WO2004104202A1 - D-乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするdna及びその利用 - Google Patents

D-乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするdna及びその利用 Download PDF

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WO2004104202A1
WO2004104202A1 PCT/JP2004/007317 JP2004007317W WO2004104202A1 WO 2004104202 A1 WO2004104202 A1 WO 2004104202A1 JP 2004007317 W JP2004007317 W JP 2004007317W WO 2004104202 A1 WO2004104202 A1 WO 2004104202A1
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WO
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amino acid
dna
lactic acid
seq
protein
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PCT/JP2004/007317
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English (en)
French (fr)
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Nobuhiro Ishida
Kenro Tokuhiro
Haruo Takahashi
Eiji Nagamori
Masana Hirai
Satoshi Saitoh
Tohru Ohnishi
Original Assignee
Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho
Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to D-lactic acid and a technique for producing a polymer using D-lactic acid, and more particularly, to a protein having D-lactic acid dehydrogenase activity suitable for causing yeast to produce D-lactic acid, and a protein having the same.
  • the present invention relates to a DNA having a nucleotide sequence encoding a protein and a field of using the same. book
  • Lactic acid has two optical isomers, L-lactic acid and D-lactic acid.
  • the technology for fermentative production of D-lactic acid includes fermentation by lactic acid bacteria that produce D-lactic acid using a medium containing brewer's yeast. It is known that it is produced in Japan (Patent Document 1).
  • a method using Bulgarian lactobacilli is also known (Patent Document 2).
  • a technique for obtaining D-lactic acid with high optical purity is also disclosed (Patent Documents 3, 4, and 5). These lactic acid-producing microorganisms have a low production rate and require a complicated medium composition, and thus are not suitable for industrial production.
  • Patent Document 6 there is also a technique for producing lactic acid by using a recombinant strain in which a lactate dehydrogenase gene has been incorporated into a yeast lacking ethanol-producing ability or having relatively low ethanol-producing ability
  • Patent Document 6 this technique only discloses production of L-lactic acid.
  • a D-lactate dehydrogenase gene is introduced into yeast having a high pyruvate production ability to produce D-lactic acid (Patent Reference 7) Power This method focuses on the high pyruvate concentration in yeast having high pyruvate production ability, and does not indicate production in general yeast.
  • Patent Document 1
  • Patent Document 2
  • Patent Document 5
  • an object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding a protein having lactate dehydrogenase activity and a protein which can be used for D-lactic acid production, and an excellent D-lactic acid using the polynucleotide.
  • the present inventors have searched for D-lactate dehydrogenase and a gene that expresses the enzyme, and have found a transformation system that exhibits excellent D-lactic acid-producing ability. That is, a protein having D-lactate dehydrogenase activity, a DNA encoding the protein having the enzyme activity, and a transformant using the DNA, which can contribute to excellent D-lactic acid production, have been found.
  • a method for producing D-lactic acid and a method for producing polylactic acid Based on these findings, the present invention provides the following means.
  • substitution positions in the above table are shown as positions from methionine corresponding to the start codon.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing the amino acid sequence comprises one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, or additions, and D-lactic acid dehydrogenation A protein having enzymatic activity.
  • a protein having an amino acid sequence containing at least the amino acid residues at positions 78 to 79, 152 to 175, 235, and 296 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having D-lactate dehydrogenase activity .
  • a DNA segment having the DNA of (1) A DNA segment having a DNA encoding a promoter or a homolog of the promoter,
  • a DNA construct comprising:
  • the host is a microorganism selected from the group consisting of eukaryotic microorganisms including yeast and fungi, and lactic acid bacteria, Echerichia spp., And prokaryotic microorganisms including Bacillus spp.
  • a method comprising:
  • a method comprising:
  • FIG. 1A is homology data of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • FIG. 1B is a continuation of FIG. 1A, and is homology data of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • FIG. 2 shows homology data of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • FIG. 3 is a diagram showing a part of a step of constructing a pBTRP-PDC1-DLDHME vector.
  • FIG. 4 is a diagram showing a part of a step of constructing a pBTRP-PDC1-DLDHME vector.
  • FIG. 5 is a diagram showing a part of the step of constructing the pBTRP-PDCl-DLDHME vector.
  • FIG. 6 is a diagram showing the final step of the construction step of the pBTRP-PDC1-DLDHME vector.
  • FIG. 7 is a diagram showing a part of the chromosome structure of the diploid transformed yeast obtained in Example 3.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of the D-lactate (calcium salt) fermentation test of the parent strain and the chromosome-introduced transformant, showing the amounts of D-lactate and ethanol produced by each strain.
  • Figure 9 is a graph showing the fermentation test results of free D-lactic acid of the parent strain, the chromosome-introduced transformant, and the self-replicating plasmid-type transformant. Indicates the amount.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of a fermentation test of free D-lactic acid in one introduced strain, showing the amounts of D-lactic acid and ethanol produced by each strain.
  • the polynucleotide of the present invention has a base sequence encoding a protein having D-lactate dehydrogenase (D-LDH) activity.
  • D-LDH D-lactate dehydrogenase
  • a transformant expressing the present protein and a transformant producing D-lactic acid can be produced.
  • D-lactic acid can be produced in an enzyme reaction system using a protein encoded by the polynucleotide of the present invention.
  • a new source of D-lactic acid raw material can be provided. Further, according to these inventions, D-lactic acid can be produced with high selectivity or with high efficiency.
  • the polynucleotide of the present invention can include any of the following.
  • (b) Encodes a protein having a D-LDH activity that hybridizes under stringent conditions with a probe prepared from the entire nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial nucleotide sequence thereof or a complementary strand thereof. Polynucleotide.
  • a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 including substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids and having D-lactic acid dehydrogenase activity; The encoding polynucleotide.
  • (g) has an amino acid sequence containing at least the amino acid residues at positions 78 to 79, 152 to 175, 235, and 296 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and has D-lactate dehydrogenase activity
  • a polynucleotide that encodes a protein has an amino acid sequence containing at least the amino acid residues at positions 78 to 79, 152 to 175, 235, and 296 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and has D-lactate dehydrogenase activity A polynucleotide that encodes a protein.
  • the polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention encodes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotide is derived from the lactic acid bacterium Leuconostoc mesenteroides. Specifically, the white stirrer is a Leuconostoc. Mesenteroi des IF03426 strain (a strain registered with the Fermentation Research Institute) ).
  • This polynucleotide is different from the sequence registered in GenBank (GenBank ACCESSION No. L29327), and differs in a 27 bp base.
  • the amino acid sequence to be coded (SEQ ID NO: 2) also differs from the amino acid sequence based on the registered nucleotide sequence (SEQ ID NO: 4) in 19 amino acid residues.
  • the homology of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is 97.3%.
  • the homology of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is 94.3%. Note that these morphologies are calculated based on (GENETYX-MAC (ver. 10.1) Software Development Co., Ltd.).
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding a protein having D-LDH activity.
  • the polynucleotide may be a naturally-occurring polynucleotide such as DNA or RNA, or a polynucleotide containing an artificially synthesized nucleotide derivative. Further, it may be a single strand or a form having a complementary strand thereof.
  • polynucleotide of the present invention is a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 1 is
  • Another embodiment of the polynucleotide of the present invention is another polynucleotide encoding a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. This is because it is sufficient to have a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2. Further, still another embodiment of the polynucleotide of the present invention comprises, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids, and , A polynucleotide having a base sequence encoding a protein having D-LDH activity.
  • probes that can hybridize under stringent conditions are selected from one or more of at least 20, preferably at least 30, for example 40, 60 or 100 contiguous sequences listed in SEQ ID NO: 1. The DNA thus obtained can be used as a probe DNA.
  • Polynucleotides that can hybridize with a DNA or probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions include those containing a nucleotide sequence similar to SEQ ID NO: 1. Such a polynucleotide is likely to encode a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • polynucleotide of the present invention comprises at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, more preferably at least 70% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It encodes a protein that has 95% or more homology and has D-lactate dehydrogenase activity.
  • the homology search of proteins can be performed using the gene angle analysis program BLAST (HYPERLINK http: // blast, genome, ad.jp http: // blast, genome. Ad.jp), FASTA (HYPERLINK http: / / fasta. genome.ad.jp/SIT/FASTA.html
  • the polynucleotide of the present invention has an amino acid sequence having one or more substitutions selected from the amino acid residue substitution table in Table 1 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, -Encodes a protein with lactate dehydrogenase activity.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is the D-LDH strain of Leuconostoc. Mesenteroides registered in GeneBank (GeneBank ACCESSION No. L29327).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has all the substitutions in the amino acid substitution table of Table 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, but does not have all of them. It is expected that a protein having D-LDH activity that can be used in the present invention can be obtained.
  • the number of substitutions is 2 or more, more preferably 11 or more, and even more preferably 19 or more.
  • amino acid residue substitution table of Table 1 it is preferable to have amino acid substitutions of substitution types 1 to 19. Also, more preferably, the substitution type
  • polynucleotide of the present invention has an amino acid sequence of at least positions 78 to 79, 152 to 175, 235, and 296 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It encodes a protein having D-LDH activity.
  • the amino acid sequences at positions 78 to 79, 152 to 175, 235, and 296 are considered to be characteristic in the amino acid of SEQ ID NO: 2, include the amino acid sequence, and have D-LDH activity In such a case, it can be said that the polynucleotide is a preferable polynucleotide of the present invention.
  • a histidine residue at position 296 as an active center and a port having an amino acid residue at positions 152 to 175 of a NADH binding site as a coenzyme are preferred.
  • the polynucleotide is other than a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or having the nucleotide sequence, it encodes a protein that functions equivalently to the protein encoded by the polynucleotide. Nucleotides are included in the polynucleotide of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention can be obtained by any of the various methods described above, can also be chemically synthesized, or can be obtained from other organisms based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 by PCR cloning, hybridization, etc. Can be obtained by For example, it can be isolated from proteins derived from prokaryotic organisms such as lactate bacteria, Escherichia coli, Bacillus subtilis, and fungi, or from eukaryotic organisms such as yeast and octopus.
  • Fujimoto et al.'S method known as a method for synthesizing long-chain DNA (Fujimoto, Hideya, Synthetic Gene Preparation, Plant Cell Engineering Series 7 Plant PCR Experiment Protocol, 1997, Shujunsha, P95-100) Can also be adopted.
  • the present invention can be used even if it is not a homologue of a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. This is because even with such a polynucleotide, the transformant of the present invention into which the polynucleotide has been introduced is useful for producing D-LDH and producing D-lactic acid.
  • having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 has D-LDH activity derived from prokaryotic organisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and Rhizobia, in addition to lactic acid bacteria, regardless of whether they are homologs or not.
  • Polynucleotides encoding proteins or proteins having D-LDH activity derived from eukaryotes such as yeast and octopus can also be used. (protein)
  • the protein of the present invention consists of or has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. These proteins are a preferred embodiment of the present invention.
  • another embodiment of the protein of the present invention is, as described above, an amino acid sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, or additions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It is a protein consisting of a sequence and having D-LDH activity. Still another embodiment has at least 70%, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, -A protein having LDH activity.
  • Still another embodiment has an amino acid sequence having one or more substitutions selected from the amino acid substitution table of Table 1 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, It is a protein having LDH activity.
  • the amino acid sequence IJ described in SEQ ID NO: 4 is a sequence of D-LDH of Leuconostoc. Mesenteroides registered in GeneBank (GeneBank ACCESSION No. L29327).
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 has all the substitutions in the amino acid substitution table in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, but can be used in the present invention even if it does not have all of them. It is assumed that a protein having effective D-LDH activity can be obtained.
  • the number of substitutions is 2 or more, more preferably 11 or more, and even more preferably 19 or more.
  • the amino acid substitution preferably has substitution type 1 to 19 amino acid substitutions, and more preferably has substitution type 6 to 16 amino acid substitutions.
  • Still another embodiment of the protein of the present invention has an amino acid sequence of at least positions 78 to 79, 152 to 175, 235, and 296 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; A protein having lactate dehydrogenase activity. 78th-79th, 152-
  • the amino acid sequences at positions 175, 235, and 296 are considered to be characteristic in the amino acids of SEQ ID NO: 2, and when the amino acid sequence includes the amino acid sequence and has D-LDH activity, the present invention is preferred. It can be said that it is a protein. More preferably, described in SEQ ID NO: 2 It is a protein having a histidine residue at position 296 as an active center and an amino acid residue at positions 152 to 175 of a NADH binding site as a coenzyme in the amino acid sequence of the above.
  • the protein of the present invention as described above is included in the polynucleotide of the present invention, as long as it has D-LDH activity, other than the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the protein of the present invention can be obtained by culturing Leuconostoc. Mesenteroides IF03426 strain. That is, it can be obtained as a culture.
  • the strain can be cultured by a known bacterial culture method.
  • the protein of the present invention can be purified by a known method.
  • the culture itself or the cells can be recovered and used as the enzyme active substance of the present invention.
  • the bacterial cell-purified enzyme or crudely purified enzyme can be used as it is, or can be immobilized.
  • the protein of the present invention is prepared by introducing a site-specific displacement method (Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publi) to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or another amino acid sequence. Using sh. John Wily & Sons Sectoin 8.1-8.5.5) or the like, it can be obtained by appropriately introducing substitution, deletion, insertion, and no or additional mutation.
  • site-specific displacement method Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publi
  • sh. John Wily & Sons Sectoin 8.1-8.5.5 or the like, it can be obtained by appropriately introducing substitution, deletion, insertion, and no or additional mutation.
  • modifications are not limited to those in which mutations are artificially introduced or synthesized, but also include those caused by amino acid mutations in the natural world based on or not limited to artificial mutation treatment. Is done.
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a DNA which is a homolog thereof is obtained, and this DNA is introduced into a host to prepare a transformant, which is then cultured to obtain a homologous protein. Can be obtained.
  • a known protein having a known D-LDH activity can be used.
  • proteins derived from prokaryotes such as lactic acid bacteria, Escherichia coli, Bacillus subtilis, and fungi, or proteins derived from eukaryotes such as yeast and octopus can be used.
  • proteins do not need to be proteins having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and need not be homologs of proteins consisting of the amino acid sequence.
  • the present invention which retains a protein having D-LDH activity so that it can be expressed Is useful for the production of D-LDH and the production of D-lactic acid.
  • cells which are preferable as the gene resources of the polynucleotide or protein of the present invention or the polynucleotide ⁇ protein for obtaining the transformant of the present invention are not limited to naturally occurring organisms. Microorganisms or cells obtained by mutagenesis or the like can also be used as genetic resources.
  • the protein used in the present invention has D-LDH activity, and the activity is measured, for example, using a commercially available kit (LACTATE DEHYDROGENASE (LDH / LD) TEST-UV (manufactured by SIGMA)). can do.
  • LACTATE DEHYDROGENASE LH / LD
  • TEST-UV manufactured by SIGMA
  • the DNA segment is used.
  • This DNA construct can be used as an expression vector by itself or by introducing it into an appropriate vector.
  • a transformant that produces a protein having D-LDH activity can be obtained by transforming a host cell with these DNA constructs. Further, by culturing this transformant, a protein having D-LDH activity can be produced. It can also produce D-lactic acid.
  • a DNA construct that enables the DNA segment consisting of D-LDH-DNA to be expressed in host cells is used.
  • DNA construct for transformation examples include, but are not limited to, plasmid (DNA), bacteriophage (DNA), retrotransposon (DNA), and artificial chromosome (YAC, PAC, BAC, MAC, etc.). It can be selected and adopted depending on the gene transfer form (extrachromosomal or intrachromosomal) and the type of host cell. Therefore, the present DNA construct can include, in addition to the present DNA, a component segment of the vector of any of these embodiments.
  • Preferred prokaryotic vectors, eukaryotic vectors, animal cell vectors, and plant cell vectors are well known in the art.
  • the plasmid DNA includes, for example, YCp-type E. coli-yeast shuttle vector such as pRS413, pRS415, pRS416, YCp50, pAUR112 or pAUR123, YEp-type E. coli-yeast shuttle vector such as pYES32 or YEpl3, pRS403, pRS404 , PRS405, pRS406, 2004/007317 Yip-type E. coli-yeast shuttle vector such as pAURlOl or pAUR135, plasmid derived from E.
