JP2008017837A - ピルビン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法によるピルビン酸の製造方法を提供すること。
【解決手段】発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物であるピルビン酸を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に保持または還流する連続発酵方法であって、分離膜として、高い透過性と高い細胞阻止率を持ち閉塞しにくい多孔性膜を用い、低い膜間差圧で濾過処理することにより、安定に低コストで、発酵によるピルビン酸の生産効率を著しく向上させることが可能とな製造方法である。
【選択図】 図１

Description

本発明は、微生物もしくは細胞の培養方法の改良に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、培養を行いながら、微生物または培養細胞の発酵培養液から、目詰まりが生じにくい多孔性分離膜を通して生産物を含む液を効率よく濾過・回収することおよび未濾過液を発酵培養液に戻すことにより発酵に関与する微生物濃度を向上させ、高い生産性を得ることを特徴とする連続発酵によるピルビン酸の製造方法に関するものである。

微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）バッチ発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh発酵法）と、（２）連続発酵法とに分類することができる。

上記（１）のバッチ発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点がある。しかしながら、時間経過と共に培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性および収率が低下してくる。そのため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持することが困難である。一方、上記（２）の連続発酵法は、発酵槽内で目的物質が高濃度に蓄積されることを回避することによって、長時間にわたって高収率でかつ高生産性を維持することができるという利点がある（非特許文献１参照。）。

次に、従来の発酵法によるピルビン酸の製造法について説明する。従来の発酵法によるピルビン酸の製造法としては、大腸菌等の細菌および酵母による発酵生産法について技術開示がなされているが、それらはいずれも回分式（バッチ式）の発酵生産に関わるもののみであり（特許文献１、特許文献２、非特許文献１および非特許文献２参照。）、連続発酵に関してはその前例は見あたらない。

すなわち、連続発酵法において、微生物や細胞を分離膜で濾過し、濾液から発酵生産物であるピルビン酸を回収すると同時に濾過された微生物や細胞を発酵培養液に還流させ、発酵培養液中の微生物や細胞濃度を向上させ、かつ、高く維持させることにより高い物質生産性を得ることは、依然として困難であり、技術の革新が望まれていた。
特開２０００−７８９９６号公報 特開平７-３０８７９５号公報 財団法人バイオインダストリー協会 発酵と代謝研究会編、「発酵ハンドブック」、３４８−３４９、共立出版（２００１） Y. Li et. al. Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー），５７，４５１−４５９（２００１）

そこで本発明における課題は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法によるピルビン酸の製造方法を提供することである。

本発明は、上記の課題を解決せんとするものであって、本発明のピルビン酸の製造方法は、ピルビン酸を製造する能力を有する微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その微生物もしくは培養細胞の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵によりピルビン酸を製造する方法であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲にして濾過処理することを特徴とするピルビン酸の製造方法である。

本発明のピルビン酸の製造方法の好ましい様態によれば、前記の多孔性膜の純水透過係数は２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上６×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以下である。

本発明のピルビン酸の製造方法の好ましい様態によれば、前記の多孔性膜の平均細孔径は０.０１μｍ以上０.２μｍ未満であり、かつ、その平均細孔径の標準偏差は０.１μｍ以下である。

本発明のピルビン酸の製造方法の好ましい様態によれば、前記の多孔性膜の膜表面粗さは０.１μｍ以下である。

本発明のピルビン酸の製造方法の好ましい様態によれば、前記の多孔性膜は多孔性樹脂層を含む多孔性膜である。

本発明のピルビン酸の製造方法の好ましい様態によれば、前記の多孔性膜の素材はポリフッ化ビニリデン系樹脂である。

本発明のピルビン酸の製造方法の好ましい様態によれば、前記のピルビン酸を製造する能力を有する微生物もしくは培養細胞の発酵原料は類を含むものである。

本発明のピルビン酸の製造方法の好ましい様態によれば、前記のピルビン酸を製造する能力を有する微生物もしくは培養細胞は真核細胞であり、その真核細胞は酵母であり、その酵母はトルロプシス・グラブラータである。

