JPWO2019230861A1 - 揮発性の化学品の製造方法および発酵装置 - Google Patents
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Abstract
本発明は、揮発性の化学品を製造する能力を有する微生物を培養する培養槽、前記培養槽で培養された培養液を前記貯蔵槽へ送液する送液ラインおよび前記微生物を培養して得られた化学品を含む溶液を貯蔵する貯蔵槽を含む培養装置を用いて、前記貯蔵槽に前記溶液を保持しながら前記培養槽にて前記微生物を培養する揮発性の化学品の製造方法であって、前記貯蔵槽内と前記培養槽内の気相部分同士が通気配管で接続されている方法である。【選択図】図1
Description
本発明は、揮発性の化学品の損失を低減するための製造方法および製造装置に関する。
バイオマス中の有機化合物を発酵原料として酵母や細菌などの微生物によって各種化学品を製造する方法が実用化されているが、化学品を発酵法にて製造する際、培養槽で発酵を行った後、培養液から目的の化学品を抽出したり、培養液を濃縮したりする場合がある。このような場合、培養液は一旦貯蔵槽などに集められる。
製造する化学品が揮発性の化学品である場合、培養液から揮発性の化学品が蒸発するため、発酵が行われる培養槽内や貯蔵槽内は、化学品を含む気体で満たされる。化学品を含む気体が満たされた状態で貯蔵槽に培養液を移液すると、槽内の圧力が上昇して危険なため、気体を槽外へ放出するベントを設置するなど、槽内の圧力を下げる装置や処置が必要となるが、気体を槽外へ放出してしまうと、気体に含まれる化学品も槽外へ放出されてしまうため、目的とする化学品の回収量が減少し、損失となる。
特許文献1には、エタノールを発酵法にて製造する際に、培養槽内の気体を吸引して培養槽内を減圧に維持することで、培養液中のエタノール濃度を低下させ、発酵速度を維持する方法が記載されている。
揮発性の化学品を培養する際には、培養槽から気体を放出するベント孔に逆流コンデンサーを設置する方法がある。逆流コンデンサーは、Cold trapとも呼ばれ、培養槽や貯蔵槽に設置された逆流コンデンサーは、槽内の気相部と槽外をつなぐラインの周囲または内部に冷却液が流れる配管を備え、気体に含まれる凝縮性成分を凝縮させることで槽内の圧力上昇を防ぎ、揮発性の化学品の損失を防ぐことができる。逆流コンデンサーを培養槽だけでなく、貯蔵槽にも設置すれば、揮発性の化学品の損失はさらに抑制されると考えられる。
また、揮発性の化学品の損失を防ぐ別の方法として、目的とする揮発性の化学品を含むガスを供給しながら培養を行う方法が検討されている。例えば特許文献2は、メタノールを製造するプロセスにおいて、メタノールを含むガスを供給しながら培養することで揮発性の化学品の損失を防いでいる。
本発明者らは、揮発性の化学品の損失を抑制するために、貯蔵槽に逆流コンデンサーの設置を検討した結果、貯蔵槽に逆流コンデンサーを設置しても、揮発性の化学品の損失を十分に抑制できないという新規な課題を見出した。つまり、逆流コンデンサーを設置しても全ての揮発性物質を凝縮させる事は困難であり、少なくとも冷却水の温度で、凝縮できる量しか回収できず、それ以外は気体として排出される。また逆流コンデンサーの伝熱面積が十分でない場合にも一部はロスとして流出する。従って、逆流コンデンサーを培養槽だけでなく、貯蔵槽にも設置すると、培養液はさらに希釈されてしまう。また、特許文献1の方法では、揮発性の化学品の損失を防ぐことは可能であるが、培養槽内を減圧にするためのエネルギーが必要であり、装置が大型化するほどに、必要とされるエネルギーも増大してしまう。また、培養槽内が減圧状態に制御されることで、培養液中に含まれる化学品の濃度も低下してしまう。
本発明は、貯蔵槽に逆流コンデンサーを使用せず、簡便に貯蔵槽からの揮発性の化学品の損失を防ぐ装置と方法を提供することを課題とする。
本発明者は鋭意検討した結果、発酵槽内と貯蔵槽内の気相部分同士を通気管で接続する事で、貯蔵槽からの揮発性の化学品の損失を簡便に低減できる事を見出し、本発明にいたった。
すなわち本発明は以下(1)〜(9)の通りである。
(1)揮発性の化学品を製造する能力を有する微生物を培養する培養槽、前記微生物を培養して得られた化学品を含む溶液を貯蔵する貯蔵槽および前記培養槽で培養された培養液を前記貯蔵槽へ送液する送液ラインを含む培養装置を用いて、前記貯蔵槽に前記溶液を保持しながら前記培養槽にて前記微生物を培養する揮発性の化学品の製造方法であって、前記貯蔵槽内と前記培養槽内の気相部分同士が通気配管で接続されている方法。
(2)前記送液ラインが、前記培養液中の微生物を分離する分離膜モジュール、前記培養液を前記分離膜モジュールへ送液する培養液送液ライン、前記分離膜モジュールのろ液を前記貯蔵槽へ送液するろ液配管、および前記分離膜モジュールの未ろ過液を前記培養槽へ還流する未ろ過液配管を含み、前記培養槽から前記貯蔵槽へ前記培養液を送液する際に、前記培養液を前記分離膜モジュールに通じて得たろ液を前記揮発性の化学品を含む溶液として前記貯蔵槽に送液し、かつ、前記培養液を前記分離膜モジュールに通じて得た未ろ過液を前記培養槽に還流する、(1)に記載の揮発性の化学品の製造方法。
(3)前記分離膜の平均細孔径が0.01μm以上5μm未満である、(2)に記載の揮発性の化学品の製造方法。
(4)前記分離膜の膜間差圧が0.1kPaから150kPaである、(2)または(3)に記載の揮発性の化学品の製造方法。
(5)前記培養槽内の液温>前記貯蔵槽内の液温である、(1)から(4)のいずれか一項に記載の揮発性の化学品の製造方法。
(6)前記揮発性の化学品の蒸気圧が30℃で1kPa以上101kPa以下である、(1)から(5)のいずれか一項に記載の揮発性の化学品の製造方法。
(7)前記揮発性の化学品が、エタノール、メタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−メチル−1−プロパノール、2−ブタノール、2−メチル−2−プロパノール、アセトン、または酢酸である、(1)から(6)のいずれか一項に記載の揮発性の化学品の製造方法。
