JP5141126B2 - 連続発酵によるｄ−乳酸の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、培養を行いながら、微生物または培養細胞の培養液より、目詰まりが生じにくい分離膜である多孔性膜を通して生産物を含む液を効率よく濾過・回収すること、および未濾過液を培養液に戻すことで発酵に関与する微生物濃度を向上させることにより、高い生産性を得ることを特徴とする連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法に関するものである。

生分解性ポリマーであるポリ乳酸は、ＣＯ_２問題やエネルギー問題の顕在化と共にサスティナビリティー（持続可能性）およびライフサイクルアセスメント（ＬＣＡ）対応型製品として強い注目を浴びており、その原料である乳酸には効率的で安価な製造法が求められている。

現在主に生産されているポリ乳酸はＬ−乳酸ポリマーであるが、乳酸にはＬ−乳酸とＤ−乳酸の２種類の光学異性体があり、Ｄ−乳酸についてもポリマー原料、農薬および医薬の中間体として近年注目が集まりつつある。但し、いずれの用途においても、原料たるＬ−乳酸とＤ−乳酸には高い光学純度が要求されることは事実である。

自然界には乳酸菌などの乳酸を効率良く生産する細菌が存在し、それらを用いた乳酸製造法の中には既に実用化されているものもある。例えば、Ｌ−乳酸を効率良く生産させる細菌として、ラクトバシラス・デルブレッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉなどがあり、またＤ−乳酸を効率良く生産させる細菌として、バシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）の微生物などが知られている（特許文献１参照。）。

また、組み換え微生物では、ゲノム情報が豊富で、遺伝子組換え宿主としての実績が十分にある酵母や大腸菌でＤ−乳酸を生産させる試みがなされている。例えば、大腸菌を組換え宿主として、Ｄ−乳酸を生産させた試みが提案されている（特許文献２参照。）。また、既知のラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｍｕ）由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することにより酵母によってＤ−乳酸を生産させようとする試みも存在している（特許文献３参照。）。しかしながら、これらのＤ−乳酸の発酵法生産は、バッチ式培養に関わるもののみであり、いずれのＤ−乳酸の生産方法も生産速度が十分ではなく、更に効率的な生産方法が望まれていた。
特開２００３−０８８３９２号公報 特開２００５−１０２６２５号公報 特開２００２−１３６２９３号公報

そこで本発明の目的は、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する連続発酵法によるＤ−乳酸の製造方法を提供することにある。

本発明者らは、鋭意研究の結果、微生物や細胞の分離膜内への侵入が少なく、微生物や細胞を膜間差圧が低い条件で濾過した場合に、膜の目詰まりが著しく抑制されることを見出し、課題であった高濃度の微生物の濾過が長期間安定に維持できることを可能とし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、培養液を分離膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を培養液に保持または還流させる連続発酵方法によるＤ−乳酸の製造方法である。具体的に、本発明の連続発酵法によるＤ−乳酸の製造方法は、Ｄ−乳酸を生産する能力を有する微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加する連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法であって、該分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲として低い膜間差圧で濾過処理することにより、安定に低コストで、発酵生産効率を著しく向上させるＤ−乳酸の製造方法を提供するものである。

本発明の連続発酵法によるＤ−乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の純水透過係数は２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上６×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以下である。

本発明の連続発酵法によるＤ−乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の平均細孔径は０.０１μｍ以上０.２μｍ未満であり、かつ、該平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下であり、そして、その膜表面粗さは０.１μｍ以下である。

本発明の連続発酵法によるＤ−乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜は多孔性樹脂層を含む多孔性膜である。

本発明の連続発酵法によるＤ−乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の多孔性膜の膜素材にポリフッ化ビニリデン系樹脂を用いることである。

本発明の連続発酵法によるＤ−乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の微生物が、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属することであり、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物がバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）であることである。

本発明の連続発酵法によるＤ−乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の微生物が、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増強している微生物であることである。

本発明の連続発酵法によるＤ−乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記の微生物が、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ組換え微生物であることであり、その組換え微生物が真核細胞であり、そして、その真核細胞が酵母であることである。

本発明の連続発酵法によるＤ−乳酸の製造方法の好ましい態様によれば、前記のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）またはバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子であることである。

本発明によれば、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の発酵生産物の高生産性を維持する連続発酵が可能となり、広く発酵工業において、発酵生産物であるＤ−乳酸を低コストで安定に生産することが可能となる。本発明のＤ−乳酸の製造法により得られたＤ−乳酸は、例えば、合成繊維の原料として有用である。

本発明は、微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加する連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法であって、分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲として濾過処理することを特徴とする連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法である。

本発明で用いられる多孔性膜は、発酵に使用する微生物および培養細胞による目詰まりが起こりにくく、かつ濾過性能が長期間安定に継続するものであることが望ましい。

本発明で使用される多孔性膜は、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の分離膜である。後述するように、多孔性膜としては、多孔質基材の少なくとも一表面に多孔質樹脂層を有する構造のものが好ましく用いられる。多孔質樹脂層が多孔性分離膜の両面に存在する場合、少なくとも一方の多孔質樹脂層が、上記の平均細孔径の条件を満たしていればよい。平均細孔径がこの範囲内にあると、菌体や汚泥などがリークすることのない高い排除率と高い透水性を両立させることができ、さらに目詰まりしにくく、透水性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。平均細孔径が、この範囲内にあれば、動物細胞、酵母、糸状菌などを用いた場合、目詰まりが少なく、また、細胞の濾液への漏れもなく安定に連続発酵が実施可能である。また、動物細胞、酵母および糸状菌より小さな細菌類を用いた場合は、０.４μｍ以下の平均細孔であればよりよく、０.２μｍ未満の平均細孔であればなお好適に実施可能である。平均細孔径は、小さすぎると透水量が低下することがあるので、通常は０．０１μｍ以上であることが好ましく、より好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。

ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。平均細孔径の標準偏差σは、０．１μｍ以下であることが好ましい。細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋ、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）と算出した。

本発明で用いられる多孔性膜において、培養液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の多孔性膜の純水透過係数を用いることができる。多孔性膜の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましく、２×１０^−９以上６×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過水量が得られる。

本発明で用いられる多孔性膜の表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子であり、好ましくは、その表面粗さが０.１μｍ以下のときに分離膜の剥離係数や膜抵抗を低下させることができ、より低い膜間差圧で連続発酵が実施可能である。また、表面粗さが低いことで、微生物や培養細胞の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、微生物または培養細胞の破壊が抑制され、多孔性膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。

ここで、表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の条件で測定することができる。
・装置 原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件 探針 ＳｉＮカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
走査範囲 １０μm、２５μm 四方（気中測定）
５μm、１０μm 四方（水中測定）
走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製 測定に際し膜サンプルは常温でエタノールに１５分浸漬後ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後風乾し用いた。ＲＯ水とは、濾過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いて濾過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。

膜の表面粗さｄ_{ｒｏｕｇｈ}は、ＡＦＭにより各ポイントのＺ軸方向の高さから下記の（式２）から算出した。

本発明における多孔性膜は、被処理水の水質や用途に応じた分離性能と透水性能を有するものであり、阻止性能、透水性能や耐汚れ性という分離性能の点からは、多孔質樹脂層を含む多孔性膜であることが好ましい。すなわち、好ましい多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与える。

本発明で用いられる多孔性膜が、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を有している場合、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。

多孔質基材の材質としては、有機材料および無機材料等で特に限定されないが、有機繊維が望ましい。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布であり、なかでも、密度の制御が比較的容易であり、製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下である。

多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するもので、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜は、基本的に有機ポリマー材料から構成される分離膜のことであり、例えば、有機繊維の不織布やマクロポア構造多孔質有機基材と当該多孔質有機基材の孔径より小さな孔径を有する多孔質樹脂層が複合化された構造を持つ場合が多い。

多孔質樹脂層の材質としては、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂などが挙げられ、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物であってもよい。なかでも、溶液による製膜が容易で、物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂およびポリアクリロニトリル系樹脂が好ましく用いられる。特に、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とするものが最も好ましく用いられる。
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましく用いられるが、フッ化ビニリデンの単独重合体の他、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。このようなビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。

本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。

多孔性膜が平膜の場合、その厚みは用途に応じて選択されるが、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下の範囲であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。上述のように、多孔性膜は、多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されていても良い。多孔質基材の厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。

多孔性膜が中空糸膜の場合、内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編み物を含んでいても良い。

まず、多孔性膜のうち、平膜の作成法の概要について説明する。

多孔質基材の表面に、樹脂と溶媒とを含む原液の被膜を形成すると共に、その原液を多孔質基材に含浸させる。その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に、多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。

原液は、樹脂を溶媒に溶解させて調整する。原液の温度は、製膜性の観点から、通常、５〜１２０℃の範囲内で選定することが好ましい。溶媒は、樹脂を溶解するものであり、樹脂に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促すものである。溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ −メチル− ２− ピロリドン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、テトラメチル尿素、リン酸トリメチル、シクロヘキサノン、イソホロン、γ −ブチロラクトン、メチルイソアミルケトン、フタル酸ジメチル、プロピレングリコールメチルエーテール、プロピレンカーボネート、ジアセトンアルコール、グリセロールトリアセテート、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。なかでも、樹脂の溶解性の高いＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましく用いられる。これらの溶媒は、単独で用いても良いし２種類以上を混合して用いても良い。原液は、先述の樹脂を好ましくは５重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の溶媒に溶解させることにより調整することができる。

また、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびグリセリンなどの溶媒以外の成分を溶媒に添加しても良い。溶媒に非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水や、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。なかでも、非溶媒として、価格の点から水やメタノールが好ましく用いられる。溶媒以外の成分および非溶媒は、混合物であってもよい。

原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、平均細孔径の大きさを制御することができる。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。

次に、多孔性膜のうち、中空糸膜の作成法の概要の一例を例示して説明する。

中空糸膜は、樹脂と溶媒からなる原液を二重管式口金の外側の管から吐出すると共に、中空部形成用流体を二重管式口金の内側の管から吐出して、冷却浴中で冷却固化して作製することができる。

原液は、上述の平膜の作成法で述べた樹脂を好ましくは２０重量％以上６０重量％以下の濃度で、上述の平膜の生成法で述べた溶媒に溶解させることにより調整することができる。また、中空部形成用流体には、通常気体もしくは液体を用いることができる。また、得られた中空糸膜の外表面に、新たな多孔性樹脂層をコーティング（積層）することもできる。積層は中空糸膜の性質、例えば、親水性・疎水性あるいは細孔径等を所望の性質に変化させるために行うことができる。積層される新たな多孔性樹脂層は、樹脂を溶媒に溶解させた原液を、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させることによって作製することができる。その樹脂の材質は、例えば、上述有機高分子膜の材質と同様のものが好ましく用いられる。また、積層方法としては、原液に中空糸膜を浸漬してもよいし、中空糸膜の表面に原液を塗布してもよく、積層後、付着した原液の一部を掻き取ったり、エアナイフを用いて吹き飛ばしすることにより積層量を調整することもできる。

本発明で用いられる多孔性膜は、支持体と組み合わせることによって膜分離エレメントとして使用することができる。支持体として支持板を用い、該支持板の少なくとも片面に本発明で用いられる多孔性膜を配した多孔性膜を有する膜分離エレメントは、本発明で用いられる膜エレメントの好適な形態の一つである。この形態では、膜面積を大きくすることが困難なので、透水量を大きくするために、支持板の両面に多孔性膜を配することも好ましい態様である。

