml의 유산 발효 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 유산 발효 배지 100ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간, 30℃에서 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 2에 나타낸 막분리형 연속 발효 장치의 1.5L의 유산 발효 배지에 접종하고, 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 400rpm으로 교반하고, 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도 조정, pH 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 유산 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 막분리형 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 L-유산의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 L-유산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 상기 L-유산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 투입 글루코오스로부터 산출된 L-유산 대당수율, L-유산 생산 속도를 표 2에 나타냈다.
240시간의 발효 시험을 행한 결과, 도 2에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 L-유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 5 효모를 사용한 연속 발효에 의한 L-유산의 제조(그 5)
분리막으로서는 참고예 3에서 제작한 다공성막을 사용하고, 실시예 4와 동일한 L-유산 연속 발효 시험을 행했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 그 결과, 안정적인 L-유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 6 효모를 사용한 연속 발효에 의한 L-유산의 제조(그 6)
분리막으로서는 참고예 4에서 제작한 다공성막을 사용하고, 실시예 5와 동일한 L-유산 연속 발효 시험을 행했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 그 결과, 안정적인 L-유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
비교예 1 회분 발효에 의한 L-유산의 제조
미생물을 사용한 발효 형태로서 가장 전형적인 회분 발효를 행하고, 그 L-유산 생산성을 평가했다. 표 1에 나타내는 유산 발효 배지를 사용하고, 도 1의 막분리형 연속 발효 장치의 반응조(1)만을 사용한 회분 발효 시험을 행했다. 상기 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 본 비교예에서도 미생물로서 참고예 1에서 조성한 효모 SW-1주를 사용하고, 생산물인 L-유산의 농도의 평가에는 참고예 1에 나타낸 HPLC를 이용해서 평가하고, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다. 비교예 2의 운전 조건을 이하에 나타낸다.
반응조 용량(유산 발효 배지량): 1(L)
온도 조정: 30(℃)
반응조 통기량: 0.05(L/min)
반응조 교반 속도: 100(rpm)
pH 조정: 1N NaOH에 의해 pH5로 조정.
우선, SW-1주를 시험관에서 5ml의 유산 발효 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 신선한 유산 발효 배지 100ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간 진탕 배양했다(전 배양). 전 배양액을 막분리형 연속 발효 장치의 1.5L의 유산 발효 배지에 접종하고, 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 100rpm으로 교반하고, 반응조(1)를 통기했다. 온도 조정, pH 조정을 행하고, 발효액 순환 펌프(10)를 가동시키지 않고, 회분 발효 배양을 행했다. 이 때의 균체 증식량은 600㎚에서의 흡광도로 14였다. 회분 발효 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure 112008067238378-pct00005
도 1 및 도 2에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-유산의 생산 속도가 대폭 향상되었다.
비교예 2 효모를 사용한 연속 발효에 의한 L-유산의 제조
분리막으로서는 참고예 5에서 제작한 세공 직경이 작고, 순수 투과 계수가 작은 다공성막을 사용하고, 막투과수량 제어 방법을 막간 차압에 의한 유량 제어(연속 발효 전체 기간 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어)하고, 그 이외에는 실시예 1 과 마찬가지로 행했다.
그 결과, 배양 개시 후 96시간에서 막간 차압이 20kPa을 초과해서 막의 폐색이 발생되었기 때문에 연속 발효를 정지했다. 이 점에서 참고예 5에서 제작한 다공성막은 L-유산의 제조에 부적합한 것이 밝혀졌다.
비교예 3 효모를 사용한 연속 발효에 의한 L-유산의 제조
분리막으로서는 참고예 5에서 제작한 세공 직경이 작고, 순수 투과 계수가 작은 다공성막을 사용하고, 막투과수량 제어 방법을 막간 차압에 의한 유량 제어(연속 발효 전체 기간 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어)하고, 그 이외에는 실시예 4 와 마찬가지로 행했다.
그 결과, 배양 개시 후 80시간에서 막간 차압이 20kPa을 초과해서 막의 폐색이 발생되었기 때문에 연속 발효를 정지했다. 이 점에서 참고예 5에서 제작한 다공성막은 L-유산의 제조에 부적합한 것이 밝혀졌다.
실시예 7 연속 발효에 의한 에탄올의 제조(그 1)
도 1의 연속 발효 장치와 표 3에 나타내는 조성의 에탄올 발효 배지를 사용하여 에탄올의 제조를 행했다. 상기 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
반응조 용량:2(L)
막분리조 용량: 0.5(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정:30(℃)
반응조 통기량: 0.05(L/min)
막분리조 통기량: 0.3(L/min)
반응조 교반 속도:100(rpm)
pH 조정:1N NaOH에 의해 pH5로 조정
에탄올 발효 배지 공급 속도: 50~300ml/hr.의 범위에서 가변 제어
발효액 순환 장치에 의한 순환액량: 0.1(L/min)
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~200시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
200시간~300시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
미생물로서 NBRC10505주를 사용하고, 배지로서 표 1에 나타내는 조성의 에탄올 발효 배지를 사용하고, 생산물인 에탄올의 농도의 평가에는 에탄올 농도는 가스크로마토그래피법에 의해 정량했다. Shimadzu GC-2010 캐필러리(capillary) GC TC-1(GL science) 15meter L.*0.53mm I.D., df1.5㎛를 이용해서 수소염 이온화 검출기에 의해 검출·산출하고, 평가했다. 또한, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다.
Figure 112008067238378-pct00006
우선, NBRC10505주를 시험관에서 5ml의 에탄올 발효 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 에탄올 발효 배지 100ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간, 30℃에서 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 1에 나타낸 막분리형 연속 발효 장치의 1.5L의 에탄올 발효 배지에 접종하고, 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 100rpm으로 교반하고, 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도 조정, pH 조정을 행하고, 발효액 순환 펌프(10)를 가동시키지 않고, 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 발효액 순환 펌프(10)를 가동시키고, 전 배양시의 운전 조건에 추가해서 막분리조(2)를 통기하고, 에탄올 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 막분리형 연속 발효 장치의 발효액량을 2L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 에탄올의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 에탄올 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정한 결과를 표 4에 나타낸다.
도 1에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 에탄올의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 8 연속 발효에 의한 에탄올의 제조(그 2)
도 2의 연속 발효 장치와 표 3에 나타내는 조성의 에탄올 발효 배지를 사용하여 에탄올의 제조를 행했다. 상기 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재로서는 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 30(℃)
발효 반응조 통기량: 0.05(L/min)
유산 발효 배지 공급 속도: 50~300ml/hr.의 범위에서 가변 제어
발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
pH 조정: 1N NaOH에 의해 pH5로 조정
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(연속 발효 개시 후~80시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
80시간~160시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
160시간~240시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
미생물로서 효모 NBRC10505주를 사용하고, 배지로서 표 2에 나타내는 조성의 에탄올 발효 배지를 사용하고, 생산물인 에탄올의 농도의 평가에는 실시예 7에 나타낸 가스크로마토그래피를 사용하고, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다.
우선, NBRC10505주를 시험관에서 5ml의 에탄올 발효 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 에탄올 발효 배지 100ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간, 30℃에서 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 2에 나타낸 막분리형 연속 발효 장치의 1.5L의 유산 발효 배지에 접종하고, 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 400rpm으로 교반하고, 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도 조정, pH 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 에탄올 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 막분리형 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 에탄올의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 에탄올 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 상기 에탄올 및 글루코오스 농도로부터 산출된 투입 글루코오스로부터 산출된 에탄올 대당수율, 에탄올 생산 속도를 표 4에 나타냈다.
도 2에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 에탄올의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
비교예 4 회분 발효에 의한 에탄올의 제조
미생물을 사용한 발효 형태로서 가장 전형적인 회분 발효를 행하여 에탄올 생산성을 평가했다. 표 3에 나타내는 에탄올 발효 배지를 사용하고, 도 1의 막분리형 연속 발효 장치의 반응조(1)만을 사용한 회분 발효 시험을 행했다. 상기 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 본 비교예에서도 미생물로서 NBRC10505주를 사용하고, 생산물인 에탄올의 농도의 평가에는 실시예 6에 나타낸 가스크로마토그래피를 이용해서 평가하고, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다. 본 비교예의 운전 조건을 이하에 나타낸다.
반응조 용량(에탄올 발효 배지량): 1(L)
온도 조정: 30(℃)
반응조 통기량: 0.05(L/min)
반응조 교반 속도: 100(rpm)
pH 조정: 1N NaOH에 의해 pH5로 조정.
우선, NBRC10505주를 시험관에서 5ml의 에탄올 발효 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 신선한 에탄올 발효 배지 100ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간 진탕 배양했다(전 배양). 전 배양액을 막분리형 연속 발효 장치의 1.5L의 에탄올 발효 배지에 접종하고, 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 100rpm으로 교반하고, 반응조(1)를 통기했다. 온도 조정, pH 조정을 행하고, 발효액 순환 펌프(10)를 가동시키지 않고, 회분 발효 배양을 행했다. 이 때의 균체 증식량은 600㎚에서의 흡광도로 18이었다. 회분 발효 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure 112008067238378-pct00007
도 1 및 도 2에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 에탄올의 생산 속도가 대폭 향상되었다.
실시예 9 연속 발효에 의한 피루빈산의 제조(그 1)
도 1의 연속 발효 장치와 표 5에 나타내는 조성의 피루빈산 발효 배지를 사용하여 피루빈산의 제조를 행했다. 상기 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
발효 반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 30(℃)
발효 반응조 통기량: 1.5(L/min)
발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
pH 조정: 4N NaOH에 의해 pH5.5로 조정
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균.
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~180시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
180시간~264시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
미생물로서 토룰롭시스 글라브라타 P120-5a주(FERM P-16745)를 사용하고, 배지로서 표 5에 나타내는 조성의 피루빈산 발효 배지를 사용하고, 생산물인 피루빈산의 농도의 평가에는 하기에 나타내는 조건으로 HPLC법에 의해 측정했다.
칼럼: Shim-Pack SPR-H(시마즈사제)
이동상: 5mM p-톨루엔술폰산(유속 0.8mL/min)
반응액: 5mM p-톨루엔술폰산, 20mM 비스트리스, 0.1mM EDTA·2Na(유속 0.8mL/min)
검출 방법: 전기 전도도
온도: 45℃.
또한, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다.
Figure 112008067238378-pct00008
우선, P120-5a주를 시험관에서 5ml의 피루빈산 발효 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 피루빈산 발효 배지 100ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간, 30℃에서 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 1에 나타낸 막분리형 연속 발효 장치의 1.5L의 피루빈산 발효 배지에 접종하고, 발효 반응조(1)을 부속 교반기(5)에 의해 800rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도 조정, pH 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 발효액 순환 펌프를 가동시키고, 전 배양시의 운전 조건에 추가해서 막분리조(2)를 통기하고, 피루빈산 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 막분리형 연속 발효 장치의 발효액량을 2L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 피루빈산의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 피루빈산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 300시간의 발효 시험을 행한 결과를 표 6에 나타낸다.
도 1에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 피루빈산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 10 연속 발효에 의한 피루빈산의 제조(그 2)
도 2의 연속 발효 장치와 표 5에 나타내는 조성의 피루빈산 발효 배지를 사용하여 피루빈산의 제조를 행했다. 상기 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재로서는 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정:30(℃)
발효 반응조 통기량: 1(L/min)
유산 발효 배지 공급 속도: 50~300ml/hr.의 범위에서 가변 제어
발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
pH 조정: 4N NaOH에 의해 pH5.5로 조정
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어.
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~180시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
180시간~264시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어)
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균.
미생물로서 토룰롭시스 글라브라타 P120-5a주(FERM P-16745)를 사용하고, 배지로서 표 5에 나타내는 조성의 피루빈산 발효 배지를 사용하고, 생산물인 피루빈산의 농도의 평가에는 하기에 나타내는 조건으로 HPLC법에 의해 측정했다.
우선, P120-5a주를 시험관에서 5ml의 피루빈산 발효 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 피루빈산 발효 배지 100ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간, 30℃에서 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 2에 나타낸 막분리형 연속 발효 장치의 1.5L의 유산 발효 배지에 접종하고, 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 800rpm으로 교반하고, 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도 조정, pH 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 피루빈산 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 막분리형 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 피루빈산의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 피루빈산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 상기 피루빈산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 투입 글루코오스로부터 산출된 유산 대당수율, 유산 생산 속도를 표 6에 나타냈다.
300시간의 발효 시험을 행한 결과, 도 2에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 피루빈산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 11 연속 발효에 의한 피루빈산의 제조(그 3)
도 1의 연속 발효 장치를 사용하고, 미생물로서 NBRC0005주를 사용하고, 그 밖의 조건은 모두 실시예 9와 마찬가지로 행했다. 연속 발효를 행한 결과를 표 6에 나타냈다. 300시간의 발효 시험을 행한 결과, 도 1에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 피루빈산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 12 연속 발효에 의한 피루빈산의 제조(그 4)
도 2의 연속 발효 장치를 사용하고, 미생물로서 NBRC0005주를 사용하고, 그 밖의 조건은 모두 실시예 10과 마찬가지로 행했다. 연속 발효를 행한 결과를 표 6에 나타냈다. 300시간의 발효 시험을 행한 결과, 도 2에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 피루빈산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
비교예 5 회분 발효에 의한 피루빈산의 제조(그 1)
미생물을 사용한 발효 형태로서 가장 전형적인 회분 발효를 2L 용량의 자퍼멘터(jar fermenter)를 이용해서 행하고, 피루빈산 생산성을 평가했다. 배지에는 표 5에 나타내는 배지를 사용하고, 고압 증기 멸균 처리(121℃, 15분)해서 사용했다. 본 비교예에서는 미생물로서 P120-5a주를 사용하고, 생산물인 피루빈산의 농도의 평가에는 실시예 9에 나타낸 HPLC를 이용해서 평가하고, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다. 본 비교예의 운전 조건을 이하에 나타낸다.