本発明によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して、濾液から発酵生産物であるピルビン酸を回収すると同時に、濾過された微生物や培養細胞を発酵培養液に還流させ、発酵培養液中の微生物や培養細胞の濃度を向上、かつ、高く維持させることにより高い物質生産性を維持させることができ、それにより、所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物であるピルビン酸を低コストで安定して生産することが可能となる。

本発明は、ピルビン酸を製造する能力を有する微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その微生物もしくは培養細胞の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵によりピルビン酸を製造する方法であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲にして濾過処理することを特徴とするピルビン酸の製造方法である。

本発明において分離膜として用いられる多孔性膜について説明する。まず、多孔性膜の構成について説明する。本発明で用いられる多孔性膜は、好ましくは、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものである。多孔性膜は、阻止性能および透水性能や分離性能、例えば、耐汚れ性の点から、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。

多孔質樹脂層を含む多孔性膜は、好ましくは、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。

本発明で用いられる多孔性膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。

多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。

多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維なる織布や不織布であり、より好ましくは、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が用いられる。

また、多孔質樹脂層には、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。

有機高分子膜の材質は、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。

ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられる。さらに、ポリフッ化ビニリデン系樹脂は、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。

本発明で使用される多孔性膜は、その平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であることが重要である。多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、発酵に使用される微生物もしくは培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ、濾過性能が長期間安定に継続する性能を有する。また、多孔性膜の平均細孔径が、０.０１μｍ以上１μｍ未満であると、微生物もしくは培養細胞がリークすることのない高い排除率と、高い透水性を両立させることができ、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。

多孔性膜の平均細孔径が、微生物もしくは培養細胞の大きさに近いと、これらが直接孔を塞いでしまう場合があるので、多孔性膜の平均細孔径は１μｍ未満である。多孔性膜の平均細孔径は、微生物もしくは培養細胞の漏出、すなわち排除率が低下する不具合の発生を防止するため、微生物もしくは培養細胞の大きさと比較して大きすぎないことが好ましい。微生物もしくは培養細胞のうち、細胞の小さい細菌などを用いる場合には、平均細孔径として０.４μｍ以下が好ましく、０.２μｍ未満であればより好適に実施することができる。

また、微生物もしくは培養細胞が目的とするピルピン酸以外の物質、例えば、タンパク質や多糖類など凝集しやすい物質を生産する場合があり、更に、発酵培養液中の微生物もしくは培養細胞の一部が死滅することにより細胞の破砕物が生成する場合があり、これらの物質による多孔性膜の閉塞を回避するために、平均細孔径は０．１μｍ以下であることが好適である。

一般的に、多孔性膜の平均細孔径は、０.４μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは０.２μｍ未満あるいは０．１μｍ以下である。

一方、平均細孔径が小さすぎると多孔性膜の透水性能が低下し、膜が汚れていなくても効率的な運転ができなくなるため、本発明における多孔性膜の平均細孔径は、０.０１μｍ以上である。多孔性膜の平均細孔径は、好ましくは０．０２μｍ以上であり、より好ましくは０．０４μｍ以上である。

ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。

本発明で用いられる多孔性膜の平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。平均細孔径の標準偏差σは小さければ小さい方が望ましい。平均細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。

本発明で用いられる多孔性膜においては、発酵培養液の透過性が重要な性能の一つである。多孔性膜の透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、多孔性膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、純水透過係数が、２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上６×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。

本発明で用いられる多孔性膜において、表面粗さとは、表面に対して垂直方向の高さの平均値である。膜表面粗さは、分離膜表面に付着した微生物もしくは培養細胞が、撹拌や循環ポンプによる液流による膜面洗浄効果で剥離しやすくするための因子の一つである。多孔性膜の表面粗さは、０.１μｍ以下であることが好ましい。表面粗さが０．１μｍ以下であると、膜に付着した微生物もしくは培養細胞が剥がれやすい。