(8)揮発性の化学品を製造する能力を有する微生物を培養する培養槽、前記微生物を培養して得られた化学品を含む溶液を貯蔵する貯蔵槽、前記培養槽で培養された培養液を前記貯蔵槽へ送液する送液ライン、および前記培養槽内と前記貯蔵槽内の気相部分同士を接続する通気配管を含む、揮発性の化学品の製造装置。
(9)前記送液ラインが、前記培養液中の微生物を分離する分離膜モジュール、前記培養液を前記分離膜モジュールへ送液する培養液送液ライン、前記分離膜モジュールのろ液を、前記化学品を含む溶液として前記貯蔵槽へ送液するろ液配管、および前記分離膜モジュールの未ろ過液を前記培養槽へ還流する未ろ過液配管を含む、(8)に記載の揮発性の化学品の製造装置。
(1)揮発性の化学品を製造する能力を有する微生物を培養する培養槽、前記微生物を培養して得られた化学品を含む溶液を貯蔵する貯蔵槽および前記培養槽で培養された培養液を前記貯蔵槽へ送液する送液ラインを含む培養装置を用いて、前記貯蔵槽に前記溶液を保持しながら前記培養槽にて前記微生物を培養する揮発性の化学品の製造方法であって、前記貯蔵槽内と前記培養槽内の気相部分同士が通気配管で接続されている方法。
(2)前記送液ラインが、前記培養液中の微生物を分離する分離膜モジュール、前記培養液を前記分離膜モジュールへ送液する培養液送液ライン、前記分離膜モジュールのろ液を前記貯蔵槽へ送液するろ液配管、および前記分離膜モジュールの未ろ過液を前記培養槽へ還流する未ろ過液配管を含み、前記培養槽から前記貯蔵槽へ前記培養液を送液する際に、前記培養液を前記分離膜モジュールに通じて得たろ液を前記揮発性の化学品を含む溶液として前記貯蔵槽に送液し、かつ、前記培養液を前記分離膜モジュールに通じて得た未ろ過液を前記培養槽に還流する、(1)に記載の揮発性の化学品の製造方法。
(3)前記分離膜の平均細孔径が0.01μm以上5μm未満である、(2)に記載の揮発性の化学品の製造方法。
(4)前記分離膜の膜間差圧が0.1kPaから150kPaである、(2)または(3)に記載の揮発性の化学品の製造方法。
(5)前記培養槽内の液温>前記貯蔵槽内の液温である、(1)から(4)のいずれか一項に記載の揮発性の化学品の製造方法。
(6)前記揮発性の化学品の蒸気圧が30℃で1kPa以上101kPa以下である、(1)から(5)のいずれか一項に記載の揮発性の化学品の製造方法。
(7)前記揮発性の化学品が、エタノール、メタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−メチル−1−プロパノール、2−ブタノール、2−メチル−2−プロパノール、アセトン、または酢酸である、(1)から(6)のいずれか一項に記載の揮発性の化学品の製造方法。
(8)揮発性の化学品を製造する能力を有する微生物を培養する培養槽、前記微生物を培養して得られた化学品を含む溶液を貯蔵する貯蔵槽、前記培養槽で培養された培養液を前記貯蔵槽へ送液する送液ライン、および前記培養槽内と前記貯蔵槽内の気相部分同士を接続する通気配管を含む、揮発性の化学品の製造装置。
(9)前記送液ラインが、前記培養液中の微生物を分離する分離膜モジュール、前記培養液を前記分離膜モジュールへ送液する培養液送液ライン、前記分離膜モジュールのろ液を、前記化学品を含む溶液として前記貯蔵槽へ送液するろ液配管、および前記分離膜モジュールの未ろ過液を前記培養槽へ還流する未ろ過液配管を含む、(8)に記載の揮発性の化学品の製造装置。
本発明によれば、貯蔵槽で発生した気体は外部に排出されず、通気配管を介して発酵槽に移動するので、発酵槽および貯蔵槽での揮発性の化学品の損失を簡便に低減することができる。
本発明は、揮発性の化学品を製造する能力を有する微生物を培養する培養槽、前記微生物を培養して得られた化学品を含む溶液を貯蔵する貯蔵槽および前記培養槽で培養された培養液を前記貯蔵槽へ送液する送液ラインを含む培養装置を用いて、前記貯蔵槽に前記溶液を保持しながら前記培養槽にて前記微生物を培養する揮発性の化学品の製造方法であって、前記貯蔵槽内と前記培養槽内の気相部分同士が通気配管で接続されていることを技術的な特徴としている。通気配管の接続箇所は各槽の液同士が混合しなければ、培養槽、貯蔵槽のどの部分でも接続することができる。通気配管の形状は、管状になっていれば特に限定されない。通気配管の材質は、耐久性の観点から金属製のものが好ましいが、樹脂製のものも使用できる。また、通気配管の内径は、気体が容易に移動できる太さがあれば特に限定されない。
本発明の方法によれば、揮発性の化学品を含む溶液が貯蔵されている貯蔵槽内と、培養液が保持されている培養槽内の気相部分同士を通気配管で接続することによって、貯蔵槽内の圧力と、培養槽内の圧力の差にともなって、貯蔵槽内の気体と培養槽内の気体は、圧力が均等になるように双方向に移動したり、貯蔵槽内と培養槽内の気相中の揮発性の化学品の濃度が均等になるように双方向に移動したりすることが可能となり、揮発性の化学品の損失を抑制することができる。具体的には、通気配管で接続しない場合と比較して、貯蔵槽に貯蔵されている揮発性の化学品を含む溶液の揮発性の化学品の濃度を高濃度に保つことができる。通気配管による接続は、培養装置構成として恒久的な接続であってもよく、また、一時的な接続であってもよい。
培養液が保持されている培養槽は、培養中であってもよいし培養が終了した状態でもよい。
揮発性の化学品を含む溶液は、培養槽で保持されている培養液や培養液から菌体を除いた溶液などが該当する。
微生物の培養方法には、大きく(1)回分培養法(Batch培養法)や流加培養法(Fed−Batch培養法)と、(2)連続培養法に分類することができる。(1)の回分培養法や流加培養法は、設備が簡素であり、培養が短時間で終了し、かつ雑菌汚染による影響が小さいという利点がある。しかしながら、時間の経過とともに培養液中の発酵製造物濃度が高くなり、浸透圧の上昇や製造物自体により発酵が阻害されること等により生産性や収率が低下してくる。(2)連続培養法は、原料や発酵液を連続的に供給、流出させることで、培養槽内で発酵製造物が高濃度に蓄積することを回避することを目的とし、そうすることで、長時間にわたり化学品の収率および生産性を高く維持することが可能となる。