발효 반응조 용량(피루빈산 발효 배지량): 1(L)
온도 조정: 30(℃)
발효 반응조 통기량: 1(L/min)
발효 반응조 교반 속도: 600(rpm)
pH 조정: 4N NaOH에 의해 pH5.5로 조정.
우선, P120-5a주를 시험관에서 5ml의 피루빈산 발효 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 신선한 피루빈산 발효 배지 50ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간 진탕 배양했다(전 배양). 전 배양액을 자퍼멘터의 1L의 피루빈산 발효 배지에 접종하여 회분 발효를 행했다. 회분 발효 결과를 표 6에 나타낸다.
비교예 6 회분 발효에 의한 피루빈산의 제조(그 2)
미생물을 사용한 발효 형태로서 가장 전형적인 회분 발효를 2L 용량의 발효조를 사용해서 행하고, 피루빈산 생산성을 평가했다. 본 비교예에서는 미생물로서 NBRC0005주를 사용하고, 그 밖의 조건은 모두 비교예 3과 마찬가지로 행했다. 회분 발효 결과를 표 6에 나타낸다.
Figure 112008067238378-pct00009
도 1 및 도 2에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 피루빈산의 생산 속도가 대폭 향상되었다.
실시예 13 연속 발효에 의한 숙신산의 연속 제조(그 1)
도 1에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 숙신산의 제조를 행했다.
숙신산의 제조에 있어서의 숙신산 및 글루코오스는 특별히 언급하지 않는 한, 이하의 방법에 의해 측정했다. 숙신산은 배양액의 원심 상청에 대해서 HPLC(시마즈 LC10A, RI 모니터: RID-10A, 칼럼: 아미넥스 HPX-87H)에 의해 분석했다. 칼럼 온도는 50℃, 0.01N H2SO4에 의해 칼럼을 평형화한 후, 샘플을 인젝션하고, 0.01N H2SO4에 의해 용출해서 분석을 행했다. 글루코오스는 글루코오스 센서(BF-4, 오지케이소쿠키키)를 이용해서 측정했다.
사용하는 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
반응조 용량: 2(L)
막분리조 용량: 0.5(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 60㎠
온도 조정: 39(℃)
반응조 CO2 통기량: 10(mL/min)
막분리조 CO2 통기량: 100(mL/min)
반응조 교반 속도: 100(rpm)
pH 조정: 2M Na2CO3에 의해 pH6.4로 조정
유산 발효 배지 공급 속도: 50~300ml/hr.의 범위에서 가변 제어
발효액 순환 장치에 의한 순환액량: 0.1(L/min)
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어.
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~200시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
200시간~264시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
본 실시예에서는 숙신산의 생산 능력이 있는 미생물로서 아나에로비오스피릴럼 석시니시프로듀센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens) ATCC53488주에 의한 숙신산의 연속 제조를 행했다. 20g/L 글루코오스, 10g/L 폴리펩톤, 5g/L 효모 엑스트랙트, 3g/L K2HPO4, 1g/L NaCl, 1g/L (NH4)2SO4, 0.2g/L MgCl2, 0.2g/L CaCl2·2H2O로 이루어지는 종배양용 배지 100mL를 125mL 용량의 삼각 플라스크에 넣고, 가열 멸균했다. 혐기 글러브 박스 내에서 30mM Na2C03 1mL와 180mM H2SO4 0.15mL를 첨가하고, 0.25g/L 시스테인·HCl, 0.25g/L Na2S로 이루어지는 환원 용액 0.5mL를 더 첨가한 후, ATCC53488주를 접종하고, 39℃에서 하룻밤 정치 배양했다(전전 배양). 도 1에 나타내는 연속 발효 장치의 1.5L의 숙신산 발효 배지(표 7)에 0.25g/L 시스테인·HCl, 0.25g/L Na2S·9H2O로 이루어지는 환원 용액 5mL를 첨가한 후, 전전 배양액 50mL를 접종하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 200rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 CO2 통기량의 조정, 온도 조정, pH 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양).
Figure 112008067238378-pct00010
전 배양 완료 후 즉시, 숙신산 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 막분리형 연속 발효 장치의 발효액량을 2L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 숙신산의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 발효 반응조 수두차를 최대 2m 이내, 즉, 막간 차압이 0.1~20kPa 이내가 되도록 적당히 수두차를 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 숙신산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 상기 숙신산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 숙신산 생산 속도 및 숙신산의 생성 수율을 표 8에 나타냈다. 모든 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 14 연속 발효에 의한 숙신산의 연속 제조(그 2)
도 2에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 숙신산의 제조를 행했다. 사용하는 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 숙신산 및 글루코오스 농도의 측정은 실시예 13과 동일한 방법에 의해 행했다. 분리막으로서 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 39(℃)
발효 반응조 CO2 통기량: 10(mL/min)
유산 발효 배지 공급 속도: 50~300ml/hr의 범위에서 가변 제어
발효 반응조 교반 속도: 600(rpm)
pH 조정: 2M Na2CO3에 의해 pH6.4로 조정
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어.
(연속 발효 개시 후~80시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
80시간~160시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
160시간~280시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어)
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균.
본 실시예에서는 숙신산의 생산 능력이 있는 미생물로서 아나에로비오스피릴럼 석시니시프로듀센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens) ATCC53488주에 의한 숙신산의 연속 제조를 행했다. 20g/L 글루코오스, 10g/L 폴리펩톤, 5g/L 효모 엑스트랙트, 3g/L K2HPO4, 1g/L NaCl, 1g/L (NH4)2SO4, 0.2g/L MgCl2, 0.2g/L CaCl2·2H2O로 이루어지는 종배양용 배지 100mL를 125mL 용량의 삼각 플라스크에 넣고, 가열 멸균했다. 혐기 글러브 박스 내에서 30Mm Na2C03 1mL와 180mMH2SO4 0.15mL를 첨가하고, 0.25g/L 시스테인·HCl, 0.25g/L Na2S로 이루어지는 환원 용액 0.5mL를 더 첨가한 후, ATCC53488주를 접종하고, 39℃에서 하룻밤 정치 배양했다(전전 배양). 도 2에 나타내는 연속 발효 장치의 1.5L의 숙신산 발효 배지(표 7)에 0.25g/L 시스테인·HCl, 0.25g/L Na2S·9H2O로 이루어지는 환원 용액 5mL를 첨가한 후, 전전 배양액 50mL를 접종하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 600rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 CO2 통기량의 조정, 온도 조정, pH 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양).
전 배양 완료 후 즉시, 숙신산 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 막분리형 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 숙신산의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 발효 반응조 수두를 최대 2m 이내, 즉, 막간 차압이 0.1~20kPa 이내가 되도록 적당히 수두차를 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 숙신산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 상기 숙신산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 숙신산 생산 속도 및 숙신산의 생성 수율을 표 8에 나타냈다. 모든 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
비교예 7 회분 배양에 의한 숙신산의 제조
아나에로비오스피릴럼 석시니시프로듀센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens)의 회분 발효에 의한 숙신산 제조는 이하와 같이 행했다.
20g/L 글루코오스, 10g/L 폴리펩톤, 5g/L 효모 엑스트랙트, 3g/L K2HPO4, 1g/L NaCl, 1g/L (NH4)2SO4, 0.2g/L MgCl2, 0.2g/L CaCl2·2H2O로 이루어지는 종배양용 배지 100mL를 125mL 용량 삼각 플라스크에 넣고, 가열 멸균했다. 혐기 글러브 박스 내에서 30MmNa2C03 1mL와 180mMH2SO4 0.15mL를 첨가하고, 0.25g/L 시스테인·HCl, 0.25g/L Na2S로 이루어지는 환원 용액 0.5mL를 더 참가한 후, 아나에로비오스피릴럼 석시니시프로듀센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens) ATCC53488을 접종하고, 39℃에서 하룻밤 정치 배양했다. 표 7에 나타내는 발효 배지 1L를 미니 자퍼멘터(ABLE사제, BMJ형, 2L)에 첨가해서 가열 멸균(120℃, 20min)했다.
CO2 가스를 스파저(sparger)로부터 10mL/min으로 통기하고, 3MNa2CO3 용액 10mL를 첨가한 후, 황산 용액에 의해 pH를 6.8로 조정했다. 0.25g/L 시스테인·HCl, 0.25g/L Na2S·9H2O로 이루어지는 환원 용액 5mL를 첨가한 후, 상기 종배양액 50mL를 접종하고, 교반 속도 200rpm, 온도는 39℃, 2MNa2CO3 용액에 의해 pH6.4로 조정하면서 배양을 행했다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.
Figure 112008067238378-pct00011
도 1 및 도 2에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 숙신산의 생산 속도가 대폭 향상되었다.
실시예 15 연속 발효에 의한 숙신산의 연속 제조(그 3)
도 1에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 숙신산의 제조를 행했다. 숙신산 및 글루코오스 농도의 측정은 실시예 13과 동일한 방법에 의해 행했다. 사용하는 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 하기 막투과수량 제어 이외에 실시예 13과 동일하다.
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어.
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~200시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
200시간~254시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
본 실시예에서는 숙신산의 생산 능력이 있는 미생물로서 액티노바실러스 석시노게네스(Actinobacillus succinogenes) ATCC55618주를 사용한 숙신산의 연속 제조를 행했다. 표 9에 나타내는 액티노바실러스용 숙신산 발효 배지 75mL와 MgCO3 4.0g을 100mL 용량 시람 시험관에 첨가하고, CO2에 의해 가스 치환한 후, 가열 멸균했다. 미리, ATCC55618주의 균체 현탁액 7.5mL를 접종하고, 37℃에서 24시간 배양해서 종배양을 조제했다(전전 배양).
Figure 112008067238378-pct00012
도 1에 나타내는 연속 발효 장치에 1.5L의 숙신산 발효 배지(표 9)를 주입하고, 전전 배양액 75mL를 접종했다. 발효 반응조(1)의 CO2 통기량을 75mL/min, 분리막조 CO2 통기량을 150mL/min으로 하고, 온도를 39℃, 5.5M NaCO3에 의해 pH를 6.8로 조정하면서 연속 배양을 행하는 이외에는 실시예 13의 배양과 마찬가지로 연속 배양을 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 숙신산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정하고, 상기 숙신산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 숙신산 생산 속도 및 숙신산의 생성 수율을 표 10에 나타냈다. 모든 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 16 연속 발효에 의한 숙신산의 연속 제조(그 4)
도 2에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 숙신산의 제조를 행했다. 사용하는 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 숙신산 및 글루코오스 농도의 측정은 실시예 13과 동일한 방법에 의해 행했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 하기 막투과수량 제어 이외에 실시예 14와 동일하다.
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어.
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~200시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
200시간~280시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
본 실시예에서는 숙신산의 생산 능력이 있는 미생물로서 액티노바실러스 석시노게네스(Actinobacillus succinogenes) ATCC55618주를 사용한 숙신산의 연속 제조를 행했다. 액티노바실러스 석시노게네스(Actinobacillus succinogenes)에 의한 숙신산의 연속 제조에서는 발효 반응조 CO2 통기량을 75mL/min으로 하고, pH 조정을 5.5M Na2CO3에 의해 pH6.8로 조정하는 이외에는 실시예 14의 연속 배양과 마찬가지로 행했다.
우선, 표 9에 나타내는 액티노바실러스용 숙신산 발효 배지 75mL와 MgCO3 4.0g을 100mL 용량 시람 시험관에 첨가하고, CO2에 의해 가스 치환한 후, 가열 멸균했다. 미리, 동결 보존하고 있던 ATCC55618주의 균체 현탁액 7.5mL를 접종하고, 37℃에서 24시간 배양해서 종배양을 조제했다(전전 배양). 도 2에 나타내는 연속 발효 장치에 1.5L의 숙신산 발효 배지(표 7)를 주입하고, 전전 배양액 75mL를 접종하고, pH를 6.8로 조정하면서 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양이 종료된 후, 표 9의 숙신산 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 도 2의 막분리형 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 발효에 의한 숙신산의 제조를 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 숙신산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 상기 숙신산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 숙신산 생산 속도 및 숙신산의 생성 수율을 표 10에 나타냈다. 모든 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
비교예 8 회분 배양에 의한 숙신산의 제조(그 2)
액티노바실러스 석시노게네스(Actinobacillus succinogenes)를 사용한 회분 발효에 의한 숙신산 제조는 다음과 같이 행했다.
표 9에 나타내는 액티노바실러스용 숙신산 발효 배지 50mL와 MgCO3 4.0g을 100mL 용량 시람 시험관에 첨가하고, CO2에 의해 가스 치환한 후, 가열 멸균했다. 미리, 동결 보존하고 있던 액티노바실러스 석시노게네스(Actinobacillus succinogenes) ATCC55618의 균체 현탁액 5mL를 접종하고, 37℃에서 24시간 배양해서 종배양을 조제했다. 표 9에 나타내는 발효 배지 1L를 pH6.8로 조정한 후, 미니자퍼멘터(ABLE사제, BMJ형, 2L)에 첨가해서 가열 멸균(120℃, 20min)했다. CO2 가스를 스파저로부터 50mL/min으로 통기하고, 온도를 39℃로 조정했다. 상기 종배양 50mL를 접종하고, 부속 교반 날개를 이용해서 600rpm으로 교반하면서 5.5M NaCO3에 의해 pH를 6.8로 조정하면서 배양했다. 그 결과를 표 10에 나타낸다.
Figure 112008067238378-pct00013
도 1 및 도 2에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 숙신산의 생산 속도가 대폭 향상되었다.
실시예 17 연속 발효에 의한 숙신산의 연속 제조(그 5)
도 1에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 숙신산의 제조를 행했다. 숙신산 및 글루코오스 농도의 측정은 실시예 13과 동일한 방법에 의해 행했다. 사용하는 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 하기 막투과수량 제어 이외에 실시예 13과 동일하다.
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어.
