BR0010806B1

BR0010806B1 - Métodos e materiais para a síntese de produtos orgânicos

Info

Publication number: BR0010806B1
Application number: BRPI0010806-5A
Authority: BR
Inventors: Vineet Rajgarhia; Vassily Hatzimanikatis; Stacey Olson; Ting Liu Carlson; John N Starr; Jeffrey J Kolstad; Aharon M Eyal
Priority date: 1999-05-21
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2014-02-18
Also published as: CA2374482C; CZ299320B6; DE60029440T2; PT1183385E; AU780135B2; PL352434A1; KR20020048910A; CZ20014090A3; NO20015688L; JP2003500062A; AU5034400A; HUP0201204A2; HUP0201204A3; CN100347308C; DE60029440D1; NO20015688D0; YU83101A; UA77386C2; US6485947B1; CA2374482A1

Description

"MÉTODOS E MATERIAIS PARA A SÍNTESE DE PRODUTOS ORGÂNICOS" ANTECEDENTES 1. Campo Técnico A invenção refere-se a métodos e materiais envolvidos na produção de produtos orgânicos. 2. Informação de Antecedentes Produtos orgânicos tais como ácido lático têm muitos usos industriais importantes. Por exemplo, ácidos orgânicos podem ser usados para síntese de materiais plásticos assim como outros produtos. Para satisfazer a crescente necessidade por produtos orgânicos, métodos de produção mais eficientes e de custo mais efetivo estão sendo desenvolvidos. Um tal método envolve o uso de bactérias.

Especificamente, certas bactérias podem produzir grandes quantidades de produtos orgânicos particulares sob certas condições de fermentação. 0 uso de bactérias vivas como fábricas, entretanto, é limitado pela incapacidade das bactérias crescerem na medida em que o produto orgânico acumula-se nos meios de crescimento. Para driblar tais limitações, várias técnicas de purificação de produto foram empregadas durante síntese de produto. Em adição, o uso de microorganismos outros crue nao bactérias foi tentado. De fato, Saccharomyces cerevisiae, que é conhecido ser tolerante a ácido, foi geneticamente modificado em um tentativa de produzir ácido lático. Especificamente, células de S. cerevisiae foram modificadas pelo provimento das células com um ADNc lactato desidrogenase bovino e interrompendo genes piruvato descarboxilase endógenos {PDC1, PDC5, e PDC6). Embora estas células de S. cerevisiae modificadas tenham produzido algum ácido lático, crescimento de célula foi suprimido conduzindo à conclusão de que ambos crescimento de célula e produção de ácido lático precisam de aperfeiçoamento.

SUMÁRIO A presente invenção genericamente refere-se a métodos e materiais para produção de produtos orgânicos.

Especificamente, a invenção provê células de levedura, métodos para cultura de células de levedura, métodos para fabricação de células de levedura, construções de ácidos nucléicos, e métodos e materiais para produção de vários produtos orgânicos. A invenção é baseada na descoberta de que microorganismos particulares (por exemplo, microorganismos bacteriais e fungos) podem ser geneticamente manipulados de modo que eles tenham a habilidade, sob específicas condições de cultura, para crescer, utilizar várias fontes de carbono para crescer assim como produção de produto, e produzir um desejado produto orgânico para propósitos comerciais. Por exemplo, as células de levedura aqui providas podem crescer e produzir um produto orgânico quando cultivadas em baixo pH e alta temperatura. Tendo a habilidade de crescer rapidamente e produzir um produto orgânico eficientemente sob, por exemplo, condições de baixo pH e alta temperatura é particularmente vantajoso.

Especificamente, a habilidade de um microorganismo tolerar pH baixo elimina a necessidade de manter-se um ambiente de pH neutro, ο que pode ser difícil e caro durante métodos de produção em grande escala. Em adição, os métodos e materiais necessários para recuperação do desejado produto orgânico a partir de um caldo de baixo pH podem ser mais práticos e eficientes que aqueles requeridos para recuperação do mesmo produto orgânico a partir do mesmo caldo tendo um pH mais neutro. Por exemplo, certos produtos ácidos orgânicos podem precipitar da solução quando o pH cai abaixo do valor de pKa de produto, tornando recuperação muito simples. Ainda, a habilidade de um microorganismo tolerar altas temperaturas elimina a necessidade de manutenção de temperaturas baixas durante as fases de crescimento e produção. Claramente, redução de necessidade de diminuir a temperatura em tanque de caldo de grande volume durante métodos de produção de grande escala torna o método total mais eficiente e mais barato. Além disso, a habilidade de um microorganismo tolerar ambos, baixo pH e alta temperatura prove um método conveniente para prevenção de contaminação por outros microorganismos menos tolerantes durante os métodos de produção de grande escala. É importante notar que um aspecto crítico com relação â habilidade para produzir um desejado produto orgânico para propósitos comerciais pode ser a específica produtividade na qual aquele desejado produto orgânico é produzido. Por exemplo, provimento de uma alta produtividade específica usando-se os métodos e materiais como aqui descritos pode permitir que um microorganismo proporcione a energia necessária para manutenção de célula quando exposto a condições de cultura tais como baixo pH e alta temperatura. Esta energia requerida pode ser gerada via um caminho de fermentação sob condições substancialmente anaeróbicas, antes que confiando na formação de energia via o caminho respiratório.