さらに好ましくは、多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下であり、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満であり、多孔性膜の純水透過係数が２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上の多孔性膜を使用することにより、膜面洗浄に必要な動力を過度に必要としない運転が、より容易に可能であることがわかった。多孔性膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、微生物もしくは培養細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることができ、微生物の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が、より容易に可能になる。また、多孔性膜の表面粗さを、０.１μｍ以下とすることにより、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能であり、多孔性膜が目詰まりした場合でも高い膜間差圧で運転した場合に比べて、洗浄回復性が良好である。多孔性膜の目詰まりを抑えることにより、安定した連続発酵が可能になることから、多孔性膜の表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。

ここで、多孔性膜の膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定したものである。
・装置 原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件 探針 SiNカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
走査範囲 １０μｍ、２５μｍ四方（気中測定）
５μｍ、１０μｍ四方（水中測定）
走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製 測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。

膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）により各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出した。

本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは平膜である。多孔性膜の形状が平膜の場合、その平均厚みは用途に応じて選択される。多孔性膜の形状が平膜の場合の平均厚みは、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下である。

また、本発明で用いられる多孔性膜の形状は、好ましくは中空糸膜である。多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は、好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下であり、膜厚は、好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下である。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。

本発明で用いられる多孔性膜の作成法の概要を例示して説明する。

まず、多孔性膜のうち、平膜の作成法の概要について説明する。

多孔質基材の表面に、樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成すると共に、その原液を多孔質基材に含浸させる。その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。

原液は、樹脂を溶媒に溶解させて調整する。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。溶媒は、樹脂を溶解するものであり、樹脂に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促すものである。溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ − メチル− ２ − ピロリドン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、テトラメチル尿素、リン酸トリメチル、シクロヘキサノン、イソホロン、γ − ブチロラクトン、メチルイソアミルケトン、フタル酸ジメチル、プロピレングリコールメチルエーテール、プロピレンカーボネート、ジアセトンアルコール、グリセロールトリアセテート、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。なかでも、樹脂の溶解性の高いＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましく用いられる。これらの溶媒は、単独で用いても良いし２種類以上を混合して用いても良い。

また、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびグリセリンなどの溶媒以外の成分を溶媒に添加しても良い。溶媒に非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水や、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。なかでも、非溶媒として、価格の点から水やメタノールが好ましく用いられる。溶媒以外の成分および非溶媒は、混合物であってもよい。

原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。

次に、多孔性膜のうち、中空糸膜の作成法の概要について説明する。

中空糸膜は、樹脂と溶媒からなる原液を二重管式口金の外側の管から吐出すると共に、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。

原液は、上述の平膜の作成法で述べた樹脂を２０重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の平膜の生成法で述べた溶媒に溶解させることにより調整することができる。また、中空部形成用流体には、通常気体もしくは液体を用いることができる。また、得られた中空糸膜の外表面に、新たな多孔性樹脂層をコーティング（積層）することもできる。積層は中空糸膜の性質、例えば、親水・疎水性あるいは細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。積層される新たな多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させることによって作製することができる。その樹脂の材質は、例えば、上述有機高分子膜の材質と同様のものが好ましく用いられる。また、積層方法としては、原液に中空糸膜を浸漬してもよいし、中空糸膜の表面に原液を塗布してもよく、積層後、付着した原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることにより積層量を調整することもできる。

本発明で用いられる多孔性膜は、樹脂などの部材を用いて中空糸膜の中空部を接着・封止し、支持体に設置することによって分離膜エレメントとすることができる。すなわち、本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。支持体として支持板を用い、その支持板の少なくとも片面に、本発明で用いられる多孔性膜を配した分離膜エレメントは、本発明で用いられる多孔性膜を有する分離膜エレメントの好適な形態の一つである。透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも分離膜エレメントの好ましい態様である。

本発明のピルビン酸の製造方法においては、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理することが重要である。発酵培養液を濾過するために、２０ｋＰａより高い膜間差圧で濾過処理すると、圧力を加えるための動力が必要であり、ピルビン酸を製造するときの経済効果が低下する。また、２０ｋＰａより高い膜間差圧を加えることによって微生物もしくは培養細胞が破砕される場合があり、ピルビン酸を生産する能力が低下する。本発明のピルビン酸の製造方法は、濾過圧力である膜間差圧が０.１から２０ｋＰａの範囲であり、水頭差により膜間差圧を得られることから、特別に発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がなく、ピルビン酸を生産する能力が低下しない。また、特別に発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、多孔性膜を発酵反応槽内部に設置する様態も可能となり、発酵装置がコンパクト化できる利点も挙げられる。本発明のピルビン酸の製造方法では、膜間差圧を、好ましくは０.１から５ｋＰａの範囲で濾過処理する。