  • YCp-type E. coli-yeast shuttle vector such as pRS413, pRS415, pRS416, YCp50, pAUR112 or pAUR123
  • YEp-type E. coli-yeast shuttle vector such as pYES32 or YEpl3, pRS403, pRS404 , PRS405,
  • ColE-based plasmid such as pBR322, pBR325, pUC18, pUC19, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript, pHSG298, pHSG396 or pTrc99A
  • PLA-based plasmid such as pACYC177 or pACYC184, pMW118, pMW119, pMW218 or pMW219 of any pSClOl-based plasmid, etc.
  • plasmid derived from Bacillus subtilis e.g., can be cited pUB110, ⁇ ⁇ 5 etc.
  • phage DNA examples include ⁇ phage (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4; Lgtl00, gtll, zap), ⁇ ⁇ 174, M13mpl8 or M13mpl9.
  • retrotransposons examples include Ty factors.
  • YAC examples include pYACC2.
  • a fragment containing D-LDH-DNA can be cut with an appropriate restriction enzyme, and inserted into a restriction enzyme site of a vector DNA to be used or a multicloning site.
  • the first embodiment of the present DNA construct comprises a promoter segment which is operably linked to a DNA segment consisting of D-LDH-DNA. That is, the present DNA segment is linked to the downstream side of the promoter so that it can be controlled by the promoter.
  • promoters include, for example, pyruvate decarboxylase gene promoter, gal promoter, galO promoter, heat shock protein promoter,
  • MF ct l promoter PH05 promoter
  • PGK promoter PGK promoter
  • GAP promoter GAP promoter
  • ADH promoter it is preferable to use the ADH promoter, A0X1 promoter and the like.
  • a pyruvate decarboxylase (1) gene promoter derived from the genus Saccharomyces is preferred, and a pyruvate decarboxylase 1 gene derived from Saccharomyces cerevisiae is more preferably used. This is because these promoters are highly expressed in the ethanol fermentation pathway of the genus Saccharomyces (Cerepiche).
  • the promoter sequence can be isolated by a PCR amplification method using the genomic DNA of pyruvate decarboxylase 1 gene of yeast belonging to the genus Saccharomyces as type III.
  • nucleotide sequence of the promoter derived from Saccharomyces cerevisiae is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the promoter segment in this DNA construct In addition to the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and the nucleotide sequence in which one or several bases have been deleted, substituted, inserted, Z-added, etc. DNA having promoter activity, and DNA prepared from all or a part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or its complementary chain and hybridizing under stringent conditions, and having promoter activity DNA (in other words, a homolog of the promoter) can be used.
  • the second DNA construct which is another embodiment of the present DNA construct, comprises a DNA segment for homologous recombination of a host chromosome in addition to DNA.
  • the DNA segment for homologous recombination is a DNA sequence homologous to the DNA sequence in the host chromosome near the target site into which the present DNA is to be introduced. At least one, and preferably two, DNA segments for homologous recombination are provided.
  • the two DNA segments for homologous recombination be DNA sequences homologous to the DNA upstream and downstream of the target site on the chromosome, and the present DNA be ligated between these DNA segments.
  • the present DNA can be controllably introduced by a promoter on the host chromosome.
  • the endogenous gene which should be controlled by the promoter can be destroyed at the same time, and foreign D-LDH-DNA can be expressed in place of the endogenous gene. It is particularly useful when the promoter is a high expression promoter in a host cell.
  • a gene that is highly expressed in the host chromosome is targeted, and D-LDH-DNA is introduced downstream of the promoter that controls this gene so that it is controlled by the promoter. It is preferable to do so.
  • the pyruvate decarboxylase gene (particularly, pyruvate decarboxylase 1 gene) is targeted and controlled by the endogenous pyruvate decarboxylase gene promoter. DNA encoding the LDH active protein can be introduced into the DNA.
  • the DNA segment for homologous recombination is composed of the pyruvate decarboxylase 1 gene LDH structural gene region or a sequence in the vicinity thereof (opened). JP2004 / 007317 (including sequences near the start codon, sequences in the upstream region of the start codon, sequences in structural genes, etc.). Also, a segment of the pyruvate decarboxylase gene promoter can be included in the DNA construct.
  • a DNA construct targeting the pyruvate decarboxylase 1 gene of the genus Saccharomyces (especially cerepiche) as a host is used.
  • the disruption of the pyruvate decarboxylase 1 gene and the replacement of this structural gene with D-LDH can be achieved with a single vector.
  • Pyruvate decarboxylase 1 is an enzyme that mediates the reverse addition reaction of pyruvate to acetoaldehyde.By disrupting this gene, it is expected that ethanol production via acetoaldehyde will be suppressed, It is expected that the production of D-lactic acid by D-LDH using pyruvic acid as a substrate is promoted.
  • the first DNA construct can also be used as a DNA construct for homologous recombination by providing a DNA segment for homologous recombination with the host chromosome.
  • the promoter segment in the DNA construct can also be used as a DNA segment for homologous recombination with the host chromosome.
  • a DNA construct having a promoter in the Saccharomyces cerevisiae host chromosome for example, a pyruvate decarboxylase 1 gene promoter as a promoter segment, is capable of linking the host gene to a target site.
  • a targeting vector to be configured. In this case, it is preferable to provide a homologous sequence to the structural gene region on the downstream side of the pyruvate decarboxylase 1 gene.
  • a terminator a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, and a liposome binding sequence (SD sequence) can be linked to the DNA construct, if necessary.
  • the selection marker is not particularly limited, and various known selection genes such as a drug resistance gene and an auxotrophy gene can be used. For example, dihydrofolate reductase gene, hygromycin B, neomycin resistance gene and the like can be used.
  • the DNA construct Once the DNA construct has been constructed, transform it into a suitable host cell. Yon method, transfection method, bonding method, protoplast fusion, electoral porosion method, lipofection method, lithium acetate method, particle gun method, calcium phosphate precipitation method, agglomerate method, PEG method, direct micro This can be introduced by any of a variety of suitable means, such as injection techniques. After introduction of the DNA construct, the recipient cells are cultured in a selective medium.
  • Host cells include bacteria such as Eshrichia coli and Bacillus subtilis, yeast such as Saccharomyces 'cerevisiae, Shizosaccharomyces' bomb (Saccharomyces pombe) s Pichia pastoris, and insect cells such as sf9 and sf21. , COS cells, animal cells such as diatom hamster ovary cells (CH0 cells), and plant cells such as sweet potato and tobacco.
  • it is a microorganism such as yeast that performs alcohol fermentation or an acid-resistant microorganism, for example, yeast such as Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae. More specifically, Saccharomyces' Celebiche IF02260 strain and YPH strain.
  • the components of the DNA construct will be present on the chromosome or on extrachromosomal factors (including artificial chromosomes). If the DNA construct is maintained extrachromosomally or is integrated into the chromosome by random integration, other enzymes using pyruvate as a substrate of LDH as a substrate, for example, pyruvate deprivation It is preferable that the gene for the carbonic enzyme (in the yeast of the genus Saccharomyces, pyruvate decarboxylase 1 gene) is knocked out by a targeting vector.
  • the DNA construct described above which is capable of achieving homologous recombination, it is controlled by the desired promoter on the host chromosome, the promoter replaced with the promoter, or the promoter downstream of the homolog thereof.
  • the desired promoter on the host chromosome There will be D-LDH-DNA operably linked.
  • the pyruvate decarboxylase 1 gene promoter on the host chromosome, the promoter replaced with the promoter, or the promoter downstream of the homolog can be controlled by the promoter.
  • -It is preferable to have LDH-DNA.
  • a selectable marker gene or a part of the disrupted structural gene is used downstream of the D-LDH-DNA is used downstream of the D-LDH-DNA is used downstream of the D-LDH-DNA in the homologous recombinant. Corresponding to).
  • D-LDH-DNA The ability to produce the protein encoded by D-LDH-DNA as a result of the introduction of the DNA construct.In particular, it breaks down the yeast pyruvate decarboxylase gene and, at the same time, under the control of the promoter of the gene or its homolog.
  • D-LDH By introducing D-LDH, it is possible to produce D-LDH even in yeast which does not originally produce D-lactic acid, and as a result, it is possible to produce D-lactic acid.
  • yeast specifically, Saccharomyces, typically cerevisiae
  • yeast produces only D-lactic acid by introducing D-LDH-DNA under the promoter of the pyruvate decarboxylase 1 gene or a homolog thereof.
  • D-DLH-DNA encodes a protein having D-LDH activity, it is presumed that it is highly expressed by the promoter, and it is inferred that it contributes to high production of D-lactic acid.
  • coding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with D-LDH-DNA also contributes to high production of D-lactic acid and selective production of D-lactic acid or D-lactic acid. Is done.
  • D-LDH-DNA has been introduced under a desired promoter can be confirmed by a PCR method or a Southern hybridization method. For example, it can be confirmed by preparing DNA from a transformant, performing PCR using an introduction site-specific primer, and detecting an expected band in the electrophoresis of the PCR product. Alternatively, it can be confirmed by performing PCR using primers labeled with a fluorescent dye or the like. It can also be identified by the protein produced by the transformant. These methods are well known to those skilled in the art.
  • a transformant into which a large number of copies of the D-LDH gene have been introduced by introducing the DNA construct.
  • two or more copies, preferably 4 to 10 copies of D-LDH-DNA are introduced.
  • a transformant in which the D-LDH gene has been introduced in multiple copies has significantly improved D-lactic acid-producing ability.
  • the productivity of D-lactic acid can be significantly improved.
  • a culture By culturing the transformant obtained by introducing the DNA construct, a culture can be obtained. D-LDH, which is the expression product of the foreign gene, is produced therein, and D-lactic acid is produced. Lactic acid can be obtained by performing the step of separating lactic acid from the culture.
  • the culture includes not only the culture supernatant but also cultured cells or bacterial cells, or crushed cells or bacterial cells.
  • D-lactic acid can be selectively produced by using a cell such as yeast which does not naturally produce D-lactic acid as a host.
  • D-lactic acid can be obtained efficiently by using fermenting microorganisms.
  • transformants using yeast as a host are useful for high production of D-lactic acid because of rapid growth. According to such a transformant capable of selectively producing D-lactic acid, it is not necessary to separate optical isomers, and a more efficient production of one layer is possible.
  • culturing conditions can be selected according to the type of the transformant.
  • Such culture conditions are well known to those skilled in the art.
  • the medium for culturing transformants obtained using microorganisms such as Escherichia coli and yeast as a host contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganisms, and efficiently cultivates the transformants. Any of natural and synthetic media can be used as long as the culture can be performed in the same manner.
  • the carbon source carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, starch, and cellulose, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • ammonia As a nitrogen source, ammonia, an ammonium salt of an inorganic acid or an organic acid such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor, etc. are used. be able to.
  • the inorganic substance potassium potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the cultivation can usually be performed at 30 ° C. for an appropriate time under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and stirring culture. For example, it can be performed for 6 to 120 hours.
  • the pH is preferably maintained at 2.0 to 6.0.
  • the pH can be adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like.
  • a medium for culturing transformants obtained using animal cells as a host generally used RPMI 1640 medium or DMEM medium used in JP2004 / 007317, or a medium obtained by adding a fetal serum or the like to these mediums can be used.
  • the cultivation is carried out 5% C0 2 the presence of 1 to 30 days 37 ° C.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as needed.
  • the culture may be a batch type or a continuous type.
  • a method of obtaining as D-lactic acid, which is neutralized with an alkali such as ammonium or calcium salt, and obtaining as a lactate such as D-lactic acid ammonium or D-calcium lactate as free-form D-lactic acid can also be adopted.
  • various combinations of ordinary purification means can be used to separate the gene product D-lactic acid from the culture.
  • the gene product when produced in transformed cells, the gene product can be separated from the cells by disrupting the cells by ultrasonic crushing, trituration, pressure crushing, etc., in a conventional manner. . In this case, a protease is added as needed. If D-lactic acid is produced in the culture supernatant, the solid content of this solution is removed by filtration or centrifugation.
  • the culture solution can be subjected to at least one solid-liquid separation process such as belt press, centrifugation, or filter press to perform the solid-liquid separation step. It is preferable to perform a purification step on the separated filtrate.
  • a purification step for example, an organic acid or saccharide other than lactic acid is removed from the filtrate containing lactic acid by electrodialysis to obtain an aqueous solution of lactic acid or ammonium lactate.
  • ammonia can be decomposed by a bipolar membrane or the like to form a lactic acid aqueous solution and ammonia water.
  • the temperature of the various liquids during electrodialysis is usually 2045 ° C, preferably in the range of 35 to 40 ° C.
  • Amino acids, inorganic ions (K, Ca, Mg, etc.) and organic acids (taenoic acid, malic acid, etc.) that could not be removed by electrodialysis can be removed at a later stage by a chromatographic separation device or ion exchange device.
  • the obtained lactic acid solution can be concentrated. For example, water in the solution is evaporated to obtain a lactic acid solution having a concentration of 50 to 90%.
  • the culture solution and the crude extract fraction are not limited to the above-mentioned methods, and it is possible to purify D-lactic acid or a salt thereof using various purification methods such as separation and extraction with an organic solvent and distillation. it can. If necessary, various D-lactic acid derivatives can be obtained by subjecting the culture solution, the crude extract fraction and its purified product to esterification, lactide formation, oligomerization, or prevolimerization. it can. If necessary, one or more of D-lactic acid, a salt thereof, and a derivative thereof can be collected from the lactic acid fermentation solution.
  • D-lactic acid can be produced not by a culture system but by an enzyme reaction system.
  • the enzymatic reaction conditions may be those that can produce D-lactic acid, and D-lactic acid obtained by such a method can be subjected to various derivatizations.
  • a lactic acid-based polymer can be produced by using the obtained D-lactic acid, a salt thereof, and a derivative thereof as at least one kind of a polymer material.
  • a polymer material besides a monomer of D-lactic acid or a derivative thereof, a prepolymer or oligomer obtained by polymerizing these to an appropriate length can also be used.
  • L-lactic acid and its derivatives, and these prepolymers and oligomers can also be used.
  • lactic acid-based polymers include homopolymers of D-lactic acid, heteropolymers with L-lactic acid, heteroblock polymers, and various heteropolymers with other polymer materials other than lactic acid. Can be.
  • a lactic acid-based polymer can be obtained by reacting these lactic acid-based polymer materials, or a lactic acid-based polymer material and another polymer material together with a suitable polymerization initiator.
  • D-lactic acid selective production and high production of D-lactic acid are possible, so that D-lactic acid can be obtained with high efficiency, and as a result, lactic acid using D-lactic acid as a material for polymerization
  • the system polymer can be produced efficiently.
  • Example 1 Isolation of D-lactate dehydrogenase gene
  • D-LDH gene sometimes simply referred to as the D-LDHME gene
  • the genomic DNA of IF03426 strain (a strain registered with the Fermentation Research Institute, Japan) was isolated as a type III by PCR amplification.
  • the genomic DNA of this strain was determined using a genomic DNA preparation kit, Fast DNA Kit (Bio101) according to the attached protocol.
  • the DNA concentration of the prepared genomic DNA was measured using a spectrophotometer Urtro spec 3000 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).
  • K0D Plus DNA Polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), which is considered to have high accuracy of the amplified fragment, was used as the amplification enzyme.
  • the ⁇ 1 reaction solution was subjected to DNA amplification using a PCR amplifier Gene Amp PCR system 9700 (manufactured by PE Applied Biosysteras).
  • the reverse conditions of PCR are as follows: after heat treatment at 96 ° C for 2 minutes, one cycle consists of three types of temperature changes: 96 ° C for 30 seconds, 53 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 90 seconds This was repeated for 25 cycles and finally to 4 ° C.
  • This reaction sample 5 ⁇ 1 was electrophoresed on a 1% TBE agarose gel (containing 0.5 / _ig / ml of ethidium bromide), and the gel was subjected to DNA banding by 254 nra ultraviolet irradiation (Funakoshi). Was detected, and the amplified gene fragment was confirmed.
  • the primer DNA used in the reaction was synthetic DNA (Sade Technology Co., Ltd.), and the DNA sequence of this primer was as follows.
  • the PCR amplified fragment was subcloned into pBluescriptll SK + vector (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • a series of reaction operations was performed according to a general DNA subcloning method. That is, the restriction enzyme Eco RV (Takara Shuzo) and phosphatase
  • Eco RV Transcription Ribonuclease
  • Alkaline Phosphatase manufactured by Takara Shuzo
  • T4 DNA Ligase for the T4 DNA Li gase reaction, LigaFast Rapid DNA Ligation (promega) was used, and the details followed the attached protocol.