Obtenção de energia via um caminho de fermentação é particularmente vantajoso quando produzindo um produto orgânico que não requer o caminho respiratório uma vez que essencialmente toda a fonte de carbono provida pode ser usada para produzir o desejado produto orgânico. A invenção é também baseada na descoberta de que a utilização de uma fonte de carbono através de certos microorganismos manipulados geneticamente pode ser controlada e direcionada predominantemente na direção da produção de tanto biomassa como um desejado produto orgânico. Em termos gerais, a invenção envolve dois tipos de métodos de cultura. Um método de cultura envolve cultura de microorganismos sob específicas condições de cultura, dependendo do microorganismo e resultado desejado, que promovem produção de biomassa, enquanto o outro envolve um diferente conjunto de condições de cultura, também dependente do microorganismo e resultado desejado, que promove a produção de um desejado produto orgânico.

Claramente, tendo-se a habilidade para manipular-se a utilização de uma fonte de carbono durante métodos de produção de larga escala é provida para os fabricantes maior flexibilidade e mais controle do que é de outro modo possível.

Em adição, a invenção é baseada na descoberta de que certos microorganismos podem ser geneticamente manipulados de modo que maior parte, se não toda, de uma fonte de carbono seja utilizada para produção de tanto biomassa como um desejado produto orgânico. Especificamente, a invenção provê células de levedura que sao modificadas de modo que caminhos de biossíntese que desviam a utilização de uma fonte de carbono da produção de biomassa ou o desejado produto orgânico são inativados. Inativação de tais caminhos de biossíntese provê microorganismos que podem ser eficientemente desenvolvidos e produz o produto desejado.

Genericamente, a invenção caracteriza uma célula de levedura contendo uma molécula de ácido nucléico exógeno, com a molécula de ácido nucléico exógena codificando um polipeptídeo tendo atividade enzimática dentro da célula. 0 ácido nucléico pode ser incorporado no genoma da célula. A atividade enzimática conduz à formação de um produto orgânico que, em algumas realizações, é secretado a partir da célula. A célula ainda tem um fenótipo negativo - crabtree e produz o produto orgânico. A célula pode ser, por exemplo, do gênero Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon, ou Yamadazyma. O produto orgânico pode ser, por exemplo, um produto de fermentação, um produto derivado piruvato, um ácido orgânico, ou um carboxilato tal como lactato. Em uma realização, o polipeptídeo pode ter atividade lactato desidrogenase. Por exemplo, o ácido nucléico exógeno codifica uma lactato desidrogenase bacterial ou lactato desidrogenase de fungo tal como uma lactato desidrogenase de fungo K. lactis.

Em uma outra realização, as células contêm quatro moléculas de ácido nucléico exógeno, cada uma das quatro moléculas de ácido nucléico exógeno codificando um polipeptídeo diferente. Por exemplo, a primeira das quatro moléculas de ácido nucléico exógeno pode codificar um primeiro polipeptídeo tendo atividade lactato desidrogenase, a segunda pode codificar um segundo polipeptídeo tendo uma atividade CoA-transferase, a terceira pode codificar um terceiro polipeptídeo tendo uma atividade lactil-CoA desidratase, e a quarta pode codificar um quarto polipeptídeo tendo atividade acrilil-CoA hidratase. Uma tal célula pode produzir acrilato como o produto carboxilato.

Alternativamente, a primeira das quatro moléculas de ácido nucléico exógeno pode codificar um primeiro polipeptídeo tendo atividade 2-desidro-3-desoxi-D-pentanoato aldolase, o segundo pode codificar um segundo polipeptídeo tendo atividade xilonato desidratase, o terceiro pode codificar um terceiro polipeptídeo tendo atividade xilono lactonase, e o quarto pode codificar um quarto polipeptídeo tendo atividade D-xilose desidrogenase. Uma tal célula pode produzir um carboidrato, tal como D-xilose, como o produto orgânico.