本発明で使用される発酵原料としては、培養する微生物もしくは培養細胞の生育を促し、目的とする発酵生産物であるピルビン酸を良好に生産させ得るものであればよいが、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が好適である。

炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類およびグリセリンなども使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。

本発明で使用されるピルビン酸を製造する能力を有する微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて使用することができる。本発明において、発酵培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言い、追加する発酵原料の組成は、ピルビン酸の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。

本発明では、発酵培養液中の糖類濃度は５ｇ／ｌ以下に保持されるようにすることが好ましい。その理由は、発酵培養液の濾過よる糖類の流失を最小限にするためである。微生物もしくは培養細胞の培養は、通常、ｐＨが４〜８で、温度が２０〜４０℃の範囲で行われる。発酵培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。

発酵培養液中への酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは発酵培養液を加圧し発酵培養液への酸素の溶解度を高めることにより、酸素の供給速度を上げることができる。また、攪拌速度を上げること、あるいは通気量を上げることにより、発酵培養液と通気した気泡の界面面積を上げ溶解速度を高めることにより、酸素の供給速度を上げることができる。

本発明においては、培養初期に回分培養または流加培養を行って、微生物もしくは培養細胞の濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の微生物もしくは培養細胞をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から原料培養液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。発酵原料液には、上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。発酵培養液中の微生物もしくは培養細胞の濃度は、発酵培養液の環境が微生物もしくは培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得る上で好ましく、一例として、乾燥重量を５ｇ／Ｌ以上に維持することにより良好な生産効率が得られる。

ピルビン酸の発酵生産能力のあるフレッシュな微生物もしくは培養細胞を増殖させつつ行う連続培養操作は、通常、単一の発酵反応槽で行うことが培養管理上好ましい態様である。しかしながら、微生物もしくは培養細胞を増殖しつつピルビン酸を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行ってもピルビン酸の高生産性は得られる。

本発明で使用されるピルビン酸の生産能力を有する微生物もしくは培養細胞としては、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物もしくは培養細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。

ピルビン酸の生産に用いることができる微生物もしくは培養細胞としては、シュードモナス属（Ｇｅｎｕｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリシア属（Ｇｅｎｕｓ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アシネトバクター属（Ｇｅｎｕｓ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌を好ましく用いることができる。さらに好ましくは、シュードモナス・フルオレエセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・アエロギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌を用いることができる。これらの細菌を、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変したものを用いてもよい。例えば、酸化的リン酸化によるＡＴＰ生産に直接関与するＡＴＰａｓｅ遺伝子を、変異または欠失させた細菌も好ましく用いられる。

また、ピルビン酸の生産に用いることができる微生物もしくは培養細胞としては、真核細胞を用いることができる。真核細胞としては、カビや酵母なども好ましく用いることができる。例えば、サッカロミセス属（Ｇｅｎｕｓ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トルロプシス属（Ｇｅｎｕｓ Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ）、カンジダ属（Ｇｅｎｕｓ Ｃａｎｄｉｄａ）およびシゾフィリウム属（Ｇｅｎｕｓ Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）に属するカビや酵母を用いて、ピルビン酸を製造することができる。さらに好ましくは、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・コプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｏｐｓｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、トルロプシス・グラブラータ（Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ）およびシゾフィリウム・コムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）などのカビや酵母を用いて、ピルビン酸を製造することができる。これらのうち、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、トルロプシス・グラブラータ（Ｔｏｌｕｒｏｐｕｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ）を好適に用いることができる。

本発明のピルビン酸の製造方法によって得られた濾過・分離発酵液に含まれるピルビン酸の精製は、陰イオン交換カラムを用いた方法により行うことができる。例えば、特開平６−３４５６８３号公報に示されている弱塩性イオン交換体を用いた精製法を好適に用いることができる。