(연속 발효 개시 후~80시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
80시간~140시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
140시간~200시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
본 실시예에서는 숙신산의 생산 능력이 있는 미생물로서 대장균 B주(Escherichia coli B) ATCC11303주를 사용한 숙신산의 연속 제조를 행했다. 대장균에 의한 숙신산 제조에서는 12g/L 글루코오스, 10g/L 폴리펩톤, 5g/L 효모 엑스트랙트, 1g/L K2HPO4, 1g/L NaCl, 0.2g/L MgCl2로 이루어지는 종배양용 배지 150mL를 200mL 용량 삼각 플라스크에 넣고, pH를 6.8로 조정했다. MgCO3 7.5g을 첨가한 후, 가열 멸균하고, 실온까지 냉각시킨 후, 혐기 글러브 박스 내에서 ATCC11303주를 접종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양했다(전전 배양). 도 1에 나타내는 연속 발효 장치에 12g/L 글루코오스, 10g/L 폴리펩톤, 5g/L 효모 엑스트랙트, 1g/L K2HPO4, 1g/L NaCl, 0.2g/L MgCl2로 이루어지는 숙신산 발효 배지 1.5L를 주입하고, 전전 배양액 150mL를 접종했다. 배양 온도를 37℃로 한 이외에는 실시예 13과 동일한 조건으로 숙신산의 연속 발효를 행했다.
24시간 배양의 전 배양 후, 표 11에 나타내는 숙신산 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 2L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양을 행했다.
Figure 112008067238378-pct00014
적당히 막투과 발효액 중의 생산된 숙신산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 상기 숙신산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 숙신산 생산 속도 및 숙신산의 생성 수율을 표 12에 나타냈다. 모든 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 18 연속 발효에 의한 숙신산의 연속 제조(그 6)
도 2에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 숙신산의 제조를 행했다. 사용하는 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 숙신산 및 글루코오스 농도의 측정은 실시예 13과 동일한 방법에 의해 행했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 하기 막투과수량 제어 이외에 실시예 14와 동일하다.
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(연속 발효 개시 후~80시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
80시간~120시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
120시간~180시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
본 실시예에서는 숙신산의 생산 능력이 있는 미생물로서 대장균 B주(Escherichia coli B) ATCC11303주를 사용한 숙신산의 연속 제조를 행했다. 12g/L 글루코오스, 10g/L 폴리펩톤, 5g/L 효모 엑스트랙트, 1g/L K2HPO4, 1g/L NaCl, 0.2g/L MgCl2로 이루어지는 종배양용 배지 150mL를 200mL 용량 삼각 플라스크에 넣고, pH를 6.8로 조정했다. MgCO3 7.5g을 첨가한 후, 가열 멸균하고, 실온까지 냉각시킨 후, ATCC11303주를 접종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양했다(전전 배양). 도 2에 나타내는 연속 발효 장치에 12g/L 글루코오스, 10g/L 폴리펩톤, 5g/L 효모 엑스트랙트, 1g/L K2HPO4, 1g/L NaCl, 0.2g/L MgCl2로 이루어지는 숙신산 발효 배지1.5L를 주입하고, 전전 배양액 150mL를 접종했다. 온도를 37℃로 하고, 5.5M NaCO3 에 의해 pH를 6.8로 조정하면서 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양이 종료된 후, 표 11에 나타내는 숙신산 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양했다. 숙신산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 숙신산 생산 속도 및 숙신산의 생성 수율을 표 12에 나타냈다. 모든 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
비교예 9 회분 배양에 의한 숙신산의 제조(그 3)
대장균(Escherichia coli)을 사용한 회분 발효에 의한 숙신산 제조는 다음과 같이 행했다.
12g/L 글루코오스, 10g/L 폴리펩톤, 5g/L 효모 엑스트랙트, 1g/L K2HPO4, 1g/L NaCl, 0.2g/L MgCl2로 이루어지는 종배양용 배지 100mL를 1250mL 용량 삼각 플라스크에 넣고, pH를 6.8로 조정했다. MgCO3 5g를 첨가한 후, 가열 멸균하고, 실온까지 냉각시킨 후, 혐기 글러브 박스 내에서 대장균 B주(Escherichia coli B) ATCC11303주를 접종하고, 37℃에서 하룻밤 정치 배양했다. 12g/L 글루코오스, 10g/L 폴리펩톤, 5g/L 효모 엑스트랙트, 1g/L K2HPO4, 1g/L NaCl, 0.2g/L MgCl2로 이루어지는 발효 배지를 pH6.8로 조정한 후, 미니 자퍼멘터(ABLE사제, BMJ형, 2L)에 첨가해서 가열 멸균(120℃, 20min)했다. CO2 가스를 스파저로부터 50mL/min에서 통기하고, 온도를 37℃로 조정했다. 상기 종배양 100mL를 접종하고, 부속 교반 날개를 이용해서 600rpm으로 교반하고, 5.5M NaCO3에 의해 pH를 6.8로 조정하면서 배양했다. 배양액 중의 글루코오스 농도가 20g/L를 초과하지 않도록 100g/L 글루코오스 용액 200mL를 소량씩 추가하면서 배양을 행했다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.
Figure 112008067238378-pct00015
도 1 및 도 2에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 숙신산의 생산 속도가 대폭 향상되었다.
실시예 19 연속 발효에 의한 1,3-프로판디올의 제조(그 1)
도 1의 연속 발효 장치와 표 13에 나타내는 조성의 1,3-프로판디올 생산 배지를 사용하여 1,3-프로판디올의 제조를 행했다.
우선, 생산물인 1,3-프로판디올의 단리, 동정(同定) 및 측정법에 대해서 설명한다.
HPLC에 의해 글리세롤의 1,3-프로판디올로의 전환을 확인했다. 분석은 표준적 방법 및 크로마토그래피의 기술 분야에 있어서의 숙련자가 이용할 수 있는 재료를 이용해서 행해졌다. 하나의 적합한 방법은 UV(210㎚) 및 RI 검출을 사용하는 Waters Maxima 820 HPLC 시스템을 사용했다. Shodex SH-1011P 프리칼럼(6㎜x50㎜)이 구비되고, 50℃에서 온도 제어된 Shodex SH-1011 칼럼(8㎜x300㎜, Waters, Milford, MA로부터 구입) 상에 이동상으로서 0.01N H2SO4를 사용하고, 0.5mL/분의 유량으로 시료를 주입했다. 정량적 분석을 행하는 경우, 외부 표준으로서 기지량의 트리메틸초산을 이용해서 시료를 조제했다. 글루코오스(RI 검출), 글리세롤, 1,3-프로판디올(RI 검출) 및 트리메틸초산(UV 및 RI 검출)의 보관 유지 시간은 각각 약 15분, 20분, 26분 및 35분이었다.
GC/MS에 의해 1,3-프로판디올의 생산을 확인했다. 분석은 표준적 방법 및 GC/MS의 기술 분야에 있어서의 숙련자가 이용할 수 있는 재료를 이용해서 행해졌다. 예를 들면, Hewlett Packard 5971 Series 질량 선택적 검출기(EI) 및 HP-INNOWax칼럼(길이 30m, 내경 0.25㎜, 필름 두께 0.25미크론)에 연결된 Hewlett Packard 5890 Series II 가스크로마토그래피를 사용했다. 생성된 1,3-프로판디올의 보관 유지 시간 및 질량 스펙트럼을 기준의 1,3-프로판디올(m/e: 57, 58)의 그것과 비교했다.
또한, 시료의 유도체화를 행했다. 1.0mL의 시료(예를 들면, 배양 상청액)에 30μL의 농(70%v/v)과염소산을 첨가했다. 혼합 후, 시료를 동결 건조시켰다. 비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드:피리딘의 1:1 혼합물(300μL)을 동결 건조된 재료에 첨가해서 격렬하게 혼합하고, 65℃에서 1시간 두었다. 원심에 의해 불용성 재료를 제거하여 시료를 투명하게 했다. 얻어지는 액체는 2개의 상으로 갈라지고, 또한, 상을 분석에 사용했다. 시료를 DB-5 칼럼(48m, 내경 0.25㎜, 필름 두께 0.25㎛; J&W Scientific으로부터) 상에서 크로마토그래피에 가하고, 배양 상청액으로부터 얻은 1,3-프로판디올 유도체의 보관 유지 시간 및 질량 스펙트럼을 기준의 표준 시료로부터 얻은 그것과 비교했다. TMS-유도체화 1,3-프로판디올의 질량 스펙트럼은 205, 177, 130 및 115AMU의 특징적 이온을 함유한다.
상기 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재로서는 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
발효 반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 37(℃)
발효 반응조 통기량: 0.6(L/min) 질소 가스
발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
pH 조정: 5N NaOH에 의해 pH7.0으로 조정
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~200시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
200시간~320시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
미생물로서 클렙시엘라 뉴모니아에 ATCC25955주를 사용하고, 배지로서 표 13에 나타내는 조성의 1,3-프로판디올 생산 배지를 사용하고, 생산물인 1,3-프로판디올의 농도의 평가는 상기의 HPLC법에 의해 측정했다.
또한, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다.
Figure 112008067238378-pct00016
우선, 클렙시엘라 뉴모니아에 ATCC25955주를 시험관에서 5ml의 1,3-프로판디올 생산 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 1,3-프로판디올 생산 배지 50ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간, 30℃에서 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 1에 나타낸 막분리형 연속 발효 장치의 1.5L의 1,3-프로판디올 생산 배지에 접종하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 800rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도 조정, pH 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 발효액 순환 펌프를 가동시키고, 전 배양시의 운전 조건에 추가해서 막분리조(2)를 통기하고, 1,3-프로판디올 생산 배지(글리세롤 농도는 100g/L)의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 1,3-프로판디올의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 1,3-프로판디올 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 상기 1,3-프로판디올 및 투입 글리세롤로부터 산출된 1,3-프로판디올 생산 속도를 표 14에 나타냈다.
320시간의 발효 시험을 행한 결과, 도 1에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 1,3-프로판디올의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 20 연속 발효에 의한 1,3-프로판디올의 제조(그 2)
도 2의 연속 발효 장치와 표 13에 나타내는 조성의 1,3-프로판디올 생산 배지를 사용하여 1,3-프로판디올의 제조를 행했다.
배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재로서는 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
발효 반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 37(℃)
발효 반응조 통기량: 0.6(L/min) 질소 가스
발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
pH 조정: 5N NaOH에 의해 pH7.0으로 조정
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어.
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~200시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
200시간~264시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
미생물로서 클렙시엘라 뉴모니아에 ATCC25955주를 사용하고, 배지로서 표 9에 나타내는 조성의 1,3-프로판디올 생산 배지를 사용하고, 생산물인 1,3-프로판디올의 농도의 평가는 HPLC법에 의해 측정했다. 또한, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다.
우선, 클렙시엘라 뉴모니아에 ATCC25955주를 시험관에서 5ml의 1,3-프로판디올 생산 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 1,3-프로판디올 생산 배지 50ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간, 30℃에서 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 2에 나타낸 막분리형 연속 발효 장치의 1.5L의 1,3-프로판디올 생산 배지에 접종하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 800rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도 조정, pH 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 1,3-프로판디올 생산 배지(글리세롤 농도는 100g/L)의 연속 공급을 행하고, 막일체형 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 1,3-프로판디올의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 1,3-프로판디올 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 상기 1,3-프로판디올 및 투입 글리세롤로부터 산출된 1,3-프로판디올 생산 속도를 표 14에 나타냈다. 264시간의 발효 시험을 행한 결과, 도 2에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 1,3-프로판디올의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
비교예 10 페드 배치 발효에 의한 1,3-프로판디올의 제조
미생물을 사용한 발효 형태로서 가장 전형적인 페드 배치 발효를 2L 용량의 자퍼멘터를 이용해서 행하고, 1,3-프로판디올 생산성을 평가했다. 상기 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 본 비교예에서는 미생물로서 클렙시엘라 뉴모니아에 ATCC25955주를 사용하고, 생산물인 1,3-프로판디올의 농도의 평가는 HPLC를 이용해서 평가하고, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다. 비교예 10의 운전 조건을 이하에 나타낸다.
발효 반응조 용량(1,3-프로판디올 생산 배지량): 1.0(L)
온도 조정: 37(℃)
발효 반응조 통기량: 0.4(L/min) 질소 가스
발효 반응조 교반 속도: 300(rpm)
pH 조정: 5N NaOH에 의해 pH7.0으로 조정.
우선, 클렙시엘라 뉴모니아에 ATCC25955주를 시험관에서 5ml의 1,3-프로판디올 생산 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 신선한 1,3-프로판디올 생산 배지 50ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간진탕 배양했다(전 배양). 전 배양액을 자퍼멘터의 1.5L의 1,3-프로판디올 생산 배지에 접종했다. 1,3-프로판디올 생산 배지(글리세롤 농도는 500g/L)를 사용하고, 글리세롤 농도를 0g/L~10g/L가 되도록 연속적으로 공급하여 페드 배치 발효를 행했다. 그 결과를 표 14에 나타낸다.
Figure 112008067238378-pct00017
도 1 및 도 2에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 1,3-프로판디올의 생산 속도가 대폭 향상되었다.
실시예 21 연속 발효에 의한 이타콘산의 제조(그 1)
도 1에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 이타콘산의 제조를 행했다. 배지에는 표 15에 나타내는 배지를 사용하고, 고압 증기 멸균 처리(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재로서 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
발효 반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 35(℃)
발효 반응조 통기량: 1.5(L/min)
발효 반응조 교반 속도: 200(rpm)
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균.
pH 조정: 4N NaOH에 의해 pH5로 조정
막투과수량 제어: 막분리조 수두차에 의해 유량을 제어
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~200시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
200시간~300시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
미생물로서 아스페르길루스 테레우스(A.terreus) ATCC10020주를 사용하고, 배지로서 표 11에 나타내는 조성의 이타콘산 발효 배지를 사용하고, 생산물인 이타콘산의 농도는 콥페샤르(Koppeshaar)의 방법{쿄리츠 출판, 미생물 광학 강좌 제 5권 「곰팡이의 이용 공업」 p72-73, 소화 31년(1956년) 발행}의 방법에 의해 측정했다. 또한, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다.