  • Competent cells were JM109 strain (manufactured by Toyobo), and the detailed handling was in accordance with the attached protocol. Colony selection was performed on an LB plate containing ampicillin lOOig / ml, plasmid DNA was prepared from each selected colony, PCR was performed using the above primer DNA, and the D-LDH gene of interest was obtained. Subcloned. The detailed manual of the different operation such as ethanol precipitation treatment and restriction enzyme treatment followed Molecular Cloning A Laboratory Manual second edition (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989).
  • the nucleotide sequence of the D-LDH gene obtained in this manner was determined.
  • Nucleotide sequence ABI PRISM 310 Genetic Analyzer PE Applied Biosystems
  • sample preparation methods and equipment were used. For details of the method, etc., we followed the manual attached to the equipment.
  • the isolated vector DNA containing the D-LDH gene was prepared by an alkali extraction method, and this was purified by GFX DNA Purification kit (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and then purified with a spectrophotometer Urtro spec 3000 (Amersham Pharmacia Biotech), and the DNA concentration was measured and used.
  • SEQ ID NO: 1 The DNA sequence determined by sequence analysis is shown in SEQ ID NO: 1, and the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Figures 1A and B show the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the D-LDHME gene obtained this time.
  • FIG. 3 shows homology data with the base sequence (SEQ ID NO: 3) of the D-LDH gene registered in GenBank.
  • the upper sequence shows the base sequence of the D-LDH gene obtained in this example, and the lower sequence shows the base sequence of the registered D-LDH gene.
  • Figure 2 shows the amino acid sequence corresponding to the nucleotide sequence of the D-LDHME gene obtained this time (SEQ ID NO: 2) and the registered amino acid sequence corresponding to the nucleotide sequence of the D-LDH gene (SEQ ID NO: 4).
  • 1 shows the homology data of.
  • the upper sequence shows the amino acid sequence corresponding to the D-LDHME gene obtained in this example, and the lower sequence shows the amino acid sequence corresponding to the registered D-LDH gene.
  • amino acid sequence of the gene obtained in this example had the amino acid residue substitution shown in Table 2.
  • a chromosome transfer vector capable of expressing the D-LDHME gene obtained in Example 1 as a target gene under the control of the bilbic acid decarboxylase 1 gene (PDC1) promoter sequence from Saccharomyces cerevisiae was constructed.
  • This newly constructed chromosome transfer vector was named pBTRP-PDC1-DLDHME vector.
  • a series of reaction operations in the construction of the vector were performed according to a general DNA subcloning method.
  • FIGS. A series of enzymes involved in vector construction were all manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. Note that the vector construction procedure is not limited to this.
  • PDC1 gene promoter fragment PDC1 gene promoter fragment
  • PDC1D PDC1 gene downstream region fragment
  • IF02260 971 bp of the promoter fragment of the PDC1 gene (PDC1P) and 518 bp of the downstream region of the PDC1 gene (PDC1D), which are necessary gene fragments, were obtained using the Saccharomyces cerevisiae IF02260 strain as a genetic resource. It was isolated by PCR amplification using genomic DNA as type I.
  • the IF02260 strain is a strain registered with the Fermentation Research Institute.
  • the genomic DNA of this strain was determined using a genomic DNA preparation kit, Fast DNA Kit (manufactured by Bio101), according to the attached protocol.
  • the DNA concentration of the prepared genomic DNA was measured with a spectrophotometer Urtro spec 3000 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).
  • the accuracy of the amplified fragment is considered to be high as the amplification enzyme
  • KOD Plus DNA Polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used. 50 ng of genomic DNA of IF02260 strain prepared in advance, 50 pmol of primer DNA X 2, 10 X K0D Enzyme reaction buffer
  • DNA amplification was performed using 9700 (manufactured by PE Applied Biosystems).
  • the PCR reaction conditions were as follows: heat treatment at 96 ° C (: 2 minutes, 30 seconds at 96 ° C, 30 minutes at 53 ° C). The three types of temperature change of 90 seconds at 72 ° C for one second were defined as one cycle, and this was repeated for 25 cycles, and finally at 4 ° C.
  • This reaction sample 5 ⁇ 1 was electrophoresed on a 1% TBE agarose gel (containing 0. S ⁇ g / ml ethidium bromide), and this gel was irradiated with 254 nm ultraviolet light (Funakoshi). The DNA band was detected, and the amplified gene fragment was confirmed.
  • the primer DNA used in the reaction was synthetic DNA (Sade Technology Co., Ltd.).
  • the DNA sequence of this primer was as follows.
  • the PDC1P amplified fragment was digested with restriction enzymes BamHI / EcoRI and
  • the amplified PDC1D fragment was treated with a restriction enzyme Xhol / Apal.
  • a restriction enzyme Xhol / Apal for a detailed manual of the series of procedures for ethanol precipitation and restriction enzyme treatment, see Molecular
  • the obtained culture was spread on an LB plate containing 100 g / ml of the antibiotic ampicillin, and cultured.
  • the grown colonies were confirmed by colony PCR using the primer DNA of the insert fragment, and confirmed by restriction enzyme treatment of the plasmid DNA preparation solution by miniprep, and the target vector pBPDClP vector was isolated. ( Figure 3, middle).
  • pYLDl vector (described in JP-A-2001-204468) constructed by Toyota Motor Corporation was treated with the restriction enzyme EcoRI / Aatll and the terminal modification enzyme T4 DNA polymerase.
  • the LDH gene (derived from Bifidobacterium longum) fragment obtained in the above was subcloned into the pBPDClP vector, which had also been treated with the EcoRI restriction enzyme and T4 DNA polymerase, and subcloned in the same manner as described above.
  • a pBPDClP-LDHI vector was prepared (middle to bottom in FIG. 3).
  • the above pYLDl vector was introduced into Escherichia coli (name: “E.
  • this vector was treated with Xhol / Apal, and the amplified PDC1D fragment similarly treated with restriction enzymes was ligated to prepare a pBPDClP-LDHII vector (upper row in FIG. 4).
  • the pBPDClP-LDHII vector that had been treated with EcoRV and T4 DNA polymerase was ligated with a Trp marker fragment obtained by treating the pRS404 vector (promega) with Aatll / Sspl and T4 DNA polemerase.
  • PBTRP-PDC1-LDH vector See lower part of Fig. 4).
  • the already obtained pBPDClP vector was treated with the restriction enzyme HincII and the phosphatase Alkaline Phospatase.
  • the fragment containing the Trp marker was ligated to construct the pBTRP-PDC1PII vector. did.
  • the D-LDHME gene fragment isolated in Example 1 was ligated into a vector obtained by treating the pBTRP-PDC1PII vector with a restriction enzyme treatment EcoRV and treating with a terminal modification enzyme T4 DNA polymerase.
  • D-LDH genes As other D-LDH genes, oligonucleotides were synthesized according to the gene sequence (SEQ ID NO: 3) in the D-1DH gene database GenBank ACCESSION No. L29327 derived from the lactic acid bacterium Leuconostoc mesenteroides, and these were sequentially ligated. Eligible! )-LDH gene was totally synthesized. The same procedure as in this example was applied to this gene fragment to construct a chromosome transfer vector.
  • the host yeast strain IF02260 (a strain registered with the Fermentation Research Institute) that lacks the ability to synthesize tryptophan is cultured in lOmlYPD medium at 30 ° C until logarithmic growth and collected. And washing with TE buffer was performed. Next, 0.5 ml of TE buffer and 0.5 ml of 0.2 M lithium acetate were added, and after shaking culture at 30 ° C for 1 hour, restriction enzymes Apal and Spel (both from Takara Shuzo) were added. Was added to pBTRP-PDC1-DLD orchid E.
  • This strain was cultured in a YPD culture solution, and genomic DNA was prepared using a genomic DNA preparation kit FAST DNA Kit (Bio 101). When the presence or absence of the transgene was confirmed using PCR, a strain in which the D-LDHME gene had been introduced downstream of the PDC1 promoter was obtained.
  • the obtained transgenic strain was applied to a spore induction medium, and spore induction was performed at 30 ° C. for 4 days.
  • Bacteria were collected from the culture medium, added with 5 units of Zymolase (Zymorisearch), and subjected to an enzymatic reaction at 37 ° C for 1 hour, followed by a microscope (Olympus) and a micromanipulator (Narimo Kagaku). Was used to separate spores on YPD medium.
  • the progeny of the obtained spores was confirmed to have the ability to select tryptophan markers, and it was confirmed that the spores were separated 2: 2 by PCR, and the desired diploid strain was obtained.
  • the diploid strains were TC14-6-1A, TC14-6-2A, and TC14-63A.
  • the obtained diploid strain has the structure shown in FIG. 7 in the yeast chromosome.
  • D-LDH gene chromosome transfer vector constructed in Example 2 was also transferred to the IF02260 strain lacking tryptophan synthesis ability in the same manner as described above, and confirmed by PCR. , D-LDH has been introduced into the chromosome
  • a self-propagating vector was constructed by introducing DLDHME into pYPD1 plasmid, a yeast self-proliferating 2 ⁇ -type plasmid vector, and the vector was introduced into the IF02260 strain in the same manner as described above. As a result, a strain (TC21-1 strain) carrying the plasmid having the D-LDH gene was obtained.
  • a fermentation test was performed on the five types of transformed strains prepared in Example 3 and the parent strain IF02260. Each strain was inoculated into 5ral YPD liquid medium, subjected to shaking culture at 30 ° C. and 130 rpm to prepare cells required for fermentation production.
  • the grown cells were collected, inoculated in a YPD liquid medium containing 10% glucose to a cell concentration of 0.5%, and fermented for 4 days at 30 ° C in a static condition.
  • D-lactate with 2.5% calcium carbonate (Narakai Testa) added to the fermentation broth and free D-lactic acid without calcium carbonate.
  • One I checked the formula.
  • the parent strain the non-transgenic yeast (IF02260 strain) produces ethanol but not D-lactic acid, whereas the four strains prepared in Example 3 did not.
  • the chromosome-introduced transformed yeast has reduced ethanol production relative to the parent strain, none of them! )-Lactic acid production was confirmed.
  • transformants TC14-6-1A, TC14-6-2A, TC14-6-3A, and D-LDH which are transformants in which the D-LDHME gene has been introduced downstream of the chromosomal PDC1 promoter.
  • D-lactic acid was produced at a concentration of 4-6% and ethanol was 2-3%. L-lactic acid was not produced in these chromosomal transfer transformants.
  • chromosomal integration is effective for D-LDH expression and D-lactic acid production.
  • the D-LDH gene (including the D-LDHME gene) is introduced under the control of the PDC1 promoter. was found to be effective for high production of D-lactic acid.
  • D-lactic acid The high production of D-lactic acid is due to both D-lactate (calcium) and free L-lactic acid. Were observed to the same extent.
  • Example 5 Genetically modified yeast having an increased number of introduced copies of the D-LDHME gene
  • the TC14-6-3A strain was used to transfer the D-LDHME gene.
  • a genetically modified yeast with an increased number of introduced copies of offspring was produced.
  • the method of introducing the D-LD dragon E gene into the TC14-6-3A strain was in accordance with the method described in Example 3. That is, in this example, the D-LDHME gene was introduced into the TC14-6-3A strain by the method described in Example 3, except that the TC14-6-3A strain was used instead of using the yeast IF02260 strain as a host. did.
  • the resulting transgenic strain TD1- 10- 1B lines, TD1- 10- 3 B strains, TD1- 10- 6A Kabu ⁇ Pi TD1-10 - was named 7D strain.
  • 7D strain The resulting transgenic strain TD1- 10- 1B lines, TD1- 10- 3 B strains, TD1- 10- 6A Kabu ⁇ Pi TD1-10 - was named 7D strain.
  • the copy number of the introduced D-LDHME gene was confirmed for these four strains in the same manner as in Example 3, it was found that four copies of the D-LDHME gene had been introduced.
  • D-lactic acid-producing ability in the transformed yeast could be improved by increasing the introduced copy number of the D-LDHME gene.
