JP2002136293A - 微生物およびｄ−乳酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 より経済的にＤ−乳酸を生産する。 【解決手段】 本発明の課題はピルビン酸の高生産性酵
母にＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込み、高発現させ
ることで、Ｄ−乳酸を高濃度蓄積させることによって解
決される。ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を
持つ微生物にＤ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を
導入した微生物を培養することでＤ−乳酸を得る。微生
物としては、トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis gl
abrata)またはトルロプシス・メタノロベッセンス(Toru
lopsis methanalvescence)などの酵母が好ましく用いら
れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｄ−乳酸の製造法
に関するものである。Ｄ−乳酸は農薬中間体などの合成
原料として使用され、需要が高まりつつある。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｄ−乳酸脱水素酵素を産生する微
生物としては、ラクトバチラス属、ロイコノストック
属、スタフィロコッカス属等に属する微生物が知られて
いる〔マイクロバイオロジカル・レビューズ（Microbio
logical Reviews）、４４巻、１０６〜１３９頁（１９
８０年）〕。

【０００３】特開平５−２１９９８７号公報には、アル
カリゲネス属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリ
ウム属またはオブサムバクテリウム属の微生物を用い、
ＤＬ−ラクトニトリルからＤ−乳酸またはＬ−乳酸を製
造する方法が開示されている。特開平５−２６０９６４
号公報には、シュードモナス属に属する微生物を培養し
て得られた酵素を用い、Ｌ−２−クロロプロピオン酸、
Ｄ−２−クロロプロピオン酸又はこれらのエナンチオマ
ー混合物からＤ−乳酸を製造する方法が開示されてい
る。特開平７−３２７６９３号公報には、アルカリゲネ
ス属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、ブレ
ビバクテリウム属、アシネトバクター属、コリネバクテ
リウム属、エンテロバクター属、ミクロコッカス属及び
ロドコッカス属の微生物の培養液、菌体等をＤＬ−ラク
トアミドに作用させ、Ｄ−乳酸及びＬ−ラクトアミドを
製造する方法が開示されている。これらはいずれもグル
コースから直接Ｄ−乳酸を製造する方法ではない。

【０００４】特表平７−５０８１６５号公報には、乳酸
菌（ラクトバチルス属）由来の乳酸脱水素酵素遺伝子を
導入したサッカロミセス酵母が開示されているが、用い
られているのはＬ−乳酸脱水素酵素であり、またこの酵
母による乳酸の生産は培地中のグルコースの２５〜３０
％に相当するにすぎず、生成効率は低い。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、微生
物によるＤ−乳酸の高効率な工業的製造方法を提供する
ことである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記問題点を解決するた
めに、本発明者らは更に生産性の高いＤ−乳酸の製造方
法について鋭意研究を行った結果、ピルビン酸の高生産
能を有する微生物に乳酸菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素遺
伝子を組み込むことにより、Ｄ−乳酸の蓄積濃度、生成
収率が著しく向上することを見出し、本発明に到達し
た。すなわち、本発明はピルビン酸高生産性能を有し、
かつＤ−乳酸脱水素酵素の高発現能を持った微生物を培
養して、培養液中にＤ−乳酸を蓄積せしめ、前記培養液
よりＤ−乳酸を回収することを特徴とするＤ−乳酸の製
造方法である。

【０００７】すなわち本発明はピルビン酸を１０ｇ／Ｌ
以上蓄積する能力を持つ微生物にＤ−乳酸脱水素遺伝子
を導入した微生物とその微生物を培養しＤ−乳酸を生産
することを特徴とするＤ−乳酸の製造方法である。

【０００８】

【発明の実施の形態】ピルビン酸は乳酸脱水素酵素の作
用により、直接乳酸に還元される。この場合、Ｌ−乳酸
脱水素酵素を用いればＬ−乳酸が、Ｄ−乳酸脱水素酵素
を用いればＤ−乳酸がピルビン酸より直接生成する。

【０００９】本発明に使用する宿主微生物は、ピルビン
酸を高生産（１０ｇ／Ｌ以上）する微生物であるならば
特に制限はない。本発明では、ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ
以上蓄積する能力を持つ微生物であれば良い。ここで、
ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能力を持つ微生物
とは、特開２０００−７８９９６号公報の実施例５に記
載の方法で培養した際にピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄
積するものである。