次に、本発明で用いられる連続発酵装置の構成および特徴について説明する。本発明で用いられる連続発酵装置は、ピルビン酸の生産能力を有する微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵によるピルビン酸を製造するための装置である。

本発明で用いられる連続発酵装置は、ピルビン酸の生産能力を有する微生物もしくは培養細胞を発酵培養させるための発酵反応槽を有するものである。

本発明で用いられる連続発酵装置のひとつの形態は、発酵反応槽と、その発酵反応槽内部に配設され分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための分離膜エレメントと、その分離膜エレメントに接続され濾過された発酵生産物を排出するための手段と、該分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御するための手段とからなり、その該分離膜として平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜が用いられる。

本発明で用いられる連続発酵装置の別の形態は、発酵反応槽と、その発酵反応槽に発酵培養液循環手段を介して接続され内部に分離膜を備えた発酵培養液を濾過するための膜分離槽と、その分離膜の膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲に制御する手段とからなり、その分離膜として平均細孔径０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜が用いられる。

次に、本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる連続発酵装置について、図面を用いて説明する。

図１は、本発明で用いられる連続発酵装置の例を説明するための概要側面図である。本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる連続発酵装置のうち、分離膜エレメントが発酵反応槽の内部に設置された代表的な一例を図１の概要図に示す。

図１において、連続発酵装置は、内部に分離膜エレメント２を備えた発酵反応槽１と水頭差制御装置３で基本的に構成されている。発酵反応槽１内の分離膜エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜と分離膜エレメントとしては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することができる。分離膜エレメントに関しては、追って詳述する。

次に、図１の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。培地供給ポンプ７によって、培地を発酵反応槽１に連続的もしくは断続的に投入する。培地は、投入前に必要に応じて、加熱殺菌、加熱滅菌あるいはフィルターを用いた滅菌処理を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて、発酵反応槽１内の攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌することができる。発酵生産時には、必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を発酵反応槽１内に供給することができる。発酵生産時は、必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵反応槽１内の発酵液のｐＨを調整し、必要に応じて、温度調節器１０によって発酵反応槽１内の発酵培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。

ここでは、計装・制御装置による発酵培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やＯＲＰの制御、オンラインケミカルセンサーなどの分析装置により、発酵液中のピルビン酸の濃度を測定し、発酵培養液中のピルビン酸の濃度を指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入は、好ましくは、上記計装装置による発酵培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。

図１において、発酵培養液は、発酵反応槽１内に設置された分離膜エレメント２によって、微生物と発酵生産物が濾過・分離され、発酵生産物が装置系から取り出される。また、濾過・分離された微生物が装置系内に留まることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力を必要としない。また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度およびよび発酵反応槽１内の発酵培養液量を適当に調節することができる。上記の分離膜エレメントによる濾過・分離には、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。また、別の培養槽（図示せず）で連続発酵により微生物または培養細胞を培養し、それを必要に応じて発酵反応槽１内に供給することができる。別の培養槽で連続発酵により微生物または培養細胞を培養し、その培養液を必要に応じて発酵反応槽１内に供給することにより、常にフレッシュでピルビン酸の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。

図２は、本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる他の連続発酵装置の例を説明するための概要側面図である。図２は、分離膜エレメントが、発酵反応槽の外部に設置された連続発酵装置の代表的な例である。

図２において、連続発酵装置は、発酵反応槽１と、分離膜エレメント２を備えた膜分離層１２と、水頭差制御装置３とで基本的に構成されている。ここで、分離膜エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性と膜分離膜エレメントとしては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを使用することが好適である。また、膜分離槽１２は、発酵培養液循環ポンプ１１を介して発酵反応槽１に接続されている。

図２において、培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機５で発酵反応槽１内の発酵培養液を攪拌し、また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給された気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびよびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって発酵液のｐＨを調整し、また必要に応じて、温度調節器１０によって発酵液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。さらに、装置内の発酵培養液は、発酵培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環する。発酵生産物を含む発酵培養液は、分離膜エレメント２によって微生物と発酵生産物に濾過・分離され、発酵生産物を装置系から取り出すことができる。また、濾過・分離された微生物は、装置系内にとどまることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。