Ainda em uma outra realização, a célula contem seis moléculas de ácido nucléico exógeno, cada uma das seis moléculas de ácido nucléico exógeno codificando um diferente polipeptídeo. Por exemplo, a primeira das seis moléculas de ácido nucléico exógeno pode codificar um primeiro polipeptídeo tendo atividade 2,5-dioxovalerato desidrogenase, a segunda pode codificar um segundo polipeptídeo tendo atividade 5-desidro-4-desoxi-D-glucarato desidrogenase, a terceira pode codificar um terceiro peptídeo tendo atividade glucarato desidratase, a quarta pode codificar um quarto polipeptídeo tendo atividade aldeído desidrogenase, a quinta pode codificar um quinto polipeptídeo tendo atividade glucurono lactono redutase, e o sexto pode codificar um sexto polipeptídeo tendo atividade L-gulono lactono oxidase. Uma tal célula pode produzir uma vitamina, por exemplo, L-ascorbato, como o produto orgânico. 0 produto orgânico pode conter mais que três átomos de carbono, e pode ser, por exemplo, um aminoãcido.

Em uma outra realização, a célula é capaz de catabolizar um carbono pentose tal como ribose, arabinose, xilose e lixose.

Em uma outra realização, a célula tem reduzida atividade piruvato descarboxilase ou reduzida atividade álcool desidrogenase. Por exemplo, a célula pode ter falta de toda atividade piruvato descarboxilase. A atividade piruvato descarboxilase reduzida pode ser devida a um locus genético interrompido, onde o locus normalmente tem a sequência de ácidos nucléicos que codifica piruvato descarboxilase. Alternativamente, a célula pode conter uma molécula anti - sentido, tal como uma ribozima, que corresponde a uma seqüência de ácidos nucléicos endógena, onde a molécula anti - sentido reduz a atividade piruvato descarboxilase. A célula então também pode conter uma molécula de ácido nucléico endógeno adicional que funciona como um plasmídeo assassino. Ετη uma outra realização, a atividade enzimatica do polipeptideo codificado pelo ácido nucléico exógeno conduz à formação do produto orgânico em uma maneira consumidora- NADH.

Em uma outra realização, a célula produz pelo menos cerca de 60 gramas do produto orgânico cada 100 gramas de glicose consumidos quando a célula é cultivada sob condições ótimas para a produção do produto orgânico.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza uma célula, por exemplo, uma célula de levedura, que contem um molécula de ácido nucléico exógeno, onde a molécula de ácido nucléico exógeno codifica um polipeptideo que promove catabolismo de um carbono pentose pela célula. 0 polipeptideo pode ser, por exemplo, xilose redutase, xilitol desidrogenase, ou xilulo cinase, e o carbono pentose pode ser, por exemplo, ribose, arabinose, xilose, e lixose. A célula ainda pode catabolizar um carbono hexose e pode, se desejado, simultaneamente catabolizar o carbono hexose e o carbono pentose. 0 arbono hexose pode ser, por exemplo, alose, altrose, glicose, manose, gulose, iodose, frutose, galactose e talose.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza uma célula de levedura contendo uma molécula de ácidonucléico exógeno, onde a molécula de acido nucléico exogeno codifica um polipeptideo que promove acumulação de acetil-CoA no citoplasma da célula. O polipeptideo pode ser um polipeptideo que tem atividade citrato liase, ou pode ser um polipeptídeo de membrana mitocondrial que promove permeabilidade de acetil-CoA através de membrana mitocondrial. A célula pode ter reduzida atividade piruvato descarboxilase ou reduzida atividade álcool desidrogenase.

Alternativamente, a célula de levedura pode carecer de produção de etanol, e pode ter uma taxa de crescimento sob condições de cultura carecendo de etanol e acetato que é maior que a taxa de crescimento observada para uma célula de levedura comparável carecendo de produção de etanol.