本発明において、微生物や細胞を濾過処理する際の膜間差圧は、微生物や細胞および培地成分が容易に目詰まりしない条件であればよいが、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲とすることが重要である。濾過の駆動力としては、培養液と多孔性膜処理水の液位差（水頭差）を利用したサイホンにより多孔性膜に膜間差圧を発生させることが可能であり、また、濾過の駆動力として多孔性膜処理水側に吸引ポンプを設置してもよいし、多孔性膜の培養液側に加圧ポンプを設置することも可能である。膜間差圧は培養液と多孔性膜処理水の液位差を変化させることで制御することができる、また、ポンプを使用する場合には吸引圧力により制御することができ、更に培養液側の圧力を導入する気体または液体の圧力によって制御することができる。これら圧力制御を行う場合には培養液側の圧力と多孔性膜処理水側の圧力差をもって膜間差圧とし、膜間差圧の制御に用いることができる。

また、本発明において使用される多孔性膜は、濾過処理する膜間差圧０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲で濾過処理することができるものであることが好ましい。また、使用前の純水透過係数が、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上の範囲であることが好ましく、さらに２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上６×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以下の範囲にあることが好ましい。

本発明で使用される発酵原料としては、培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物であるＤ−乳酸を良好に生産させ得るものであればよいが、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が好ましく用いられる。

上記の炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースやラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類およびグリセリンなども使用される。ここで糖分とは、多価アルコールの最初の酸化生成物であり、アルデヒド基またはケトン基をひとつ持ち、アルデヒド基を持つ糖をアルドース、ケトン基を持つ糖をケトースと分類される炭水化物のことを指す。

また上記の窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類および各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。

また上記の無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。

本発明で使用される微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合にはその栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤も必要に応じて使用することができる。

本発明において、培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言い、追加する発酵原料の組成は、目的とするＤ−乳酸の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。

本発明では、培養液中の糖類濃度は５ｇ／Ｌ以下に保持されるようにすることが好ましい。その理由は、培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。微生物の培養は、通常、ｐＨ４〜８、温度２０〜４０℃の範囲で行われることが多い。培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節される。微生物または培養細胞の培養において、酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、培養を加圧する、攪拌速度を上げる、あるいは通気量を上げるなどの手段を用いることができる。逆に、酸素の供給速度を下げる必要あれば、炭酸ガス、窒素およびアルゴンなど酸素を含まないガスを空気に混合して供給することも可能である。

本発明においては、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物濃度を高くした後に連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から原料培養液の供給および培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は、必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。原料培養液には、上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましく、一例として、乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。また、連続発酵装置の運転上の不具合、生産効率の低下を招かなければ、微生物の濃度の上限値は限定されない。

発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、培養管理上、通常、単一の発酵反応槽で行うことが好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵反応槽の数は問わない。発酵反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵反応槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。

本発明で使用される微生物や培養細胞は、Ｄ−乳酸を生産することが可能な微生物や培養細胞であり、例えば、野生型株では、Ｄ−乳酸を合成する能力を有するラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する微生物が挙げられる。

本発明では、これら野生型株のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｄ−ＬＤＨともいうことがある。）の酵素活性を増強していることが好ましい。酵素活性を増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。更に好ましくは、微生物がＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組み込むことによりＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増強した組換え微生物が挙げられる。

本発明では、組換え微生物の宿主としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、特に好ましくは酵母である。

本発明では、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）またはバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子であることが好ましく、更に好ましくはバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子である。

本発明の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法により製造された濾過・分離発酵液に含まれるＤ−乳酸の分離・精製は、従来知られている濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。

Ｄ−乳酸の分離・精製方法としては、例えば、濾過・分離発酵液のｐＨを１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着洗浄した後に溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとし蒸留する方法、およびカルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などが挙げられる。好ましくは、濾過・分離発酵液の水分を蒸発させた濃縮Ｄ−乳酸溶液を蒸留操作にかけることができる。ここで、蒸留する際には、蒸留原液の水分濃度が一定になるように水分を供給しながら蒸留することが好ましい。Ｄ−乳酸水溶液の留出後は、水分を加熱蒸発することにより濃縮し、目的とする濃度の精製Ｄ−乳酸を得ることができる。留出液として低沸点成分（エタノール、酢酸等）を含むＤ−乳酸水溶液を得た場合は、低沸点成分をＤ−乳酸濃縮過程で除去することが好ましい態様である。蒸留操作後、留出液について必要に応じて、イオン交換樹脂、活性炭およびクロマト分離等による不純物除去を行い、さらに高純度のＤ−乳酸を得ることもできる。

本発明の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法で用いられる連続発酵装置１つの例は、主に、微生物もしくは培養細胞を保持しＤ−乳酸を製造するための発酵反応槽、および微生物もしくは培養細胞と培養液を濾過分離するための多孔性膜を含む膜分離エレメントから構成される。膜分離エレメントは、発酵反応槽の内部または外部のいずれに設置されてもよい。

本発明の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法は、平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を使用し、濾過圧力である膜間差圧が０.１から２０ｋＰａの範囲で濾過処理することを特徴としている。そのため、特別に発酵反応槽内を加圧状態に保つ必要がないことから、濾過分離装置と発酵反応槽間で培養液を循環させる動力手段が不要となり、膜分離エレメントを発酵反応槽内部に設置して発酵装置をコンパクト化することが可能である。

本発明の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法で用いられる連続発酵装置のうち、膜分離エレメントが発酵反応槽の内部に設置された代表的な一例を図１の概要図に示す。

図１は、本発明の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法で用いられる連続発酵装置の一つの実施の形態を示す概略側面図である。図１において、連続発酵装置は、内部に膜分離エレメント２を備えた発酵反応槽１と水頭差制御装置３で基本的に構成されている。発酵反応槽１内の膜分離エレメント２には多孔性膜が組み込まれている。この多孔性膜としては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている膜、および膜エレメントを使用することができる。膜分離エレメントについては、追って詳述する。