  • the transformed yeast into which four copies of the D-LD simple E gene had been introduced was examined.However, by introducing the D-LDHME gene at a higher copy number, D-lactic acid production can be further improved. . That is, according to the present example, it was found that a transformed yeast having more excellent D-lactic acid-producing ability can be produced by increasing the number of copies into which the D-LDHME gene was introduced. All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety. Industrial potential ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the efficient production technique of D-lactic acid can be provided. Sequence listing free text
  • SEQ ID NOS: 6 to 11 Artificial DNA (primer)

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Abstract

D-乳酸生産に利用できる、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び当該タンパク質を提供する。（ａ）配列番号1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（ｂ）配列番号1記載の塩基配列の全体もしくはその一部から調製されるプローブ又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、D-乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを利用する。

Description

D -乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA及びその利用
技術分野
この発明は、 D-乳酸及び D-乳酸を利用したポリマーを製造する技術に関し、 詳 しくは、酵母に D -乳酸を生産させるのに適する D-乳酸脱水素酵素活性を備えるタ ンパク質及び当該タンパク質をコー明ドする塩基配列を有する DNAとこれらを利用 する分野に関する。 書
背景技術
組換え DNA技術の進歩により、 微生物、 カビ、 動植物および昆虫などの宿主で 外来遺伝子を発現させ、 その形質転換体を増殖させることによって、 目的遺伝子 産物を取得する技術が発展してきた。 例えば、 酵母などの培養によれば、 発酵生 産により大量の目的遺伝子産物を生産させることも可能である。
近年、 カーボンニュートラルの考え方から、 植物由来プラスチックの原料とな る乳酸の効率的生産の要請が高まっている。
乳酸には、光学異性体である L -乳酸と D -乳酸とがあるが、 D -乳酸を発酵生産す る技術としては、 ビール酵母を含む培地を用いて D-乳酸生産する乳酸菌による発 酵で生産することが知られている （特許文献 1)。 また、 ブルガリア乳酸棹菌を利 用する方法も知られている （特許文献 2)。 さらに、 光学純度の高い D-乳酸を得る 技術も開示されている （特許文献 3、 4及び 5)。 これらの乳酸生産微生物は、 生 産速度も遅く、 また、 複雑な培地組成を要求するため、 工業生産には不向きであ つた。
さらに、 エタノール生産能を欠失しているか、 相対的に低いエタノール生産能 を有する酵母菌に乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込んだ組換え体を用いて乳酸を生 産させる技術も存在している （特許文献 6) 、 この技術では L -乳酸を生産する ことしか開示されていない。 さらに、 高いピルビン酸生産能を有する酵母に D -乳 酸脱水素酵素遺伝子を導入して D -乳酸を生産させることも開示されている （特許 文献 7) 力 この方法では、 高いピルビン酸生産能を有する酵母における高いピ ルビン酸濃度に着目したものであり、 一般の酵母での生産を示しているものでは なレヽ。
特許文献 1
特開昭 5 8 - 1 6 6 88号公報
特許文献 2
特開昭 58— 3 6 3 94号公報
特許文献 3
特開昭 6 1 - 29 3 38 7号公報
特許文献 4
特開平 4一 2 7 1 78 7号公報
特許文献 5
特開 200 1— 2906 3号公報
特許文献 6
特表 200 1— 5 1 6584号公報
特許文献 Ί
特開 2002— 1 3 629 3号公報
そこで、 本発明の課題は、 D-乳酸生産に利用できる、 乳酸脱水素酵素活性を有 するタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び当該タンパク質を提供し、 ま た、 このポリヌクレオチドを利用した優れた D-乳酸生産系を提供することにより、 D -乳酸の効率的な生産技術を提供することである。 発明の開示
上記課題を解決するために、 本発明者らは、 D-乳酸脱水素酵素及び当該酵素を 発現する遺伝子について探索したところ、優れた D-乳酸生産能を発揮する形質転 換系を見出した。 すなわち、 優れた D-乳酸生産に寄与できる、 D-乳酸脱水素酵素 活性を有するタンパク質、 当該酵素活性を有するタンパク質をコードする DNA、 また、 当該 DNAによる形質転換体を見出し、 さらに、 これらを利用した D -乳酸生 産方法、 並びにポリ乳酸製造方法を見出した。 これらの知見により、 本発明は以下の手段を提供する。
( 1 ) 以下の （a ) 〜 （g ) のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
( a ) 配列番号 1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド。
( b ) 配列番号 1記載の塩基配列の全体もしくはその一部の塩基配列から調製さ れるプローブ又はその相補鎖とス トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ、 D -乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
( c ) 配列番号 2記載のァミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌク レオチド。
( d ) 配列番号 2記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置 換、 欠失、 挿入、 又は付加を含むアミノ酸配列からなり、 かつ、 D-乳酸脱水素酵 素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
( e ) 配列番号 2に記载のァミノ酸配列と 70%以上の相同性を有し、 D-乳酸脱水 素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
( f ) 配列番号 4に記載のァミノ酸配列において、 表 1のァミノ酸残基置換表か ら選択される 1種あるいは 2種以上の置換を有するアミノ酸配列を有し、 D -乳酸 脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
表 1
ァミノ酸残基置換表
置換タイプ 置換位置 置換アミノ酸
1 4 0 ノ リン Val
2 1 1 2 ィソロイシン lie
3 1 3 1 ヒスチジン His
4 1 3 9 ィソロイシン lie
5 1 8 1 グルタミン酸 Glu
6 2 6 6 グリシン Gly
7 2 6 7 ロイシン Leu
8 2 6 8 フエ二ルァラニン Phe
9 2 6 9 ァスパラギン Asn
1 0 2 7 0 グルタミン酸 Glu 1 1 2 7 1 ァスパラギン酸 Asp
1 2 2 7 2 トリプトファン Trp
1 3 2 7 3 セリ ン Ser
1 4 2 7 4 ダリシン Gly
1 5 2 7 6 グルタミン酸 Glu
1 6 2 7 7 フエ二ルァラニン Phe
1 7 2 8 7 セリン Ser
1 8 2 9 2 ロイシン Leu
1 9 2 9 3 ノくリ ン Val
ただし、 上記表における置換位置は開始コドンに対応するメチォニンからの位 置として示す。
( g ) 配列番号 2のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 78〜79位、 152〜： L75位、 235位、 296位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、 D -乳酸脱水素酵素活性 を有する、 タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
( 2 ) 下記 （h ) 〜 （ 1 ) のいずれかに記載のタンパク質。
( h ) 配列表の配列番号 2記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
( i ) 配列表の配列番号 2記载のァミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミ ノ酸の置換、 欠失、 挿入、 又は付加を含むアミノ酸配列からなり、 かつ、 D-乳酸 脱水素酵素活性を有するタンパク質。
( j ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有し、 D -乳酸脱水 素酵素活性を有するタンパク質。
( k ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 表 1のアミノ酸残基置換表か ら選択される 1種あるいは 2種以上の置換を有するアミノ酸配列を有し、 D -乳酸 脱水素酵素活性を有するタンパク質。
( 1 ) 配列番号 2のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 78〜79位、 152〜175位、 235位、 296位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、 D-乳酸脱水素酵素活性 を有するタンパク質。
( 3 ) DNA構築物であって、
( 1 ) に記載の DNAを有する DNAセグメントと、 プロモーター又は当該プロモーターのホモログをコードする DNAを有する DNA セグメント、
とを備える、 DNA構築物。
(4) 前記プロモーターは、 ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターである、 (3) 記載の DNA構築物。
(5) 前記プロモーターは、 サッカロマイセス属のピルビン酸脱炭酸酵素 1遺伝 子プロモーターである、 （3) 又は （4) に記載の DNA構築物。
( 6 ) 前記プ口モーターは、 サッカロマイセス 'セレピシェのピルビン酸脱炭酸酵 素 1遺伝子プロモーターである、 （5) 記載の DNA構築物。
(7) 宿主中に （1) に記載の DNAを発現可能に保持する形質転換体。
( 8 )宿主が、酵母並びに真菌を含む真核微生物、及ぴ乳酸菌、 Echerichia属菌、 並びに Bacillus属菌を含む原核微生物からなる群から選択される微生物である、
(7) 記載の形質転換体。
(9) 前記 DNAは、 プロモーターあるいは当該プロモーターのホモログの制御下 において発現可能に保持されている、 （7) 又は （8) に記載の形質転換体。
( 1 0)前記プロモーターは、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターである、 (9) 記載の形質転換体。
(1 1) 前記プロモーターは、 サッカロマイセス属のピルビン酸脱炭酸酵素 1遺 伝子プロモーターである、 （9) または （1 0) に記載の形質転換体。
(1 2) 前記 DNAは、 宿主ピルビン酸脱炭酸酵素 1遺伝子プロモーターの制御下 において発現可能に保持されている、 （1 1) に記載の形質転換体。
(1 3) 前記宿主微生物がサッカロマイセス 'セレピシェである、 （7) 〜 （1 2) のいずれかに記載の形質転換体。
(1 4) D-乳酸の生産方法であって、
(7) 〜 （1 3) のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程と、
当該培養物から D-乳酸、 その塩、 及びその誘導体のうちの 1種あるいは 2種 以上を採取する工程、
とを備える、 方法。
(1 5) 乳酸系ポリマーの生産方法であって、 ( 7 ) 〜 （1 3 ) のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程と、 当該培養物から D-乳酸、 その塩、 及ぴその誘導体のうちの 1種あるいは 2種以 上を採取する工程と、
揉取した D -乳酸あるいはその誘導体を少なくとも 1種の重合材料として用いて 乳酸ポリマーを製造する工程、
とを備える、 方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003- 145085号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1 Aは、 配列番号 1に記載の塩基配列と配列番号 3に記載の塩基配列とのホ モロジ一データである。
図 1 Bは、 図 1 Aの続きであり、 配列番号 1に記載の塩基配列と配列番号 3に 記載の塩基配列とのホモ口ジーデータである。
図 2は、 配列番号 2に記載のァミノ酸配列と配列番号 4に記載のァミノ酸配列 とのホモロジ一データである。
図 3は、 pBTRP- PDC1-DLDHMEベクターの構築工程の一部を示す図である。
図 4は、 pBTRP- PDC1-DLDHMEベクターの構築工程の一部を示す図である。
図 5は、 pBTRP-PDCl- DLDHMEベクターの構築工程の一部を示す図である。
図 6は、 pBTRP- PDC1- DLDHMEベクターの構築工程の最終工程を示す図である。 図 7は、 実施例 3において得られた 2倍体の形質転換酵母の染色体構造の一部 を示す図である。
図 8は、 親株及び染色体導入型形質転換株の D-乳酸塩 （カルシウム塩） の発酵 試験結果を示すグラフ図であって、各株の D -乳酸塩とエタノールの生産量を示し ている。
図 9は、 親株、 染色体導入型形質転換株及び自己複製型プラスミ ド型形質転換 株のフリ一 D-乳酸の発酵試験結果を示すグラフ図であって、各株の D-乳酸とエタ ノール生産量を示している。
図 1 0は、 D- LDHME遺伝子を 2コピー導入した株及ぴ D- LDHME遺伝子を 4コピ 一導入した株における、 フリ一 D-乳酸の発酵試験結果を示すグラフ図であって、 各株の D -乳酸とエタノール生産量を示している。 発明を実施するための形態
本発明のポリヌクレオチドは、 D-乳酸脱水素酵素 （D- LDH) 活性を有するタンパ ク質をコードする塩基配列を有している。
また、 本発明のポリヌクレオチドを用いることにより、 本タンパク質を発現す る形質転換体及び D-乳酸を生産する形質転換体を作製することができる。 また、 本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を用いる酵素反応系 において D-乳酸を製造することができる。
これらの発明によれば、 新たな D -乳酸原料の供給源を提供することができる。 また、 これらの発明によれば、 D-乳酸を高い選択性で、 あるいは高効率で生産す ることができる。
したがって、 これらの発明、 すなわち、 本タンパク質を用いた酵素反応系ある いは本タンパク質を発現する形質転換体により生産する D-乳酸を用いて、乳酸系 ポリマーを生産する技術も提供することができる。
以下、 本発明のポリヌクレオチド、 タンパク質、 形質転換体、 さらに D-乳酸の 製造等について説明する。
本発明のポリヌクレオチドは、 以下のいずれかを含むことができる。
すなわち、
( a ) 配列番号 1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド。
( b ) 配列番号 1記載の塩基配列全体もしくはその一部の塩基配列から調製され るプローブ又はその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 か つ、 D- LDH活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
( c ) 配列番号 2記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌク レオチド。
( d ) 配列番号 2記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置 換、 欠失、 挿入、 又は付加を含むアミノ酸配列からなり、 かつ、 D -乳酸脱水素酵 素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 ( e ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有し、 D -乳酸脱水 素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
( f ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 表 1のアミノ酸置換表から選 択される 1種あるいは 2種以上の置換を有するアミノ酸配列を有し、 D -乳酸脱水 素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
( g ) 配列番号 2のアミノ酸配列のうち、 少なく とも 78〜79位、 152〜175位、 235位、 296位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、 D-乳酸脱水素酵素活性 を有する、 タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
本発明の配列番号 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、 配列番号 2 記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている。 また、 このポリヌ クレオチドは、 乳酸菌であるロイコノストック .メセンテロイデス （Leuconostoc mesenteroi des)に由来し、具体白勺には、当亥 Leuconostoc. mesenteroi des IF03426 株 （社団法人発酵研究所に登録されている株である。） に由来している。
本ポリヌクレオチドは、 GenBankに登録されている配列（GenBank ACCESSION No. L29327) と相違しており、 27bpの塩基において相違している。 結果として、 コー ドするアミノ酸配列 （配列番号 2) においても、 19ァミノ酸残基が登録塩基配列 に基くアミノ酸配列 （配列番号 4) と相違している。 配列番号 1 に記載の塩基配 列の配列番号 3に記載の塩基配列に対するホモロジ一は、 97. 3%である。 また、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列は、 配列番号 4に記載のァミノ酸配列に対する ホモロジ一が 94. 3 %である。 なお、 これらのホ 'モロジ一は、 （GENETYX-MAC (ver. 10. 1) ソフトウェア開発株式会社製） に基いて算出されている。
本発明は、 D- LDH活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関 している。 なお、 本発明においてポリヌクレオチドは、 DNA、 RNAのような天然に 存在するポリヌクレオチドであってもよいし、 人工的に合成されたヌクレオチド 誘導体を含むポリヌクレオチドにすることもできる。 また、 1 本であっても、 そ の相補鎖を有する形態であってもよい。
本発明のポリヌクレオチドの一つの態様は、 配列番号 1に記載の塩基配列を有 するポリヌクレオチドである。 配列番号 1記載のポリヌクレオチドは、 配列番号
