JP2002136293A - 微生物およびd−乳酸の製造方法 - Google Patents
微生物およびd−乳酸の製造方法Info
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Abstract
母にD−乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込み、高発現させ
ることで、D−乳酸を高濃度蓄積させることによって解
決される。ピルビン酸を10g/L以上蓄積する能力を
持つ微生物にD−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を
導入した微生物を培養することでD−乳酸を得る。微生
物としては、トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis gl
abrata)またはトルロプシス・メタノロベッセンス(Toru
lopsis methanalvescence)などの酵母が好ましく用いら
れる。
Description
に関するものである。D−乳酸は農薬中間体などの合成
原料として使用され、需要が高まりつつある。
生物としては、ラクトバチラス属、ロイコノストック
属、スタフィロコッカス属等に属する微生物が知られて
いる〔マイクロバイオロジカル・レビューズ(Microbio
logical Reviews)、44巻、106〜139頁(19
80年)〕。
カリゲネス属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリ
ウム属またはオブサムバクテリウム属の微生物を用い、
DL−ラクトニトリルからD−乳酸またはL−乳酸を製
造する方法が開示されている。特開平5−260964
号公報には、シュードモナス属に属する微生物を培養し
て得られた酵素を用い、L−2−クロロプロピオン酸、
D−2−クロロプロピオン酸又はこれらのエナンチオマ
ー混合物からD−乳酸を製造する方法が開示されてい
る。特開平7−327693号公報には、アルカリゲネ
ス属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、ブレ
ビバクテリウム属、アシネトバクター属、コリネバクテ
リウム属、エンテロバクター属、ミクロコッカス属及び
ロドコッカス属の微生物の培養液、菌体等をDL−ラク
トアミドに作用させ、D−乳酸及びL−ラクトアミドを
製造する方法が開示されている。これらはいずれもグル
コースから直接D−乳酸を製造する方法ではない。
菌(ラクトバチルス属)由来の乳酸脱水素酵素遺伝子を
導入したサッカロミセス酵母が開示されているが、用い
られているのはL−乳酸脱水素酵素であり、またこの酵
母による乳酸の生産は培地中のグルコースの25〜30
%に相当するにすぎず、生成効率は低い。
物によるD−乳酸の高効率な工業的製造方法を提供する
ことである。
めに、本発明者らは更に生産性の高いD−乳酸の製造方
法について鋭意研究を行った結果、ピルビン酸の高生産
能を有する微生物に乳酸菌由来のD−乳酸脱水素酵素遺
伝子を組み込むことにより、D−乳酸の蓄積濃度、生成
収率が著しく向上することを見出し、本発明に到達し
た。すなわち、本発明はピルビン酸高生産性能を有し、
かつD−乳酸脱水素酵素の高発現能を持った微生物を培
養して、培養液中にD−乳酸を蓄積せしめ、前記培養液
よりD−乳酸を回収することを特徴とするD−乳酸の製
造方法である。
以上蓄積する能力を持つ微生物にD−乳酸脱水素遺伝子
を導入した微生物とその微生物を培養しD−乳酸を生産
することを特徴とするD−乳酸の製造方法である。
用により、直接乳酸に還元される。この場合、L−乳酸
脱水素酵素を用いればL−乳酸が、D−乳酸脱水素酵素
を用いればD−乳酸がピルビン酸より直接生成する。
酸を高生産(10g/L以上)する微生物であるならば
特に制限はない。本発明では、ピルビン酸を10g/L
以上蓄積する能力を持つ微生物であれば良い。ここで、
ピルビン酸を10g/L以上蓄積する能力を持つ微生物
とは、特開2000−78996号公報の実施例5に記
載の方法で培養した際にピルビン酸を10g/L以上蓄
積するものである。
れ、特に、トルロプシス(Torulopsis)属の
酵母が好ましい。さらに好ましくは、トルロプシス・グ
ラブラタ(Torulopsis glabrata)
またはトルロプシス・メタノロベッセンス(Torul