Ainda em um outro aspecto, a invenção caracteriza uma célula de levedura tendo reduzida atividade de um polipeptídeo mitocondrial, onde a célula tem um fenótipo negativo-crabtree. Uma tal célula pode ser, por exemplo, do gênero Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon ou Yamadazyma. A célula pode carecer completamente de atividade. A célula pode conter um locus interrompido, onde o locus normalmente inclui uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica o polipeptídeo mitocondrial . 0 polipeptídeo mitocondrial pode ser uma enzima do ciclo de Krebs. Ainda, a célula pode acumular um produto de ciclo de Krebs. A célula pode incluir uma molécula de ácido nucléico exógeno, onde a molécula de acido nucleico exogeno pode codificar um polipeptídeo tendo atividade enzimática dentro da célula, com a atividade enzimática conduzindo a formação de um produto orgânico, de modo que a célula produza o produto orgânico. 0 produto orgânico pode ser, por exemplo, citrato, α-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato, e oxaloacetato. 0 polipeptídeo pode ser um polipeptídeo que participa no catabolismo de lactato ou acetato.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza um método para a produção de um produto orgânico. O método inclui provimento de células de levedura, onde as células incluem uma molécula de ácido nucléico exógeno que codifica um polipeptídeo tendo atividade enzimatica dentro das células, onde a atividade enzimática conduz â formação do produto orgânico, e onde as células tem um fenótipo negativo - crabtree, e cultivando as células com meio de cultura de modo que o produto orgânico seja produzido. As células de levedura podem ser de gêneros Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon ou Yamadazyma. 0 produto orgânico pode ser um produto de fermentação, um produto derivado piruvato, um produto orgânico contendo mais de três átomos de carbono, um carboxilato, carboidrato, aminoácido, vitamina, ou produto lipídeo. 0 produto orgânico ainda pode ser lactato, glicerol, acrilato, xilose, ascorbato, citrato, isocitrato, alfa — ceto glutarato, succinil-CoA, succinato, fumarato, malato, ou oxaloacetato. Em algumas realizações, o produto orgânico é secretado pelas células. O método pode resultar em células tendo reduzida atividade piruvato descarboxilase ou reduzida atividade álcool desidrogenase. A atividade enzimática pode conduzir a formação do produto orgânico em uma maneira consumidora de NADH. Células fabricadas através destes métodos podem produzir pelo menos cerca de 60 gramas do produto orgânico para cada 100 gramas de glicose consumidos quando a etapa de cultura é ótima para produção do produto orgânico. O meio de cultura, que pode ser líquido, pode incluir um inibidor de respiração celular, tal como antimycin A, cianeto, ou azida. A etapa de cultura pode incluir crescimento das células sob condições de crescimento aeróbicas seguida por contato das ditas células com um inibidor de respiração celular.

Em uma realização alternativa, a etapa de cultura inclui incubação de células sob condições anaeróbicas de cultura. Ainda em uma realização alternativa, a etapa de cultura inclui crescimento de células sob condições de crescimento aeróbico seguido por incubação de células sob condições anaeróbicas de cultura. A etapa de cultura também pode incluir cultura das células em uma temperatura maior que cerca de 35“C.

Em uma realização, o meio de cultura tem um valor de pH orgânico de menos que cerca de 3,0, e/ou um valor de pH inorgânico de menos que cerca de 3,0. Em uma outra realização, o meio contem um carbono pentose tal como ribose, arabinose, xilose, ou lixose. O meio também pode incluir um hidrolisato de fibra de milho tendo, por exemplo, um valor de pH entre cerca de 2,0 e cerca de 6,5.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza um método para produção de um produto orgânico, o método incluindo a) provimento de células de levedura contendo uma molécula de ácido nucléico exógeno codificando um polipeptídeo que promove catabolismo de um carbono pentose através da célula, onde a célula contem uma atividade enzimãtica que conduz à formação do dito produto orgânico, e b) cultura das células com meio de cultura de modo que o produto orgânico seja produzido.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza um método para produção de um produto orgânico, o método incluindo: a) provimento de células de levedura, onde as células incluem uma molécula de ácido nucléico exógeno codificando um polipeptídeo que promove acumulação de acetil-CoA no citoplasma da célula, e onde a célula contem uma atividade enzimãtica que conduz à formação do produto orgânico, e b) cultura das células com meio de cultura de modo que o produto orgânico seja produzido.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza um método para produção de um produto orgânico, o método incluindo: a) provimento de células de levedura tendo reduzida atividade de uma enzima mitocondrial, onde redução da atividade conduz â acumulação do produto orgânico, e b) cultura das ditas células com meio de cultura de modo que o dito produto orgânico é produzido.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza um método para cultura de células de levedura tendo um fenótipo negativo - crabtree, o método incluindo cultura de células com meio de cultura, onde o meio de cultura tem um valor de pH orgânico de menos que cerca de 3,0 e/ou um valor de pH inorgânico de menos que cerca de 3,0. A etapa de cultura pode incluir cultura de células em uma temperatura maior que cerca de 35°C. O meio de cultura pode incluir um inibidor de respiração celular. 0 meio de cultura também pode incluir um carbono pentose. Em uma outra realização, o meio de cultura pode incluir um hidrolisato de fibra de milho.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza um método para cultura de células de levedura tendo um fenótipo negativo - crabtree, o método incluindo cultura de células com o meio de cultura, onde o meio de cultura inclui um hidrolisato de fibra de milho.