2記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている。 本発明のポリヌクレオチドの他の一つの態様は、 配列番号 2に記載のアミノ酸 配列を有するタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドである。 配列番号 2 に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有していれば足りるからである。 また、 本発明のポリヌクレオチドのさらに他の一つの態様は、 配列番号 2記載 のアミノ酸配列において、 1 若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、 揷入、 又は 付加を含むアミノ酸配列からなり、 かつ、 D - LDH 活性を有するタンパク質をコー ドする塩基配列を有するポリヌクレオチドである。 配列番号 2記載のアミノ酸配 列においても、 1 個あるいは数個のアミノ酸の置換、 欠失、 揷入又は付加によつ ても、 同等の D - LDH活性を有することが想定されるからである。 このようなアミ ノ酸置換等を施すことにより、 本発明に利用することができる程度の D- LDH活性 を有するタンパク質を選択することは、 当業者が日常的に行うことができる。 なお、 当業者であれば、 配列番号 1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチ ドに対して、 部位特異的変異導入法 （Nucleic Aci d Res. 10, pp. 6487 (1982) , Methods in Enzymol . 100, pp. 448 (1983) , Molecular Cloning 2ndEdt. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PGR A Practical Approach IRL Press pp. 200 (1991) などを用いて、 適宜置換、 欠失、 挿入、 および/または付加変異を導入す ることが可能である。 なお、 数個とは、 2個〜 10個程度であることが好ましい。 より好ましくは、 2個〜 4個程度である。
さらに、 本発明のポリヌクレオチドのさらに他の一つの態様は、 配列番号 1記 載の塩基配列の全体又は一部の塩基配列からなるプローブあるいはその相補鎖と ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ、 D-乳酸脱水素酵素活性を 有するタンパク質をコードしているポリヌクレオチドである。 ストリンジ工ント な条件でハイプリダイズできるプローブは、 配列番号 1に記載中の任意の少なく とも 20個、好ましくは少なくとも 30個、 たとえば 40、 60または 100個の連続し た配列を一つまたは複数選択した DNAをプローブ DNAとすることができる。 配列 番号 1記載の DNAあるいはこのようなプローブを用いて、ストリジェントな条件、 たとえば、 50%ホルムアルデヒド存在下でハイプリダイゼーション温度が約 37°C、 より厳しい条件としては約 42°C、 さらに厳しい条件としてはホルムアルデヒ ド存 在下で約 65°C等の条件において、ハイプリダイズするポリヌクレオチドを意味し ている。
ストリンジェントな条件下で配列番号 1に記載の塩基配列からなる DNAあるい はプローブとハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドには、 配列番号 1 と類似する塩基配列を含むものが含まれる。 このようなポリヌクレオチドは、 配列番号 2のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等な蛋白質をコード している可能性が高い。
本発明のポリヌクレオチドのさらに他の一つの態様は、 配列番号 2に記載のァ ミノ酸配列と少なく とも 70%、 好ましくは、 少なく とも 80%、 より好ましくは少 なく とも 90%、 さらに好ましくは 95%以上の相同性を有し、 D-乳酸脱水素酵素活 性を有するタンパク質をコードしている。 タンパク質のホモロジ一検索は、 遺伝 子 角军 析 プ ロ グ ラ ム BLAST ( HYPERLINK http： //blast, genome, ad. jp http : //blast, genome. ad. jp ) , FASTA (HYPERLINK http : //fasta. genome. ad. jp/SIT/FASTA. html
http : //fasta. genome, ad. jp/SIT/FASTA. html)などによって決定することができ る。また、ここでいう相同性とは、これらのプログラムにおける'同一性（Identity) を意味している。
さらに、 本発明のポリヌクレオチドは、 配列番号 4に記載のアミノ酸配列にお いて、 表 1のアミノ酸残基置換表から選択される 1種あるいは 2種以上の置換を 有するアミノ酸配列を有し、 D-乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコード している。 配列番号 4 に記載のアミノ酸配列は、 GeneBank に登録されている Leuconostoc. mesenteroidesの D-LDHの酉己歹 lj (GeneBank ACCESSION No. L29327) である。 配列番号 2に記載のアミノ酸配列は、 配列番号 4に記載のァミノ酸配列 において表 1のアミノ酸置換表における全ての置換を有しているが、.これらの全 てを有していなくても、 本発明に利用できる D-LDH活性を有するタンパク質を得 ることができると想定される。 好ましくは、 置換数は、 2 以上であり、 より好ま しくは、 11以上であり、 さらに好ましくは、 19以上である。
また、 表 1のアミノ酸残基置換表において、 好ましくは、 置換タイプ 1〜19の アミノ酸置換を有していることが好ましい。 また、 より好ましくは、 置換タイプ
6〜16のアミノ酸置換を有していることが好ましい。 また、 本発明のポリヌクレオチドのさらに他の一つの態様は、 配列番号 2のァ ミノ酸配列のうち、 少なくとも 78〜79位、 152〜175位、 235位、 296位のアミノ 酸配列を有し、 D- LDH活性を有する、 タンパク質をコードしている。 78〜79位、 152〜175位、 235位、 296位のアミノ酸配列は、 配列番号 2のアミノ酸において 特徴的であると考えられ、 当該アミソ酸配列を含み、 D - LDH 活性を有している場 合には、 本発明の好ましいポリヌクレオチドであるといえる。 より好ましくは、 配列番号 2記载のァミノ酸配列のうち、 活性中心として 296位のヒスチジンの残 基、 及ぴ、 補酵素である NADH結合部位の 152〜175位のァミノ酸残基を有するポ リヌクレオチドである。
以上のように、 配列番号 1に記載の塩基配列からなるあるいは当該塩基配列を 有するポリヌクレオチド以外であっても、 当該ポリヌクレオチドがコ一ドするタ ンパク質と同等に機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、 本発明 のポリヌクレオチドに含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、 上記した各種手法で得ることができる他、 化学 的に合成することもできるし、 配列番号 1に記載した塩基配列に基いて他の生物 から PCRクロー-ングゃハイブリダィズ等により得ることができる。 例えば、 乳 酸菌他、大腸菌、枯草菌、 カビ属等の原核生物に由来するタンパク質、 もしくは、 酵母、 タコ等の真核生物に由来するものから単離することもできる。 また、 長鎖 DNA の合成方法として知られている藤本らの手法 （藤本英也、 合成遺伝子の作製 法、 植物細胞工学シリーズ 7 植物の PCR 実験プロ トコール、 1997、 秀潤社、 P95-100) を採用することもできる。 ， 本発明では、 特に配列番号 1記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドのホモ 口グでなくても利用することができる。このようなポリヌクレオチドであっても、 当該ポリヌクレオチドを導入した本発明形質転換体は、 D- LDHの生産及ぴ D-乳酸 の製造に有用だからである。
例えば、 配列番号 1記載の塩基配列を有すると力 、 そのホモログであるか否か にかかわらず、乳酸菌の他、大腸菌、枯草菌、力ビ属等の原核生物に由来する D- LDH 活性を有するタンパク質、.もしくは、 酵母、 タコ等の真核生物に由来する D-LDH 活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも用いることができる。 (タンパク質）
本発明のタンパク質は、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなる、 あるいは 当該アミノ酸配列を有するタンパク質である。 これらのタンパク質は、 本発明の 好ましい態様である。
さらに、 本発明のタンパク質の他の一つの態様は、 既に述べたように、 配列番 号 2記載のアミノ酸配列において、 1 若しくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、 挿 入、 又は付加を含むアミノ酸配列からなり、 かつ、 D-LDH活性を有するタンパク 質である。 さらに他の一つの態様は、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列と少なく とも 70%、 好ましくは、 80%以上、 より好ましくは 90%以上、 さらに好ましくは 95 %以上の相同性を有し、 D-LDH活性を有するタンパク質である。
また、 さらに他の一つの態様は、 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 表 1のアミノ酸置換表から選択される 1種あるいは 2種以上の置換を有するアミ ノ酸配列を有し、 D-LDH活性を有するタンパク質である。 配列番号 4に記載のァ ミノ酸酉己歹 IJは、 GeneBankに登録されている Leuconostoc. mesenteroidesの D-LDH の配列 （GeneBank ACCESSION No. L29327) である。 配列番号 2に記載のアミノ酸 配列は、 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において上記アミノ酸置換表における 全ての置換を有しているが、 これらの全てを有していなくても、 本発明に利用可 能な D - LDH活性を有するタンパク質を得ることができると想定される。 好ましく は、 置換数は、 2以上であり、 より好ましくは、 11以上であり、 さらに好ましく は、 19以上である。
また、 表 1のアミノ酸残基置換表において、 好ましくは、 置換タイプ 1〜19の アミノ酸置換を有し、 さらに好ましくは、 置換タイプ 6〜16のアミノ酸置換を有 している。
また、 本発明のタンパク質のさらに他の一つの態様は、 配列番号 2のアミノ酸 配列のうち、 少なくとも 78〜79位、 152〜175位、 235位、 296位のァミノ酸配列 を有し、 D-乳酸脱水素酵素活性を有する、 タンパク質である。 78〜79 位、 152〜
175位、 235位、 296位のアミノ酸配列は、 配列番号 2のアミノ酸において特徴的 であると考えられ、当該アミノ酸配列を含み、 D-LDH活性を有している場合には、 本発明の好ましいタンパク質であるといえる。 より好ましくは、 配列番号 2記載 のアミノ酸配列のうち、 活性中心として 296位のヒスチジンの残基、 及び、 補酵 素である NADH結合部位の 152〜 175位のアミノ酸残基を有するタンパク質である。 上記のような本発明のタンパク質は、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列からな るタンパク質以外であっても、 D-LDH 活性を有すれば、 本発明のポリヌクレオチ ドに含まれる。
本発明のタンパク質は、 Leuconostoc. mesenteroidesIF03426 株を培養するこ とによって得ることができる。 すなわち、 その培養物として得ることができる。 当該菌株は、 公知の細菌培養法によって培養することができる。 培養物からは、 公知の方法によって本発明のタンパク質を精製することができる。 あるいは培養 物そのものや、菌体を回収して本発明の酵素活性物質として用いることができる。 菌体ゃ精製酵素、 あるいは粗精製酵素は、 そのまま用いることもできるし、 固定 化することもできる。
また、 本発明のタンパク質は、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列あるいは他の ァミノ酸配列に対して、 部位特異的変位導入法 （Current Protocol s I Molecular Biology edit. Ausubel et al. , (1987) Publi sh. John Wi ly & Sons Sectoin 8. 1-8. 5) 等を用いて、 適宜、 置換、 欠失、 挿入、 およびノまたは付加変異を導入 することにより得ることができる。 また、 このような改変は、 人工的に変異を導 入しあるいは合成したものに限らず、 人工的な変異処理に基づいてあるいはこれ に限らず、 自然界におけるアミノ酸の変異によっても生じたものも包含される。 さらに、 配列番号 1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドあるいはその ホモログである DNAを得て、 この DNAを宿主に導入して形質転換体を作製、 それ を培養することによつても、 ホモログタンパク質を得ることができる。
なお、 本発明においては、 例えば、 公知の D-LDH活性を有する公知のタンパク 質を用いることができる。 これらのタンパク質は、 例えば、 乳酸菌、 大腸菌、 枯 草菌、 カビ属等の原核生物に由来するタンパク質、 もしくは、 酵母、 タコ等の真 核生物に由来するタンパク質を用いることができる。
なお、 これらのタンパク質は、 特に配列番号 2記載のアミノ酸配列を有するタ ンパク質でなくてもよく、 また、 当該アミノ酸配列からなるタンパク質のホモ口 グでなくてもよい。 D- LDH 活性を有するタンパク質を発現可能に保持する本発明 の形質転換体は、 D- LDHの生産及び D-乳酸の製造に有用だからである。
なお、 本発明のポリヌクレオチドやタンパク質、 あるいは本発明の形質転換体 を得るのに好ましいポリヌクレオチドゃタンパク質の遺伝子資源である細胞は、 天然に存在する生物に限られない。 変異処理などにより得られた微生物や細胞を 遺伝子資源とすることもできる。
本発明に用いるタンパク質は、 D - LDH 活性を有しているが、 その活性は、 例え ば、 市販のキッ ト （LACTATE DEHYDROGENASE (LDH/LD) TEST- UV (SIGMA社製）） に よつて測定することができる。
(DNA構築物）
単離された、 D- LDH 活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド (DNA) (以下、 当該ポリヌクレオチドが DNAの場合、 D- LDH- DNA というものとす る。）を用いて、当該 DNAセグメントを有する DNA構築物を作製することができる。 この DNA構築物はそれ自体あるいは適当なベクターに導入することにより発現べ クタ一として用いることができる。 これらの DNA構築物を用いて宿主細胞を形質 転換することにより D-LDH活性を有するタンパク質を生産する形質転換体を得る ことができる。 さらに、 この形質転換体を培養することにより、， D - LDH 活性を有 するタンパク質を生産することができる。また、 D -乳酸を生産することができる。 形質転換にあたっては、 D - LDH— DNAからなる DNAセグメントを、 宿主細胞内で 発現可能とする DNA構築物を用いる。 形質転換のための DNA構築物の態様として は、 特に限定しないでプラスミ ド （DNA)、 バクテリオファージ （DNA)、 レトロ ト ランスポゾン （DNA)、 人工染色体 （YAC、PAC、BAC、MAC 等） を、 外来遺伝子の導入 形態 （染色体外あるいは染色体内） や宿主細胞の種類に応じて選択して採用する ことができる。 したがって、 本 DNA構築物は、 本 DNAの他、 これらのいずれかの 態様のベクターの構成セグメントを備えることができる。 好ましい原核細胞性べ クタ一、 真核細胞性ベクター、 動物細胞性ベクター、 植物細胞性ベクターは当該 分野において周知である。
なお、プラスミ ド DNAとしては、例えば、 pRS413、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112 または pAUR123などの YCp型大腸菌一酵母シャトルべクタ一、 pYES32または YEpl3 などの YEp型大腸菌一酵母シャ トルベクター、 pRS403、 pRS404、 pRS405、 pRS406、 2004/007317 pAURlOlまたは pAUR135などの Yip型大腸菌一酵母シャ トルベクター、 大腸菌由 来のプラスミ ド （pBR322、 pBR325、 pUC18、 pUC19、 pUC119、 pTV118N、 pTV119N、 pBluescript、pHSG298、pHSG396又は pTrc99Aなどの ColE系プラスミ ド、 pACYC177 又は PACYC184などの plA系プラスミ ド、 pMW118、 pMW119, pMW218又は pMW219な どの pSClOl系プラスミ ド等）、 枯草菌由来のプラスミ ド （例えば、 pUB110、 ΡΤΡ5 等）などを挙げることができる。ファージ DNAとしては、 λ ファージ（Charon4A、 Charon21A、 EMBL3、 EMBL4、 ； L gtl00、 gtll、 zap) , φ Χ174、 M13mpl8又は M13mpl9 などを挙げることができる。 レトロ トランスポゾンとしては、 Ty因子などを挙げ ることができる。 YACとしては、 pYACC2などを挙げることができる。
本 DNA構築物を作製するには、 D-LDH- DNAを含むフラグメントなどを適当な制 限酵素で切断し、 使用するベクター DNA の制限酵素部位あるいはマルチクロー二 ングサイ トに揷入などすることができる。
本 DNA構築物の第 1の態様は、 D - LDH- DNAからなる DNAセグメントを発現可能 に連結さ;^るプロモーターセグメントを備えている。 すなわち、 プロモーターに より制御可能にそのプロモーターの下流側に本 DNAセグメントが連結されている。
D-LDH 活性を備えるタンパク質の発現にあっては、 酵母における発現が好まし いことから、 酵母中で発現するプロモーターを使用することが好ましい。 かかる プロモーターとしては、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーター、 gal l プロモーター、 gal lO プロモーター、 ヒートショックタンノ ク質プロモーター、
MF ct lプロモーター、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、
ADHプロモーター、 A0X1プロモーターなどを使用することが好ましい。 特に、 サ ッカロマイセス属由来のピルビン酸脱炭酸酵素（1)遺伝子プロモーターが好まし く、 サッカロマイセス ·セレビシェ由来のピルビン酸脱炭酸酵素 1遺伝子プ口モ 一ターを利用することがより好ましい。 これらのプロモーターは、 サッカロマイ セス属 （セレピシェ） のエタノール発酵経路において高発現されているからであ る。 なお、 かかるプロモーター配列は、 サッカロマイセス属酵母のピルビン酸脱 炭酸酵素 1遺伝子のゲノム DNAを铸型とする PCR増幅法によつて単離することが できる。 一例として、 サッカロマイセス 'セレビシェ由来の当該プロモーターの 塩基配列を、 配列番号 5に示す。 なお、 本 DNA構築物におけるプロモーターセグ 04 007317 メントには、 この配列番号 5記載の塩基配列からなる DNAの他、 この塩基配列に おいて 1若しくは数個の塩基が欠失，置換、揷入及び Z又は付加等された塩基配列 からなり、 かつプロモーター活性を有する DNA、 及ぴ配列番号 5で示される塩基 配列の全部若しくは一部の配列から調製された DNAあるいはその相捕鎖とストリ ンジヱントな条件でハイブリダィズし、 かつプロモーター活性を有する DNA (換 言すれば、当該プロモーターのホモログ） を用いることができる。また、当然に、 他の酵母や他のサッカロマイセス ·セレビシェ属酵母のピルビン酸脱炭酸酵素遺 伝子やピルビン酸脱炭酸酵素 1遺伝子のプロモーターも用いることができる。 また、 本 DNA構築物の他の態様である第 2の DNA構築物は、 DNAの他、 宿主染 色体を相同組換えのための DNAセグメントを備える。 相同組換え用 DNAセグメン トは、 宿主染色体において本 DNAを導入しようとするターゲット部位近傍の DNA 配列と相同な DNA配列である。 相同組換え用 DNAセグメントは、 少なくとも 1個 備えられ、 好ましくは、 2 個備えられている。 例えば、 2 個の相同組換え用 DNA セグメントを、 染色体上のターゲット部位の上流側と下流側の DNAに相同な DNA 配列とし、 これらの DNAセグメントの間に本 DNAを連結することが好ましい。 相同組換えにより宿主染色体に本 DNAを導入する場合、 宿主染色体上のプロモ 一ターにより制御可能に本 DNAを導入することができる。 この場合、 目的遺伝子 の導入によって、 同時に、 本来当該プロモーターによって制御されるべき内在性 遺伝子を破壊し、 この内在性遺伝子に替えて外来の D- LDH- DNAを発現させること ができる。 特に、 当該プロモーターが、 宿主細胞において高発現プロモーターで ある場合に有用である。