【００１０】微生物としては、酵母が好ましく用いら
れ、特に、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属の
酵母が好ましい。さらに好ましくは、トルロプシス・グ
ラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ ｇｌａｂｒａｔａ）
またはトルロプシス・メタノロベッセンス（Ｔｏｒｕｌ
ｏｐｓｉｓ ｍｅｔｈａｎａｌｖｅｓｃｅｎｃｅ）であ
る。

【００１１】さらに宿主としてはピルビン酸を２０ｇ／
Ｌ蓄積する微生物が好ましい。このような微生物として
はトルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata) TR
-2026株（FERM BP1425）、ACII33株（FERM BP1424）、X
-15株（FERM BP1423）、X-68株（FERM BP1426）、AOA-8
株（FERM BP1427）、トルロプシス・メタノロベッセン
ス(Torulopsis methanalvescence) TR-2044株（FERM BP
1428）などがあげられる。

【００１２】さらに宿主としてはピルビン酸を４０ｇ／
Ｌ以上蓄積する微生物が好ましい。このような微生物と
してはトルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrat
a) P95-21株（FERM P-10652）、P120-5a株（FERM P-167
45)、B26株（FERM P-16744）などがあげられる。

【００１３】また、ピルビン酸の高生産能力があれば、
他に薬剤に対する耐性、栄養要求性などの性質があって
もよく、ピルビン酸の高生産能力がある微生物はすべて
本発明に含まれる。

【００１４】宿主に組み込むべきＤ−乳酸脱水素酵素を
コードする遺伝子は、宿主によって発現され、Ｄ−乳酸
脱水素酵素としての活性が保持されるならば特に制限は
ないが、酵母以外の生物主由来であるものが好ましく、
さらに、乳酸菌由来のＤ−乳酸脱水素酵素をコードする
遺伝子が好ましい。乳酸菌のＤ−乳酸脱水素酵素をコー
ドする遺伝子としてはラクトバチルス・デルブレッキー
(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・プラ
ンタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス
・ジョンソニー(Lacto-bacillus johnsonii)、ロイコノ
ストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroid
es)などの遺伝子が知られており、これらが好ましく用
いられる。

【００１５】Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子の取得方法とし
ては特に制限はなく、ＰＣＲ法、ゲノムライブラリーや
ｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング法などが用
いられる。

【００１６】取得した遺伝子は適当な発現ベクターに組
み込み、宿主内に導入する。導入方法としては特に制限
はないが、例えば酵母の場合はプロトプラスト法、塩化
リチウム法、エレクトロポレーション法などが用いられ
る。

【００１７】用いられる発現ベクターのタイプについて
は宿主細胞中で安定に維持されるものであれば特に制限
はない。例えば酵母においては、酵母内在性の２μプラ
スミドの複製起点を持つＹＥｐ型ベクター、酵母染色体
の複製起点を持つＹＲｐ型ベクター、酵母染色体の複製
起点及びセントロメア配列を持つＹＣｐ型ベクター、酵
母染色体の複製起点及びテロメア配列を持つＹＬｐ型ベ
クター、酵母中での複製起点を持たないＹＩｐ型ベクタ
ーなどが適宜用いられるが、発現ベクターを安定に保持
するためにはＹＩｐ型ベクターを用いることが好まし
い。

【００１８】Ｄ−乳酸脱水素酵素を発現させるためのプ
ロモーターについては、宿主細胞においてＤ−乳酸脱水
素酵素が発現され、Ｄ−乳酸が生成する限り特に制限は
ない。例えば酵母においてはホスホグリセレートキナー
ゼ（ＰＧＫ）遺伝子、アルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ
１）遺伝子、抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）遺
伝子等があげられる。構成的に発現するプロモーターを
用いても良いし、誘導性プロモーターを用いることも可
能である。

【００１９】本発明における培養方法について説明す
る。ピルビン酸の高生産用培地は炭素源、窒素源、無機
イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有
する通常の培地であるが、Ｄ−乳酸が生成する限り特に
制限はない。