ここで、分離膜エレメント２による濾過・分離は、膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって行うことができ、特別な動力を必要としない。必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、分離膜エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の発酵培養液量を適当に調節することができる。必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を膜分離槽１２内に供給することができる。このとき、供給された気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で膜分離槽１２内に供給することができる。

分離膜エレメント２による濾過・分離は、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。また、別の培養槽（図示せず）で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、それを必要に応じて発酵反応槽内に供給することができる。別の培養槽で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、得られた培養液を必要に応じて発酵槽内に供給することにより、常にフレッシュでピルビン酸の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。

次に、本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる連続発酵装置で、好ましく用いられる分離膜エレメントについて説明する。

図３に示す分離膜エレメントについて説明する。図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントを例示説明するための概略斜視図である。本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、好ましくは、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および分離膜エレメントを用いることができる。分離膜エレメントは、図３に示されるように、剛性を有する支持板１３の両面に、流路材１４と前記の分離膜１５（多孔性膜）をこの順序で配し構成されている。支持板１３は、両面に凹部１６を有している。分離膜１５は、発酵培養液を濾過する。流路材１４は、分離膜１５で濾過された透過水を効率よく支持板１３に流すためのものである。支持板１３に流れた透過水は、支持板１３の凹部１６を通り、集水パイプ１７を介して連続発酵装置外部に取り出される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。

図４に示す分離膜エレメントについて説明する。図４は、本発明で用いられる別の分離膜エレメントを例示説明するための概略斜視図である。分離膜エレメントは、図４に示すように、中空糸膜（多孔性膜）で構成された分離膜束１８と上部樹脂封止層１９と下部樹脂封止層２０によって主に構成される。分離膜束１８は、上部樹脂封止層１９および下部樹脂封止層２０よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層２０による接着・固定化は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の中空部を封止しており、発酵培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１９は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の内孔を封止しておらず、集水パイプ２２に透過水が流れる構造となっている。この分離膜エレメントは、支持フレーム２１を介して連続発酵装置内に設置することが可能である。分離膜束１８によって濾過された透過水は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ２２を介して連続発酵装置外部に取り出される。透過水を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。

本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる連続発酵装置の分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。連続発酵装置内が滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避することができ、より安定した連続発酵が可能となる。分離膜エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である、１２１℃で１５分間に耐性であることが好ましい。分離膜エレメント部材は、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定できる。

本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、分離膜エレメントは、図１のように発酵反応槽内に設置しても良いし、図２のように発酵反応槽外に設置しても良い。分離膜エレメントを発酵反応槽外に設置する場合には、別途、膜分離槽を設けてその内部に分離膜エレメントを設置することができ、発酵反応槽と膜分離槽の間を発酵培養液を循環させながら、分離膜エレメントにより発酵培養液を連続的に濾過することができる。

本発明のピルビン酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能であることが望ましい。膜分離槽が高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌による汚染回避が容易である。

本発明のピルビン酸の製造方法に従って、ピルビン酸の連続発酵生産を行った場合、従来のバッチ発酵と比較して、高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における生産速度は、次の（式３）で計算される。
・発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×発酵培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ） ・・・・（式３）
また、バッチ培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の培養液量（Ｌ）で除して求められる。

以下、本発明のピルビン酸の製造方法をさらに具体的に説明するために、図１および図２の概要図に示す連続発酵装置を用いることによる連続的なピルビン酸の発酵生産について、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されない。また、下記に示すピルビン酸の製造に関する実施例においては、ピルビン酸を生産させる微生物として、酵母トルロプシス・グラブラータ（Torulopsis glabrata）のうち、トルロプシス・グラブラータＰ１２０−５ａ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６７４５）とＮＢＲＣ０００５株を用いた。

（参考例１）多孔性膜の作製（その１）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、下記組成を有する原液を得た。
［原液］
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％
次に、上記の原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ³で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに下記組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
［凝固浴］
・水 ：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水透過係数を評価したところ、５０×１０^-9ｍ³／ｍ²／ｓ／Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。