かかる発現系を宿主染色体上に創出するには、 宿主染色体において高発現遺伝 子をターゲットとし、 この遺伝子を制御するプロモーターの下流に当該プロモー ターにより制御を受けるように D-LDH-DNAを導入するようにすることが好ましい。 酵母などのエタノール発酵性微生物を宿主とする場合、 ピルビン酸脱炭酸酵素遺 伝子 （特に、 ピルビン酸脱炭酸酵素 1遺伝子） をターゲットとし、 内在性のピル ビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターの制御下に LDH活性タンパク質をコードす る DNAを導入することができる。 この場合、 相同組換え用 DNAセグメントは、 ピ ルビン酸脱炭酸酵素 1遺伝子の LDHの構造遺伝子領域あるいはその近傍の配列（開 JP2004/007317 始コドンの近傍の配列、 開始コドンの上流域の配列、 構造遺伝子内の配列などを 含む） と相同とすることができる。 また、 ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモー ターのセグメントを DNA構築物に含めることもできる。
好ましくは、 サッカロマイセス属 （特にセレピシェ） を宿主として、 この宿主 のピルビン酸脱炭酸酵素 1遺伝子をターゲットとする DNA構築物とする。 かかる DNA 構築物によれば、 ピルビン酸脱炭酸酵素 1遺伝子の破壊とこの構造遺伝子部 分の D-LDHによる置換を一つのベクターで達成することができる。 ピルビン酸脱 炭酸酵素 1は、 ピルビン酸からァセトアルデヒ ドへの付加逆反応を媒介する酵素 であり、 この遺伝子を破壊することにより、 ァセトアルデヒ ドを経たエタノール 生産が抑制されることが期待されるとともに、 ピルビン酸を基質とする D-LDHに よる D-乳酸生産が促進されることが期待できる。
なお、 第 1の DNA構築物であっても、 宿主染色体との相同組換えのための DNA セグメントを備えることにより、相同組換え用の DNA構築物とすることができる。 第 1の DNA構築物にあっては、 DNA構築物中のプロモーターセグメントを、 宿主 染色体との相同組換え用の DNAセグメントに兼用することもできる。 例えば、 宿 主サッカロマイセス .セレビシェに対して、 サッカロマイセス ·セレピシェ宿主 染色体にあるプロモーター、 例えば、 ピルビン酸脱炭酸酵素 1遺伝子プロモータ 一をプロモーターセグメントとして有する DNA構築物は、 宿主の当該遺伝子をタ 一ゲット部位とするターゲティングベクタ一を構成する。 この場合、 ピルビン酸 脱炭酸酵素 1遺伝子の下流側の構造遺伝子領域に対する相同配列を備えることが 好ましい。
なお、 DNA構築物には、 ターミネータ一他、 必要に応じてェンハンサーなどの シスエレメント、スプライシングシグナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー、 リポソーム結合配列（SD配列）を連結することができる。選択マーカーとしては、 特に限定しないで、 薬剤抵抗性遺伝子、 栄養要求性遺伝子などを始めとする公知 の各種選択マ一力一遺伝子を利用できる。例えば、ジヒ ドロ葉酸還元酵素遺伝子、 ハイグロマイシン B、 ネオマイシン耐性遺伝子等を使用することができる。
(DNA構築物による形質転換）
一旦、 DNA構築物が構築されたら、 適当な宿主細胞に、 トランスフォーメーシ ヨン法や、 トランスフエクシヨン法、 接合法、 プロ トプラス ト融合、 エレク ト口 ポレーシヨン法、 リポフエクシヨン法、 酢酸リチウム法、 パーティクルガン法、 リン酸カルシウム沈殿法、 ァグロバタテリゥム法、 P E G法、 直接マイクロイン ジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、 これを導入することが できる。 DNA構築物の導入後、 その受容細胞は、 選択培地で培養される。
宿主細胞は、 Eshrichia coli、 Baci llus subtili s などの細菌、 サッカロマイ セス 'セレビシェ、 シゾサッカロマイセス 'ボンベ (Saccharomyces pombe) s ピキ ァ - パス トリス （Pichia pastoris) などの酵母、 sf9、 sf21 等の昆虫細胞、 COS 細胞、 チヤイエーズハムスター卵巣細胞 （CH0細胞） などの動物細胞、 サッマイ モ、 タバコなどの植物細胞などとすることができる。 好ましくは、 酵母などのァ ルコール発酵を行う微生物あるいは耐酸性微生物であり、 例えば、 サッカロマイ セス . セレピシェなどのサッカロマイセス属を始めとする酵母である。 具体的に は、 サッカロマイセス 'セレビシェ IF02260株や同 YPH株である。
本 DNA構築物によって形質転換された形質転換体においては、 DNA構築物の構 成成分が染色体上あるいは染色体外因子 （人工染色体を含む） 上に存在すること になる。 なお、 DNA構築物が染色体外に維持されている場合、 あるいは、 ランダ ムインテグレーションにより染色体に組み込まれている場合には、 LDH の基質で あるピルビン酸を基質とする他の酵素、 例えば、 ピルビン酸脱炭酸酵素の遺伝子 (サッカロマイセス属酵母においては、 ピルビン酸脱炭酸酵素 1遺伝子） は、 タ ーゲティングベクターによりノックァゥトされていることが好ましい。
上述の DNA構築物であって、 相同組換えを達成できる DNA構築物が導入される と、 宿主染色体上の所望のプ口モーターあるいは当該プロモーターと置換された 当該プロモーターあるいはそのホモログの下流にかかるプロモーターによって制 御可能に連結された D - LDH-DNAが存在することになる。 サッカロマイセス属酵母 の形質転換体にあっては、 宿主染色体上において、 ピルビン酸脱炭酸酵素 1遺伝 子プロモーターあるいは当該プロモーターと置換された当該プロモーターあるい はそのホモログの下流にそのプロモーターによって制御可能に D- LDH-DNAを備え ることが好ましレ、。また、通常、相同組換え体における D - LDH - DNAの下流側には、 選択マーカー遺伝子や、 破壊された構造遺伝子の一部 （DNA 構築物上の相同配列 に対応する部位） が存在する。
DNA構築物の導入の結果、 D - LDH- DNAがコードするタンパク質が生産される力 特に、 酵母のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子を破壌し、 同時に、 当該遺伝子のプロ モーターあるいはそのホモログによる制御下に D - LDHが導入されることにより、 本来的に D -乳酸を製造しない酵母においても、 D- LDHを生産させ、 結果として、 D-乳酸を生産することができる。
特に、 酵母 （具体的には、 サッカロマイセス属、 典型的にはセレビシェ） ピル ビン酸脱炭酸酵素 1遺伝子のプロモーターあるいはそのホモログ下に D- LDH- DNA を導入することにより、 D -乳酸のみを生産させることができる。ここで、 D - DLH - DNA は、 D - LDH活性を有するタンパク質をコードしてれば、 当該プロモーターにより 高発現するものと推定され、 D -乳酸の高生産に寄与しているものと推論される。 一方、 D - LDH - DNA により配列番号 2記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコ 一ドすることも、 D-乳酸の高生産及びノ又は D -乳酸の選択的生産に寄与している ものと推論される。
なお、 所望のプロモーター下に D- LDH- DNA が導入されたか否かの確認は、 PCR 法やサザンハイプリダイゼーシヨン法により行うことができる。 例えば、 形質転 換体から DNAを調製し、 導入部位特異的プライマーにより PCRを行い、 PCR産物 について、 電気泳動において予期されるバンドを検出することによって確認でき る。 あるいは蛍光色素などで標識したプライマーで PCRを行うことでも確認でき る。 また、 形質転換体の生産するタンパク質により同定することもできる。 これ らの方法は、 当業者において周知である。
また、 DNA構築物を導入することによって、 多コピー数の D-LDH遺伝子を導入 した形質転換体を作製することが好ましい。 例えば、 形質転換酵母を作製する場 合、 2コピー以上、 好ましくは 4〜 1 0コピーの D- LDH-DNA を導入する。 D- LDH 遺伝子を多コピー数で導入した形質転換体は、 D-乳酸の生産能が大幅に向上した ものとなる。 言い換えると、 D - LDH遺伝子を多コピー数で導入した形質転換体を 使用することによって、 D-乳酸の生産性を大幅に向上させることができる。
(D -乳酸の製造）
本 DNA構築物が導入されて得られる形質転換体を培養することにより、 培養物 中に外来遺伝子の発現産物である D - LDHが生産され、 さらに D -乳酸が生成する。 培養物から乳酸を分離する工程を実施することにより、乳酸を得ることができる。 なお、 本発明において培養物とは、 培養上清の他、 培養細胞あるいは菌体、 細胞 若しくは菌体の破碎物を包含している。
本発明において、酵母等の本来的に D-乳酸を生産しない細胞を宿主として用い ることにより、 D -乳酸を選択的に生産することができる。 特に、 発酵微生物を用 いることにより効率的に D -乳酸を得ることができる。 なかでも、 酵母を宿主とす る形質転換体によれば、 成長が速いため D -乳酸の高生産に有用である。 このよう な D-乳酸選択生産性の形質転換体によれば、 光学異性体の分離も不要となり、 一 層の効率的生産が可能となる。
本発明の形質転換体の培養にあたっては、 形質転換体の種類に応じて培養条件 を選択することができる。このような培養条件は、当業者においては周知である。 大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地とし ては、 微生物が資化可能な炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の 培養を効率的に行うことができる培地であれば、 天然培地、 合成培地のいずれも 使用することができる。 炭素源としては、 グルコース、 フルク トース、 スクロー ス、 デンプン、 セルロース等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタ ノール、 プロパノール等のアルコールを用いることができる。 窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、 リン酸 アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩またはその他の含窒素 化合物の他、 ペプトン、 肉エキス、 コーンスティープリカ一等を用いることがで きる。 無機物としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸マグネシウム、 硫酸マグネ シゥム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシウム などを用いることができる。
培養は、 通常、 振とう培養または通気攪拌培養等の好気条件下、 30°Cで適切な 時間行うことができる。 例えば、 6〜120時間行うことができる。 培養期間中、 pH は 2. 0〜6. 0に保持することが好ましい。 また、 pHの調整は、 無機あるいは有機 酸、 アルカリ溶液等を用いて行うことができる。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する倍地としては、 一般に使 JP2004/007317 用されている RPMI 1640倍地、 D M E M倍地またはこれらの培地にゥシ胎児血清な どを添加した培地を用いることができる。 培養は、 通常、 5%C02存在下、 37°Cで 1 〜30日行う。 培養中は必要に応じてカナマイシン、 ペニシリンなどの抗生物質を 培地に添加してもよい。
培養は、 回分式であっても連続式であってもよい。 培養方式としては、 アンモ ユアやカルシウム塩などのアルカリにより中和しつつ D-乳酸アンモニゥムゃ D- 乳酸カルシウムなどの乳酸塩として得る方式のほ力 \ フリーの D -乳酸として得る 方式も採用できる。
培養終了後、 培養物から遺伝子産物である D-乳酸を分離するには、 通常の精製 手段などを各種組み合わせて使用することができる。 例えば、 形質転換細胞内に 生産された場合は、 常法により菌体を超音波破壌処理、 摩砕処理、 加圧破碎など に細胞を破壊して，遺伝子産物を細胞と分離することができる。 この場合、必要に 応じてプロテアーゼを添加する。また、培養上清に D-乳酸が生産された場合には、 この溶液を、 ろ過、 遠心分離などにより固形分を除去する。
例えば、 培養工程終了後は、 培養液をベルトプレス、 遠心分離、 フィルタープ レスなどの少なくとも 1種の固液分離処理によって固液分離工程を実施すること ができる。 分離したろ液については、 精製工程を実施することが好ましい。 精製 工程においては、 例えば、 乳酸を含むろ液を電気透析によって乳酸以外の有機酸 や糖類を除去して乳酸あるいは乳酸アンモニゥム水溶液とすることができる。 乳 酸アンモ-ゥム液の場合、 バイポーラ膜等によってアンモニアを分解し、 乳酸水 溶液とアンモニア水とすることができる。 該ろ液中の乳酸以外の有機酸や糖類の 含量が比較的少ない場合には、 電気透析をせず、 必要に応じて水分を蒸発させて 濃縮し、 パイポーラ膜の処理を行うこともできる。
なお、 電気透析時の各種液の温度は、 通常、 20 45°C、 好ましくは 35〜40°Cの 範囲である。 電気透析で除去できなかったアミノ酸、 無機イオン （K, Ca, Mg 等）、 有機酸 （タエン酸、 リンゴ酸等） は、 後段において、 クロマト分離装置、 イオン 交換装置により除去することができる。 さらに、 必要に応じて、 得られた乳酸溶 液を濃縮することができる。 例えば、 溶液中の水分を蒸発させ、 50〜90%濃度の 乳酸溶液を得ることができる。 なお、 培養液、 粗抽出画分に対しては、 上記方法に限られず、 有機溶剤による 分離抽出、 蒸留等の各種精製分離法等を利用して、 D-乳酸あるいはその塩を精製 することができる。 また、 必要に応じて、 培養液、 粗抽出画分及びその精製物に 対してエステル化、ラクチド化、オリゴマーあるいはプレボリマー化等の処理を行 うことにより、 各種の D-乳酸誘導体を得ることができる。 必要に応じて、 乳酸発 酵液から D-乳酸、その塩及ぴその誘導体の 1種あるいは 2種以上を採取すること ができる。
なお、 本発明の D - LDH活性を有するタンパク質を利用することにより、 培養系 でなく酵素反応系による D-乳酸の生産も可能である。 酵素反応条件は、 D-乳酸が 生産できる条件を採用すればよく、またかかる方法により得られた D -乳酸に対し ても、 各種の誘導体化を施すことができる。
(乳酸系ポリマーの製造）
得られた D -乳酸、その塩及ぴその誘導体を少なくとも一種類の重合材料として 利用して、 乳酸系ポリマーを製造することができる。 重合材料としては、 D -乳酸 あるいはその誘導体の単量体の他、 これらを適当な長さに重合したプレポリマー やオリゴマーを用いることもできる。 さらに、 L -乳酸やその誘導体、 ならびにこ れらのプレボリマーやオリゴマーも用いることができる。
乳酸系ポリマーとしては、 D -乳酸のホモ重合体、 L-乳酸とのヘテロ重合体、 へ テロプロック重合体の他、 乳酸以外の他の重合材料との各種のへテロ重合体を挙 げることができる。
これらの乳酸系重合材料、 あるいは乳酸系重合材料と他の重合材料とを、 適当 な重合開始剤とともに反応させて、 乳酸系ポリマーを得ることができる。
本発明によれば、 D-乳酸の選択的生産及ぴ Z又は高生産が可能であるため、 高 効率に D-乳酸を得ることができ、 結果として、 D -乳酸を重合用材料とする乳酸系 ポリマーを効率的に生産することができる。
(実施例）
以下に、 本発明の具体例を記載するが、 本発明を以下の具体例に限定する趣旨 ではなく、 本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の態様で実施できる。
(実施例 1： D-乳酸脱水素酵素遺伝子の単離） 真核生物である乳酸菌 Leuconostoc mesenteroides由来の D-乳酸脱水素酵素遺 伝子 （D-LDH遺伝子、 以下、 単に D-LDHME遺伝子ということもある。） の単離を行 つた。 '
当該遺伝子資源としては、 IF03426 株 （社団法人発酵研究所に登録されている 菌株である） のゲノム DNAを鎳型として、 PCR増幅法によって単離した。 この菌 株のゲノム DNAは、 ゲノム DNA調製キットである、 Fast DNA Kit (Bio 101社製） を用い、 その詳細は、 付属のプロトコールに従って行った。 また、 調製したゲノ ム DNAは、 分光光度計 Urtro spec 3000 (Amersham Pharmacia Biotech 社製）に より DNA濃度の測定を行った。
PCR 反応においては、 増幅酵素として、 増幅断片の正確性が高いとされる K0D Plus DNA Polymerase (東洋紡株式会社製） を使用した。 予め調製したゲノム DNA50ng、 プライマー DNA50pmol X 2、 10 X K0D 酵素反応用バッファー 5 1、 25mM MgS04 2 μ 1、 2mM dNTP mix 5 μ 1、 K0D plus DNA Polymerase 1. 0ュニットをカロえ た合計で 50 μ 1の反応溶液を、 PCR増幅装置 Gene Amp PCR system 9700 (PE Applied Biosysteras社製） によって DNA増幅を行った。
PCRの反条件は、 96°C、 2分の熱処理を行った後、 96°Cで 30秒、 53°Cで 30秒、 72°Cで 90秒の 3種類の温度変化を 1サイクルとし、これを 25サイクル繰り返し、 最後に 4°Cとした。本反応試料 5 ^ 1を 1 %TBEァガロースゲル（0. 5 /_i g/mlのェチ ジゥムブロマイ ド含有） にて電気泳動を行い、 本ゲルを 254nraの紫外線照射 （フ ナコシ社製） によって DNAパンドを検出し、 遺伝子増幅断片の確認を行った。 なお、 反応に使用したプライマー DNAは、 合成 DNA (サヮデーテクノロジ一社） を用い、 このプライマーの DNA配列は以下の通りであった。
• DLDEME-U (21mer, Tm値 57. 2°C)
： 5 ' -ATG AAG ATT TTT GCT TAC GGC - 3， (配列番号 6)
. DLDEME-U (24mer, Tmィ直 54. 7°C)
： 5 ' - ATC TTA ATA TTC AAC AGC AAT AGC-3 ' (配列番号 7)
PCR 増幅断片を、 pBluescriptll SK +ベクター （東洋紡株式会社製） へサブク ローニングを行った。 一連の反応操作は、 一般的な DNAサブクローニング方法に 準じて行った。 すなわち、 制限酵素 Eco RV (宝酒造製） 及び脱リン酸化酵素 Alkal ine Phosphatase (宝酒造製） を施した上記ベクターに実施例 1で取得した 遺伝子増幅断片を T4 DNA Li gaseによって連結した。 T4 DNA Li gase反応には、 Li gaFast Rapid DNA Ligati on (プロメガ社製） を用い、 詳細は付属のプロトコ一 ルに従った。
次に、 Li gation反応液を大腸菌のコンビテント細胞へ形質転換を行った。 コン ピテント細胞は、 JM109 株 （東洋紡製） を用い、 詳細な取り扱いは付属のプロ ト コールに従った。アンピシリン lOO i g/mlを含有した LBプレート下でコロニー選 抜を行い、 各選抜コロニーからプラスミ ド DNAを調製し、 これに上記プライマー DNAを用いて、 PCRを行い、 目的とする D-LDH遺伝子をサブクローニングした。 な お、 エタノール沈殿処理、 制限酵素処理等の一違操作の詳細なマニュアルは、 Molecular Cloning A Laboratory Manual second edit ion (Maniatis et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989)に従った。