Em um outro aspecto a invenção caracteriza um método para cultura de células com meio de cultura em uma temperatura maior que cerca de 3 5°C, com o meio de cultura tendo um valor de pH inorgânico de menos que cerca de 3,0.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza um método para cultura de células de levedura tendo um fenótipo negativo - crabtree, o método incluindo cultura de células com meio de cultura em uma temperatura maior que cerca de 35°C, com o meio de cultura incluindo um carbono pentose.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza um método para cultura de células de levedura tendo um fenótipo negativo - crabtree, o método incluindo cultura de células com meio de cultura em uma temperatura maior que cerca de 35 °C, com o meio de cultura incluindo um hidrolisato de fibra de milho.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza uma construção de ãcidonucléico que inclui uma seqüência recombinação e uma seqüência selecionada, com a seqüência recombinação correspondendo a uma seqüência genômica de uma célula tendo um fenótipo negativo - crabtree, com a seqüência genômica codificando uma enzima expressa pela célula, e com a seqüência selecionada codificando uma enzima que conduz â formação de um produto orgânico dentro da célula. A ’ seqüência selecionada pode estar dentro da seqüência de recombinação de modo que a seqüência selecionada seja flanqueada em cada extremidade pela seqüência de recombinação.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza um método para fabricação de uma célula de levedura recombinante, incluindo provimento de uma célula de levedura tendo um fenótipo negativo - crabtree, seleção de um produto final, identificação de qual enzima exógena ou enzimas precisam ser adicionadas à célula para produzir o produto final, identificação de qual enzima ou enzimas endógenas cujas atividades são para serem reduzidas na dita célula para permitir produção do dito produto final dentro da dita célula, adicionando a enzima ou enzimas exógenas identificadas â célula de levedura provida, e reduzindo a atividade da enzima ou enzimas endógenas identificadas na célula de levedura provida de modo que a célula produz o produto final sob condições de cultura.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza um hidrolisato de fibra de milho, o hidrolisato tendo um valor de pH entre cerca de 2,0 e cerca de 6,5. O hidrolisato pode incluir glicose, xilose e arabinose. O hidrolisato pode incluir cerca de 40 gramas/L glicose, cerca de 40 gramas / L xilose, e cerca de 20 gramas / L arabinose.

Alternativamente, o hidrolisato pode incluir cerca de 38,7 gramas / L de glicose, cerca de 39,1 gramas / L xilose, cerca de 20,7 gramas / L arabinose, e cerca de 1,6 gramas /L furfural.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza um método para fabricação de um produto orgânico, incluindo a) cultura de um microorganismo sob condições de cultura, onde o microorganismo tem reduzida atividade enzimãtica; a atividade enzimática pode ser piruvato descarboxilase, álcool desidrogenase, aldeído desidrogenase, ou atividade acetil-CoA sintase; o microorganismo exibe uma taxa de crescimento na ausência de etanol e acetato que é pelo menos cerca de 30% daquela observada para um microorganismo correspondente não tendo a dita atividade enzimãtica reduzida, e b) alterando as condições de cultura para promover produção do produto orgânico.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza um método para fabricação de um produto orgânico, incluindo: a) cultura de um microorganismo sob condições que promovem respiração celular, onde o microorganismo tem reduzida atividade enzimãtica; a atividade enzimática pode ser piruvaro descarboxilase, álcool desidrogenase, aldeído desidrogenase, ou atividade acetil-CoA, com o microorganismo exibindo uma taxa de crescimento na ausência de etanol e acetato que é pelo menos cerca de 30% daquela observada para um correspondente microorganismo não tendo tal atividade enzimática reduzida, e b) alterando as condições de cultura para reduzir respiração celular, pelo que promovendo produção do produto orgânico. À menos que de outro modo estabelecido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por aquele versado na técnica a qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais apropriados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, controlará. Em adição, os materiais, métodos e exemplos são somente ilustrativos e não pretendidos serem limitantes.

Outras características e vantagens da invenção serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada, e a partir das reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um diagrama mostrando o plasmídeo pHES. A Figura 2 é um diagrama mostrando o plasmídeo pSEH. A Figura 3 é um diagrama mostrando a geração de plasmídeos pCRII contendo Lh-ldh ou Pa-ldh. A Figura 4 é um diagrama mostrando os plasmídeos ldh/pCRII. A Figura 5 é um diagrama mostrando a geração de plasmídeos pHES contendo Lh-ldh ou Pa-ldh. A Figura 6a é um diagrama mostrando a geração de fragmento knockout piruvato descarboxilase (PDC). A Figura 6B ê um diagrama mostrando o fragmento de 5,5 kbp circundando PDC1 de 1,7 kbp de K. marxianus. A Figura 6c é um diagrama mostrando a supressão de 400 bp da região homóloga PDC de 5,5 kbp e a inserção de um gene para resistência a canamicina. A Fig. 6d é um diagrama mostrando a região de 4 kb contendo o gene de resistência a canamicina e 2,3 kbp circundante do PDC1. A Figura 6e é um diagrama mostrando o PDC1 K. thermotolerans de 7,5 kbp e região circundante. A Figura 6f é um diagrama mostrando a supressão de 750 bp do gene PDC1 de 1,7 kbp e a inserção do gene de resistência a canamicina. A Figura 7 é um gráfico plotando crescimento (densidade ótica; OD) versus tempo (horas) para Kluyveromyces marxianus cultivado sob condições de baixo pH (pH 2,5) e alta temperatura (40°C). A Figura 8 é um gráfico plotando crescimento (OD) versus tempo (horas) para K. marxianus cultivado com glicose, xilose ou arabimnose a 30°C. A Figura 9 é um gráfico plotando crescimento (OD) versus tempo (horas) para K. marxianus cultivado com um hidrolisato de fibra de milho a 30°C. A Figura 10 é um gráfico plotando crescimento (OD) versus tempo (horas) para K. marxianus cultivado a 30 C e o pH indicado. A Figura 11 é um gráfico plotando crescimento (OD) versus tempo (horas) para K. marxianus cultivado a 30°C e o pH indicado na presença de 40 gramas de ácido lático. A Figura 12 mostra três gráficos plotando (A) produção de biomassa; (B) consumo de glicose; e (C) produção de etanol de S. uvarum e K. marxianus quando cultivados sobre meio mineral com glicose 2% sob condiçoes aeróbicas. A Figura 13 mostra três gráficos plotando (A) produção de biomassa; (B) consumo de glicose; e (C) produção de etanol de S. uvaram e K.marxianus quando cultivados sobre meio mineral com glicose 2% sob condiçoes anaeróbicas. A Figura 14 é um mapa de plasmídeo de vetor promotor PDC1.