opsis methanalvescence)であ
る。
L蓄積する微生物が好ましい。このような微生物として
はトルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata) TR
-2026株(FERM BP1425)、ACII33株(FERM BP1424)、X
-15株(FERM BP1423)、X-68株(FERM BP1426)、AOA-8
株(FERM BP1427)、トルロプシス・メタノロベッセン
ス(Torulopsis methanalvescence) TR-2044株(FERM BP
1428)などがあげられる。
L以上蓄積する微生物が好ましい。このような微生物と
してはトルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrat
a) P95-21株(FERM P-10652)、P120-5a株(FERM P-167
45)、B26株(FERM P-16744)などがあげられる。
他に薬剤に対する耐性、栄養要求性などの性質があって
もよく、ピルビン酸の高生産能力がある微生物はすべて
本発明に含まれる。
コードする遺伝子は、宿主によって発現され、D−乳酸
脱水素酵素としての活性が保持されるならば特に制限は
ないが、酵母以外の生物主由来であるものが好ましく、
さらに、乳酸菌由来のD−乳酸脱水素酵素をコードする
遺伝子が好ましい。乳酸菌のD−乳酸脱水素酵素をコー
ドする遺伝子としてはラクトバチルス・デルブレッキー
(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・プラ
ンタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス
・ジョンソニー(Lacto-bacillus johnsonii)、ロイコノ
ストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroid
es)などの遺伝子が知られており、これらが好ましく用
いられる。
ては特に制限はなく、PCR法、ゲノムライブラリーや
cDNAライブラリーからのスクリーニング法などが用
いられる。
み込み、宿主内に導入する。導入方法としては特に制限
はないが、例えば酵母の場合はプロトプラスト法、塩化
リチウム法、エレクトロポレーション法などが用いられ
る。
は宿主細胞中で安定に維持されるものであれば特に制限
はない。例えば酵母においては、酵母内在性の2μプラ
スミドの複製起点を持つYEp型ベクター、酵母染色体
の複製起点を持つYRp型ベクター、酵母染色体の複製
起点及びセントロメア配列を持つYCp型ベクター、酵
母染色体の複製起点及びテロメア配列を持つYLp型ベ
クター、酵母中での複製起点を持たないYIp型ベクタ
ーなどが適宜用いられるが、発現ベクターを安定に保持
するためにはYIp型ベクターを用いることが好まし
い。
ロモーターについては、宿主細胞においてD−乳酸脱水
素酵素が発現され、D−乳酸が生成する限り特に制限は
ない。例えば酵母においてはホスホグリセレートキナー
ゼ(PGK)遺伝子、アルコール脱水素酵素1(ADH
1)遺伝子、抑制性酸性ホスファターゼ(PHO5)遺
伝子等があげられる。構成的に発現するプロモーターを
用いても良いし、誘導性プロモーターを用いることも可
能である。
る。ピルビン酸の高生産用培地は炭素源、窒素源、無機
イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有
する通常の培地であるが、D−乳酸が生成する限り特に
制限はない。
合、ピルビン酸からL−乳酸が生産されるため、D−乳
酸のみを製造するためにL−乳酸脱水素酵素遺伝子を破
壊することも可能である。
ス、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸
などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロール
などのアルコール類などを1〜15%、窒素源として酢
酸アンモニウムなどの有機アンモニウム塩、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸
アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素などを0.1%〜4.0%、有
機微量成分としてはビオチンなどの被要求性物質が0.