本発明の方法によれば、(1)回分培養法(Batch培養法)や流加培養法(Fed−Batch培養法)、(2)連続培養法のどちらの培養方法で、揮発性の化学品を製造した場合にも、揮発性の化学品の損失の低減効果を期待できるが、(2)連続培養法が好ましい。
また、本発明の方法は、培養槽内と貯蔵槽内の気相部分同士を通気配管で接続し、揮発性の化学品を含む溶液を貯蔵槽に保持しながら、前記培養槽で培養する時間が長いほど、揮発性の化学品の損失低減効果を顕著に期待することができる。培養時間の具体例としては、100時間以上が好ましく、より好ましくは150時間以上、さらに好ましくは200時間以上である。
培養槽での培養方法が(1)回分培養法(Batch培養法)や流加培養法である場合、前記培養槽にてこれら培養法にしたがった培養を行い、培養終了後に培養液を、前記送液ラインを経て前記貯蔵槽に培養液を送液し、前記貯蔵槽で前記培養液を揮発性の化学品を含む溶液として貯蔵する。この際、前記培養液の一部を前記培養槽に残しておいてもよいし、前記培養槽で新しい培養を始めてもよい。前記培養液を前記送液ラインにて送液する際にも、前記培養槽内と前記貯蔵槽内の気相部分同士が通気配管で接続されていることが好ましい。
培養槽での培養方法が(2)連続培養法である場合、多段式培養法や膜利用培養法が好ましく適用されるが、膜利用培養法がより好ましく適用される。膜利用培養法とは、例えばWO2007/097260号に例示されるような連続培養法であり、本発明に当てはめると、前記送液ラインに、少なくとも前記培養液中の微生物を分離する分離膜モジュール、前記培養液を前記分離膜モジュールへ送液する培養液送液ライン、前記分離膜モジュールのろ液を前記貯蔵槽へ送液するろ液配管、および前記分離膜モジュールの未ろ過液を前記培養槽へ還流する未ろ過液配管を配置させたうえで、WO2007/097260号に記載の方法によって前記培養槽での培養と培養液の連続膜ろ過をし、得られたろ過液を揮発性の化学品を含む溶液として前記貯蔵槽に貯蔵することにより実施することができる。膜利用培養法の場合、連続的に前記培養槽から前記貯蔵槽への前記培養液の送液が行われるため、前記培養槽内と前記貯蔵槽内の気相部分同士の通気配管による接続は、培養装置構成として恒久的な接続であることが好ましい。
前記分離膜は、培養液から微生物をろ別することができれば無機膜、有機膜のどちらも用いることができ、具体的には多孔質セラミック膜、多孔質ガラス膜、多孔質有機高分子膜、金属繊維編織体、不織布などを用いることができる。これらの中で特に多孔質有機高分子膜もしくはセラミック膜が好ましい。また、分離膜を2気圧の飽和水蒸気121℃で20分処理できれば、分離膜モジュールを滅菌することがきるため、分離膜は耐熱性を有していることが好ましい。さらに、分離膜の構成としては、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を機能層として含む分離膜であることが好ましい。
多孔質樹脂層を含む分離膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有していることが好ましい。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。また、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでもよい。
多孔質基材の好ましい平均厚みは、50μm〜3000μmである。多孔質基材は、有機材料および/または無機材料等からなり、これらの中でも有機繊維が好ましい。多孔質基材に用いられる好ましい有機繊維は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などであり、これらの織布や不織布が好ましく用いられる。特に密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましい。
多孔質樹脂層は、有機高分子膜を好ましくに使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が50重量%以上、好ましくは60重量%以上含有することをいう。有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。
本発明で使用される分離膜は、培養に使用される微生物が通過できない細孔径を有していればよいが、培養に使用される微生物の分泌物や発酵原料中の微粒子による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する範囲であることが望ましい。よって、多孔性分離膜の平均細孔径が、0.01μm〜5μmであることが好ましい。さらに好ましくは、分離膜の平均細孔径が、0.01μm〜1μmであると、微生物がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、透水性を長時間保持することができる。
また、分離膜の平均細孔径は、微生物の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止するため、微生物の大きさと比較して大きすぎないことが好ましい。微生物のうち、細胞の小さい細菌などを用いる場合には、平均細孔径として0.01μm以上0.4μm以下が好ましく、0.01μm以上0.2μm以下がより好ましい。