このようにして得られた D-LDH遺伝子について塩基配列を決定した. 塩基配列 角军析装置としては、 ABI PRISM 310 Geneti c Analyzer (PE Appl ied Biosystems) を用い、 試料の調製方法、 機器の使用方法等の詳細は、 装置付属のマニュアルに 従った。 単離した D-LDH遺伝子を含むベクター DNAは、 アルカリ抽出法によって 調製し、 これを GFX DNA Purif i cation kit (Amersham Pharmacia Biotech社製) にてカラム精製した後、分光光度計 Urtro spec 3000 (Amersham Pharmacia Biotech 社製） により DNA濃度を測定し、 調整したものを用いた。
配列解析によって決定した DNA配列を配列番号 1に示し、 その対応するァミノ 酸配列を配列番号 2に示す。
本実施例で単離した D- LDHME遺伝子の塩基配列と、 GenBankに既に登録されて いる D-LDH 遺伝子の酉己歹 (] (？し酸 ¾ Leuconostoc raesenteroides 由来、 GenBank accession No. L29327) (配列番号 3) と比較するとアミノ酸配列レベルで 19のァ ミノ酸残基、 塩基配列レベルで 27bpが相違していた。
図 1 A及ぴ Bには、 今回取得した D-LDHME遺伝子の塩基配列 （配列番号 1) と
GenBankに登録されている前記 D-LDH遺伝子の塩基配列（配列番号 3) とのホモ口 ジーデータを示す。 なお、 上段の配列が、 本実施例により取得した D- LDH遺伝子 の塩基配列を示し、下段の配列が前記登録 D-LDH遺伝子の塩基配列を示している。 図 2には、今回取得した D- LDHME遺伝子の塩基配列に対応するアミノ酸配列（配 列番号 2)と登録されている D - LDH遺伝子の塩基配列に対応するアミノ酸配列（配 列番号 4) とのホモロジ一データを示す。 なお、 上段の配列が、 本実施例により 取得した D - LDHME遺伝子に対応するァミノ酸配列を示し、下段の配列が登録 D-LDH 遺伝子に対応するアミノ酸配列を示している。
特に、 アミノ酸配列からすると、 本実施例で取得した遺伝子のアミノ酸配列に は表 2のアミノ酸残基置換があると認められた。
表 2
ァミノ酸残基置換表
置換タイプ 置換位置 置換アミノ酸
1 4 0 パリン Val
2 1 1 2 ィソロイシン lie
3 1 3 1 'ヒスチジン His
4 1 3 9 ィソロイシン He
5 1 8 1 グルタミン酸 Glu
6 2 6 6 ダリシン Gly
7 2 6 7 ロイシン Leu
8 2 6 8 フエ二ルァラニン Phe
9 2 6 9 ァスパラギン Asn
1 0 2 7 0 グノレタミン酸 Glu
1 1 2 7 1 ァスパラギン酸 Asp
1 2 2 7 2 トリプトファン Trp
1 3 2 7 3 セリン Ser
1 4 2 7 4 グリシン Gly
1 5 2 7 6 グルタミン酸 Glu
1 6 2 7 7 フエ二ルァラニン Phe
1 7 2 8 7 セリ ン Ser
1 8 2 9 2 ロイシン Leu
1 9 2 9 3 パリン Val P T/JP2004/007317 ただし、 上記表における置換位置は開始コドンに対応するメチォニンからの位 置として示す。
(実施例 2：組換えベクターの構築）
サッカロマイセス ' セレビシェ由来のビルビン酸脱炭酸酵素 1遺伝子 （PDC1) プロモーター配列の制御下で、 目的遺伝子として実施例 1で取得した D - LDHME遺 伝子が発現可能な染色体導入用ベクターを構築した。 新たに構築したこの染色体 導入型ベクターを pBTRP - PDC1 - DLDHMEベクターと名付けた。 なお、 ベクターの構 築における一連の反応操作は、一般的な DNAサブクローニング法に準じて行った。 以下に、本実施例におけるベクター構築工程の詳細を図 3〜6に基いて説明する。 ベクター構築に関わる一連の酵素は、 全て宝酒造株式会社製であった。 なお、 ベ クタ一構築の手順はこれに限定されるものではない。
1. PDC1遺伝子のプロモーター断片（PDC1P)及び PDC1遺伝子下流領域断片（PDC1D) の単離
まず、ベクターの構築にあたって、必要な遺伝子断片である PDC1遺伝子のプロ モーター断片 （PDC1P) 971bp と、 PDC1遺伝子下流領域断片 （PDC1D) 518bpは、 遺伝子資源としてサッカロマイセス ·セレビシェ IF02260株を用い、 この株のゲ ノム DNAを铸型として使用した PCR増幅法によって単離した。 なお、 IF02260株 は、社団法人発酵研究所に登録されている菌株である。この菌株のゲノム DNAは、 ゲノム DNA調製キットである、 Fast DNA Kit (Bio 101社製） を用い、 その詳細 は、 付属のプロ トコールに従って行った。 また、 調製したゲノム DNAは、 分光光 度計 Urtro spec 3000 (Amersham Pharmacia Biotech社製）により DNA濃度の測 定を行った。
この PCR反応においては、 増幅酵素として、 増幅断片の正確性が高いとされる
KOD Plus DNA Polymerase (東洋紡株式会社製） を使用した。 予め調製した IF02260 株のゲノム DNA50ng、 プライマー DNA50pmol X 2、 10 X K0D 酵素反応用バッファー
5 μ 1、 25raM MgS04 2 μ 1、 2mM dNTP mix 5 KOD plus DNA Polymerase 1. 0 ュ ニットを加えた合計で 50 1 の反応溶液を.、 PCR増幅装置 Gene Amp PCR system
9700 (PE Appl ied Biosystems社製） によって DNA増幅を行った。
PCRの反応条件は、 96° (：、 2分の熱処理を行った後、 96°Cで 30秒、 53°Cで 30 秒、 72°Cで 90秒の 3種類の温度変化を 1サイクルとし、 これを 25サイクル繰り' 返し、 最後に 4°Cとした。 本反応試料5 ^ 1を 1 %TBEァガロースゲル （0. S ^ g/ml のェチジゥムブロマイ ド含有） にて電気泳動を行い、 本ゲルを 254nmの紫外線照 射 （フナコシ社製） によって DNAバンドを検出し、 遺伝子増幅断片の確認を行つ た。
なお、 反応に使用したプライマー DNAは、 合成 DNA (サヮデーテクノロジ一社） を用いた。 このプライマーの DNA配列は以下の通りであった。
[PDC1P断片増幅用]
• PDC1P- LDH- U (31raer、 Tm値 58. 3°C)
： 5 ' - ATA TAT GGA TCC GCG TTT ATT TAG CTA TCT C - 3 ' (配列番号 8) (下線部： Bam HIサイ ト）
- PDCIP-LDH-D (31mer、 Tm値 54. 4。C)
： 5 ' -ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G-3' (配列番号 9) (下線部： Eco RIサイ ト）
[PDC1D断片増幅用]
- PDC1D-LDH-U (31mer、 Tm値 55. 3°C)
： 5 ' -ATA TAT CTC GAG GCC AGC TAA CTT CTT GGT CGA C- 3 ' (配列番号 10) (下 線部： Xholサイ ト）
• PDC1D- LDH- D (31raer、 Tm値 65. 2°C)
： 5 ' -ATA TAT GGG CCC CCC CTC GAG GTC CCC CCT C- 3' (配列番号 11) (下線 部： Apalサイ ト）
上記反応にて取得した PDC1P及び PDC1D各遺伝子増幅断片をそれぞれ、 ェタノ ール沈殿処理によって精製した後、 PDC1P増幅断片を制限酵素 BamHI/EcoRI及ぴ
PDC1D増幅断片を制限酵素 Xhol/Apalにて制限酵素反応処理を行った。 また、 ェ タノール沈殿処理、 制限酵素処理の一連操作の詳細なマニュアルは Molecular
Cloning A Laboratory Manual second edition (Maniatis et al. , Cold Spring
Harbor Laboratory press. 1989) に従った。
2 . pBPDClPベクターの構築
制限酵素 BamHI/EcoRI (宝酒造社製）及ぴ脱リン酸化酵素 Alkal ine Phosphatase P T/JP2004/007317
(BAP, 宝酒造社製） を施した pBluescriptll SK+ベクター （東洋紡社製） に、 上記 PCR法にて増幅し制限酵素処理を施した PDC1P断片を T4 DNA Ligase反応に よって連結させた （図 3 上段）。 T4 DNA Ligase 反応には、 LigaFast Rapid DNA Ligation System (プロメガ社製） を用い、 詳細は付属のプロトコールに従った。 次に Ligat ion反応を行つた溶液を用いて、コンビテント細胞への形質転換を行 つた。 コンビテント細胞は大腸菌 JM109株 （東洋紡社製） を用い、 詳細は付属の プロ トコールに従って行った。 得られた培養液は抗生物質アンピシリ ン 100 g/mlを含有した LBプレートにまいてー晚培養した。生育したコロニーにつ き、ィンサート断片のプライマー DNAを用いたコロニー PCR法による確認、及びミ ニプレップによるプラスミ ド DNA調製溶液に対する制限酵素処理による確認を行 い、 目的とするベクター pBPDClPベクターを単離した （図 3中段）。
3. pBPDClP-LDHIベクターの構築
次いで、 図 3に示すように、 トヨタ自動車 （株） によって構築された pYLDlベ クタ一 （特開 2001- 204468号公報に記載） を制限酵素 EcoRI/Aatll処理及び末端 修飾酵素 T4 DNA polymerase処理することで得られる LDH遺伝子 （ビフィ ドバク テリウ.ム .ロンガム由来） 断片を、 同じく制限酵素 EcoRI処理、 末端修飾酵素 T4 DNA polymerase処理を行った pBPDClPベクター中に、 上述と同様の操作でサブク ローニングを行い、 pBPDClP - LDHIベクターを作製した（図 3中段〜下段）。なお、 上記の pYLDlベクターは大腸菌に導入され （名称：「E. col i pYLDl」）、 独立行政法 人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1 番地 1中央第 6) に、 受託番号 FERM BP- 7423としてプダべスト条約に基づき国際 寄託されている （原寄託日 ： 1999年 10月 26 日）。
4. pBPDClP-LDHベクタ一の構築
続いて、 図 4に示すように、 このベクターを Xhol/Apal処理し、 同様に制限酵 素処理を施した増幅 PDC1D断片を連結して pBPDClP- LDHIIべクターを作製した（図 4上段）。
次いで、 この pBPDClP- LDHIIベクターを EcoRV処理及ぴ T4 DNA polymerase処 理したものに、 pRS404ベクター （プロメガ社製） を Aatll/Sspl処理及び T4 DNA polemeras e処理して得られた Trpマーカー断片を連結して、 pBTRP- PDC1 - LDHベク ターを構築した （図 4下段参照）。
5. pBTRP - PDC1PIIベクターの構築
図 5に示すように、既に得られている pBPDClPベクターに制限酵素 HincII処理 及ぴ脱リン酸化酵素 Alkaline Phospatase処理を行った。これに、 pBTrp- PDC1- LDH ベクターを、 制限酵素 Apalおよび Aflllで処理した後、 末端修飾酵素 T4 DNAポ リ メ ラーゼ処理することによって、 Trp マーカーを含む断片を連結し、 pBTRP- PDC1PIIベクターを構築した。
6. pBTRP- PDC1- DLDHMEベタターの構築
図 6に示すように、 pBTRP- PDC1PIIベクターに制限酵素処理 EcoRV処理を行い、 末端修飾酵素 T4 DNAポリメラーゼ処理を行ったベクター中に、実施例 1で単離し た D-LDHME 遺伝子断片を連結し、 最終ベクターである、 染色体導入型 pBTRP- PDC1- DLD丽 Eを構築した。
なお、他の D - LDH遺伝子として、乳酸菌 Leuconostoc mesenteroides由来の D- 1DH 遺伝子データベース GenBank ACCESSION No. L29327中の遺伝子配列 （配列番号 3) にしたがってオリゴヌクレオチドを合成し、 これを順次連結させることで、 対象 となる！)- LDH遺伝子を全合成した。 この遺伝子断片に対して、 本実施例と同様の 手順を適用して、 染色体導入型ベクターを構築した。
(実施例 3：酵母の形質転換）
宿主である酵母 IF02260株 （社団法人発酵研究所に登録されている菌株） のト リプトファン合成能を欠損した株を、 lOmlYPD培地にて 30°Cで対数増殖期まで培 養を行い、 集菌および TEバッファによる洗浄を行った。 次に、 0. 5ml TEバッフ ァと 0. 5ml 0. 2Mの酢酸リチウムを加え、 30°Cにて 1時間の振とう培養を行った後 に、制限酵素 Apalおよび Spel (いずれも宝酒造製）で処理した pBTRP- PDC1- DLD蘭 E を添加した。
この懸濁液を 30°Cで 30分振とう培養後、 150 ^ 1の 70%ポリエチレングリコー ル 4000 (和光純薬製） を加え、 よく攪拌した。 さらに、 30°Cにて 1時間振とう培 養した後、 42°Cにて 5分間ヒートショ ックを与え、 本菌体を IralYPD培地 30°Cで 12時間培養を行った。本培養液を洗浄後、 200 1の滅菌水に懸濁したものをトリ プトファン選択培地に塗沫した。 得られたコロニーを新たなトリプトフアン選択培地で再度単離し、 生育能を維 持している株を形質転換候捕株とした。本株を YPD培養液にて培養し、ゲノム DNA 調製キット FAST DNA Kit (Bio 101社製） を用いて、 ゲノム DNAを調製した。 こ れに PCR法を利用して導入遺伝子の有無を確認したところ、 PDC1プロモーター下 流に D - LDHME遺伝子が導入されている株を取得した。
得られた遺伝子導入株を胞子誘導培地に塗沬し、 30°Cで 4日間で胞子誘導した。 培地から菌を採取し、 これにザィモレース 5ユニット （ザィモリサーチ社製） を 加えて、 37°C 1 時間の酵素反応を施した後に、 顕微鏡 （ォリ ンパス社製） 及びマ イクロマニュピレーター （成茂科学社製） を用い、 YPD培地上で胞子分離を行つ た。 得られた胞子の後代の株に対して、 トリプトファンマーカー選択能の有無と PCR法を利用して 2 : 2に分離していることを確認し、 目的とする 2倍体株を取得 した。 2倍体株は、 TC14- 6-1A株、 TC14- 6- 2A株、 TC14- 6 3A株であった。 なお、 得られた 2倍体株は、 酵母染色体中において図 7に示す構造を取っている。
なお、 実施例 2で構築した他の D-LDH遺伝子の染色体導入型ベクターも、 上記 と同様にして IF02260株のトリプトファン合成能を欠損した株に遺伝子導入を行 い、 PCR 法により確認することにより、 D - LDH が染色体に導入されている株
(TC20- 1 - 1A株） を取得した。
さらに、 対照として、 酵母自己増殖 2 μ型プラスミ ドベクターである pYPDlプ ラスミ ドに DLDHME を導入して自己増殖型ベクターを構築し、 当該ベクターを IF02260株に上記と同様にして導入し、 PCR法で確認することにより、 D- LDH遺伝 子を有するプラスミ ドを保持する株 （TC21-1株） を取得した。
(実施例 4：形質転換体における D-乳酸生産の確認）
実施例 3で作製した 5種類の形質転換株と親株である IF02260株について発酵 試験を行った。 各株を YPD液体培地 5ralに植菌し、 30°C、 130rpraにてー晚振とう 培養を行い、 発酵生産に必要な菌体を準備した。
増殖した菌体を集菌し、 グルコース 10%の YPD液体培地に菌体濃度が 0. 5%に なるよう植菌し、 30°Cの静置条件にて 4日間の発酵を行った。 なお、 本発酵試験 では、 発酵液に炭酸カルシウム （ナラカイテスタ社製） を 2. 5%加えた D-乳酸塩 での生産と、 炭酸カルシウムを加えないフリー D-乳酸での生産の 2種類の生産方 式について確認した。
発酵開始から 4日経過後において、 発酵液を採取し、 本溶液に含まれる D-乳酸 及びエタノール量を多機能バイオセンサ BF- 4装置（王子計測機器社製） を用いて 測定した。 なお D-乳酸の測定には、 D-乳酸測定キット （王子計測機器社製） を用 い、 使用の詳細は附属のマニュアルに従った。 結果を図 8及び図 9に示す。
図 8及ぴ図 9に示すように、親株である遺伝子非導入酵母（IF02260株）では、 エタノールが生産されるが D-乳酸は生産されないのに対して、実施例 3で作製し た 4種類の染色体導入型形質転換酵母は、 親株に対してエタノール生産が低下す る一方、 いずれも！)-乳酸の生産が確認された。
すなわち、 酵母染色体において、 染色体の PDC1プロモーターの下流に D-LDHME 遺伝子が導入された形質転換体である TC14 - 6- 1A株、 TC14-6-2A株、 TC14 - 6- 3A 株及ぴ D- LDH遺伝子を導入した TC20-1- 1A株の 4株においては、 D-乳酸が 4〜6% 濃度で生産され、 エタノールが 2〜3%であった。 また、 これらの染色体導入型形 質転換体にあっては、 L-乳酸は生産されていなかった。
これに対し、自己複製プラスミ ドによって D- LDHME遺伝子を導入した株（TC21- 1 株） では、 D -乳酸の生産量は極めて少なく、 エタノール生産量は IF02260株と同 等であった。
これらのことから、 D-LDHの発現及ぴ D-乳酸生産には染色体組み込み型が有効 であり、 特に、 PDC1プロモーターの制御下に D-LDH遺伝子 （D- LDHME遺伝子を含 む） を導入することが D -乳酸の高生産に有効であることが明らかであった。
また、 前記した染色体導入型形質転換体 4株のなかでも、 PDC1プロモーター下 に D- LDHME遺伝子が導入された 3株では、 5 %〜 6 %の高い D-乳酸生産に対して 2 % の低いエタノール生産を示し、 ェタノールに対して 2倍〜 3倍の D -乳酸生産量で あつたのに対し、 同プロモーター下に D- LDH 遺伝子 （ GeneBank ACCESSION No. L29327) が導入されたものでは、 D-乳酸の生産量も低く （4%程度） しかもェ タノール生産量とほぼ同等〜 1. 3 倍程度であった。 これらのことから、 染色体導 入型形質転換体において D- LDHME遺伝子が D-乳酸の高生産に寄与していることが 明らかであった。
なお、 D -乳酸の高生産は、 D -乳酸塩（カルシウム）とフリーの L -乳酸との双方に おいて同程度に観察された。
(実施例 5： D-LDHME遺伝子の導入コピー数を増大させた遺伝子組換え酵母） 実施例 4で作製した D-乳酸生産酵母のうち TC14- 6- 3A株を用いて、 D- LDHME遺 伝子の導入コピー数を増大させた遺伝子組換え酵母を作製した。 D- LD龍 E 遺伝子 を TC14- 6 - 3A株に導入する方法は、実施例 3に記載した方法に準じた。すなわち、 本例では、 宿主として酵母 IF02260株を使用する代わりに TC14- 6- 3A株を使用し た以外は、実施例 3に記載した方法で TC14- 6-3A株に D- LDHME遺伝子を導入した。 得られた遺伝子導入株を TD1- 10- 1B 株、 TD1- 10- 3B 株、 TD1- 10- 6A 株及ぴ TD1-10 - 7D 株と命名した。 また、 これら 4株について実施例 3と同様にして、 D-LDHME遺伝子の導入コピー数を確認したところ、 D- LDHME遺伝子が 4コピー導入 されていることが判明した。
次に、これら 4株について、実施例 4に記載した方法に準じて発酵試験を行い、 D -乳酸の生産量を確認した。 その結果を図 1 0に示す。 図 1 0に示すように、 親 株である TC14- 6 - 3A株における D -乳酸生産量 （4. 65 % ) と比較して、 本例で取得 した TD1- 10- 1B株、 TD1-10-3B株、 TD1- 10- 6A株及ぴ TD1-10-7D株いずれにおいて も D-乳酸生産量が向上していた。 また、 親株と比較して、 本例で取得した 4株に おいては、 エタノール生産が減少していた。
これらの結果から、 D- LDHME遺伝子の導入コピー数を増大させることによって、 形質転換酵母における D -乳酸生産能を向上させることができることが判明した。 なお、 本例では、 D- LD簡 E 遺伝子を 4コピー導入した形質転換酵母について検討 したが、 より多くのコピー数で D- LDHME遺伝子を導入することによって、 D -乳酸 生産量をより向上できる。 すなわち、 本例によって、 D- LDHME 遺伝子の導入コピ 一数を増やすことによって、 より優れた D-乳酸生産能を有する形質転換酵母を作 製できることが判明したこととなる。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性 本発明によれば、 D-乳酸の効率的な生産技術を提供することができる。 配列表フリーテキスト