Figure 112008067238378-pct00018
우선, 아스페르길루스 테레우스 ATCC10020주를 시험관에서 표 15에 나타내는 5ml 전배양 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 전 배양 배지 100ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 48시간, 35℃의 온도에서 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 1에 나타내는 막분리형 연속 발효 장치의 1.5L의 연속·회분 발효 배지에 접종하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 200rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 통기량의 조정과 온도 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 발효액 순환 펌프를 가동시키고, 전 배양시의 운전 조건에 추가해서 막분리조(2)를 통기하고, 이타콘산 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 막분리형 연속 발효 장치의 발효액량을 2L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 이타콘산의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 이타콘산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 이타콘산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 투입 글루코오스로부터 산출된 이타콘산 생산 속도를 표 16에 나타냈다.
도 1에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 이타콘산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 22 연속 발효에 의한 이타콘산의 제조(그 2)
도 2에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 이타콘산의 제조를 행했다. 배지에는 표 15에 나타내는 배지를 사용하고, 고압 증기 멸균 처리(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재로서 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
발효 반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: PVDF 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 35(℃)
발효 반응조 통기량: 1.5(L/min)
발효 반응조 교반 속도: 200(rpm)
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균.
pH 조정: 4N NaOH에 의해 pH5로 조정
막투과수량 제어: 막분리조 수두차에 의해 유량을 제어
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~200시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
200시간~300시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
미생물로서 아스페르길루스 테레우스(A.terreus) ATCC10020주를 사용하고, 배지로서 표 11에 나타내는 조성의 이타콘산 발효 배지를 사용하고, 생산물인 이타콘산의 농도는 실시예 17에 나타내는 방법에 의해 측정했다. 또한, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다.
우선, 아스페르길루스 테레우스 ATCC10020주를 시험관에서 표 15에 나타내는 5ml 전 배양 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 전 배양 배지 100ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 48시간, 35℃의 온도에서 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 2에 나타내는 연속 발효 장치의 1.5L의 연속·회분 발효 배지에 접종하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 200rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 통기량의 조정과 온도 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 연속·회분 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 이타콘산의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 이타콘산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 이타콘산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 투입 글루코오스로부터 산출된 이타콘산 생산 속도를 표 16에 나타냈다.
도 2에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 이타콘산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
비교예 11 회분 발효에 의한 이타콘산의 제조
미생물을 사용한 발효 형태로서 가장 전형적인 회분 발효를 2L 용량의 자퍼멘터를 이용해서 행하고, 이타콘산 생산성을 평가했다. 배지에는 표 15에 나타내는 배지를 사용하고, 고압 증기 멸균 처리(121℃, 15분)해서 사용했다. 이 비교예 11에서는 미생물로서 아스페르길루스 테레우스 ATCC10020주를 사용하고, 생산물인 이타콘산의 농도의 평가는 실시예 17에 나타낸 방법을 이용해서 평가하고, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다. 비교예 11의 운전 조건을 이하에 나타낸다.
발효 반응조 용량(이타콘산 발효 배지량): 1.5(L)
온도 조정: 35(℃)
발효 반응조 통기량: 1.5(L/min)
발효 반응조 교반 속도: 200(rpm)
pH 조정: 4N NaOH에 의해 pH5로 조정.
우선, ATCC10020주를 시험관에서 표 1에 나타내는 5ml 전 배양 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 신선한 전 배양 배지 50ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 48시간 진탕 배양했다(전 배양). 전 배양액을 자퍼멘터의 1.5L의 표 15에 나타내는 연속·회분 발효 배지에 접종하여 회분 발효를 행했다. 회분 발효 결과를 표 16에 나타낸다.
Figure 112008067238378-pct00019
도 1 및 도 2에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 이타콘산의 생산 속도가 대폭 향상되었다.
실시예 23 연속 발효에 의한 카다베린의 제조(그 1)
도 1에 나타내는 연속 발효 장치와 표 17에 나타내는 조성의 카다베린 발효 배지를 사용하여 카다베린의 제조를 행했다.
우선, 생산물인 카다베린의 평가법에 대해서 설명한다. 카다베린은 이하에 나타내는 HPLC법에 의해 평가했다.
사용 칼럼: CAPCELL PAK C18(시세이도)
이동상: 0.1%(w/w) 인산 수용액: 아세토니트릴=4.5:5.5
검출: UV 360㎚
샘플 전 처리: 분석 샘플 25μl에 내표로서 1,4-디아미노부탄(0.03M)을 25μl, 탄산수소나트륨(0.075M)을 150μl 및 2,4-디니트로플루오로벤젠(0.2M)의 에탄올 용액을 첨가 혼합하고, 37℃의 온도에서 1시간 보온한다. 상기 반응 용액 50μl를 1ml 아세토니트릴에 용해한 후, 10,000rpm으로 5분간 원심한 후의 상청 10μl를 HPLC분석했다.
상기 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재로서 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
발효 반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 30(℃)
발효 반응조 통기량: 1.5(L/min) 공기
발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
pH 조정: 3M HCl 및 3M 암모니아수에 의해 pH7.0으로 조정
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어.
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~200시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
200시간~320시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
카다베린을 생산시키는 미생물로서 일본 특허공개 2004-222569호 공보에 기재된 코리네박테리움 글루타미컴 TR-CAD1주를 사용하고, 배지로서 표 17에 나타내는 조성의 카다베린 생산 배지를 사용했다. 생산물인 카다베린의 농도의 평가는 HPLC법에 의해 측정했다. 또한, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠사제)를 사용했다.
Figure 112008067238378-pct00020
우선, 코리네박테리움 글루타미컴 TR-CAD1주를 시험관에서 5ml의 카나마이신(25㎍/ml)을 첨가한 카다베린 발효 배지 첨가에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 카나마이신(25㎍/ml)을 첨가한 카다베린 생산 배지 50ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간, 30℃의 온도에서 진폭 30㎝로 180rpm의 조건하에서 배양을 행했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 1에 나타내는 연속 발효 장치의 2.0L의 카다베린 발효 배지에 접종하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 800rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도 조정, pH 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양).
전 배양 완료 후 즉시, 발효액 순환 펌프(10)를 가동시키고, 전 배양시의 운전 조건에 추가해서 막분리조(2)를 통기하고, 카다베린 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 2L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 카다베린의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 유산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다.
160시간의 연속 발효 시험을 행한 결과를 표 18에 나타낸다. 도 1에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 카다베린의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 24 연속 발효에 의한 카다베린의 제조(그 2)
도 2에 나타내는 연속 발효 장치와 표 17에 나타내는 조성의 카다베린 발효 배지를 사용하여 카다베린의 제조를 행했다. 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재로서 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
발효 반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 30(℃)
발효 반응조 통기량: 1.5(L/min) 공기
공기 발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
pH 조정: 3M HCl 및 3M 암모니아수에 의해 pH7.0으로 조정
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어.
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~200시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
200시간~264시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
미생물로서 코리네박테리움 글루타미컴 TR-CAD1주를 사용하고, 배지로서 표 17에 나타내는 조성의 카다베린 발효 배지를 사용하고, 생산물인 카다베린의 농도의 평가는 HPLC법에 의해 측정했다. 또한, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠사제)를 사용했다.
우선, 코리네박테리움 글루타미컴 TR-CAD1주를 시험관에서 5ml의 카나마이신(25㎍/ml)을 첨가한 카다베린 생산 배지 첨가에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 카나마이신(25㎍/ml)을 첨가한 카다베린 생산 배지 50ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간, 30℃의 온도에서 진폭 30㎝로 180rpm의 조건하에서 배양을 행했다(전전 배양).
전전 배양액을 도 2에 나타내는 연속 발효 장치의 1.5L의 카다베린 생산 배지에 접종하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 800rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도 조정 및 pH 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 카다베린 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 카다베린의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 발효 반응조 수두를 최대 2m 이내, 즉, 막간 차압이 20kPa 이내가 되도록 적당히 수두차를 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 카다베린 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 상기 카다베린 및 투입 글루코오스로부터 산출된 카다베린 생산 속도를 표 18에 나타냈다.
320시간의 연속 발효 시험을 행한 결과를 표 18에 나타낸다. 도 2에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 카다베린의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
비교예 12 회분 발효에 의한 카다베린의 제조
미생물을 사용한 발효 형태로서 가장 전형적인 회분 발효를 2L 용량의 자퍼멘터를 이용해서 행하고, 카다베린 생산성을 평가했다. 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 본 비교예에서는 미생물로서 코리네박테리움 글루타미컴 TR-CAD1주를 사용하고, 생산물인 카다베린의 농도의 평가는 HPLC를 이용해서 평가하고, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠사제)를 사용했다. 비교예 8의 운전 조건은 하기와 같다.
발효 반응조 용량(카다베린 생산 배지량): 1.0(L)
온도 조정: 30(℃)
발효 반응조 통기량: 1.5(L/min) 공기
발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
pH 조정: 3M HCl 및 3M 암모니아수에 의해 pH7.0으로 조정.
우선, 코리네박테리움 글루타미컴 TR-CAD1주를 시험관에서 5ml의 카나마이신(25㎍/ml)을 첨가한 카다베린 생산 배지 첨가에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 카나마이신(25㎍/ml)을 첨가한 카다베린 생산 배지 50ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간, 30℃의 온도에서 진폭 30㎝로 180rpm의 조건하에서 배양을 행했다(전 배양).
전 배양액을 자퍼멘터의 1.0L의 카다베린 생산 배지(글루코오스 농도는 100g/L)에 접종했다. 카다베린 생산 배지를 사용하여 회분 발효를 행했다. 그 결과를 표 18에 나타낸다.
Figure 112008067238378-pct00021
도 1 및 도 2에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 카다베린의 생산 속도가 대폭 향상되는 것을 밝힐 수 있었다.
실시예 25 연속 발효에 의한 핵산의 제조(그 1)
도 1에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 핵산의 제조를 행했다. 배지에는 표 19에 나타내는 배지를 사용하고, 고압 증기 멸균 처리(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재로서 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
발효 반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 30(℃)
발효 반응조 통기량: 1000(mL/min)
발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균.
pH 조정: 25% 암모니아 수용액에 의해 pH6.8로 조정
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(연속 발효 개시 후~150시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
150시간~300시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
300시간~400시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
원핵 미생물로서 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC21479주를 사용하고, 배지로서 표 19에 나타내는 조성의 핵산 발효 배지를 사용했다. 발효액에 함유되는 구아노신 및 이노신은 하기에 나타내는 조건으로 HPLC법에 의해 각각의 핵산량을 측정함으로써 확인했다.
[분석 조건]
칼럼: Asahipak GS-220(7.6㎜ID×500mmL), 완충액: 0.2M NaH2PO4(pH3.98)인산에 의해 pH 조정, 온도: 55℃, 유속: 1.5ml/min, 검출: UV 254㎚, 보관 유지 시간(min): 이노신 16.1, 구아노신 20.5.
또한, 글루코오스 농도의 측정에는 “글루코오스 테스트 와코C”(등록 상표)(와코쥰야쿠사제)를 사용했다.
Figure 112008067238378-pct00022
우선, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC2147주를 사카구치 플라스크 안에서 표 15에 나타내는 전 배양 배지 150ml를 이용해서 24시간, 30℃의 온도에서 진탕 배양했다(전전 배양). 얻어진 전전 배양액을 도 1에 나타내는 연속 발효 장치의 1L 전 배양 배지에 접종하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 800rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 통기량의 조정과 30℃의 온도로 온도 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 발효액 순환 펌프를 가동시키고, 전 배양시의 운전 조건에 추가해서 막분리조(2)를 통기하고, 연속 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 전 배양 완료 후 즉시, 연속 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 발효액 순환 펌프(11)에 의해 발효 반응조(1)와 막분리조(12) 사이를 순환시켜 막분리형 연속 발효 장치의 발효액량을 2L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양함으로써 연속 발효에 의한 핵산의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 핵산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 핵산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 투입 글루코오스로부터 산출된 핵산 생산 속도를 표 20에 나타냈다.
400시간의 발효 시험을 행한 결과, 도 1에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 핵산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 26 연속 발효에 의한 핵산의 제조(그 2)
도 2에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 핵산의 제조를 행했다. 배지에는 표 19에 나타내는 배지를 사용하고, 고압 증기 멸균 처리(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재로서 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
발효 반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 30(℃)
발효 반응조 통기량: 1000(mL/min)
발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균.
pH 조정: 25% 암모니아 수용액에 의해 pH6.8로 조정
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(연속 발효 개시 후~150시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
150시간~300시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
300시간~400시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
원핵 미생물로서 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC21479주를 사용하고, 배지로서 표 19에 나타내는 조성의 핵산 발효 배지를 사용했다. 발효액에 함유되는 구아노신 및 이노신, 글루코오스는 실시예 1과 동일한 방법에 의해 각각의 핵산량을 측정함으로써 확인했다.
우선, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC21479주를 사카구치 플라스크 안에서 표 19에 나타내는 전 배양 배지 150ml를 이용해서 24시간, 30℃의 온도에서 진탕 배양했다(전전 배양). 얻어진 전전 배양액을 도 2에 나타내는 연속 발효 장치의 1L 전 배양 배지에 접종하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 800rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 통기량의 조정과 30℃의 온도로 온도 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 연속 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 핵산의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 핵산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 핵산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 투입 글루코오스로부터 산출된 핵산 생산 속도를 표 20에 나타냈다.
400시간의 발효 시험을 행한 결과, 도 2의 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 핵산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
비교예 13 회분 발효에 의한 핵산의 제조
미생물을 사용한 발효 형태로서 가장 전형적인 회분 발효를 2L 용량의 자퍼멘터를 이용해서 행하고, 그 핵산 생산성을 평가했다. 배지에는 표 19에 나타내는 연속 발효 배지를 사용하고, 고압 증기 멸균 처리(121℃, 15분)해서 사용했다. 본 비교예에서는 원핵 미생물로서 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC21479주를 사용하고, 생산물인 핵산의 농도의 평가는 실시예 21에 나타낸 방법을 이용해서 평가하고, 글루코오스 농도의 측정에는 “글루코오스 테스트 와코C”(등록 상표)(와코쥰야쿠사제)를 사용했다. 본 비교예의 운전 조건을 이하에 나타낸다.