次に、図１の連続発酵装置による連続発酵の形態について説明する。図１において、培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１に連続的もしくは断続的に投入する。培地は投入前に必要に応じて加熱殺菌、あるいは加熱滅菌、あるいはフィルターを用いた滅菌を行うことができる。発酵生産時には、必要に応じて攪拌機５で発酵反応槽１内の培養液を攪拌し、また必要に応じて気体供給装置４によって必要とする気体を供給し、また必要に応じてｐＨセンサ・制御装置９、およびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって培養液のｐＨを調整し、また必要に応じて温度調節器１０によって培養液の温度を調節することにより生産性の高い発酵生産を行うことができる。ここでは、計装・制御装置による培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度を例示したが、必要に応じて溶存酸素やＯＲＰの制御、更にはオンラインケミカルセンサーなどの分析装置により培養液中のＤ−乳酸の濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、上記計装装置による培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。

培養液は、発酵反応槽１内に設置された膜分離エレメント２によって微生物もしくは培養細胞と発酵生産物に濾過・分離され、発酵生産物は装置系から取り出される。また、濾過・分離された微生物もしくは培養細胞は装置系内にとどまることにより装置系内の微生物もしくは培養細胞濃度を高く維持でき、生産性の高い発酵生産を可能としている。ここで、膜分離エレメント２による濾過・分離には、発酵反応槽１の水面との水頭差圧によって行い、特別な動力は必要ない。また、必要に応じてレベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、膜分離エレメント２の濾過・分離速度、及び発酵反応槽内の培養液量を適当に調節することができる。上記の膜分離エレメントによる濾過・分離には水頭差圧によって行うことを例示したが、必要に応じてポンプ等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。

図２は、本発明のＤ−乳酸の製造方法で用いられる他の連続発酵装置の例を説明するための概略側面図である。図２は、膜分離エレメントが、発酵反応槽の外部に設置された連続発酵装置の代表的な例である。

図２において、連続発酵装置は、発酵反応槽１と、膜分離エレメント２を備えた膜分離槽１２と、水頭差制御装置３とで基本的に構成されている。ここで、膜分離エレメント２には、多孔性膜が組み込まれている。この多孔性を備えた膜分離エレメントとしては、例えば、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および膜分離エレメントを使用することが好適である。また、膜分離槽１２は、培養液循環ポンプ１１を介して発酵反応槽１に接続されている。

図２において、培地供給ポンプ７によって培地を発酵反応槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機５で発酵反応槽１内の培養液を攪拌し、また必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を供給することができる。このとき、供給された気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で供給することができる。また必要に応じて、ｐＨセンサ・制御装置９およびよびｐＨ調整溶液供給ポンプ８によって培養液のｐＨを調整し、また必要に応じて、温度調節器１０によって培養液の温度を調節することにより、生産性の高い発酵生産を行うことができる。さらに、装置内の培養液は、培養液循環ポンプ１１によって発酵反応槽１と膜分離槽１２の間を循環する。発酵生産物を含む培養液は、膜分離エレメント２によって微生物と発酵生産物に濾過・分離され、発酵生産物を装置系から取り出すことができる。また、濾過・分離された微生物は、装置系内にとどまることにより装置系内の微生物濃度を高く維持することができ、生産性の高い発酵生産を可能としている。

ここで、膜分離エレメント２による濾過・分離は、膜分離槽１２の水面との水頭差圧によって行うことができ、特別な動力を必要としない。必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置３によって、膜分離エレメント２の濾過・分離速度および装置系内の培養液量を適当に調節することができる。必要に応じて、気体供給装置４によって必要とする気体を膜分離槽１２内に供給することができる。このとき、供給された気体を回収リサイクルして再び気体供給装置４で膜分離槽１２内に供給することができる。

膜分離エレメント２による濾過・分離は、必要に応じて、ポンプ等による吸引濾過あるいは装置系内を加圧することにより、濾過・分離することもできる。また、別の培養槽（図示せず）で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、それを必要に応じて発酵反応槽内に供給することができる。別の培養槽で連続発酵に微生物または培養細胞を培養し、得られた培養液を必要に応じて発酵槽内に供給することにより、常にフレッシュでＤ−乳酸の生産能力の高い微生物または培養細胞による連続発酵が可能となり、高い生産性能を長期間維持した連続発酵が可能となる。

次に、本発明のＤ−乳酸の製造方法で用いられる連続発酵装置で、好ましく用いられる膜分離エレメントについて説明する。

図３に示す膜分離エレメントについて説明する。図３は、本発明で用いられる膜分離エレメントを例示説明するための概略斜視図である。本発明のＤ−乳酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、好ましくは、国際公開第２００２／０６４２４０号パンフレットに開示されている分離膜および膜分離エレメントを用いることができる。膜分離エレメントは、図３に示されるように、剛性を有する支持板１３の両面に、流路材１４と前記の分離膜１５（多孔性膜）をこの順序で配し構成されている。支持板１３は、両面に凹部１６を有している。分離膜１５は、培養液を濾過する。流路材１４は、分離膜１５で濾過された濾液を効率よく支持板１３に流すためのものである。支持板１３に流れた濾液は、支持板１３の凹部１６を通り、集水パイプ１７を介して連続発酵装置外部に取り出される。濾液を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。