DFfiCRICÃO DETALHADA A invenção provê métodos e materiais relacionados à produção de produtos orgânicos. Especificamente, a invenção provê células de leveduras, métodos para cultura de células de levedura, métodos para fabricação de células de levedura, construções de ácido nucléico, e métodos e materiais para produção de vários produtos orgânicos.

As células de levedura aqui providas podem ser usadas para produção de produtos orgânicos. Tais produtos orgânicos podem ser usados em uma ampla faixa de aplicações.

Por exemplo, produtos orgânicos produzidos pelas células de levedura aqui descritas podem ser usados como preservativos ou aditivos em alimento, produtos farmacêuticos, ou cosméticos, e podem ser usados para fabricar plástico assim como outros produtos.

Para os propósitos desta invenção, um produto orgânico é qualquer composto contendo um átomo de carbono.

Por exemplo, carboxilatos (por exemplo, lactato, acrilato, citrato, isocitrato, alfa - cetoglutarato, succinato, fumarato, raalato, oxalo acetato), carboidratos (por exemplo, D-xilose), alditóis (por exemplo, xilitol, arabitol, ribitol), aminoácidos (por exemplo, glicina, triptofano, glutamato), lipídeos, ésteres, vitaminas (por exemplo, L- ascorbato), polióis (por exemplo, glicerol, 1,3-propanodiol, eritritol), aldeídos, alquenos, alquinos, e cetonas são produtos orgânicos. Assim, um produto orgânico pode conter um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais átomos de carbono. Em adição, produtos orgânicos podem ter um peso molecular que é menos que cerca de 1.000 (por exemplo, menos que cerca de 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, ou 100) . Por exemplo, D-xilose (C5H10O5) é um produto orgânico que tem um peso molecular de 150. Ainda, produtos orgânicos podem ser produtos de fermentação. O termo "produto de fermentação" como usado aqui refere-se a qualquer composto orgânico que é produzido por um método de fermentação. Em termos gerais, um método de fermentação envolve a conversão enzimática anaeróbica de compostos orgânicos tais como carboidratos a compostos tais como álcool etílico, resultando em energia na forma de adenosina trifosfato (ATP). Assim, fermentação difere de respiração celular em que produtos orgânicos antes que oxigênio molecular são usados como receptores de elétrons. Exemplos de produtos de fermentação incluem, sem limitação, acetato, etanol, butirato, e lactato.

Produtos orgânicos também podem ser produtos derivados - piruvato. 0 termo "produto derivado - piruvato" como aqui usado refere-se a qualquer composto que é sintetizado a partir de piruvato dentro de não mais que quinze etapas enzimáticas. Uma etapa enzimãtica é qualquer reação química ou série de reações catalisadas por um polipeptídeo tendo atividade enzimática. O termo "polipeptídeo tendo atividade enzimãtica" como aqui usado refere-se a qualquer polipeptídeo que catalisa uma reação química de outras substâncias sem ele próprio sendo destruído ou alterado com término da reação ou reações.

Tipicamente, um polipeptídeo enzimático catalisa a formação de um ou mais produtos a partir de um ou mais substratos.