ここで、平均細孔径は、倍率10,000倍の走査型電子顕微鏡観察における、9.2μm×10.4μmの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。平均細孔径は、あるいは膜表面を、走査型電子顕微鏡を用いて倍率10,000倍で写真撮影し、10個以上、好ましくは20個以上の細孔を無作為に選び、それら細孔の直径を測定し、数平均して求めることもできる。細孔が円状でない場合、画像処理装置等によって、細孔が有する面積と等しい面積を有する円(等価円)を求め、等価円直径を細孔の直径とする方法により求められる。
本発明で用いられる分離膜の平均細孔径の標準偏差σは、0.1μm以下であることが好ましい。平均細孔径の標準偏差σは小さければ小さい方が望ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の9.2μm×10.4μmの範囲内で観察できる細孔数をNとして、測定した各々の直径をXkとし、細孔直径の平均をX(ave)とした下記の(式1)により算出される。
本発明で用いられる分離膜においては、培養液の透過性が重要な性能の一つである。分離膜の透過性の指標として、使用前の分離膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、分離膜の純水透過係数は、逆浸透膜による25℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ1mで透水量を測定し算出したとき、5.6×10−10m3/m2/s/pa以上であることが好ましく、純水透過係数が、5.6×10−10m3/m2/s/pa以上6×10−7m3/m2/s/pa以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。
本発明で用いられる分離膜において、表面粗さとは、表面に対して垂直方向の高さの平均値である。膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするための因子の一つである。分離膜の表面粗さは、特に制限はなく、膜に付着した微生物やその他の固形物が剥がれる範囲であればよいが、0.1μm以下であることが好ましい。表面粗さが0.1μm以下であると、膜に付着した微生物やその他の固形物が剥がれやすくなる。
さらに好ましくは、分離膜の膜表面粗さが0.1μm以下であり、平均細孔径が0.01〜1μmであり、分離膜の純水透過係数が2×10−9m3/m2/s/pa以上の分離膜を使用することにより、膜面洗浄に必要な動力を過度に必要としない運転が、より容易に可能であることがわかった。分離膜の表面粗さを、0.1μm以下とすることにより、微生物の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることができ、微生物の破壊が抑制され、分離膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が、より容易に可能になる。また、分離膜の表面粗さを、0.1μm以下とすることにより、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能であり、分離膜が目詰まりした場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好である。分離膜の目詰まりを抑えることにより、安定した連続発酵が可能になることから、分離膜の表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
ここで、分離膜の膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置(AFM)を使用して、以下の条件で測定した値である。
装置 原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments(株)製“Nanoscope(登録商標) IIIa”)
測定条件
探針 SiNカンチレバー(Digital Instruments(株)製)
走査モード コンタクトモード(気中測定)
水中タッピングモード(水中測定)
走査範囲 10μm、25μm四方(気中測定)
5μm、10μm四方(水中測定)
走査解像度 512×512。
装置 原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments(株)製“Nanoscope(登録商標) IIIa”)
測定条件
探針 SiNカンチレバー(Digital Instruments(株)製)
走査モード コンタクトモード(気中測定)
水中タッピングモード(水中測定)
走査範囲 10μm、25μm四方(気中測定)
5μm、10μm四方(水中測定)
走査解像度 512×512。
測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに15分浸漬後、RO水中に24時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。RO水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜(RO膜)を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。RO膜の孔の大きさは、概ね2nm以下である。
膜表面粗さdroughは、上記の原子間力顕微鏡装置(AFM)により各ポイントのZ軸方向の高さから、下記の(式2)により算出する。
本発明で用いられる分離膜の形状は特に限定されず、平膜や中空糸膜などを用いることができるが、好ましくは中空糸膜である。分離膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは200μm〜5000μmであり、膜厚は、好ましくは20〜2000μmである。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
なお、前述の分離膜は、例えばWO2007/097260に記載される製造方法により製造することができる。