図４に示す膜分離エレメントについて説明する。図４は、本発明で用いられる別の膜分離エレメントを例示説明するための概略斜視図である。膜分離エレメントは、図４に示すように、中空糸膜（多孔性膜）で構成された分離膜束１８と上部樹脂封止層１９と下部樹脂封止層２０によって主に構成される。分離膜束１８は、上部樹脂封止層１９および下部樹脂封止層２０よって束状に接着・固定化されている。下部樹脂封止層２０による接着・固定化は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の中空部を封止しており、培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１９は、分離膜束１８の中空糸膜（多孔性膜）の内孔を封止しておらず、集水パイプ２２に濾液が流れる構造となっている。この膜分離エレメントは、支持フレーム２１を介して連続発酵装置内に設置することが可能である。分離膜束１８によって濾過された濾液は、中空糸膜の中空部を通り、集水パイプ２２を介して連続発酵装置外部に取り出される。濾液を取り出すための動力として、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。

本発明のＤ−乳酸の製造方法で用いられる連続発酵装置の膜分離エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作に耐性の部材であることが好ましい。連続発酵装置内が滅菌可能であれば、連続発酵時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避することができ、より安定した連続発酵が可能となる。膜分離エレメントを構成する部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である、１２１℃で１５分間に耐性であることが好ましい。膜分離エレメント部材は、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、ポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等の樹脂を好ましく選定することができる。

本発明のＤ−乳酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離エレメントは、図１のように発酵反応槽内に設置しても良いし、図２のように発酵反応槽外に設置しても良い。膜分離エレメントを発酵反応槽外に設置する場合には、別途、膜分離槽を設けてその内部に膜分離エレメントを設置することができ、発酵反応槽と膜分離槽の間を培養液を循環させながら、膜分離エレメントにより培養液を連続的に濾過することができる。

本発明のＤ−乳酸の製造方法で用いられる連続発酵装置では、膜分離槽は、高圧蒸気滅菌可能であることが望ましい。膜分離槽が高圧蒸気滅菌可能であると、雑菌による汚染回避が容易である。

本発明の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法に従って、連続発酵を行った場合、従来のバッチ発酵と比較して高い体積生産速度が得られ、極めて効率のよい発酵生産が可能となる。ここで、連続培養における生産速度は、次の（式３）で計算される。
・発酵生産速度（ｇ／Ｌ／ｈｒ）＝抜き取り液中の生産物濃度（ｇ／Ｌ）×培養液抜き取り速度（Ｌ／ｈｒ）÷装置の運転液量（Ｌ）・・・（式３）
また、バッチ培養での発酵生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の培養液量（Ｌ）で除して求められる。

本発明の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法によって得られたＤ−乳酸は、ポリエステル樹脂の原料に用いられ、それらポリエステル樹脂は、射出成形、押出成形、ブロー成形、真空成形、溶融紡糸およびフィルム成形などの任意の成形方法により、所望の形状に成形することができ、機械部品などの樹脂成形品、衣料・産業資材などの繊維、および包装・磁気記録などのフィルムとして使用することができる。

以下、本発明のＤ−乳酸の製造方法をさらに具体的に説明するために、図１および図２の概要図に示す連続発酵装置を用いることによる連続的なＤ−乳酸の発酵生産について、実施例を挙げて説明する。

Ｄ−乳酸濃度のＨＰＬＣによる分析方法は次のとおりである。
[Ｄ−乳酸濃度のＨＰＬＣによる分析方法]
培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定した。
・カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（島津社製）
・ 移動相：５っＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・温度：４５℃。

また、Ｄ−乳酸の光学純度測定は、下記の条件でＨＰＬＣ法により測定した。

カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｅｎａｎｔｉｏ Ｌ１（東ソー社製）
・移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
・温度 ：３０℃
また、Ｄ−乳酸の光学純度は、次式で計算される。
・光学純度（％）＝１００×（Ｄ−Ｌ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度であり、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。

（参考例１）多孔性膜の作製（その１）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、下記組成を有する原液を得た。
［原液］
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％
次に、上記の原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ³で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに下記組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔性膜を得た。
［凝固浴］
・水 ：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％
この多孔性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記分離膜について純水透水透過係数を評価したところ、５０×１０^-9ｍ³／ｍ²／ｓ／Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。

（参考例２）多孔性膜の作製（その２）
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。

次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社製、商品名“イオネットＴ−２０Ｃ”（登録商標））を５重量％、および水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた本発明で用いる中空糸膜（多孔性膜）を製作した。得られた中空糸膜（分離膜）の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０５μｍであった。次に、上記の分離膜である中空糸膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０^-9ｍ³／ｍ²・ｓ・Ｐａであった。透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、平均細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。

（参考例３）バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡの調製
バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３を、ＧＹＰ培地（特開２００３−０８８３９２号公報に記載のＧＹＰ培地）１００ｍｌに接種し、温度３０℃の温度で２４時間培養して培養物を得た。得られた培養物を３０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離処理し湿潤菌体０．５ｇを得た後、該湿潤菌体から、斎藤、三浦の方法（Biochem．Biophys．Acta.，72，619（1963））により染色体ＤＮＡを得た。次いで、この染色体ＤＮＡ６０μｇおよび制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ、３ユニットを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄および１ｍＭ ジチオスレイトール含有（ｐＨ ７．４））に各々混合し、温度３７℃で３０分間反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈澱処理してＳａｕ３ＡＩで消化されたバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡ断片５０μｇを得た。

（参考例４）プラスミドベクターＤＮＡを利用したバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の遺伝子ライブラリーの作製
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で自律複製可能なプラスミドベクタ−ＤＮＡ（ｐＵＣ１９）２０μｇおよび制限酵素ＢａｍＨＩ２００ユニットを、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ硫酸マグネシウム含有（ｐＨ７．４））に混合し、温度３７℃で２時間反応させて消化液を得、該消化液を常法によりフェノール抽出し、更にエタノール沈澱処理を行った。

その後、プラスミドベクター由来のＤＮＡフラグメントが再結合することを防止するため、バクテリアルアルカリホスファターゼ処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理を行った。