발효 반응조 용량: 2(L)
온도 조정: 30(℃)
발효 반응조 통기량: 1000(mL/min)
발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
pH 조정: 25% 암모니아 수용액에 의해 pH6.8로 조정.
우선, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC21479주를 사카구치 플라스크 안에서 표 19에 나타내는 전 배양 배지 150ml를 이용해서 24시간, 30℃의 온도에서 진탕 배양했다(전 배양). 얻어진 전 배양액을 자퍼멘터의 1L의 표 19에 나타내는 연속 발효 배지에 접종하여 회분 발효를 행했다. 발효 개시 후, 5%의 글루코오스를 첨가해서 발효를 계속했다. 120시간의 회분 발효 결과를 표 20에 나타낸다.
Figure 112008067238378-pct00023
도 1 및 도 2에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 핵산의 생산 속도가 대폭 향상되는 것을 밝힐 수 있었다.
실시예 27 연속 발효에 의한 L-트레오닌의 제조(그 1)
도 1의 연속 발효 장치와 표 21에 나타내는 조성의 발효 배지를 사용하여 L-트레오닌의 제조를 행했다.
우선, 생산물인 L-트레오닌의 평가 방법에 대해서 설명한다. 배양액 중에 함유되는 L-트레오닌량의 측정은 다음 방법에 의해 행했다. 측정하는 L-트레오닌을 함유하는 배양액을 25μL 취하고, 그것에 150μ1의 NaHCO3(75mM) 및 내표로서 25μl의 L-메티오닌(2g/L)을 첨가한다. 상기 용액에 900μl의 에탄올 및 150μl의 DNFB(0.2M)를 더 첨가하여 혼합한다. 상기 용액을 37℃에서 1시간 정치한 후, 하기 조건으로 HPLC 분석을했다.
칼럼: CAPCELLPAK C18 TYPE SG120(시세이도)
이동상: 0.1%(w/v) H3PO4: 아세토니트릴=7:3(유속 1.2mL/min)
검출 방법: UV(360㎚)
온도: 23℃.
검량선은 농도 기지의 L-트레오닌을 표품으로 해서 분석을 행하고, 가로축에 L-트레오닌 농도, 세로축에 L-트레오닌 면적/L-메티오닌(내표) 면적의 면적비를 플롯해서 제작했다. 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다.
본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
반응조 용량: 2(L)
막분리조 용량: 0.5(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 60㎠
온도 조정: 37(℃)
반응조 통기량: 1.5(L/min)
막분리조 통기량: 1(L/min)
반응조 교반 속도: 800(rpm)
pH 조정: 28% 암모니아 수용액에 의해 pH7로 조정
L-트레오닌 발효 배지 공급 속도: 50~300ml/hr.의 범위에서 가변 제어
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~200시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어).
L-트레오닌 생산 미생물로서 프로비덴시아 레트게리 중 프로비덴시아 레트게리 SGR588-77주(FERM P-10528)를 사용하고, 배지로서 표 21에 나타내는 조성의 발효 배지를 사용하고, 생산물인 L-트레오닌의 농도의 평가에는 상술한 HPLC를 사용하고, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다.
Figure 112008067238378-pct00024
우선, 100ml의 글루코오스 부용(bouillon) 배지{1% 글루코오스, 3% 부용(닛스이사제)}를 투입한 500ml 용량의 삼각 플라스크에 한천 배지로부터 스크래핑한 프로비덴시아 레트게리 SGR588-77주를 접종했다. 이것을 37℃, 140rpm으로 교반하면서 배양을 행했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 1에 나타내는 연속 발효 장치의 1.5L 전 배양 배지(표 21)에 접종하고, 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 800rpm으로 교반하고, 반응조(1)의 통기량의 조정과 37℃의 온도로 온도 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 발효액 순환 펌프를 가동시키고, 전 배양시의 운전 조건에 추가해서 막분리조(2)를 통기하고, 표 17에 나타내는 조성의 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 2L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 L-트레오닌의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 L-트레오닌 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 발효 반응조 수두를 최대 2m 이내, 즉, 막간 차압이 20kPa 이내가 되도록 적당히 수두차를 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 L-트레오닌 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 200시간의 연속 발효 시험을 행한 결과를 표 22에 나타낸다.
도 1에 나타내는 연속 배양 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 L-트레오닌의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 28 연속 발효에 의한 L-트레오닌의 제조(그 2)
도 2의 막분리형 연속 발효 장치와 표 21에 나타내는 조성의 발효 배지를 사용하여 L-트레오닌의 제조를 행했다. 상기 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재로서는 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: PVDF 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 37(℃)
반응조 통기량: 1.5(L/min)
반응조 교반 속도: 800(rpm)
pH 조정: 28% 암모니아 수용액에 의해 pH7로 조정
L-트레오닌 발효 배지 공급 속도: 50~300ml/hr.의 범위에서 가변 제어
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100시간~200시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어)
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20분의 오토클레이브에 의한 고압 증기 멸균.
L-트레오닌 생산 미생물로서 프로비덴시아 레트게리 중 프로비덴시아 레트게리 SGR588-77주(FERM P-10528)를 사용하고, 배지로서 표 21에 나타내는 조성의 발효 배지를 사용하고, 생산물인 L-트레오닌의 농도의 평가에는 실시예 23에 나타낸 HPLC를 사용하고, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다.
우선, 100ml의 글루코오스 부용 배지{1% 글루코오스, 3% 부용(닛스이사제)}를 투입한 500ml 용량의 삼각 플라스크에 한천 배지로부터 스크래핑한 프로비덴시아 레트게리 SGR588-77주를 접종했다. 이것을 37℃, 140rpm으로 교반하면서 배양을 행했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 1에 나타내는 연속 발효 장치의 1.5L 전 배양 배지(표 21)에 접종하고, 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 800rpm으로 교반하고, 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도 조정, pH 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 표 21에 나타내는 조성의 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 L-트레오닌의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 L-트레오닌 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 상기 L-트레오닌 및 글루코오스 농도로부터 산출된 투입 글루코오스당 대당수율, 유산 생산 속도를 표 18에 나타냈다.
200시간의 연속 발효 시험을 행한 결과, 도 2에 나타내는 연속 배양 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 L-트레오닌의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
비교예 14 회분 발효에 의한 L-트레오닌의 제조
미생물을 사용한 발효 형태로서 가장 전형적인 회분 발효를 2L 용량의 자퍼멘터를 이용해서 행하고, 그 L-트레오닌 생산성을 평가했다. 회분 배양 개시시의 배지에는 표 21에 나타내는 전 배양 배지를 사용했다. 이들 배지는 고압 증기 멸균 처리(121℃, 15분)해서 사용했다. 본 비교예에서는 미생물로서 프로비덴시아 레트게리 SGR588-77주를 사용하고, 발효액에 함유되는 L-트레오닌 및 글루코오스의 농도는 실시예 27에 나타낸 방법에 의해 행했다. 본 비교예의 운전 조건을 이하에 나타낸다.
발효 반응조 용량(L-트레오닌 발효 배지량): 1(L)
온도 조정: 37(℃)
발효 반응조 통기량: 1(L/min)
발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
pH 조정: 28% 암모니아 수용액에 의해 pH7로 조정.
우선, 90ml의 글루코오스 부용 배지{1%글루코오스, 3% 부용(닛스이사제)}를 투입한 500ml 용량의 삼각 플라스크에 한천 배지로부터 스크래핑한 프로비덴시아 레트게리 SGR588-77주를 접종했다. 이것을 37℃, 140rpm으로 교반하면서 배양을 행했다(전 배양). 전 배양액을 810ml의 표 17에 나타내는 전 배양 배지를 투입한 미니자퍼멘터에 접종하여 회분 발효를 행했다. 배양 도중에 추가한 배지의 조성을 표 9의 추가 배지에 나타냈다. 배지의 추가는 배양 개시 후 24, 32, 40, 48시간에 50mL씩 행했다. 회분 발효 결과를 표 22에 나타낸다.
Figure 112008067238378-pct00025
도 1 및 도 2에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-트레오닌의 생산 속도가 대폭 향상되는 것을 밝힐 수 있었다.
실시예 29 유산균을 사용한 연속 발효에 의한 L-유산의 제조(그 1)
도 1에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 L-유산의 제조를 행했다. 배지에는 표 23에 나타내는 L-유산균 유산 발효 배지를 사용하고, 고압 증기 멸균 처리(121℃, 15분)해서 사용했다. 상기 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
발효 반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 37(℃)
발효 반응조 통기량: 50(mL-질소/min)
발효 반응조 교반 속도: 600(rpm)
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균.
pH 조정: 8N 암모니아 수용액에 의해 pH6.5로 조정
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(연속 발효 개시 후~150시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
150시간~300시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
300시간~400시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
원핵 미생물로서 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) JCM7638주를 사용하고, 배지로서 표 23에 나타내는 조성의 유산균 유산 발효 배지를 사용했다. 발효액에 함유되는 L-유산은 참고예 1과 동일한 방법에 의해 평가했다. 또한, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다.
Figure 112008067238378-pct00026
우선, 락토코커스 락티스 JCM7638주를 시험관에서 표 23에 나타내는 5ml의 질소 가스에 의해 퍼지(purge)된 유산 발효 배지에 의해 24시간, 37℃의 온도에서 정치 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 질소 가스에 의해 퍼지된 신선한 유산 발효 배지 50ml에 접종하고, 48시간, 37℃의 온도에서 정치 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 1에 나타내는 연속 발효 장치의 질소 가스에 의해 퍼지된 1.5L의 유산 발효 배지에 접종하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 600rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 통기량의 조정과 37℃의 온도로 온도 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, 유산 발효 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 2L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 L-유산의 제조를 행했다. 이 때, 기체 공급 장치로부터 질소 가스를 발효 반응조 내에 공급하고, 배출된 가스를 회수해서 재차 발효 반응조에 공급했다. 즉, 질소 가스를 함유하는 기체의 리사이클 공급을 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 L-유산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 상기 L-유산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 투입 글루코오스로부터 산출된 L-유산 대당수율, L-유산 생산 속도를 표 24에 나타냈다.
400시간의 발효 시험을 행한 결과, 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 L-유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 30 유산균을 사용한 연속 발효에 의한 L-유산의 제조(그 2)
도 2에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 L-유산의 제조를 행했다. 배지에는 표 23에 나타내는 유산균 유산 발효 배지를 사용하고, 고압 증기 멸균 처리(121℃, 15분)해서 사용했다. 상기 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
발효 반응조 용량: 2(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 37(℃)
발효 반응조 통기량: 50(mL-질소/min)
발효 반응조 교반 속도: 600(rpm)
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균.
pH 조정: 8N 암모니아 수용액에 의해 pH6.5로 조정
투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(연속 발효 개시 후~150시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
150시간~300시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
300시간~400시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
원핵 미생물로서 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) JCM7638주를 사용하고, 전 배양까지는 실시예 29와 마찬가지로 행했다. 전 배양 완료 후 즉시, 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 L-유산의 제조를 행했다. 이 때, 기체 공급 장치로부터 질소 가스를 발효 반응조 내에 공급하고, 배출된 가스를 회수해서 재차 발효 반응조에 공급했다. 즉, 질소 가스를 함유하는 기체의 리사이클 공급을 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 L-유산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 상기 L-유산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 투입 글루코오스로부터 산출된 L-유산 대당수율, L-유산 생산 속도를 표 24에 나타냈다.
400시간의 발효 시험을 행한 결과, 도 2에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 L-유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
비교예 15 회분 발효에 의한 L-유산의 제조
미생물을 사용한 발효 형태로서 가장 전형적인 회분 발효를 2L 용량의 자퍼멘터를 이용해서 행하고, 그 L-유산 생산성을 평가했다. 배지에는 표 23에 나타내는 배지를 사용하고, 고압 증기 멸균 처리(121℃, 15분)해서 사용했다. 이 본 비교예에서는 원핵 미생물로서 락토코커스 락티스 JCM7638주를 사용하고, 생산물인 L-유산의 농도의 평가는 참고예 1에 나타낸 방법을 이용해서 평가하고, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠)를 사용했다. 본 비교예의 운전 조건을 이하에 나타낸다.
발효 반응조 용량: 1(L)
온도 조정: 37(℃)
발효 반응조 통기량: 50(mL-질소/min)
발효 반응조 교반 속도: 200(rpm)
pH 조정: 8N 암모니아 수용액에 의해 pH6.5로 조정.
우선, 락토코커스 락티스 JCM7638주를 시험관에서 표 23에 나타내는 5ml의 질소 가스에 의해 퍼지된 유산 발효 배지에서 24시간, 37℃에서 정치 배양했다(전전 배양). 얻어진 배양액을 질소 가스에 의해 퍼지된 신선한 유산 발효 배지 50ml에 접종하고, 48시간, 37℃의 온도에서 정치 배양했다(전 배양). 전 배양액을 자퍼멘터의 1L의 표 23에 나타내는 연속·회분 발효 배지에 접종하여 회분 발효를 행했다. 회분 발효 결과를 표 24에 나타낸다.
Figure 112008067238378-pct00027
도 1 및 도 2에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 L-유산의 생산 속도가 대폭 향상되는 것을 밝힐 수 있었다.
참고예 6 바실러스 라에보락티커스 JCM2513의 염색체 DNA의 조제
바실러스 라에보락티커스 JCM2513을 GYP 배지(일본 특허공개 2003-088392호 공보에 기재된 GYP 배지) 100ml에 접종하고, 온도 30℃의 온도에서 24시간 배양해서 배양물을 얻었다. 얻어진 배양물을 3000rpm으로 15분간, 원심 분리 처리해서 습윤균체 0.5g을 얻은 후, 상기 습윤균체로부터 사이토 미우라의 방법{Biochem. Biophys. Acta., 72, 619(1963)}에 의해 염색체 DNA를 얻었다. 이어서, 이 염색체 DNA 60㎍ 및 제한 효소 Sau3AI, 3유닛을 10mM 트리스-염산 완충액{50mM NaCl, 10mM MgSO4 및 1mM 디티오트레이톨 함유(pH7.4)}에 각각 혼합하고, 온도 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료액을 상법에 의해 페놀 추출 처리하고, 에탄올 침전 처리해서 Sau3AI에 의해 소화된 바실러스 라에보락티커스 JCM2513의 염색체 DNA 단편 50㎍을 얻었다.