前記分離膜でのろ過は膜間差圧によって制御される。ろ過時の膜間差圧は、培養液をろ過することができれば特に制限されることはないが、膜間差圧が高すぎると分離膜の構造が破壊されてしまい、膜間差圧が低すぎるとろ過が十分に行われないため、0.1kPa〜150kPaの範囲の膜間差圧が好ましく、さらに好ましくは0.1kPa〜50kPaの範囲であり、最も好ましくは0.1kPa〜20kPaの範囲である。
その他、本発明においては、培養方法に関わらず培養槽内よりも貯蔵槽内の温度を低く制御することが好ましい。培養槽内よりも貯蔵槽内の温度を低く制御すると、培養槽の気相中よりも貯蔵槽の気相中の揮発性の化学品の濃度が低くなるので、培養槽から貯蔵槽に向かって揮発性の化学品が通気配管を拡散によって移動する。したがって、揮発性の化学品を含む溶液を貯蔵する貯蔵槽の温度が低いほうが好ましい。本発明において、培養槽内の温度は、培養液の液温、貯蔵槽内の温度は、貯蔵槽内の液温を指す。
本発明の方法で製造される揮発性の化学品は、常温、常圧で蒸気圧を有するものであれば特に制限はないが、常温常圧で主に液体として存在する物質が好ましく、具体的には30℃で1kPa以上101kPa以下の蒸気圧を持つ物質が好ましい。30℃で1kPa以上101kPa以下の蒸気圧を持つ物質の具体例としては、エタノール、メタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−メチル−1−プロパノール、2−ブタノール、2−メチル−2−プロパノール、アセトン、酢酸などが挙げられる。
目的とする揮発性の化学品以外に、気体が発生する場合には、安全のためベントが含まれる培養槽で揮発性の化学品の製造を行うことが好ましい。特に二酸化炭素が発生する培養では、ベント孔に逆流コンデンサーを設置することで、二酸化炭素とともに目的とする化学品が培養槽外へ排出されてしまうことを抑制できる。
本発明で使用する微生物は、揮発性の化学品を製造する能力を有する微生物であれば特に制限はない。そのような微生物の好ましい具体例としては、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌などが挙げられる。自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
培養槽での培養方法が(1)回分培養法(Batch培養法)または流加培養法(Fed−Batch培養法)である場合の本発明の培養装置の一態様を図1に示す。図1の培養装置は、揮発性の化学品を製造する能力を有する微生物を培養する培養槽1と、培養後の培養液を貯蔵する貯蔵槽2、培養槽1から培養液を貯蔵槽2へ送液する送液ライン3、および培養槽内と貯蔵槽内の気相部分同士を接続する通気配管5を含む。
図1において、送液ライン3には、送液手段としてポンプ4が、培養槽1には上記の他に、原料供給ライン7、微生物供給ライン8などが含まれているが、これらの装置は必須ではなく、含まれていなくてもよい。培養槽1には、安全のためベント6が含まれることが好ましい。また、必須の装置ではないが、これらの装置に加えて、攪拌機や気体供給装置、pHセンサ、pH制御装置、温度調節機、液面レベルセンサーなどがさらに含まれていてもよい。
図1の培養装置において培養槽1内の培養液は発酵終了後に培養槽に保持されるか、送液ライン3を介して、貯蔵槽2に送液される。培養槽1と貯蔵槽2は、通気配管5で接続されているため、培養槽1と貯蔵槽2内の気体は、通気配管5を介して双方向に移動することが可能となる。
培養槽1から貯蔵槽2へ培養液が送液される際にも通気配管5を接続しておけば、培養槽1内の液面レベルが低下し、貯蔵槽2内の液面レベルが上昇する。貯蔵槽2内の液面レベルが上昇した際には、貯蔵槽2内の気体は通気配管5を通じて培養槽1側に移動する。つまり、通気配管5を設けることにより、培養槽1と貯蔵槽2から槽外への気体の流出や、槽外からの気体の流入を防ぐことができる。
培養槽での培養方法が(2)連続培養法のうち多段連続培養法である場合の本発明の培養装置の一態様を図2に示す。多段連続培養は、複数の培養槽が接続されている培養方式であり、培養槽は直列または並列に接続されている。図2は、培養槽が3段直列につながった例である。図2の培養装置は、揮発性の化学品を製造する能力を有する微生物の培養を行う培養槽1、1a、1b、各培養槽を接続する多段用送液ライン11、11a、培養槽1bから貯槽槽2へ培養液を送液する送液ライン3、培養後の培養液を貯蔵する貯蔵槽2、培養槽1内と貯蔵槽2内の気相部分同士を接続する通気配管5を含む。
培養槽1、1aの培養液は、多段用送液ライン11、11aによってそれぞれ培養槽1a、1bへ送液される。
図2には、送液ライン3および多段用送液ライン11、11aの送液手段としてポンプ4、4a、4bが含まれているが、これらは必須の装置ではなく、装置に含まれていなくてもよい。
各培養槽と貯蔵槽2間で培養液が送液される際にも通気配管5を接続しておけば、各培養槽内および貯蔵槽2内の液面レベルが上下するが、液面レベルの上下に伴って、培養槽1と貯蔵槽2内の気体が通気配管5を通じて移動することが可能となるため、多段連続培養の培養方式でも、通気配管を設けることにより、培養槽と貯蔵槽からの気体の流出や槽外からの気体の流入を防ぐことができる。
図2の培養槽1、1a、1bには、上記の他に原料供給ライン7、微生物供給ライン8、が含まれているが、これらは必須の装置ではなく含まれていなくてもよい。培養槽1、1a、1bには、安全のためベント6が含まれることが好ましい。また、必須の装置ではないが、これらの装置に加えて必要に応じてさらに攪拌機や気体供給装置、pHセンサ・制御装置、温度調節機、液面レベルセンサーなどが含まれていてもよい。
また、培養槽1内、1a内、1b内、貯蔵槽2内の気相部分同士を通気配管で接続してもよい。
培養槽での培養方法が、(2)連続培養法のうち分離膜モジュールを利用した連続培養の場合の本培養装置の一態様を図3に示す。分離膜モジュールを利用した連続培養は、揮発性の化合物を培養槽で培養し、得られた培養液を分離膜モジュールで微生物とろ液にろ過し、ろ液を貯蔵槽に回収するとともに、未ろ過液を保持または培養槽へ還流し、かつ培養槽へ発酵原料を追加する。