このＢａｍＨＩで消化されたｐＵＣ１９を１μｇ、参考例３で得られたＳａｕ３ＡＩで消化されたバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３の染色体ＤＮＡ断片１μｇ、および２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）を、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトールおよび１０ｍＭ ＡＴＰを含有する６６ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で１６時間反応させ、ＤＮＡを連結させた。次いで、得られたＤＮＡ混合物で、常法によりエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９を形質転換し、これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ寒天培地上にまき、約２０，０００個のコロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。約２０，０００個のコロニーより、組換えＤＮＡの回収を行なった。回収の方法は、上記に示した斎藤、三浦の方法に従った。

（参考例５）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング用宿主の作製
バシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３株のＤ−ＬＤＨ遺伝子のスクリーニングを、機能相補によって行った。その原理の詳細は、「（DOMINIQUE, G., Appl Environ Microbiol, United States (1995) 61 266-272）」に記載されている。すなわち、エッシェリシア・コリのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ酵素活性およびピルビン酸ギ酸リアーゼ酵素活性を欠失した株を作製する必要がある。キリルらの方法（Kirill, A., PNAS, United States (2000) 97 6640-6645）によって、エッシェリシア・コリのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）およびピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子（ｐｆｌＢおよびｐｆｌＤ）を破壊欠失した株を作製した。このようにして作製した株を、エシェリヒア・コリ ＴＭ３３株（Ｅ．ｃｏｌｉ ΔｌｄｈＡ ΔｐｆｌＢ：：Ｋｍ^ｒ ΔｐｆｌＤ：：Ｃｍ^ｒ）と命名し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング用宿主とした。

（参考例６）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング
エシェリヒア・コリ ＴＭ３３株を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン硫酸塩および１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、温度３７℃で２４時間培養し、培養物を得た。このようにして得られた培養物を、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離処理し、湿潤菌体０．８ｇを得た。得られた湿潤菌体を１０％グリセロール溶液１０ｍｌで３度洗浄した後、１０％グリセロール溶液０．１ｍｌにけん濁しコンピテントセルとした。このコンピテントセルに、参考例４で得られたバシラス・ラエボラクティカス ＪＣＭ２５１３株の遺伝子ライブラリーを１μｌ加え、電気穿孔法の常法に従い導入した株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＭ９ＧＰ寒天培地（Ｍ９培地＋０．４％グルコース＋０．２％ペプトン）上にまき、嫌気条件下で生育可能であった株を数株得た。

（参考例７）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡの塩基配列の解析
上記で得られた組換えＤＮＡを含有するエシェリヒア・コリ ＴＭ３３／ｐＢＬ２から、常法に従いプラスミドを調製し、得られた組換えＤＮＡを用い塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社製）を用いＳａｎｇｅｒの方法に従って行った。得られたＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列は、２，９９５塩基対あった。この配列についてGenetyx（ソフトウェア開発株式会社製）を用いてオープン・リーディング・フレーム検索を行い、１，０１１塩基対のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）を仮決定した。

（参考例８）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターの作製
バシラス・ラエボラクティカスから、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子をクローニングした。Ｄ−ＬＤＨ遺伝子は、全てＰＣＲ法によりクローニングを行い、同様の方法で発現ベクターに導入している。クローニング方法を以下に示す。

バシラス・ラエボラクティカスを培養し遠心回収後、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO社製）を用いてゲノムＤＮＡの抽出を行った。詳細な操作方法は、付属のプロトコールに従った。得られたゲノムＤＮＡを続くＰＣＲの鋳型とした。上記で得られたＤＮＡを鋳型として、それぞれＰＣＲによりＤ−ＬＤＨ遺伝子のクローニングを行った。ＰＣＲ増幅反応には、Ｔａｑの５０倍の正確性を持つとされるＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いた。反応バッファーおよびｄＮＴＰｍｉｘなどは、付属のものを使用した。Ｄ−ＬＤＨ遺伝子増幅用プライマー（配列番号２、３）は、５末端側にはＸｈｏＩ認識配列、３末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。

各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（ＴＡＫＡＲＡ社社製）を用いて行った。エシェリヒア・コリ ＤＨ５αに形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子がサブクローニングされたプラスミドが得られた。この各Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで切断し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図５）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に導入した。このようにして作製したＤ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクターをｐＴＭ６３と示す。

（参考例９）Ｄ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクターの酵母への導入
参考例８のようにして得られたｐＴＭ６３を酵母サッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換した。形質転換は、YEASTMAKER Yeast Transformation System（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするサッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株はウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＭ６３の持つＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＭ６３の導入された形質転換体の選択が可能である。

このようにして得られた形質転換体へのＤ−ＬＤＨ遺伝子発現ベクター導入の確認は、ウラシル非添加の液体培地で培養した形質転換株から、ゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（ＴＡＫＡＲＡ社製）によりプラスミドＤＮＡを含むゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として“ＰｒｅＭｉｘ Ｔａｑ”（登録商標）（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いたＰＣＲにより行った。プライマーには、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子をクローニングした際に用いたプライマーを使用した。その結果、全ての形質転換体において、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が導入されていることが確認された。

ｐＴＭ６３が導入されたサッカロマイセス・セレビシエ ＮＢＲＣ１０５０５株を以下、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株と示す。

（実施例１） 連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その１）
図１の連続発酵装置を稼働させることにより、Ｄ−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表１に示す組成のＤ−乳酸生産培地を用い、この装置による連続発酵試験を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。膜分離エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、参考例１で作成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。多孔性膜の平均細孔径は上記のとおり０.１μｍであり、純水透過係数は５０×１０^-9ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａである。本実施例における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）空気
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．０に調整
・滅菌：膜分離エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御。

（連続発酵開始後〜９０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
９０〜１８０時間：２ｋＰａ以下で制御
１８０〜２６４時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
微生物として、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を用い、培地として表１に示す組成のＤ−乳酸生産培地を用い、生産物であるＤ−乳酸の濃度の評価はＨＰＬＣ法により測定した。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。