참고예 7 플라스미드 벡터 DNA를 이용한 바실러스 라에보락티커스 JCM2513의 유전자 라이브러리의 제작
에쉐리시아 콜리(Escherichia coli)에 의해 자율 복제 가능한 플라스미드 벡터 DNA(pUC19) 20㎍ 및 제한 효소 BamHI200 유닛을 50mM 트리스-염산 완충액{100mMNaCl 및 10mM 황산마그네슘 함유(pH7.4)}에 혼합하고, 온도 37℃에서 2시간 반응시켜서 소화액을 얻고, 상기 소화액을 상법에 의해 페놀 추출하고, 또한, 에탄올 침전 처리를 행했다.
그 후, 플라스미드 벡터 유래의 DNA 프래그먼트가 재결합되는 것을 방지하기 위해서 박테리얼알칼리포스파타아제 처리에 의해 DNA 단편의 탈인산화를 행하고, 상법에 의해 페놀 추출 처리하고, 또한, 에탄올 침전 처리를 행했다.
이 BamHI에 의해 소화된 pUC19을 1㎍, 참고예 6에서 얻어진 Sau3AI에 의해 소화된 바실러스 라에보락티커스 JCM2513의 염색체 DNA 단편 1㎍ 및 2유닛의 T4DNA 리가아제{타카라슈조(주)제}를 66mM 염화마그네슘, 10mM 디티오트레이톨 및 10mMATP를 함유하는 66mM 트리스-염산 완충액(pH7.5)에 첨가하고, 온도 16℃에서 16시간 반응시켜 DNA를 연결시켰다. 이어서, 얻어진 DNA 혼합물에 의해 상법에 의해 에쉐리시아 콜리 JM109를 형질 전환하고, 이것을 50㎍/ml의 암피실린나트륨을 함유하는 LB 한천 배지 상에 뿌려 약 20,000개의 콜로니를 얻고, 유전자 라이브러리로 했다. 약20,000개의 콜로니로부터 재조합 DNA의 회수를 행했다. 회수 방법은 상기에 나타낸 사이토, 미우라의 방법에 따랐다.
참고예 8 D-유산 데히드로게나아제 유전자의 스크리닝용 숙주의 제작
바실러스 라에보락티커스 JCM2513주의 D-LDH 유전자의 스크리닝을 기능 상보에 의해 행했다. 그 원리의 상세는 「{DOMINIQUE, G., Appl Environ Microbiol, United States(1995) 61 266-272}」에 기재되어 있다. 즉, 에쉐리시아 콜리의 D-유산 데히드로게나아제 효소 활성 및 피루빈산 포름산 리아제 효소 활성이 결실된 주를 제작할 필요가 있다. 키릴 등의 방법{Kirill, A., PNAS, United States(2000) 97 6640-6645}에 의해 에쉐리시아 콜리의 D-유산 데히드로게나아제 유전자(ldhA) 및 피루빈산 포름산 리아제 유전자(pflB 및 pflD)가 파괴 결실된 주를 제작했다. 이렇게 해서 제작한 주를 에쉐리시아 콜리 TM33주(E. coli ΔldhA ΔpflB::Kmr ΔpflD::Cmr)로 명명하고, D-유산 데히드로게나아제 유전자의 스크리닝용 숙주로 했다.
참고예 9 D-유산 데히드로게나아제 유전자의 스크리닝
에쉐리시아 콜리 TM33주를 50㎍/ml의 카나마이신황산염 및 15㎍/ml의 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지 100ml에 접종하고, 온도 37℃에서 24시간 배양하여 배양물을 얻었다. 이렇게 해서 얻어진 배양물을 3,000rpm으로 15분간 원심 분리 처리하여 습윤균체 0.8g을 얻었다. 얻어진 습윤균체를 10% 글리세롤 용액 10ml에 의해 3번 세정한 후, 10% 글리세롤 용액 0.1ml에 현탁하여 컴피텐트 셀(competent cell)로 했다. 이 컨피텐트 셀에 참고예 8에서 얻어진 바실러스 라에보락티커스 JCM2513주의 유전자 라이브러리를 1μl 첨가하고, 전기 천공법의 상법에 따라 도입한 주를 50㎍/ml의 암피실린나트륨을 함유하는 M9GP 한천 배지(M9배지+0.4% 글루코오스+0.2% 펩톤) 상에 뿌려 혐기 조건하에서 생육 가능했던 주를 수주 얻었다.
참고예 10 D-유산 데히드로게나아제 유전자를 함유하는 DNA의 염기 배열의 해석
상기에서 얻어진 재조합 DNA를 함유하는 에쉐리시아 콜리 TM33/pBL2로부터 상법에 따라 플라스미드를 조제하고, 얻어진 재조합 DNA를 이용하여 염기 배열의 결정을 행했다. 염기 배열의 결정은 Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(아프라이드바이오케미컬사제)를 사용해서 Sanger의 방법에 따라 행했다. 얻어진 D-유산 데히드로게나아제 유전자를 함유하는 DNA의 염기 배열은 2,995 염기쌍이었다. 이 배열에 대해서 Genetyx(소프트웨어개카이하츠 가부시키가이샤제)를 이용해서 오픈·리딩·프레임 검색을 행하여 1,011 염기쌍의 D-유산 데히드로게나아제 유전자의 DNA 배열(배열 번호 10)을 가결정했다.
참고예 11 D-유산 데히드로게나아제 유전자 발현 벡터의 제작
바실러스 라에보락티커스로부터 D-LDH 유전자를 클로닝했다. D-LDH 유전자는 모두 PCR법에 의해 클로닝을 행하고, 동일한 방법에 의해 발현 벡터에 도입하고 있다. 클로닝 방법을 이하에 나타낸다.
바실러스 라에보락티커스를 배양해서 원심 회수한 후, Ultra Clean Microbial DNA Isolation Kit(MO BIO사제)를 이용해서 게놈 DNA의 추출을 행했다. 상세한 조작 방법은 부속의 프로토콜에 따랐다. 얻어진 게놈 DNA를 계속되는 PCR의 주형으로 했다. 상기에서 얻어진 DNA를 주형으로 해서 각각 PCR에 의해 D-LDH 유전자의 클로닝을 행했다. PCR 증폭 반응에는 Taq의 50배의 정확성을 갖는다는 KOD-Plus-polymerase(토요보사제)를 사용했다. 반응 버퍼 및 dNTPmix 등은 부속의 것을 사용했다. D-LDH 유전자 증폭용 프라이머(배열 번호 11, 12)는 5말단측에는 XhoI 인식 배열, 3말단측에는 NotI 인식 배열이 각각 부가되도록 해서 제작했다.
각 PCR 증폭 단편을 정제하여 말단을 T4 Polynucleotide Kinase(TAKARA사제)에 의해 인산화 후, pUC118 벡터(제한 효소 HincII에 의해 절단하고, 절단면을 탈인산화 처리한 것)에 라이게이션했다. 라이게이션은 DNA Ligation Kit Ver.2(TAKARA사제)를 사용해서 행했다. 에쉐리시아 콜리 DH5α로 형질 전환하고, 플라스미드 DNA를 회수함으로써 D-LDH 유전자가 서브클로닝된 플라스미드가 얻어졌다. 이 각 D-LDH 유전자가 삽입된 pUC118 벡터를 제한 효소 XhoI 및 NotI에 의해 절단하고, 얻어진 각 DNA 단편을 효모 발현용 벡터 pTRS11(도 5)의 XhoI/NotI 절단 부위에 도입했다. 이렇게 해서 제작한 D-LDH 유전자 발현 벡터를 pTM63으로 나타낸다.
참고예 12 D-LDH 유전자 발현 벡터의 효모로의 도입
참고예 11과 같이 해서 얻어진 pTM63을 효모 사카로마이세스 세레비시에 NBRC10505주로 형질 전환했다. 형질 전환은 YEASTMAKER Yeast Transformation System(CLONTECH사제)을 사용한 초산 리튬법에 의해 행했다. 상세는 부속의 프로토콜에 따랐다. 숙주로 하는 사카로마이세스 세레비시에 NBRC10505주는 우라실 합성 능력이 결손된 주이며, pTM63이 갖는 URA3 유전자의 작용에 의해 우라실 비첨가 배지 상에서 pTM63이 도입된 형질 전환체의 선택이 가능하다.
이렇게 해서 얻어진 형질 전환체로의 D-LDH 유전자 발현 벡터 도입의 확인은 우라실 비첨가의 액체 배양지에서 배양한 형질 전환주로부터 게놈 DNA 추출 키트 Gen 토루쿤(TAKARA사제)에 의해 플라스미드 DNA를 함유하는 게놈 DNA를 추출하고, 이것을 주형으로 해서 PreMix Taq(TAKARA사제)를 사용한 PCR에 의해 행했다. 프라이머에는 D-LDH 유전자를 클로닝했을 때에 사용한 프라이머를 사용했다. 그 결과, 모든 형질 전환체에 있어서 D-LDH 유전자가 도입되어 있는 것이 확인되었다.
pTM63이 도입된 사카로마이세스 세레비시에 NBRC10505주를 이하, NBRC10505/pTM63주로 나타낸다.
실시예 31 연속 발효에 의한 D-유산의 제조(그 1)
도 1에 나타내는 연속 발효 장치와 표 25에 나타내는 조성의 D-유산 생산 배지를 사용하여 D-유산의 제조를 행했다. 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재에는 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
발효 반응조 용량: 2.0(L)
사용 분리막: PVDF 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 30(℃)
발효 반응조 통기량: 0.2(L/min) 공기
공기 발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
pH 조정: 5N NaOH에 의해 pH5.0으로 조정
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어
(연속 발효 개시 후~100시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
100~200 이상 시간: 2kPa 이하로 제어
200~320시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
미생물로서 NBRC10505/pTM63주를 사용하고, 배지로서 표 25에 나타내는 조성의 D-유산 생산 배지를 사용하고, 생산물인 D-유산의 농도의 평가는 참고예 1과 동일한 HPLC법에 의해 측정했다. 또한, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠사제)를 사용했다.
Figure 112008067238378-pct00028
우선, NBRC10505/pTM63주를 시험관에서 5ml의 D-유산 생산 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 D-유산 생산 배지 50ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간, 30℃의 온도에서 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 도 1에 나타내는 연속 발효 장치의 2.0L의 D-유산 생산 배지에 접종하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 800rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도 조정, pH 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양).
전 배양 완료 후 즉시, 발효액 순환 펌프(10)를 가동시키고, 전 배양시의 운전 조건에 추가해서 막분리조(2)를 통기하고, D-유산 생산 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 2L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 카다베린의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 유산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 320시간의 연속 발효 시험을 행한 결과를 표 26에 나타낸다.
막분리형 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 D-유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 32 연속 발효에 의한 D-유산의 제조(그 2)
도 2에 나타내는 발효 장치와 표 25에 나타내는 조성의 D-유산 생산 배지를 사용하여 D-유산의 제조를 행했다. 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 분리막 엘리먼트 부재에는 스테인레스 및 폴리설폰 수지의 성형품을 사용했다. 분리막으로서는 참고예 2에서 제작한 다공성막을 사용했다. 본 실시예에 있어서의 운전 조건은 특별히 언급하지 않는 한, 이하와 같다.
발효 반응조 용량: 1.5(L)
사용 분리막: 폴리불화비닐리덴 여과막
막분리 엘리먼트 유효 여과 면적: 120㎠
온도 조정: 30(℃)
발효 반응조 통기량: 0.2(L/min) 공기
발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)
pH 조정: 5N NaOH에 의해 pH5.0으로 조정
멸균: 분리막 엘리먼트를 함유하는 배양조 및 사용 배지는 모두 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균
막투과수량 제어: 막간 차압에 의한 유량 제어.
(연속 발효 개시 후~90시간: 0.1kPa 이상 5kPa 이하로 제어
90~180시간: 0.1kPa 이상 2kPa 이하로 제어
180~264시간: 0.1kPa 이상 20kPa 이하로 제어).
미생물로서 NBRC10505/pTM63주를 사용하고, 배지로서 표 25에 나타내는 조성의 D-유산 생산 배지를 사용하고, 생산물인 D-유산의 농도의 평가는 참고예 1과 동일한 HPLC법에 의해 측정했다. 또한, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠사제)를 사용했다.
우선, NBRC10505/pTM63주를 시험관에서 5ml의 D-유산 생산 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전전 배양). 얻어진 배양액을 신선한 D-유산 생산 배지 50ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간, 30℃의 온도에서 진탕 배양했다(전전 배양).
전전 배양액을 도 2에 나타내는 연속 발효 장치의 1.5L의 D-유산 생산 배지에 접종하고, 발효 반응조(1)를 부속 교반기(5)에 의해 800rpm으로 교반하고, 발효 반응조(1)의 통기량의 조정, 온도 조정 및 pH 조정을 행하여 24시간 배양을 행했다(전 배양). 전 배양 완료 후 즉시, D-유산 생산 배지의 연속 공급을 행하고, 연속 발효 장치의 발효액량을 1.5L가 되도록 막투과수량의 제어를 행하면서 연속 배양하여 연속 발효에 의한 D-유산의 제조를 행했다. 연속 발효 시험을 행할 때의 막투과수량의 제어는 수두차 제어 장치(3)에 의해 수두차를 막간 차압으로서 측정하고, 상기 막투과수량 제어 조건으로 변화시킴으로써 행했다. 적당히 막투과 발효액 중의 생산된 D-유산 농도 및 잔존 글루코오스 농도를 측정했다. 또한, 상기 D-유산 및 투입 글루코오스로부터 산출된 D-유산 생산 속도를 표 26에 나타냈다.