図3に示す培養装置は、揮発性の化学品を製造する能力を有する微生物の培養を行う培養槽1と培養液をろ過するための分離膜モジュール12で構成されている。培養槽1と分離膜モジュール12は培養液送液ライン15および未ろ過液配管13(循環ライン)で接続されている。分離膜モジュール12の二次側(ろ過側)と貯蔵槽2は、ろ液配管14によって接続されている。また、貯蔵槽2内と培養槽1内の気相部分同士を接続する通気配管5が接続されている。
培養槽1には、発酵原料を培養槽へ追加するための原料供給ライン7が接続されている。図3の培養槽1には、微生物供給ライン8が含まれているが、これらは必須の装置ではなく、含まれていなくてもよい。培養槽1には、安全のためベント6が含まれることが好ましい。また、必須の装置ではないが、これらの装置に加えて、攪拌機、気体供給装置、pHセンサ、pH制御装置、温度調節機、液面レベルセンサーなどが含まれていてもよい。
また、図3の培養液送液ライン15には培養液を送液するための、ポンプ4が含まれているが、これは必須の装置ではなく、含まれていなくてもよい。また、同じく必須の装置ではないが、必要に応じて未ろ過液配管13にもポンプが含まれていてもよい。二次側のろ液配管14にはろ過速度を調節するために、ポンプやコントロールバルブが含まれていてもよい。
分離膜モジュール12によって培養液からろ過されたろ液は、ろ液配管14を介して貯蔵槽2に送液される。ろ液は貯蔵槽2で一定時間貯蔵され、必要に応じて、蒸留などの後工程に送液される。
分離膜モジュール12は一次側に培養液送液ライン15と未ろ過液配管13、二次側にろ液配管14が接続できる構造であれば、その形状等は問わない。
図3に示す培養装置で連続培養を行う際に、培養槽1の培養液が送液ライン15を介して分離膜モジュール12へ送液されると、送液された培養液の液量分培養槽内の液面レベルが低下し、貯蔵槽2では、ろ液配管14から送液されたろ液の液量分の液面レベルが上昇する。貯蔵槽2で液面レベルが向上すると、貯蔵槽内の気体が通気配管5を介して、培養槽1へと移動する。培養槽1では、液面レベル低下した分気体を受け入れることができる。
また、培養槽1に発酵培地が追加などにより培養槽内の液面レベルが上昇した場合には、貯蔵槽から移動した気体を十分に受け入れる余地がなくなるが、その場合には、貯蔵槽のろ液を抜き取ることによって、培養槽1と貯蔵槽2の液面レベルを調整してもよい。貯蔵槽のろ液を採取する場合には、貯蔵槽下部から培養液を採取するなどして、培養液のみを採取すれば、揮発性の化学品の損失をさらに低減することができる。
以下、本発明について、実施例、比較例を挙げて詳細に説明する。全ての実施例および比較例において、培養装置の通気配管、ベント、逆流コンデンサーは、常時開として実験を行った。
(参考例1)エタノールの測定
エタノール濃度は、下記に示すガスクロマトグラフの条件で、標品との比較により測定した。
機器:SHIMADZU GAS CHROMATOGRAPH GC−2010(SHIMADZU)
カラム:TC−BOND Q 0.25mm*30ミリ
移動相:ヘリウム
検出方法:FID
流速:40cm/s
温度:250℃。
エタノール濃度は、下記に示すガスクロマトグラフの条件で、標品との比較により測定した。
機器:SHIMADZU GAS CHROMATOGRAPH GC−2010(SHIMADZU)
カラム:TC−BOND Q 0.25mm*30ミリ
移動相:ヘリウム
検出方法:FID
流速:40cm/s
温度:250℃。
(参考例2)糖の測定
糖の濃度は、下記に示すHPLC条件で、標品との比較により定量した。
機器:SHIMADZU HPLC システム(Shimadzu)
カラム:HILICpak VG−50 4E(Shodex)
移動相:アセトニトリル:水=3:1
検出方法:RI検出器
流速 移動相:0.6mL/min
温度:40℃。
糖の濃度は、下記に示すHPLC条件で、標品との比較により定量した。
機器:SHIMADZU HPLC システム(Shimadzu)
カラム:HILICpak VG−50 4E(Shodex)
移動相:アセトニトリル:水=3:1
検出方法:RI検出器
流速 移動相:0.6mL/min
温度:40℃。
(参考例3)廃糖蜜の調製
発酵原料には、廃糖蜜と水を1:3の重量比で混合し、発酵原料として用いた。廃糖蜜に含まれる糖を参考例2に示す方法により分析した結果を表1に示す。
発酵原料には、廃糖蜜と水を1:3の重量比で混合し、発酵原料として用いた。廃糖蜜に含まれる糖を参考例2に示す方法により分析した結果を表1に示す。
(実施例1)
図4に示す培養装置を用いて試験を行った。シゾサッカロマイセス・ポンベNBRC1628株を5mlのSD培地を投入した試験管に植菌し一晩振とう培養した(前々培養)。得られた培養液を、45mlの参考例3で調製した廃糖蜜を投入した三角フラスコに植菌し、30℃、120rpmで8時間振とう培養した(前培養)。前培養液50mLのうち35mLを分取して、700mLの参考例3で調製した廃糖蜜を投入した培養槽に植菌し、撹拌機によって300rpmで撹拌、無通気、無中和で1回目のエタノールの発酵を行った。なお、エタノール発酵の際には二酸化炭素が発生するため、培養槽1には逆流コンデンサー16を備え付けた。発酵の終了は、参考例2の方法によって、培地中に含まれていた糖がすべて消費されている事により判断した。培養液は培養槽1と通気配管5で接続された貯蔵槽2へ送液ライン3を介して送液して保持し、貯蔵槽には培養液が貯蔵されている状態とした。続いて2回目のエタノール発酵を行った。2回目のエタノール発酵は、1回目と同様の条件で行い、発酵終了後の培養液はそのまま培養槽に保持した。2回目のエタノール発酵開始した時点から320時間までの貯蔵槽中のエタノール濃度を参考例1の方法により、経時的に測定した。その結果を図10に示す。