Tais polipeptídeos podem ter qualquer tipo de atividade enzimãtica incluindo, sem limitação, a atividade enzimãtica associada com uma enzima tal como aconitase, isocitrato desidrogenase, ceto glutarato desidrogenase, succinato tiocinase, succinato desidrogenase, fumarase, malato desidrogenase, citrato sintase, 2,5-dioxo valerato desidrogenase, 5-desidro-4-desoxi-D-glucarato desidrogenase, glucarato desidratase, aldeído desidrogenase, glucurono lactono redutase, L-gulono lactona oxidase, 2-desidro-3- desoxi-D-pentanoato aldolase, xilonato desidratase, xilono lactonase, D-xilose desidrogenase, lactato desidrogenase, CoA-transferase, lactil-CoA desidratase, ou acrilil-CoA hidratase. É importante notar que um polipeptídeo tendo uma particular atividade enzimática pode ser um polipeptídeo que está tanto ocorrendo naturalmente como ocorrendo não- naturalmente. Um polipeptídeo ocorrendo naturalmente é qualquer polipeptideotendo uma seqüência de aminoãcidos como encontrada em natureza, incluindo polipeptideos polimórficos e tipo selvagem. Tais polipeptideos ocorrendo naturalmente pode ser obtidos a partir de quaisquer espécies incluindo, sem limitação, espécies mamíferas, fungos e bacterial. Um polipeptídeo ocorrendo não-naturalmente é qualquer polipeptideo tendo uma seqüência de aminoãcidos que não é encontrada na natureza. Assim, um polipeptídeo ocorrendo não-naturalmente pode ser uma versão mutante de um polipeptídeo ocorrendo naturalmente, ou um polipeptídeo engenheirado. Por exemplo, polipeptídeo ocorrendo não- naturalmente tendo atividade citrato sintase pode ser uma versão mutante de um polipeptídeo ocorrendo naturalmente tendo atividade citrato sintase que retém pelo menos alguma atividade citrato sintase. Um polipeptídeo pode sofrer mutação através de, por exemplo, adições, supressões e/ou substituições de seqüências.

Um produto orgânico não é um produto derivado - piruvato se este produto é sintetizado de piruvato requerendo mais que quinze etapas enzimãticas. Exemplos de produtos derivados - piruvato incluem, sem limitação, citrato, alfa-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato, oxalo acetato, 2-desidro-3-desoxi-D-xilonato, D-xilonato, D- xilono lactona, D-xilose, acrilato, acetato, etanol, butirato, e lactato.

Para os propósitos desta invenção, produtos carboxilato que podem estar em uma forma "ácido livre" ou "sal", serão referidos usando-se a nomenclatura de forma sal. Por exemplo, ácido lático serão referidos como lactato.

Assim, neste caso, será apreciado que o termo "lactato" inclui ácido lático assim como lactato. 0 termo "ácido nucléico" como usado aqui inclui ambos ARN e ADN, incluindo ADNc, ADN genômico, e ADN sintético (isto é, sintetizado quimicamente). 0 ácido nucleíco pode ser de fita dupla ou fita simples. Onde de fita simples, o ácido nucléico pode ser a fita sentido ou a fita anti-sentido. Em adição, ácido nucléico pode ser circular ou linear. 0 termo "exógeno" como aqui usado com referência a uma molécula de ácido nuicléico e uma célula particular refere-se a qualquer molécula de ácido nucléico que não se origina daquela particular célula como encontrada em natureza. Assim, todas as moléculas de ácido nucléico ocorrendo não-naturalmente são consideradas serem exógenas para uma célula uma vez introduzidas na célula. É importante notar que moléculas de ácido nucléico ocorrendo não- naturalmente podem conter seqüências de ácido nucléico ou fragmentos de seqüências de ácidos nucléicos que são encontradas na natureza contanto que a molécula de ácido nucléico como um todo não exista em natureza. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico contendo uma seqüência de ADN genômico dentro de um vetor de expressão é considerada ser uma molécula de ácido nucléico ocorrendo não-naturalmente, e assim é considerada ser exógena para uma célula uma vez introduzida na célula, uma vez que esta molécula de ácido nucléico como um todo (ADN genômico plus ADN vetor) não existe em natureza. Assim, qualquer vetor, plasmídeo replicando autonomamente, ou vírus (por exemplo, retrovírus, adenovírus, ou vírus de herpes) que como um todo não existe em natureza é considerado ser uma molécula de ácido nucléico ocorrendo não-naturalmente. Segue-se que fragmentos de ADN genômicos produzidos por PCR ou tratamento com endonuclease de restrição assim como ADNc's são considerados serem moléculas de ácido nucléico ocorrendo não-naturalmente uma vez que elas existem como moléculas separadas não encontradas na natureza. Também segue-se que qualquer molécula de ácido nucléico contendo uma seqüência promotora e seqüência codificando polipeptídeo (por exemplo, ADNc ou ADN genômico) em um arranjo não encontrada na natureza é considerada ser uma molécula de ácido nucléico ocorrendo não-naturalmente. 0 termo "endógeno" refere-se a material genômico que não é exógeno. Genericamente, material genômico endógeno desenvolve-se dentro de um organismo, tecido, ou célula, e não é inserido ou modificado por tecnologia recombinante.