264시간의 발효 시험을 행한 결과, 도 2에 나타내는 연속 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 안정적인 D-유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
비교예 16 회분 발효에 의한 D-유산의 제조
미생물을 사용한 발효 형태로서 가장 전형적인 회분 발효를 2L 용량의 자퍼멘터를 이용해서 행하고, 그 D-유산 생산성을 평가했다. 배지는 고압 증기 멸균(121℃, 15분)해서 사용했다. 본 비교예에서는 미생물로서 NBRC10505/pTM63주를 사용하고, 생산물인 D-유산의 농도의 평가는 HPLC를 이용해서 평가하고, 글루코오스 농도의 측정에는 글루코오스 테스트 와코C(와코쥰야쿠사제)를 사용했다. 본 비교예의 운전 조건은 이하와 같다.
발효 반응조 용량(D-유산 생산 배지량): 1.0(L)
온도 조정: 30(℃)
발효 반응조 통기량: 0.2(L/min) 공기
발효 반응조 교반 속도: 300(rpm)
pH 조정: 5N NaOH에 의해 pH5.0으로 조정.
우선, NBRC10505/pTM63주를 시험관에서 5ml의 D-유산 생산 배지에 의해 하룻밤 진탕 배양했다(전전 배양). 전전 배양액을 신선한 D-유산 생산 배지 50ml에 접종하고, 500ml 용량 사카구치 플라스크에서 24시간, 30℃의 온도에서 진탕 배양했다(전 배양). 전 배양액을 자퍼멘터의 1.5L의 D-유산 생산 배지에 접종했다. D-유산 생산 배지를 사용하여 회분 발효를 행했다. 그 결과를 표 26에 나타낸다.
Figure 112008067238378-pct00029
도 1 및 도 2에 나타내는 발효 장치를 사용한 본 발명의 화학품의 제조 방법에 의해 D-유산의 생산 속도가 대폭 향상되는 것을 밝힐 수 있었다.
참고예 13 다공성막의 제작(그 5)
중량 평균 분자량 41.7만의 불화비닐리덴호모폴리머와 γ-부티로락톤을 각각 38중량%와 62중량%의 비율로 170℃의 온도에서 용해하여 원액을 제작했다. 이 원액을 γ-부티로락톤을 중공부 형성 액체로 해서 수반(隨拌)시키면서 구금으로부터 토출하고, 온도 20℃의 γ-부티로락톤 80중량% 수용액으로 이루어지는 냉각욕 안에서 고화해서 중공사막을 제작했다.
이어서, 중량 평균 분자량 28.4만의 불화비닐리덴호모폴리머를 14중량%, 셀룰로오스아세테이트프로피오네이트(이스트만케미컬사, CAP482-0.5)를 1중량%, N-메틸-2-피롤리돈을 77중량%, 폴리옥시에틸렌야자유지방산 소르비탄(산요카세이가부시키가이샤, 상품명 이오네트 T-20C)을 5중량%, 물을 3중량%의 비율로 95℃의 온도에서 혼합 용해해서 원액을 조정했다. 이 원액을 중공사막 표면에 균일하게 도포하고, 바로 수욕 안에서 응고시킨 중공사막을 제작했다. 얻어진 중공사막은 피처리 물측 표면의 평균 구멍 지경이 0.05㎛였다. 이어서, 상기 분리막에 대해서 순수 투수량을 평가한 결과, 5.5×10-9㎥/㎡·s·Pa이었다. 투수량의 측정은 역침투막에 의한 25℃의 정제수를 사용하고, 헤드 높이 1m에서 행했다. 또한, 평균 세공 직경의 표준 편차는 0.006㎛였다.
실시예 33 중공사막을 사용한 연속 발효에 의한 L-유산의 제조(그 1)
분리막으로서 참고예 13에서 제작한 다공성막을 사용해서 제작한 유효 여과 면적이 120㎠인 도 4에 나타내는 분리막 엘리먼트를 사용하고, 실시예 1과 동일한 L-유산 연속 발효 시험을 행했다. 그 결과를 비교예 1의 결과와 함께 표 27에 나타낸다. 안정적인 L-유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능했다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
실시예 34 중공사막을 사용한 연속 발효에 의한 L-유산의 제조(그 2)
분리막으로서 참고예 13에서 제작한 다공성막을 사용해서 제작한 유효 여과 면적이 120㎠인 도 4에 나타내는 분리막 엘리먼트를 사용하고, 실시예 4와 동일한 L-유산 연속 발효 시험을 행했다. 그 결과를 비교예 1과 함께 표 27에 나타낸다. 안정적인 L-유산의 연속 발효에 의한 제조가 가능한 것을 확인할 수 있었다. 연속 발효의 전체 기간 중의 막간 차압은 2kPa 이하로 추이했다.
Figure 112008067238378-pct00030
본 발명은 간편한 조작 방법에 의해 장시간에 걸쳐 안정적으로 고생산성을 유지하는 연속 발효법에 의한 화학품의 제조 방법이다. 본 발명에 의하면 간편한 조작 조건으로 장시간에 걸쳐 안정적으로 고생산성을 유지하는 연속 발효가 가능하게 되고, 널리 발효 공업에 있어서 발효 생산물인 화학품을 저비용으로 안정적으로 생산하는 것이 가능하게 된다.
SEQUENCE LISTING <110> Toray Industries, Inc <120> Method for producing a chemical product and continuous fermentor <130> 06082 <160> 12 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 1 ctcgagatgg caactctaaa ggatca 26 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 2 gcggccgctt aaaattgcag ctcctttt 28 <210> 3 <211> 999 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggcaactc taaaggatca gctgatttat aatcttctaa aggaagaaca gaccccccag 60 aataagatta cagttgttgg ggttggtgct gttggcatgg cctgtgccat cagtatctta 120 atgaaggact tggcagatga acttgctctt gttgatgtca tcgaagacaa attgaaggga 180 gagatgatgg atctccaaca tggcagcctt ttccttagaa caccaaagat tgtctctggc 240 aaagactata atgtaactgc aaactccaag ctggtcatta tcacggctgg ggcacgtcag 300 caagagggag aaagccgtct taatttggtc cagcgtaacg tgaacatatt taaattcatc 360 attcctaatg ttgtaaaata cagcccgaac tgcaagttgc ttattgtttc aaatccagtg 420 gatatcttga cctacgtggc ttggaagata agtggttttc ccaaaaaccg tgttattgga 480 agtggttgca atctggattc agcccgattc cgttacctga tgggggaaag gctgggagtt 540 cacccattaa gctgtcatgg gtgggtcctt ggggaacatg gagattccag tgtgcctgta 600 tggagtggaa tgaatgttgc tggtgtctct ctgaagactc tgcacccaga tttagggact 660 gataaagata aggaacagtg gaaagaggtt cacaagcagg tggttgagag tgcttatgag 720 gtgatcaaac tcaaaggcta cacatcctgg gctattggac tctctgtagc agatttggca 780 gagagtataa tgaagaatct taggcgggtg cacccagttt ccaccatgat taagggtctt 840 tacggaataa aggatgatgt cttccttagt gttccttgca ttttgggaca gaatggaatc 900 tcagaccttg tgaaggtgac tctgacttct gaggaagagg cccgtttgaa gaagagtgca 960 gatacacttt gggggatcca aaaggagctg caattttaa 999 <210> 4 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 4 tctcaattat tattttctac tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa 60 atggcaactc taaaggatca 80 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 5 aggcgtatca cgaggccctt 20 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 6 gaattaattc ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct agattgtact gagagtgcac 60 <210> 7 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 7 tatttttcgt tacataaaaa tgcttataaa actttaacta ataattagag attaaatcgc 60 ctgtgcggta tttcacaccg 80 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 8 caaatatcgt ttgaatattt ttccg 25 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 9 aatccagatt gcaaccactt 20 <210> 10 <211> 1011 <212> DNA <213> Bacillus laevolacticus <400> 10 atgaaattct tgatgtatgg agtacaagat catgagagag caacgatcga gaattgggca 60 aatcaacatc aggtggagat cgcaacaacc tcagatttcc tctcagaaga tacagtcgct 120 caatcgaaag gctttgacgg tatctgcatt caacagccga ttgcactcgg aggcccgaat 180 ttatacactc aattaaaaaa caacggtatc aaacagattg ctacacgaac agccggttac 240 gacatgattg atttgaacga agccgagaaa aacagtttgt tggtgaccaa tgttccagca 300 tactcccctt acgcagtcgc cgagctcgcg gtcactcagg cgatgcagct cgtccgccat 360 attcctgaat tcaataaacg tgttgcaggc aaagattttc gctggtcagg ccttatttcc 420 agagaaatcc gatcattaac ggtcggcata gtcggcaccg gccgcatcgg tgcaacggcc 480 gcacagctct tcaaaggact aggggcaaaa atcattggtt ttgatcaata tcccaacgat 540 cggctaaacg gtatccttga ctatcggcct tcacttgaag acgtgcttaa ggaagctgat 600 atcatttctc ttcacacgcc gctttttgat tcgactcggc acatgatcaa taaaagcaca 660 ttaaaactga tgaaaaatag tgcctatcta atcaatgttg ccagaggcgg cttaattaaa 720 actgaagatc tgattgaagc acttgaaaac ggcgaaattg ccggtgcagc gttagatacc 780 tttgaaaatg aactcatgat taataaagat ctgagtaagc agccgctcaa tgatccgctt 840 ctttcgaaac ttctcgatat ggaacaagtg ctgctcacac cgcatgtcgg cttctttact 900 gagaccgcca ttcaaaacat tgttgaaggt gccttagaca gtgttgtcga ggttttgaag 960 acaggaacaa gcaaaaatct tgttcaagca caaccgctat cggcaaaata a 1011 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 11 ctcgagatga aattcttgat gtatggagta 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 12 gcggccgctt attttgccga tagcggttgt 30

Claims (26)

  1. 미생물 또는 배양 세포의 배양액을 분리막에 의해 여과하고, 여과액으로부터 생산물을 회수하고, 또한, 미여과액을 상기 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한, 발효 원료를 상기 배양액에 추가하는 연속 발효에 있어서 상기 분리막으로서 평균 세공 직경이 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만인 다공성막을 사용하고, 막간 차압을 0.1~20kPa의 범위에서 여과 처리하는 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 다공성막의 순수 투과 계수는 2×10-9㎥/㎡/s/pa 이상 6×10-7㎥/㎡/s/pa 이하인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 다공성막의 평균 세공 직경은 0.01㎛ 이상 0.2㎛ 미만이며, 또한, 상기 다공성막의 세공 직경의 표준 편차는 0.1㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 다공성막의 막 표면 거칠기는 0.1㎛ 이하인 다공성막인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 다공성막은 다공질 수지층을 함유하는 다공성막인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 다공질 수지층은 유기 고분자로 이루어지는 다공질 수지층인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 유기 고분자는 폴리불화비닐리덴인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 미생물 또는 상기 배양 세포의 배양액 및 발효 원료는 당류를 함유하는 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 화학품은 유기산인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 화학품은 L-유산인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 화학품은 D-유산인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 화학품은 피루빈산인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 화학품은 숙신산인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 화학품은 이타콘산인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 화학품은 카다베린인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 화학품은 알코올인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 화학품은 에탄올인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 화학품은 1,3-프로판디올인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 화학품은 핵산인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 화학품은 이노신인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 화학품은 아미노산인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 상기 화학품은 L-트레오닌인 것을 특징으로 하는 화학품의 제조 방법.
  23. 미생물 또는 배양 세포의 발효 배양액을 분리막에 의해 여과하고, 여과액으로부터 생산물을 회수함과 아울러 미여과액을 상기 발효 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한, 발효 원료를 상기 발효 배양액에 추가하는 연속 발효에 의한 화학품의 제조 장치로서: 상기 미생물 또는 상기 배양 세포를 발효 배양시키기 위한 발효 반응조와, 상기 발효 반응조에 발효 배양액 순환 수단을 통해 접속되어 내부에 상기 분리막을 구비한 상기 발효 배양액을 여과하기 위한 막분리조와, 상기 분리막의 막간 차압을 0.1~20kPa의 범위로 제어하는 수단으로 이루어지고, 상기 분리막은 평균 세공 직경 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만의 다공성막인 것을 특징으로 하는 연속 발효 장치.
  24. 미생물 또는 배양 세포의 발효 배양액을 분리막에 의해 여과하고, 여과액으로부터 생산물을 회수함과 아울러 미여과액을 상기 발효 배양액에 유지 또는 환류하고, 또한, 발효 원료를 상기 발효 배양액에 추가하는 연속 발효에 의한 화학품의 제조 장치로서: 상기 미생물 또는 상기 배양 세포를 발효시키기 위한 발효 반응조와, 그 발효 반응조 내부에 배치되어 상기 분리막을 구비한 상기 발효 배양액을 여과하기 위한 분리막 엘리먼트와, 상기 분리막 엘리먼트에 접속되어 여과된 발효 생산물을 배출하기 위한 수단과, 상기 분리막의 막간 차압을 0.1~20kPa의 범위로 제어하기 위한 수단으로 이루어지고, 상기 분리막은 평균 세공 직경 0.01㎛ 이상 1㎛ 미만의 세공을 갖는 것을 특징으로 하는 다공성막인 것을 특징으로 하는 연속 발효 장치.
  25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 상기 다공성막의 순수 투과 계수는 2×10-9㎥/㎡/s/pa 이상 6×10-7㎥/㎡/s/pa 이하인 것을 특징으로 하는 연속 발효 장치.