図4に示す培養装置を用いて試験を行った。シゾサッカロマイセス・ポンベNBRC1628株を5mlのSD培地を投入した試験管に植菌し一晩振とう培養した(前々培養)。得られた培養液を、45mlの参考例3で調製した廃糖蜜を投入した三角フラスコに植菌し、30℃、120rpmで8時間振とう培養した(前培養)。前培養液50mLのうち35mLを分取して、700mLの参考例3で調製した廃糖蜜を投入した培養槽に植菌し、撹拌機によって300rpmで撹拌、無通気、無中和で1回目のエタノールの発酵を行った。なお、エタノール発酵の際には二酸化炭素が発生するため、培養槽1には逆流コンデンサー16を備え付けた。発酵の終了は、参考例2の方法によって、培地中に含まれていた糖がすべて消費されている事により判断した。培養液は培養槽1と通気配管5で接続された貯蔵槽2へ送液ライン3を介して送液して保持し、貯蔵槽には培養液が貯蔵されている状態とした。続いて2回目のエタノール発酵を行った。2回目のエタノール発酵は、1回目と同様の条件で行い、発酵終了後の培養液はそのまま培養槽に保持した。2回目のエタノール発酵開始した時点から320時間までの貯蔵槽中のエタノール濃度を参考例1の方法により、経時的に測定した。その結果を図10に示す。
(比較例1)
図5の装置を用いて試験を行った。図5の装置は、図4の装置の通気配管5を取り外し、貯蔵槽2にベント6を備えた。他の条件・操作は全て実施例1と同様に行った。その結果を図10に示す。比較例1では、時間の経過と共に貯蔵槽のエタノール濃度が低下した。
図5の装置を用いて試験を行った。図5の装置は、図4の装置の通気配管5を取り外し、貯蔵槽2にベント6を備えた。他の条件・操作は全て実施例1と同様に行った。その結果を図10に示す。比較例1では、時間の経過と共に貯蔵槽のエタノール濃度が低下した。
(比較例2)
図6の装置を用いて試験を行った。図6の装置は、図5の装置のうち貯蔵槽にベント6の代わりに逆流コンデンサーを備えている。他の条件・操作は全て実施例1と同様に行った。その結果を図10に示す。
図6の装置を用いて試験を行った。図6の装置は、図5の装置のうち貯蔵槽にベント6の代わりに逆流コンデンサーを備えている。他の条件・操作は全て実施例1と同様に行った。その結果を図10に示す。
比較例2では、貯蔵槽に逆流コンデンサーを設置したことによって、比較例1と比べて、貯蔵槽のエタノール濃度の低下は改善されたが、比較例1と同様に時間の経過と共に貯蔵槽のエタノール濃度が低下しており、実施例1の結果と比べると改善効果が低いことがわかった。
つまり、実施例1と比較例1、2の結果から、培養槽内と貯蔵槽内の気相部分同士を通気配管で接続することにより、揮発性の化学品の流出を防ぐことが可能となり、その流出抑制効果は、比較例2の逆流コンデンサーを利用する方法よりも高いことがわかった。
(実施例2)
図7に示す培養装置を用いて試験を行った。エタノール発酵の際に二酸化炭素が発生するため、培養槽1には逆流コンデンサー16を備え付けた。原料としては参考例3で調製した廃糖蜜を利用し、実施例1と同様に酵母を培養、植菌し、植菌後直ちに培養液循環ポンプを稼動させ、分離膜モジュールと培養槽間の液循環を24時間おこなった。その後、分離膜モジュールからろ液の抜き出しを開始した。ろ過開始後は、連続発酵装置の培養液量を700mLになるよう発酵原料添加制御を行いながら以下の連続発酵条件でエタノールの連続発酵を600時間行った。ろ液は培養槽1と通気配管5で接続された貯蔵槽2へ送液ライン15とろ液配管14を介して送液して保持した。連続培養が定常状態となる、植菌開始から200時間後以降の貯蔵槽中エタノール濃度変化を参考例1の方法により経時的に測定した。培養開始後200時間から600時間の間のエタノール濃度の平均値は64.1g/lであった。
図7に示す培養装置を用いて試験を行った。エタノール発酵の際に二酸化炭素が発生するため、培養槽1には逆流コンデンサー16を備え付けた。原料としては参考例3で調製した廃糖蜜を利用し、実施例1と同様に酵母を培養、植菌し、植菌後直ちに培養液循環ポンプを稼動させ、分離膜モジュールと培養槽間の液循環を24時間おこなった。その後、分離膜モジュールからろ液の抜き出しを開始した。ろ過開始後は、連続発酵装置の培養液量を700mLになるよう発酵原料添加制御を行いながら以下の連続発酵条件でエタノールの連続発酵を600時間行った。ろ液は培養槽1と通気配管5で接続された貯蔵槽2へ送液ライン15とろ液配管14を介して送液して保持した。連続培養が定常状態となる、植菌開始から200時間後以降の貯蔵槽中エタノール濃度変化を参考例1の方法により経時的に測定した。培養開始後200時間から600時間の間のエタノール濃度の平均値は64.1g/lであった。
[連続発酵条件]
上記連続発酵装置1を用いた連続発酵条件は、以下の通りとした。
発酵用微生物:シゾサッカロマイセス・ポンベNBRC1628株
発酵微生物植菌量:10v/v%(培養液体積[ml]/体積[ml])
発酵条件:
発酵反応槽容量:2(L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン製濾過膜
分離膜エレメント有効濾過面積:218(cm2)
温度調整:30(℃)
発酵反応槽通気量:無通気
発酵反応槽撹拌速度:300(rpm)
pH調整:無調整
濾過フラックス設定値(発酵原料速度も同じ):0.1(m3/m2/日)
滅菌:分離膜エレメントおよび発酵槽は121℃、20minのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
平均細孔径:0.1μm
平均細孔径の標準偏差:0.035μm
膜表面粗さ:0.06μm
純水透過係数:50×10−9m3/m2/s/pa。
上記連続発酵装置1を用いた連続発酵条件は、以下の通りとした。
発酵用微生物:シゾサッカロマイセス・ポンベNBRC1628株
発酵微生物植菌量:10v/v%(培養液体積[ml]/体積[ml])
発酵条件:
発酵反応槽容量:2(L)