（参考例２）多孔性膜の作製（その２）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。

次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社、商品名イオネットＴ−２０Ｃ）を５重量％、および水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた本発明で用いる中空糸多孔性膜を製作した。得られた中空糸多孔性膜の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０５μｍであった。次に、上記の分離膜である中空糸多孔性膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０^-9ｍ³／ｍ²・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。

（実施例１）連続発酵によるピルビン酸の製造（その１）
微生物もしくは培養細胞としてＰ１２０−５ａ株を用い、発酵培地として表１に示す組成のピルビン酸発酵培地を用い、図１に示す連続発酵装置を用いて連続発酵試験を行った。図１の連続発酵装置は、本発明の一実施の形態を示す概要図であり、本発明で用いられる連続発酵装置はこの形態になんら限定されるものではない。また、上記のピルビン酸発酵培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には、参考例１で作成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。この実施例１における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：４Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを５．５に調整した。
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌した。
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御（０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。

また、ピルビン酸の濃度の評価には、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により測定した。
・カラム：Ｓｈｉｍ-Ｐａｃｋ ＳＰＲ-Ｈ（島津社製）
・移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・温度：４５℃。

また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。

まず、Ｐ１２０−５ａ株を、試験管で５ｍｌのピルビン酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なピルビン酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した連続発酵装置の１．５Ｌのピルビン酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、ピルビン酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるピルビン酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、膜間差圧として０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたピルビン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、そのピルビン酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたピルビン酸発酵生産性を、表２に示す。

（実施例２） 連続発酵によるピルビン酸の製造（その２）
微生物もしくは培養細胞としてＰ１２０−５ａ株を用い、表１に示す組成のピルビン酸発酵培地を用い、図２に示す連続発酵装置を用いて連続発酵試験を行った。図２の連続発酵装置は本発明の一実施の形態を示す概要図であり、本発明で用いられる連続発酵装置はこの形態になんら限定されるものではない。発酵培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には、参考例２で作成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。この実施例２における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：４０００平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：４Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを５．５に調整した。
・滅菌：分離膜エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌した。
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御（０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）。

ピルビン酸およびグルコース濃度は、実施例１と同様の方法を用いて評価した。まず、Ｐ１２０−５ａ株を、試験管で５ｍｌのピルビン酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮なピルビン酸発酵培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した連続発酵装置の１．５Ｌのピルビン酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、ピルビン酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の発酵液量を１．５Ｌとなるように膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるピルビン酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、膜間差圧として０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたピルビン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、そのピルビン酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたピルビン酸発酵生産性を、表２に示す。

（比較例１）バッチ発酵によるピルビン酸の製造（その１）
微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を、２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、そのピルビン酸生産性を評価した。発酵培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。この比較例１では、微生物としてＰ１２０−５ａ株を用い、生産物であるピルビン酸の濃度の評価には、実施例１に示したＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。比較例１の運転条件を、次に示す。
［運転条件］
・発酵反応槽容量（ピルビン酸発酵培地量）：１．５（Ｌ）
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：１．５（Ｌ／ｍｉｎ）
・発酵反応槽攪拌速度：６００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：４Ｎ ＮａＯＨによりｐＨを５．５に調整した。

まず、Ｐ１２０−５ａ株を、試験管で５ｍｌのピルビン酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮なピルビン酸発酵培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。前培養液をジャーファーメンターの１．５Ｌのピルビン酸発酵培地に植菌し、バッチ発酵を行った。バッチ発酵の結果を、実施例１と実施例２の連続発酵試験で得られたピルビン酸発酵生産性と比較して、表２に示す。

これら比較の結果、図１および図２に示す連続発酵装置を用いることにより、ピルビン酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。すなわち、本発明によって開示された多孔性膜を組み込んだ連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液からピルビン酸を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵によるピルビン酸の製造が可能であることが明らかとなった。

（実施例３）連続発酵によるピルビン酸の製造（その３）
微生物としてＮＢＲＣ０００５株を用い、実施例１と同じ培養培地、同じ条件および同じ評価法により、図１の連続発酵装置を用いて連続発酵試験を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、膜間差圧として０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたピルビン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、そのピルビン酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたピルビン酸発酵生産性を、表３に示す。