  26. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 상기 다공성막의 평균 세공 직경은 0.01㎛ 이상 0.2㎛ 미만이며, 또한, 상기 다공성막의 세공 직경의 표준 편차는 0.1㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 연속 발효 장치.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5223520B2 (ja) * 2007-08-22 2013-06-26 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法
JP5532919B2 (ja) * 2007-12-07 2014-06-25 東レ株式会社 乳酸脱水素酵素発現カセット、形質転換酵母および乳酸の製造方法
JP2009142210A (ja) * 2007-12-14 2009-07-02 Toray Ind Inc 連続発酵による乳酸の製造方法
CN101939439B (zh) * 2008-02-04 2014-08-06 东丽株式会社 通过连续发酵实施的乳酸的制造方法
JP5593594B2 (ja) * 2008-07-23 2014-09-24 東レ株式会社 連続培養による化学品の製造方法
KR20110060888A (ko) 2008-09-30 2011-06-08 도레이 카부시키가이샤 화학품의 제조 방법 및 연속 배양 장치
CN102639722B (zh) 2008-12-09 2017-09-29 东丽株式会社 糖液的制造方法
ES2765889T3 (es) * 2008-12-26 2020-06-11 Toray Industries Procedimiento para la producción de ácido láctico y procedimiento para la producción de ácido poliláctico
US8822195B2 (en) 2009-06-03 2014-09-02 Toray Industries, Inc. Polypeptide having D-lactate dehydrogenase activity, polynucleotide encoding the polypeptide, and process for production of D-lactic acid
CN102459138A (zh) * 2009-06-04 2012-05-16 基因组股份公司 分离发酵液成分的方法
CN102791872A (zh) 2010-03-10 2012-11-21 东丽株式会社 精制糖水溶液的制造方法及化学品的制造方法
EP2586871A1 (en) 2010-06-24 2013-05-01 Toray Industries, Inc. Process for production of aqueous refined sugar solution
EP2404508A1 (en) * 2010-07-09 2012-01-11 LoHaS Products GmbH Method for producing a liquid with reduced saccharide content
BRPI1004963A2 (pt) * 2010-08-19 2015-03-24 Companhia Refinadora Da Amazônia Sistema e processo de correção de acidez a volume constante de meios fermentativos para a produção de ácidos orgânicos
JP5796282B2 (ja) * 2010-08-31 2015-10-21 東レ株式会社 コリネ型細菌による化学品の製造方法
ES2795837T3 (es) * 2010-09-14 2020-11-24 Toray Industries Método de producción de productos químicos mediante fermentación continua
US8999681B2 (en) * 2010-12-08 2015-04-07 Toray Industries, Inc. Method for producing cadaverine
KR20130135859A (ko) * 2010-12-08 2013-12-11 도레이 카부시키가이샤 카다베린의 제조 방법
JP5978995B2 (ja) 2010-12-09 2016-08-24 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法
US20130330792A1 (en) * 2010-12-27 2013-12-12 Toray Industries, Inc. Method for producing chemicals by continuous fermentation
MY163268A (en) 2011-02-22 2017-08-30 Toray Industries Diol composition and polyester
WO2012133477A1 (ja) 2011-03-29 2012-10-04 東レ株式会社 糖液の製造方法
US8802404B2 (en) * 2011-04-06 2014-08-12 University Of New Hampshire Vinyl acid monomer recovery
WO2012147903A1 (ja) 2011-04-28 2012-11-01 東レ株式会社 乳酸生産酵母変異株および乳酸の製造方法
KR101286158B1 (ko) * 2011-08-24 2013-07-15 씨제이제일제당 (주) 발효액에서 1,4-디아미노부탄의 분리 및 정제하는 방법
EP2751255B1 (de) * 2011-09-01 2020-10-21 GICON Grossmann Ingenieur Consult GmbH Verfahren und vorrichtung zur gezielten einspeisung von gasen oder gasgemischen in eine flüssigkeit, suspension oder emulsion in einem photobioreaktor
MY173716A (en) * 2012-01-13 2020-02-18 Toray Industries Method for producing chemical substance
AU2013208441B2 (en) * 2012-01-13 2016-12-01 Toray Industries, Inc. Method for producing chemical substance
RU2595388C2 (ru) * 2012-01-13 2016-08-27 Торэй Индастриз, Инк. Способ получения химического вещества
WO2013146920A1 (ja) 2012-03-30 2013-10-03 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法および連続発酵装置
US9670516B2 (en) 2012-06-12 2017-06-06 Toray Industries, Inc. Method of producing sugar liquid
ITNA20120046A1 (it) * 2012-08-02 2014-02-03 No Self S R L Uso di acidi nucleici di sistemi biologici parassiti, patogeni e infestanti per l'inibizione e/o controllo degli stessi sistemi
JP5757443B2 (ja) 2013-07-12 2015-07-29 東レ株式会社 セルロース含有バイオマスからのアルコールの製造方法
JP2015077119A (ja) * 2013-10-15 2015-04-23 カンウォン ナショナル ユニバーシティ， ユニバーシティ−インダストリー コーペレーション ファンデーション アクチノバシラススクシノゲネスを用いたコハク酸連続生産工程
US10927389B2 (en) 2014-04-14 2021-02-23 Toray Industries, Inc. Method of producing chemical substance by continuous fermentation
JP2017205019A (ja) * 2014-09-19 2017-11-24 旭硝子株式会社 有機酸の製造方法
WO2016117023A1 (ja) * 2015-01-20 2016-07-28 三菱化学エンジニアリング株式会社 酸素含有気体のマイクロナノバブルを供給する装置及び溶存二酸化炭素を除去する装置を備えた生物反応装置及びこの生物反応装置を用いた生物反応方法
US20180250640A1 (en) * 2015-09-04 2018-09-06 Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd. Porous film and method for producing same
AU2017231506B2 (en) 2016-03-09 2023-02-09 Toray Industries, Inc. Glucose composition, microbial fermentation raw material, and method for producing chemical product
JP6927036B2 (ja) * 2016-03-17 2021-08-25 東レ株式会社 化学品の製造方法および微生物の培養方法
JP6142042B1 (ja) 2016-03-18 2017-06-07 株式会社村田製作所 有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法
CN106367326B (zh) * 2016-07-28 2018-10-30 南京工业大学 一种固定化细胞连续生产萃取戊二胺的装置
EP3581658A4 (en) 2017-02-07 2021-01-20 Toray Industries, Inc. PROCESS FOR THE PRODUCTION OF ALCOHOL BY CONTINUOUS FERMENTATION AND CONTINUOUS FERMENTATION APPARATUS TO BE USED THEREFORE
JP6249124B1 (ja) 2017-04-26 2017-12-20 株式会社村田製作所 有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法
JP7070416B2 (ja) * 2017-06-30 2022-05-18 東レ株式会社 連続発酵による化学品の製造方法および製造装置
CN111328342B (zh) * 2017-07-31 2024-04-12 赛纳塔生物有限公司 用于在去除前浓缩悬浮的固体的系统和方法
CN107446813B (zh) * 2017-08-22 2023-10-31 江西省科学院微生物研究所 一种连续转化生产2-pe的装置及其连续转化生产2-pe的方法
BR112020004870A2 (pt) * 2017-09-15 2020-09-15 Toray Industries, Inc. método para a produção de etanol e líquidos de fermentação de etanol
CN107617251A (zh) * 2017-10-19 2018-01-23 苏州苏震生物工程有限公司 一种用于1,3‑丙二醇和2,3‑丁二醇发酵液预处理的设备及工艺
JP6815307B2 (ja) * 2017-11-09 2021-01-20 株式会社村田製作所 有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法
CN108300661A (zh) * 2018-02-13 2018-07-20 京东方科技集团股份有限公司 培养装置和培养设备
JPWO2019230861A1 (ja) 2018-05-31 2021-04-22 東レ株式会社 揮発性の化学品の製造方法および発酵装置
CN109609392B (zh) * 2018-12-24 2022-04-19 上海智城分析仪器制造有限公司 一种用于酵母菌的虹吸导管补料摇床培养方法
WO2020165873A1 (en) * 2019-02-15 2020-08-20 Oncosimis Biotech Private Limited Method and system for enhanced continuous production, secretion and separation of recombinant polypeptides from bacteria
WO2020170228A1 (en) * 2019-02-24 2020-08-27 Oncosimis Biotech Private Limited Method for continous production of recombinant glp-1 peptide by bacteria
CN110129385A (zh) * 2019-03-18 2019-08-16 卢松 一种提高菌株产酸效率的方法
JP2020162549A (ja) 2019-03-29 2020-10-08 味の素株式会社 制御装置、制御方法およびプログラムならびに有機化合物の製造方法
CN110982863B (zh) * 2019-12-31 2023-02-03 广州舒国生物科技有限公司 一种产呈味核苷酸二钠的微生物发酵方法
CN112410216A (zh) * 2020-10-21 2021-02-26 英诺维尔智能科技（苏州）有限公司 一种氮气和氧气动态调节反应器内溶氧量的方法
CN112646844A (zh) * 2020-12-25 2021-04-13 天津科技大学 一种赖氨酸循环发酵方法和应用
WO2023212400A1 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Manus Bio Inc. Fermentation processes and systems
GR1010735B (el) * 2023-05-12 2024-07-25 Εθνικο Κεντρο Ερευνας Και Τεχνολογικης Αναπτυξης (Ε.Κ.Ε.Τ.Α.), Βιοτεχνολογικη μεθοδος για τον καθαρισμο διαλυματων γαλακτικου οξεος απο χημικες προσμιξεις με γενετικα τροποποιημενους μικροοργανισμους και βιοαντιδραστηρες μεμβρανων

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005028339A (ja) 2003-07-11 2005-02-03 Daicel Chem Ind Ltd 洗車排水処理装置

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0073079B1 (de) 1981-08-18 1986-03-26 DrM, Dr. Müller AG Verfahren und Vorrichtung zur Züchtung von Mikroorganismen
JPH0712303B2 (ja) 1985-12-12 1995-02-15 猛 小林 連続型微生物培養装置
JPS63248396A (ja) * 1987-04-06 1988-10-14 Nok Corp ジヒドロオキソイソホロンの製造方法
JP2564147B2 (ja) 1987-10-09 1996-12-18 株式会社中埜酢店 高濃度菌体酢酸醗酵法
JPH0669367B2 (ja) 1988-12-27 1994-09-07 雪印乳業株式会社 乳酸菌の培養方法
US5256294A (en) 1990-09-17 1993-10-26 Genentech, Inc. Tangential flow filtration process and apparatus
JPH07121216B2 (ja) * 1991-10-07 1995-12-25 工業技術院長 撹拌型バイオリアクター及び培養器
JP2661848B2 (ja) 1992-09-22 1997-10-08 工業技術院長 培養方法及び培養装置
US5503750A (en) * 1993-10-04 1996-04-02 Russo, Jr.; Lawrence J. Membrane-based process for the recovery of lactic acid by fermentation of carbohydrate substrates containing sugars
JP3341428B2 (ja) 1993-12-24 2002-11-05 栗田工業株式会社 浸漬膜装置の運転方法
JP3341427B2 (ja) 1993-12-24 2002-11-05 栗田工業株式会社 浸漬膜装置
JPH10118461A (ja) * 1996-10-16 1998-05-12 Kao Corp 発酵生産物の回収方法
JP3812019B2 (ja) 1996-11-21 2006-08-23 味の素株式会社 連続発酵によるｌ−グルタミン酸の製造法
JPH10174594A (ja) 1996-12-17 1998-06-30 Ngk Insulators Ltd 微生物によるグリコール酸の生産方法
JPH10323543A (ja) * 1997-05-22 1998-12-08 Arakawa Chem Ind Co Ltd 微生物反応における生成物の分離方法
JPH11113587A (ja) 1997-10-14 1999-04-27 Ube Ind Ltd アルコール発酵によるアルコールの製造方法および装置
JPH11137286A (ja) 1997-11-11 1999-05-25 Musashino Chemical Laboratory Ltd 乳酸の発酵方法
JPH11215980A (ja) 1998-02-02 1999-08-10 Kurita Water Ind Ltd 菌体含有液の処理方法
KR100594482B1 (ko) 1998-04-14 2006-07-03 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 막 여과
JP2000094000A (ja) 1998-09-21 2000-04-04 Kajima Corp 浸漬型膜利用メタン発酵システム
JP2000167555A (ja) 1998-09-29 2000-06-20 Nittetu Chemical Engineering Ltd 浸漬膜の洗浄方法
JP3577992B2 (ja) 1999-05-07 2004-10-20 栗田工業株式会社 膜分離方法
US6544424B1 (en) 1999-12-03 2003-04-08 Refined Technology Company Fluid filtration system
JP2001211878A (ja) 2000-02-04 2001-08-07 National Federation Of Dairy Cooperative Associations ヨーグルトスターター乳酸菌の高濃度培養方法、及び得られた高濃度培養液を用いたヨーグルトの製造方法
US6607669B2 (en) 2000-06-23 2003-08-19 Scilog, Inc. Method and apparatus for enhancing filtration yields in tangential flow filtration
JP5127107B2 (ja) * 2001-02-16 2013-01-23 東レ株式会社 分離膜の製造方法
JP2003053164A (ja) * 2001-08-20 2003-02-25 Kuraray Co Ltd 病原性原生動物の除去方法およびこれに用いられる分離膜
JP3755035B2 (ja) 2001-08-23 2006-03-15 独立行政法人産業技術総合研究所 エタノール分離膜、エタノール分離膜を有するエタノール製造装置及びエタノール分離膜を用いるエタノール製造方法
DE60232668D1 (de) 2001-10-04 2009-07-30 Toray Industries Verfahren zur herstellung einer hohlfasermembran
JP2003135939A (ja) 2001-10-31 2003-05-13 Toray Ind Inc 分離膜およびその製造方法
JP2003144869A (ja) 2001-11-13 2003-05-20 Toray Ind Inc 分離膜およびその製造方法
JP2005111326A (ja) 2003-10-06 2005-04-28 Toray Ind Inc 液体分離膜およびその使用方法
EP2308958A3 (en) 2004-03-05 2011-08-10 DSM IP Assets B.V. Process for cell culturing by continuous perfusion and alternating tangential flow
JP4554277B2 (ja) 2004-05-27 2010-09-29 昭和電工株式会社 微生物によるコハク酸の製造方法
JP5130811B2 (ja) 2006-07-19 2013-01-30 東レ株式会社 連続発酵による１，３−プロパンジオールの製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005028339A (ja) 2003-07-11 2005-02-03 Daicel Chem Ind Ltd 洗車排水処理装置

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AU2007218753B2 (en) 2012-08-16
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