使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン製濾過膜
分離膜エレメント有効濾過面積:218(cm2)
温度調整:30(℃)
発酵反応槽通気量:無通気
発酵反応槽撹拌速度:300(rpm)
pH調整:無調整
濾過フラックス設定値(発酵原料速度も同じ):0.1(m3/m2/日)
滅菌:分離膜エレメントおよび発酵槽は121℃、20minのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
平均細孔径:0.1μm
平均細孔径の標準偏差:0.035μm
膜表面粗さ:0.06μm
純水透過係数:50×10−9m3/m2/s/pa。
(比較例3)
図8の装置を用いて試験を行った。図8の装置では、図7の装置のうち通気配管5の代わりに貯蔵槽2にベント6を備えている。他の条件は全て実施例2と同様である。200時間から600時間の間のエタノール濃度の平均値は57.0g/lであった。
図8の装置を用いて試験を行った。図8の装置では、図7の装置のうち通気配管5の代わりに貯蔵槽2にベント6を備えている。他の条件は全て実施例2と同様である。200時間から600時間の間のエタノール濃度の平均値は57.0g/lであった。
(比較例4)
図9の装置を用いて試験を行った。図9の装置は、図8の装置のうち、図7の通気配管5の代わりに貯蔵槽2に逆流コンデンサー16を備えている。他の条件・操作は全て実施例2と同様に行った。200時間から600時間の間のエタノール濃度の平均値は60.7g/lであった。
図9の装置を用いて試験を行った。図9の装置は、図8の装置のうち、図7の通気配管5の代わりに貯蔵槽2に逆流コンデンサー16を備えている。他の条件・操作は全て実施例2と同様に行った。200時間から600時間の間のエタノール濃度の平均値は60.7g/lであった。
比較例4では、貯蔵槽に逆流コンデンサーを設置したことによって、比較例3と比べて、貯蔵槽のエタノール濃度の低下は改善されたが、実施例2の結果と比べるとエタノール濃度の平均値が低い結果となった。
つまり、実施例2と比較例3、4の結果から、培養槽内と貯蔵槽内の気相部分同士を通気配管で接続することにより、揮発性の化学品の流出を防ぐことが可能となり、その流出抑制効果は、比較例4の逆流コンデンサー利用する方法よりも高いことがわかった。
1、1a、1b 培養槽
2 貯蔵槽
3、3a、3b 送液ライン
4、4a、4b ポンプ
5 通気配管
6 ベント
7 原料供給ライン
8 微生物供給ライン
9 原料供給ライン用ポンプ
10 微生物供給ラインポンプ
11、11a 多段用送液ライン
12 分離膜モジュール
13 未ろ過液配管
14 ろ液配管
15 培養液送液ライン
16 逆流コンデンサー
2 貯蔵槽
3、3a、3b 送液ライン
4、4a、4b ポンプ
5 通気配管
6 ベント
7 原料供給ライン
8 微生物供給ライン
9 原料供給ライン用ポンプ
10 微生物供給ラインポンプ
11、11a 多段用送液ライン
12 分離膜モジュール
13 未ろ過液配管
14 ろ液配管
15 培養液送液ライン
16 逆流コンデンサー
Claims (9)
- 揮発性の化学品を製造する能力を有する微生物を培養する培養槽、前記微生物を培養して得られた化学品を含む溶液を貯蔵する貯蔵槽および前記培養槽で培養された培養液を前記貯蔵槽へ送液する送液ラインを含む培養装置を用いて、前記貯蔵槽に前記溶液を保持しながら前記培養槽にて前記微生物を培養する揮発性の化学品の製造方法であって、前記貯蔵槽内と前記培養槽内の気相部分同士が通気配管で接続されている方法。
- 前記送液ラインが、前記培養液中の微生物を分離する分離膜モジュール、前記培養液を前記分離膜モジュールへ送液する培養液送液ライン、前記分離膜モジュールのろ液を前記貯蔵槽へ送液するろ液配管、および前記分離膜モジュールの未ろ過液を前記培養槽へ還流する未ろ過液配管を含み、前記培養槽から前記貯蔵槽へ前記培養液を送液する際に、前記培養液を前記分離膜モジュールに通じて得たろ液を前記揮発性の化学品を含む溶液として前記貯蔵槽に送液し、かつ、前記培養液を前記分離膜モジュールに通じて得た未ろ過液を前記培養槽に還流する、請求項1に記載の揮発性の化学品の製造方法。
- 前記分離膜の平均細孔径が0.01μm以上5μm未満である、請求項2に記載の揮発性の化学品の製造方法。
- 前記分離膜の膜間差圧が0.1kPaから150kPaである、請求項2または3に記載の揮発性の化学品の製造方法。
- 前記培養槽内の液温>前記貯蔵槽内の液温である、請求項1から4のいずれか一項に記載の揮発性の化学品の製造方法。
- 前記揮発性の化学品の蒸気圧が30℃で1kPa以上101kPa以下である、請求項1から5のいずれか一項に記載の揮発性の化学品の製造方法。
- 前記揮発性の化学品が、エタノール、メタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−メチル−1−プロパノール、2−ブタノール、2−メチル−2−プロパノール、アセトン、または酢酸である、請求項1から6のいずれか一項に記載の揮発性の化学品の製造方法。
- 揮発性の化学品を製造する能力を有する微生物を培養する培養槽、前記微生物を培養して得られた化学品を含む溶液を貯蔵する貯蔵槽、前記培養槽で培養された培養液を前記貯蔵槽へ送液する送液ライン、および前記培養槽内と前記貯蔵槽内の気相部分同士を接続する通気配管を含む、揮発性の化学品の製造装置。
- 前記送液ラインが、前記培養液中の微生物を分離する分離膜モジュール、前記培養液を前記分離膜モジュールへ送液する培養液送液ライン、前記分離膜モジュールのろ液を、前記揮発性の化学品を含む溶液として前記貯蔵槽へ送液するろ液配管、および前記分離膜モジュールの未ろ過液を前記培養槽へ還流する未ろ過液配管を含む、請求項8に記載の揮発性の化学品の製造装置。
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