【００２０】宿主がＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を持つ場
合、ピルビン酸からＬ−乳酸が生産されるため、Ｄ−乳
酸のみを製造するためにＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子を破
壊することも可能である。

【００２１】炭素源としてはグルコース、フラクトー
ス、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸
などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロール
などのアルコール類などを１〜１５％、窒素源として酢
酸アンモニウムなどの有機アンモニウム塩、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸
アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素などを０．１％〜４．０％、有
機微量成分としてはビオチンなどの被要求性物質が０．
００００００１％〜０．１％、それぞれ適当量含有する
培地が用いられる。

【００２２】これらの他にリン酸カルシウム、硫酸マグ
ネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸亜
鉛、硫酸銅、硫酸第１鉄などが微量物質として必要に応
じて添加される。さらにチアミン、ナイアシン、ピリド
キシン、ビオチンなどの要求ビタミン、又はこれらを含
有する酵母エキス、コーンスティープリカー、その他天
然物を適当量含有した培地を用いることもできる。

【００２３】培養は通常、好気的条件下で行うが、Ｄ−
乳酸の生成に応じて適宜条件を変更することが可能であ
る。培養中はＤ−乳酸の生成蓄積に応じて、培地のｐＨ
低下が起こるので、炭酸カルシウム、苛性ソーダ、苛性
カリなどのアルカリでｐＨ３〜ｐＨ８に調節することが
有効である。好ましくは消泡剤なども添加し、培養条件
の安定化を図る。培養温度は１５℃〜４５℃、好ましく
は２０℃〜３５℃が用いられる。

【００２４】これらの条件の下に２４〜１２０時間振と
うまたは撹拌培養することで好ましい結果が得られる。

【００２５】培養液中に生成したＤ−乳酸は、そのまま
単離精製することなく利用することもできるし、菌体を
遠心分離などで除去した後、常法により単離精製し利用
することもできる。

【００２６】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。

【００２７】実施例１ （１）Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子のクローニング 宿主細胞の生産するピルビン酸からＤ−乳酸を産生させ
るために、Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子のクローニングを
行った。

【００２８】公知となっているＤ−乳酸脱水素酵素遺伝
子の塩基配列はデータベース(GenBank)の配列を元に、
ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantar
um)用のＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲに用いた
プライマーの配列は配列表１、配列表２に示した。

【００２９】これらのプライマーを用い、Lactobacillu
s plantarum ATCC8041株のゲノムDNAを鋳型としてＰＣ
Ｒを行い、1027塩基対の増幅断片を得た。この増幅断片
は大腸菌のベクターであるpUC18のHincII切断部位にサ
ブクローニングし、塩基配列を確認した結果、この増幅
断片が実際にLactobacillus plantarumのＤ−乳酸脱水
素酵素遺伝子をコードしていることを確認した。

【００３０】（２）発現ベクターの作製 （１）で増幅したDNA断片を酵母中で発現するPGKプロモ
ーターに連結し、市販の酵母用ベクターであるpAUR101
（宝酒造社製）のSmaＩ切断部位に導入し、Ｄ−乳酸脱
水素酵素発現ベクターpDLD1を作製した（図）。

【００３１】（３）宿主への発現ベクターの導入 （２）で作製した発現ベクターpDLD1をTorulopsis glab
rata B26株 にプロトプラスト法を用いて導入した。

【００３２】発現ベクターを導入後、組換え酵母の選択
は抗生物質であるオーレオバシジン耐性を指標に行い、
形質転換体を得た。この形質転換株をTorulopsis glabr
ataDLA株と命名した。

【００３３】実施例２（形質転換株によるＤ−乳酸の発
現） Torulopsis glabrata B26株、Torulopsis glabrata P12
0-5a株、およびこの形質転換株Torulopsis glabrata DL
A株を培養した。すなわち、これらの菌株を各々ＹＣＢ
培地５ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とう
して前培養した。

【００３４】次に、以下に示した組成の培地５０ｍｌを
５００ｍｌの三角フラスコに入れ、予め１１５℃、１０
分間蒸気滅菌した。この培地に前培養した上記菌株を植
え継ぎ、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で７０
時間培養した。