（実施例４） 連続発酵によるピルビン酸の製造（その４）
微生物としてＮＢＲＣ０００５株を用い、実施例２と同じ培養培地、同じ条件および同じ評価法により、図２の連続発酵装置を用いて連続発酵試験を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、膜間差圧として０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過発酵液中の生産されたピルビン酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、そのピルビン酸およびグルコース濃度から算出された投入グルコースから算出されたピルビン酸発酵生産性を、表３に示す。

（比較例２）バッチ発酵によるピルビン酸の製造（その２）
この比較例２では、微生物としてＮＢＲＣ０００５株を用い、その他条件はすべて比較例１に準じて行った。比較例２のバッチ発酵の結果を、実施例３および実施例４の連続発酵試験で得られたピルビン酸発酵生産性をと比較して、表３に示す。

これら比較の結果、図１および図２の連続発酵装置を用いることにより、ピルビン酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。すなわち、本発明によって開示された多孔性膜を組み込んだ連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、発酵培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液からピルビン酸を回収するとともに、未濾過液を発酵培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵によるピルビン酸の製造が可能であることが明らかとなった。

本発明のピルビン酸の製造方法は、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して、濾液から発酵生産物であるピルビン酸を回収すると同時に、濾過された微生物や培養細胞を発酵培養液に還流させ、発酵培養液中の微生物や培養細胞の濃度を向上、かつ、高く維持させることにより高い物質生産性を維持させることができる製造方法である。そのため、所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能であり、広く発酵工業において、発酵生産物であるピルビン酸を低コストで安定して生産することができる。

図１は、本発明で用いられる連続発酵装置の例を説明するための概略側面図である。 図２は、本発明で用いられる他の連続発酵装置の例を説明するための概略側面図である。 図３は、本発明で用いられる分離膜エレメントの例を説明するための概略斜視図である。 図４は、本発明で用いられる他の分離膜エレメントの例を説明するための断面説明図である。

符号の説明

１ 発酵反応槽
２ 分離膜エレメント
３ 水頭差制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 発酵培養液循環ポンプ
１２ 膜分離槽
１３ 支持板
１４ 流路材
１５ 分離膜
１６ 凹部
１７ 集水パイプ
１８ 分離膜束
１９ 上部樹脂封止層
２０ 下部樹脂封止層
２１ 支持フレーム
２２ 集水パイプ

Claims (10)

1. ピルビン酸を製造する能力を有する微生物もしくは培養細胞の発酵培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の発酵培養液に保持または還流し、かつ、その微生物もしくは培養細胞の発酵原料を前記の発酵培養液に追加する連続発酵によりピルビン酸を製造する方法であって、前記の分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の細孔を有する多孔性膜を用い、その膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲にして濾過処理することを特徴とするピルビン酸の製造方法。
2. 多孔性膜の純水透過係数が、２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上６×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以下である請求項１記載のピルビン酸の製造方法。
3. 多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上０.２μｍ未満であり、かつ、該平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下である請求項１または２記載のピルビン酸の製造方法。
4. 多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下である請求項１から３のいずれかに記載のピルビン酸の製造方法。
5. 多孔性膜が多孔性樹脂層を含む多孔性膜である請求項１から４のいずれかに記載のピルビン酸の製造方法。
6. 多孔性膜の素材がポリフッ化ビニリデン系樹脂である請求項１から５のいずれかに記載のピルビン酸の製造方法。
7. ピルビン酸を製造する能力を有する微生物もしくは培養細胞の発酵原料が糖類を含む請求項１から６のいずれかに記載のピルビン酸の製造方法。
8. ピルビン酸を製造する能力を有する微生物もしくは培養細胞が真核細胞であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載のピルビン酸の製造方法。
9. 真核細胞が酵母であることを特徴とする請求項８記載のピルビン酸の製造方法。
10. 酵母がトルロプシス・グラブラータであることを特徴とする請求項９記載のピルビン酸の製造方法。

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