配列番号 6〜11：人工 DNA (プライマー）
- J J -

Claims

請求の範囲
1 . 以下の （a ) 〜 （g ) のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
( a ) 配列番号 1に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド。
( b ) 配列番号 1記載の塩基配列の全体もしくはその一部から調製されるプロ一 ブ又はその相補鎖とストリンジヱントな条件下でハイブリダイズし、 かつ、 D -乳 酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
( c ) 配列番号 2記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌク レオチド。
( d ) 配列番号 2記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の置 換、 欠失、 挿入、 又は付加を含むアミノ酸配列からなり、 かつ、 D-乳酸脱水素酵 素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
( e ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有し、 D -乳酸脱水 素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
( f ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 表 1のアミノ酸残基置換表か ら選択される 1種あるいは 2種以上の置換を有するアミノ酸配列を有し、 D -乳酸 脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌク レオチド。
表 1
ァミノ酸残基置換表
置換タイプ 置換位置 置換アミノ酸
1 4 0 バリン Val
2 1 1 2 ィソロイシン lie
3 1 3 1 ヒスチジン His
4 1 3 9 - ィソロイシン lie
5 1 8 1 グルタミン酸 Glu
6 2 6 6 グリシン Gly
7 2 6 7 ロイシン Leu
8 2 6 8 フエ二ルァラニン Phe
9 2 6 9 ァスパラギン Asn 1 0 2 7 0 グルタミン酸 Glu
1 1 2 7 1 ァスパラギン酸 Asp
1 2 2 7 2 トリプトファン Trp
1 3 2 7 3 セリ ン Ser
1 4 2 7 4 グリシン Gly
1 5 2 7 6 グルタミン酸 Glu
1 6 2 7 7 フエ二ルァラニン Phe
1 7 2 8 7 セリ ン Ser
1 8 2 9 2 ロイシン Leu
1 9 2 9 3 パリン Val
ただし、 上記表における置換位置は開始コドンに対応するメチォニンからの位 置として示す。
( g ) 配列番号 2のアミノ酸配列のうち、 少なくとも 78〜79位、 152〜175位、 235位、 296位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、 D -乳酸脱水素酵素活性 を有する、 タンパク質をコードするポリヌクレオチド。 -
2 . 以下の （h ) 〜 （1 ) のいずれかに記載のタンパク質。
( h ) 配列表の配列番号 2記載のァミノ酸配列からなるタンパク質。
( i ) 配列表の配列番号 2記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミ ノ酸の置換、 欠失、 挿入、 又は付加を含むアミノ酸配列からなり、 かつ、 D-乳酸 脱水素酵素活性を有するタンパク質。
( j ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列と 70%以上の相同性を有し、 D-乳酸脱水 素酵素活性を有するタンパク質。
( k ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 表 1のアミノ酸残基置換表か ら選択される 1種あるいは 2種以上の置換を有するアミノ酸配列を有し、 D -乳酸 脱水素酵素活性を有するタンパク質。
( 1 ) 配列番号 2のァミノ酸配列のうち、 少なくとも 78〜79位、 152〜175位、 235位、 296位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、 D -乳酸脱水素酵素活性 を有するタンパク質。
3 . DNA構築物であって、 請求項 1に記載の DNAを有する DNAセグメントと、
プロモーター又は当該プロモーターのホモ口グをコ一ドする DNAを有する D N Aセグメント、
とを備える、 DNA構築物。
4 . 前記プロモ一ターは、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターである、 請求項 3記載の DNA構築物。
5 . 前記プロモーターは、 サッカロマイセス属のピルビン酸脱炭酸酵素 1遺 伝子プロモーターである、 請求項 3又は請求項 4に記載の DNA構築物。
6 . 前記プロモーターは、サッカロマイセス 'セレピシェのピルビン酸脱炭酸 酵素 1遺伝子プロモーターである、 請求項 5記載の DNA構築物。
7 . 宿主中に請求項 1に記載の DNAを発現可能に保持する形質転換体。
8 . 宿主が、 酵母並びに真菌を含む真核微生物、 及び乳酸菌、 Echerichia属 菌、並びに Bacillus属菌を含む原核微生物からなる群から選択される微生物であ る、 請求項 7記載の形質転換体。
9 . 前記 DNAは、 プロモーターあるいは当該プロモータ"のホモログの制御 下において発現可能に保持されている、 請求項 7又は 8に記載の形質転換体。
1 0 . 前記プロモーターは、 ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターであ る、 請求項 9記載の形質転換体。
1 1 . 前記プロモーターは、 サッカロマイセス属のピルビン酸脱炭酸酵素 1 遺伝子プロモーターである、 請求項 9または請求項 1 0に記載の形質転換体。
1 2 . 前記 DNAは、 宿主ピルビン酸脱炭酸酵素 1遺伝子プロモーターの制御 下において発現可能に保持されている、 請求項 1 1に記載の形質転換体。
1 3 . 前記宿主微生物がサッカロマイセス 'セレピシェである、請求項 7〜1 2のいずれかに記載の形質転換体。
1 4 . D-乳酸の生産方法であって、
請求項 7〜 1 3のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程と、
当該培養物から D-乳酸、 その塩、 及びその誘導体のうちの 1種あるいは 2種以 上を採取する工程、
とを備える、 方法。
1 5 . 乳酸系ポリマーの生産方法であって、
請求項 7〜 1 3のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程と、
当該培養物から D-乳酸、 その塩、 及びその誘導体のうちの 1種あるいは 2種以 上を採取する工程と、
採取した D-乳酸あるいはその誘導体を少なくとも 1種の重合材料として用いて 乳酸ポリマーを製造する工程、
とを備える、 方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006296377A (ja) * 2005-04-25 2006-11-02 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 有機酸生産用形質転換体
US7326550B2 (en) 1997-09-12 2008-02-05 Tate & Lyle Ingredients Americas, Inc. Yeast strains for the production of lactic acid
US7473540B2 (en) 2005-09-22 2009-01-06 Tate & Lyle Ingredients Americas, Inc. Methods for selecting a yeast population for the production of an organic acid and producing an organic acid
WO2010140602A1 (ja) 2009-06-03 2010-12-09 東レ株式会社 Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびｄ－乳酸の製造方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0308379A (pt) * 2002-03-11 2005-01-11 Toyota Motor Co Ltd Método de controle de produção de etanol
US7232664B2 (en) * 2002-05-30 2007-06-19 Natureworks Llc Fermentation process using specific oxygen uptake rates as a process control
CN101633691B (zh) * 2008-07-22 2011-09-14 清华大学 一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用
JP5797280B2 (ja) * 2011-02-23 2015-10-21 マクロジェン・インコーポレーテッド 高光学純度の乳酸生産用形質転換体およびそれを利用した乳酸生産方法
KR20130013226A (ko) 2011-07-27 2013-02-06 현대자동차주식회사 광학 순수 ｄ타입 유산 제조방법
EP3011017B1 (en) 2013-06-18 2019-09-11 Calysta, Inc. Compositions and methods for biological production of lactate from c1 compounds using lactate dehydrogenase transformants
US10337043B2 (en) 2014-01-16 2019-07-02 Calysta, Inc. Carbohydrate-enriched recombinant microorganisms
KR102581464B1 (ko) 2015-05-28 2023-09-21 삼성전자주식회사 락테이트 데히드로게나제 변이체를 스크리닝하는 방법, 락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 락테이트를 생산하는 방법
JP2020505043A (ja) * 2017-01-24 2020-02-20 四川大学 核酸巻き戻し機能を有する膜貫通型ナノポア並びにその構築方法及び用途
WO2019200072A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 Lygos, Inc. Recombinant host cells and methods for producing l-lactic acid
CN109182285A (zh) * 2018-10-10 2019-01-11 浙江卓运生物科技有限公司 坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5816688A (ja) 1981-07-02 1983-01-31 バスフ・アクチェンゲゼルシャフト 光学的に純粋なｄ−又はｌ−乳酸の製法
JPS5836394A (ja) 1981-08-11 1983-03-03 ヘキスト・アクチエンゲゼルシヤフト Ｄ−乳酸の製法
JPS61293387A (ja) 1985-06-21 1986-12-24 Daicel Chem Ind Ltd Ｄ−乳酸の製造法
JPH04271787A (ja) 1991-02-28 1992-09-28 Mitsubishi Petrochem Co Ltd Ｄ−乳酸の製造法及びシュードモナス属細菌
JP2001029063A (ja) 1999-07-19 2001-02-06 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 高純度のｄ−乳酸を生成する微細藻と、これを用いたｄ−乳酸製造方法及び装置
JP2001204468A (ja) 2000-01-27 2001-07-31 Toyota Motor Corp 耐酸性乳酸生成微生物
JP2001516584A (ja) 1997-09-12 2001-10-02 エイ・イー・スタリー・マニユフアクチヤリング・カンパニー 乳酸生産のための酵母菌株
JP2002136293A (ja) 2000-08-23 2002-05-14 Toray Ind Inc 微生物およびｄ−乳酸の製造方法
WO2003027280A1 (fr) * 2001-09-20 2003-04-03 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Systeme de surexpression genique
JP2003145085A (ja) 2001-11-08 2003-05-20 Ohbayashi Corp 廃棄物処分場の埋立て方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2692591B1 (fr) * 1992-06-23 1995-06-09 Agronomique Inst Nat Rech Souches de levure exprimant le gene de la ldh lactique, et vecteurs utilisables pour l'obtention desdites souches.
BR0010806B1 (pt) * 1999-05-21 2014-02-18 Métodos e materiais para a síntese de produtos orgânicos
JP2003164294A (ja) 2001-09-20 2003-06-10 Toyota Motor Corp Ｐｄｃ１プロモーター
JP4109489B2 (ja) 2001-09-20 2008-07-02 トヨタ自動車株式会社 遺伝子高発現系
JP2003259878A (ja) 2002-03-11 2003-09-16 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 乳酸脱水素酵素をコードするｄｎａおよびその利用
JP2003334092A (ja) 2002-03-11 2003-11-25 Toyota Central Res & Dev Lab Inc エタノール生産制御方法
JP4095889B2 (ja) 2002-12-13 2008-06-04 トヨタ自動車株式会社 高光学純度な乳酸の製造方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5816688A (ja) 1981-07-02 1983-01-31 バスフ・アクチェンゲゼルシャフト 光学的に純粋なｄ−又はｌ−乳酸の製法
JPS5836394A (ja) 1981-08-11 1983-03-03 ヘキスト・アクチエンゲゼルシヤフト Ｄ−乳酸の製法
JPS61293387A (ja) 1985-06-21 1986-12-24 Daicel Chem Ind Ltd Ｄ−乳酸の製造法
JPH04271787A (ja) 1991-02-28 1992-09-28 Mitsubishi Petrochem Co Ltd Ｄ−乳酸の製造法及びシュードモナス属細菌
JP2001516584A (ja) 1997-09-12 2001-10-02 エイ・イー・スタリー・マニユフアクチヤリング・カンパニー 乳酸生産のための酵母菌株
JP2001029063A (ja) 1999-07-19 2001-02-06 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 高純度のｄ−乳酸を生成する微細藻と、これを用いたｄ−乳酸製造方法及び装置
JP2001204468A (ja) 2000-01-27 2001-07-31 Toyota Motor Corp 耐酸性乳酸生成微生物
JP2002136293A (ja) 2000-08-23 2002-05-14 Toray Ind Inc 微生物およびｄ−乳酸の製造方法
WO2003027280A1 (fr) * 2001-09-20 2003-04-03 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Systeme de surexpression genique
JP2003145085A (ja) 2001-11-08 2003-05-20 Ohbayashi Corp 廃棄物処分場の埋立て方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOUREL G. ET AL: "The response of Leuconostoc mesenteroides to low external oxidoreduction potential genereated by hydrogen gas", J. APPL. MICROBIOL., vol. 94, February 2003 (2003-02-01), pages 280 - 288, XP002977747 *
DARTOIS V. ET AL: "Purification, properties and DNA sequence of the D-lactate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris", RES. MICROBIOL., vol. 146, 1995, pages 291 - 302, XP002977746 *
HIDEYA FUJIMOTO: "Shokubutsu saibo kogaku", 1997, PROTOCOL OF PLANT PCR EXPERIMENTS, article "Gousei idenshi no sakuseihou (Production of synthetic genes)", pages: 95 - 100
MANIATIS ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
See also references of EP1637603A4

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7326550B2 (en) 1997-09-12 2008-02-05 Tate & Lyle Ingredients Americas, Inc. Yeast strains for the production of lactic acid
JP2006296377A (ja) * 2005-04-25 2006-11-02 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 有機酸生産用形質転換体
US7473540B2 (en) 2005-09-22 2009-01-06 Tate & Lyle Ingredients Americas, Inc. Methods for selecting a yeast population for the production of an organic acid and producing an organic acid
WO2010140602A1 (ja) 2009-06-03 2010-12-09 東レ株式会社 Ｄ－乳酸脱水素酵素活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびｄ－乳酸の製造方法
US8822195B2 (en) 2009-06-03 2014-09-02 Toray Industries, Inc. Polypeptide having D-lactate dehydrogenase activity, polynucleotide encoding the polypeptide, and process for production of D-lactic acid
RU2553563C2 (ru) * 2009-06-03 2015-06-20 Торэй Индастриз, Инк. Полипептид, обладающий активностью d-лактатдегидрогеназы, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и способ получения d-молочной кислоты

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