まず、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を、試験管で５ｍｌのＤ−乳酸生産培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なＤ−乳酸生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。

前々培養液を、図１に示した連続発酵装置の１．５ＬのＤ−乳酸生産培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、Ｄ−乳酸生産培地の連続供給を行い、連続発酵装置の培養液量を１．５Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置６により、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることで行った。適宜、膜透過濾液中の生産されたＤ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該Ｄ−乳酸および投入グルコースから算出されたＤ−乳酸生産速度を表２に示した。２６４時間の発酵試験を行った結果、図１に示した連続発酵装置を用いることにより、安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。

（実施例２） 連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その２）
微生物もしくは培養細胞としてＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を用い発酵培地として表１に示す組成のＤ−乳酸生産培地を用い、図２に示す連続発酵装置用いて連続発酵試験を行った。また、上記Ｄ−乳酸生産培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。膜分離エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜としてはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。分離膜には、参考例２で作成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。この実施例２における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：４０００平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）空気
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ７．０に調整
・培養液循環速度：１００ｍｌ／ｍｉｎ
・滅菌：膜分離エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌した。
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜９０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
９０〜１８０時間：２ｋＰａ以下で制御
１８０〜２６４時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
Ｄ−乳酸およびグルコース濃度は、実施例１と同様の方法を用いて評価した。

まず、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を試験管で５ｍｌのＤ−乳酸生産培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なＤ−乳酸生産培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示した連続発酵装置の２．０ＬのＤ−乳酸生産培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整および培養液循環速度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、Ｄ−乳酸生産培地の連続供給を行い、連続発酵装置の培養液量を２．０Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、膜間差圧として０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過濾液中の生産されたＤ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該Ｄ−乳酸および投入グルコースから算出されたＤ−乳酸発酵生産性を表２に示した。

（比較例１）バッチ発酵によるＤ−乳酸の製造（その１）
微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、そのＤ−乳酸生産性を評価した。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。この比較例１では、微生物としてＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を用い、生産物であるＤ−乳酸の濃度の評価はＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。比較例１の運転条件は、下記のとおりである。
・発酵反応槽容量（Ｄ−乳酸生産培地量）：１．０（Ｌ）
・温度調整：３０（℃）
・発酵反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）空気
・発酵反応槽攪拌速度：３００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５．０に調整。

まず、ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を試験管で５ｍｌのＤ−乳酸生産培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮なＤ−乳酸生産培地５０ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前培養）。前培養液をジャーファーメンターの１．０ＬのＤ−乳酸生産培地に植菌した。Ｄ−乳酸生産培地を用い、バッチ発酵を行った。その結果を実施例１および実施例２の連続発酵試験で得られたＤ−乳酸発酵生産性を比較して表２に示す。

これら比較の結果、図１および図２に示す連続発酵装置を用いることにより、Ｄ−乳酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。本発明によって開示された分離膜である多孔性膜を組み込んだ連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、培養液を多孔性膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵によるＤ−乳酸の製造が可能であることが明らかとなった。

（実施例３）連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その３）
図１の連続発酵装置を稼働させることにより、Ｄ−乳酸連続発酵系が得られるかどうかを調べるため、表３に示す組成のＤ−乳酸発酵培地を用い、この装置による連続発酵試験を行った。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。膜分離エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜には、参考例１で作成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。多孔性膜の平均細孔径は上記のとおり０.１μｍであり、純水透過係数は５０×１０^-9ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａである。この実施例３における運転条件は、特に断らないり限り下記のとおりである。
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）窒素ガス
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ６．０に調整
・滅菌：膜分離エレメントを含む培養槽、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎの
オートクレーブにより高圧蒸気滅菌
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御。

（連続発酵開始後〜９０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
９０〜１８０時間：２ｋＰａ以下で制御
１８０〜２４５時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
微生物として、バシラス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ２３４９２株を用い、培地として表３に示す組成のＤ−乳酸発酵培地を用い、生産物であるＤ−乳酸の濃度の評価はＨＰＬＣ法により測定した。また、グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。

まず、バシラス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ２３４９２株を、試験管で５ｍｌのＤ−乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なＤ−乳酸発酵培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。

前々培養液を、図１に示した連続発酵装置の１．５ＬのＤ−乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、Ｄ−乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の培養液量を１．５Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置６により、発酵反応槽水頭を最大２ｍ以内、すなわち膜間差圧が２０ｋＰａ以内となるように適宜水頭差を変化させることで行った。適宜、膜透過濾液中の生産されたＤ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該Ｄ−乳酸および投入グルコースから算出されたＤ−乳酸生産速度を表４に示した。２４５時間の発酵試験を行った結果、本連続発酵装置を用いることにより、安定したＤ−乳酸の連続発酵による製造が可能であることを確認することができた。

（実施例４） 連続発酵によるＤ−乳酸の製造（その４）
微生物もしくは培養細胞としてバシラス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ２３４９２株を用い発酵培地として表３に示す組成のＤ−乳酸発酵培地を用い、図２に示す連続発酵装置用いて連続発酵試験を行った。また上記Ｄ−乳酸発酵培地は１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。膜分離エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成形品を用いた。分離膜としてはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。分離膜には、参考例２で作成したポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を主成分とする多孔性膜を用いた。この実施例４における運転条件は、特に断らない限り下記のとおりである。
［運転条件］
・発酵反応槽容量：１．５（Ｌ）
・膜分離槽容量：０．５（Ｌ）
・使用分離膜：ＰＶＤＦ濾過膜
・膜分離エレメント有効濾過面積：４０００平方ｃｍ
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）窒素
・発酵反応槽攪拌速度：８００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ６．０に調整
・培養液循環速度：１００ｍｌ／ｍｉｎ
・滅菌：膜分離エレメントを含む培養槽および使用培地は、総て１２１℃の温度で２０分間のオートクレーブにより高圧蒸気滅菌した。
・膜透過水量制御：膜間差圧による流量制御
（連続発酵開始後〜９０時間：０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
９０〜１８０時間：２ｋＰａ以下で制御
１８０〜２５０時間：０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
・Ｄ−乳酸およびグルコース濃度は、実施例１と同様の方法を用いて評価した。