0000001%〜0.1%、それぞれ適当量含有する
培地が用いられる。
ネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸亜
鉛、硫酸銅、硫酸第1鉄などが微量物質として必要に応
じて添加される。さらにチアミン、ナイアシン、ピリド
キシン、ビオチンなどの要求ビタミン、又はこれらを含
有する酵母エキス、コーンスティープリカー、その他天
然物を適当量含有した培地を用いることもできる。
乳酸の生成に応じて適宜条件を変更することが可能であ
る。培養中はD−乳酸の生成蓄積に応じて、培地のpH
低下が起こるので、炭酸カルシウム、苛性ソーダ、苛性
カリなどのアルカリでpH3〜pH8に調節することが
有効である。好ましくは消泡剤なども添加し、培養条件
の安定化を図る。培養温度は15℃〜45℃、好ましく
は20℃〜35℃が用いられる。
うまたは撹拌培養することで好ましい結果が得られる。
単離精製することなく利用することもできるし、菌体を
遠心分離などで除去した後、常法により単離精製し利用
することもできる。
る。
るために、D−乳酸脱水素酵素遺伝子のクローニングを
行った。
子の塩基配列はデータベース(GenBank)の配列を元に、
ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantar
um)用のPCRプライマーを設計した。PCRに用いた
プライマーの配列は配列表1、配列表2に示した。
s plantarum ATCC8041株のゲノムDNAを鋳型としてPC
Rを行い、1027塩基対の増幅断片を得た。この増幅断片
は大腸菌のベクターであるpUC18のHincII切断部位にサ
ブクローニングし、塩基配列を確認した結果、この増幅
断片が実際にLactobacillus plantarumのD−乳酸脱水
素酵素遺伝子をコードしていることを確認した。
ーターに連結し、市販の酵母用ベクターであるpAUR101
(宝酒造社製)のSmaI切断部位に導入し、D−乳酸脱
水素酵素発現ベクターpDLD1を作製した(図)。
rata B26株 にプロトプラスト法を用いて導入した。
は抗生物質であるオーレオバシジン耐性を指標に行い、
形質転換体を得た。この形質転換株をTorulopsis glabr
ataDLA株と命名した。
現) Torulopsis glabrata B26株、Torulopsis glabrata P12
0-5a株、およびこの形質転換株Torulopsis glabrata DL
A株を培養した。すなわち、これらの菌株を各々YCB
培地5mlに1白金耳植菌し、30℃で24時間振とう
して前培養した。
500mlの三角フラスコに入れ、予め115℃、10
分間蒸気滅菌した。この培地に前培養した上記菌株を植
え継ぎ、振幅30cmで、180rpmの条件下で70
時間培養した。
D−乳酸の濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて
定量した。その結果を以下に示した。
B26株、Torulopsis glabrata P120-5a株に比較して組換
え株であるTorulopsis glabrata DLA株ではD−乳酸の
著量蓄積が見られた。
クターであるpAUR123(宝酒造社製)のSmaI切断部位に
導入し、D−乳酸脱水素酵素発現ベクターpDLD123を作
製した(図2)。
abrata B26株 にプロトプラスト法を用いて導入した。
は抗生物質であるオーレオバシジン耐性を指標に行い、
形質転換体を得た。この形質転換株をTorulopsis glabr
ataDLA123株と命名した。
現) Torulopsis glabrata DLA123株を実施例2に従って培養
した。
D−乳酸の濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて
定量した。その結果を以下に示した。
B26株に比較して組換え株であるTorulopsis glabrata D
LA123株でもD−乳酸の著量蓄積が見られた。
乳酸を培養液中に生産すると、既存の方法に比較してよ
り経済的なD−乳酸の生産が可能となる。
ィジカルマップを示す図である。
フィジカルマップを示す図である。
Claims (8)
- 【請求項1】 ピルビン酸を10g/L以上蓄積する能
力を持つ微生物にD−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝
子を導入した微生物。 - 【請求項2】 ピルビン酸を10g/L以上蓄積する能
力を持つ微生物が酵母であるところの請求項1に記載の
微生物。 - 【請求項3】 ピルビン酸を10g/L以上蓄積する能
力を持つ微生物がトルロプシス(Torulopsis)属であると
ころの請求項2に記載の微生物。 - 【請求項4】 ピルビン酸を10g/L以上蓄積する能
力を持つ微生物がトルロプシス・グラブラタ(Torulopsi
s glabrata)またはトルロプシス・メタノロベッセンス
(Torulopsis methanalvescence)であるところの請求項
3に記載の微生物。 - 【請求項5】 D−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子
が酵母以外の生物主由来であるところの請求項1〜4の
いずれかに記載の微生物。 - 【請求項6】 D−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子
が乳酸菌由来であるところの請求項5に記載の微生物。 - 【請求項7】 D−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子
がラクトバチルス・デルブレッキー(Lactobacillus del
brueckii)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacil
lus plantarum)、ラクトバチルス・ジョンソニー(Lacto
-bacillus johnsonii)、ロイコノストック・メセンテロ
イデス(Leuconostoc mesenteroides)のいずれかに由来
するところの請求項6に記載の微生物。 - 【請求項8】 請求項1〜7のいずれかに記載の微生物
を培養し、D−乳酸を生産させることを特徴とするD−
乳酸の製造方法。
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