【００３５】

【表１】

【００３６】培養終了後、菌体を除去した培養上清中の
Ｄ−乳酸の濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて
定量した。その結果を以下に示した。

【００３７】

【表２】

【００３８】コントロールであるTorulopsis glabrata
B26株、Torulopsis glabrata P120-5a株に比較して組換
え株であるTorulopsis glabrata DLA株ではＤ−乳酸の
著量蓄積が見られた。

【００３９】実施例３ （１）発現ベクターの作製 実施例１の（１）で増幅したDNA断片を市販の酵母用ベ
クターであるpAUR123（宝酒造社製）のSmaＩ切断部位に
導入し、Ｄ−乳酸脱水素酵素発現ベクターpDLD123を作
製した（図２）。

【００４０】（２）宿主への発現ベクターの導入 （１）で作製した発現ベクターpDLD123をTorulopsis gl
abrata B26株 にプロトプラスト法を用いて導入した。

【００４１】発現ベクターを導入後、組換え酵母の選択
は抗生物質であるオーレオバシジン耐性を指標に行い、
形質転換体を得た。この形質転換株をTorulopsis glabr
ataDLA123株と命名した。

【００４２】実施例４（形質転換株によるＤ−乳酸の発
現） Torulopsis glabrata DLA123株を実施例２に従って培養
した。

【００４３】培養終了後、菌体を除去した培養上清中の
Ｄ−乳酸の濃度を高速液体クロマトグラフィーを用いて
定量した。その結果を以下に示した。

【００４４】

【表３】

【００４５】コントロールであるTorulopsis glabrata
B26株に比較して組換え株であるTorulopsis glabrata D
LA123株でもＤ−乳酸の著量蓄積が見られた。

【００４６】

【発明の効果】本発明の酵母を用い、発酵法によりＤ−
乳酸を培養液中に生産すると、既存の方法に比較してよ
り経済的なＤ−乳酸の生産が可能となる。

【００４７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TORAY <120> The method to produce D-lactate <130> 51E16151 <160> 2 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> PCR primer to obtain D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus pl antarum <400> gtaatgaagcttattgcatatgctgtacgtg <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> PCR primer to obtain D-lactate dehydrogenase from Lactobacillus pl antarum <400> ttaaggatcctcgaaattagtcaaacttaacttgcg

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｄ−乳酸脱水素酵素発現ベクターpDLD1のフ
ィジカルマップを示す図である。

【図２】 Ｄ−乳酸脱水素酵素発現ベクターpDLD123の
フィジカルマップを示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:88） 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA07 BA08 CA02 CA04 DA12 EA04 GA11 4B050 CC03 CC04 DD02 LL05 4B064 AD33 CA06 CA19 CC24 DA11 4B065 AA01Y AA30Y AA82X AB01 BA02 CA10 CA47

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能
   力を持つ微生物にＤ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝
   子を導入した微生物。
2. 【請求項２】 ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能
   力を持つ微生物が酵母であるところの請求項１に記載の
   微生物。
3. 【請求項３】 ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能
   力を持つ微生物がトルロプシス(Torulopsis)属であると
   ころの請求項２に記載の微生物。
4. 【請求項４】 ピルビン酸を１０ｇ／Ｌ以上蓄積する能
   力を持つ微生物がトルロプシス・グラブラタ(Torulopsi
   s glabrata)またはトルロプシス・メタノロベッセンス
   (Torulopsis methanalvescence)であるところの請求項
   ３に記載の微生物。
5. 【請求項５】 Ｄ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子
   が酵母以外の生物主由来であるところの請求項１〜４の
   いずれかに記載の微生物。
6. 【請求項６】 Ｄ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子
   が乳酸菌由来であるところの請求項５に記載の微生物。
7. 【請求項７】 Ｄ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子
   がラクトバチルス・デルブレッキー(Lactobacillus del
   brueckii)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacil
   lus plantarum)、ラクトバチルス・ジョンソニー(Lacto
   -bacillus johnsonii)、ロイコノストック・メセンテロ
   イデス(Leuconostoc mesenteroides)のいずれかに由来
   するところの請求項６に記載の微生物。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれかに記載の微生物
   を培養し、Ｄ−乳酸を生産させることを特徴とするＤ−
   乳酸の製造方法。