まず、バシラス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ２３４９２株を試験管で５ｍｌのＤ−乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を、新鮮なＤ−乳酸発酵培地５０ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図２に示した連続発酵装置の２．０ＬのＤ−乳酸発酵培地に植菌し、発酵反応槽１を付属の攪拌機５によって８００ｒｐｍで攪拌し、発酵反応槽１の通気量の調整、温度調整、ｐＨ調整および培養液循環速度調整を行い、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、Ｄ−乳酸発酵培地の連続供給を行い、連続発酵装置の培養液量を２．０Ｌとなるよう膜透過水量の制御を行いながら連続培養し、連続発酵によるＤ−乳酸の製造を行った。連続発酵試験を行うときの膜透過水量の制御は、水頭差制御装置３により、膜間差圧として０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下となるように適宜水頭差を変化させることにより行った。適宜、膜透過濾液中の生産されたＤ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。また、該Ｄ−乳酸および投入グルコースから算出されたＤ−乳酸発酵生産性を表４に示した。

（比較例２）バッチ発酵によるＤ−乳酸の製造（その２）
微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を２Ｌ容のジャーファーメンターを用いて行い、そのＤ−乳酸生産性を評価した。培地は、１２１℃の温度で１５分間高圧蒸気滅菌して用いた。この比較例２では、微生物としてバシラス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ２３４９２株を用い、生産物であるＤ−乳酸の濃度の評価はＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコー”（登録商標Ｃ）（和光純薬社製）を用いた。比較例２の運転条件は、下記のとおりである。
・発酵反応槽容量（Ｄ−乳酸生産培地量）：１．０（Ｌ）
・温度調整：３７（℃）
・発酵反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）窒素
・発酵反応槽攪拌速度：３００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：５Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ６．０に調整。

まず、バシラス・ラエボラクティカス ＡＴＣＣ２３４９２株を試験管で５ｍｌのＤ−乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮なＤ−乳酸発酵培地５０ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前培養）。前培養液をジャーファーメンターの１．５ＬのＤ−乳酸発酵培地に植菌した。Ｄ−乳酸発酵培地を用い、バッチ発酵を行った。その結果を実施例３と実施例４の連続発酵試験で得られたＤ−乳酸発酵生産性を比較して表４に示す。

これらを比較した結果、Ｄ−乳酸を生産する能力を有する微生物が異なったとしても、図１および図２に示す連続発酵装置を用いることにより、Ｄ−乳酸の生産速度が大幅に向上することを明らかにすることができた。本発明によって開示された分離膜である多孔性膜を組み込んだ連続発酵装置を用い、膜間差圧を制御することにより、培養液を多孔性膜によって濾液と未濾過液に分離し、濾液から所望の発酵生産物を回収するとともに、未濾過液を培養液に戻す連続発酵方法を可能とし、微生物量を高く維持しながら、連続発酵によるＤ−乳酸の製造が可能であることが明らかとなった。

図１は、本発明で用いられる連続発酵装置の例を説明するための概略側面図である。 図２は、本発明で用いられる他の連続発酵装置の例を説明するための概略側面図である。 図３は、本発明で用いられる膜分離エレメントの例を説明するための概略斜視図である。 図４は、本発明で用いられる他の膜分離エレメントの例を説明するための概略斜視図である。 図５は、本発明のＤ−乳酸の製造方法で用いられる酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す構築図である。

符号の説明

１ 発酵反応槽
２ 膜分離エレメント
３ 水頭差圧制御装置
４ 気体供給装置
５ 攪拌機
６ レベルセンサ
７ 培地供給ポンプ
８ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
９ ｐＨセンサ・制御装置
１０ 温度調節器
１１ 培養液循環ポンプ
１２ 膜分離槽
１３ 支持板
１４ 流路材
１５ 分離膜
１６ 凹部
１７ 集水パイプ
１８ 分離膜束
１９ 上部樹脂封止層
２０ 下部樹脂封止層
２１ 支持フレーム
２２ 集水パイプ

Claims (12)

1. Ｄ−乳酸を生産する能力を有する微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を培養液に追加する連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法であって、該分離膜として平均細孔径が０.０１μｍ以上１μｍ未満の多孔性膜を用い、膜間差圧を０.１から２０ｋＰａの範囲として濾過処理することを特徴とする連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法。
2. 多孔性膜の純水透過係数が、２×１０^−９ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以上６×１０^−７ｍ^３／ｍ^２／ｓ／ｐａ以下であることを特徴とする請求項１記載の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法。
3. 多孔性膜の平均細孔径が０.０１μｍ以上０.２μｍ未満であり、かつ、該平均細孔径の標準偏差が０.１μｍ以下であることを特徴とする請求項１または２記載の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法。
4. 多孔性膜の膜表面粗さが０.１μｍ以下であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法。
5. 多孔性膜が多孔性樹脂層を含む多孔性膜である請求項１から４のいずれかに記載のＤ−乳酸の製造方法。
6. 多孔性膜の膜素材にポリフッ化ビニリデン系樹脂を用いることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法。
7. 微生物が、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属することを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法。
8. 微生物が、バシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法。
9. 微生物が、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増強している微生物であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法。
10. 微生物が、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ組換え微生物であることを特徴とする請求項９記載の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法。
11. 組換え微生物が酵母であることを特徴とする請求項１０記載の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法。
12. Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）またはバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）由来の遺伝子であることを特徴とする請求項９から１１のいずれかに記載の連続発酵によるＤ−乳酸の製造方法。

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