Material genômico endógeno inclui em seu escopo variações ocorrendo naturalmente. Ê também importante notar que uma molécula de ácido nucléico que está ocorrendo naturalmente pode ser exógena para uma célula particular. Por exemplo, um cromossoma inteiro isolado de uma célula de uma pessoa X pode ser considerado uma molécula de ácido nucléico exógena com relação a uma célula de pessoa Y uma vez aquele cromossoma seja introduzido na célula de Y.

Como aqui usada, a frase "geneticamente modificado" refere-se a um organismo cujo genoma foi modificado, por exemplo, através de adição, substituição ou supressão de material genético. Métodos para adição ou supressão de material genético são conhecidos e incluem, mas não são limitados a, mutagênese randômica, mutações de ponto, incluindo inserções, supressões e substituições, tecnologia knock-out, e transformação de um organismo com uma seqüência de ácidos nucléicos usando-se tecnologia recombinante, incluindo ambos transformantes estáveis e transientes. As células de levedura também podem catabolizar amido, tanto naturalmente como devido a uma modificação genética, e podem mesmo ser geneticamente modificadas para catabolizarem celulósicos através de adição de, por exemplo, celuloses â base de fungos. 1. Células de Levedura tendo um Fenótipo Negativo - Crabtree A invenção provê uma variedade de células de levedura manipuladas geneticamente que têm um fenótipo negativo - crabtree. Tais células de levedura recombinantes podem ser usadas para produção de produtos orgânicos. Por exemplo, a invenção provê uma célula de levedura que tem um fenótipo negativo - crabtree, e contem uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um polipeptídeo tendo atividade enzimãtica que conduz à formação de um produto orgânico. Tais células de levedura estão dentro do escopo da invenção contanto que produzam o produto orgânico. É notado que o produto orgânico produzido pode ser secretado da célula de levedura, eliminando a necessidade de romper-se a membrana de célula para recuperar o produto orgânico.

Tipicamente, as células de levedura da invenção produzem o produto orgânico com o rendimento sendo pelo menos cerca de 40 gramas (por exemplo, pelo menos cerca de 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, ou 95 gramas) de produto orgânico para cada 100 gramas de glicose consumidos quando cultivadas sob condições ótimas para produção de produto. Quando determinando-se o rendimento de produção de produto orgânico para uma particular célula de levedura, qualquer método pode ser usado. Ver, por exemplo, Kiers et al., Yeast, 14 (5) :459- 469 (1998). É também notado que a atividade enzimática do polipeptídeo codificado pode conduzir â formação do produto orgânico em uma maneira consumidora - NADH. Em outras palavras, a produção do composto orgânico requerer NADH como uma fonte de energia. 0 termo "NAD" refere-se aos co-fatores que atuam como carreadores de elétrons e hidrogênio em particular reações de oxidação - redução, enquanto o termo "NADH" refere-se â forma reduzida de NAD. Exemplos de produtos orgânicos cuja síntese requer NADH incluem, sem limitação, lactato, etanol, acetato, e acrilato.

Tipicamente, as células de levedura dentro do escopo da invenção catabolizam um carbono hexose tal como glicose.

Entretanto, tais células de levedura também podem catabolizar um carbono pentose (por exemplo, ribose, arabinose, xilose e lixose). Em outras palavras, uma célula de levedura dentro do escopo da invenção tanto pode utilizar naturalmente um carbono pentose, como pode ser engenheirada para utilizar um carbono pentose. Por exemplo, uma célula de levedura pode receber uma molécula de ácido nucléico exógeno que codifica xilose redutase, xilitol desidrogenase, e/ou xilulo cinase de modo que xilose pode ser catabolizada. As células de levedura também podem catabolizar amido, tanto naturalmente como devido a uma modificação genética, e podem mesmo ser modificadas para catabolizarem celulósicos através de adição de, por exemplo, celuloses à base de fungos.

Uma célula de levedura tendo um fenótipo negativo - crabtree é qualquer célula de levedura que não exibe o efeito crabtree. 0 termo "negativo - crabtree" refere-se a ambos organismos, ocorrendo naturalmente ou geneticamente modificados. Em resumo, o efeito crabtree é definido como a inibição de consumo de oxigênio por um microorganismo quando cultivado sob condições aeróbicas devido â presença de uma alta concentração de glicose (por exemplo, 50 gramas de glicose/L). Em outras palavras, uma célula de levedura tendo um fenótipo positivo - crabtree continua a fermentar independente de disponibilidade de oxigênio devido à presença de glicose, enquanto uma célula de levedura tendo um fenótipo negativo - crabtree não exibe inibição mediada por glicose de consumo de oxigênio. Exemplos de células de levedura tendo tipicamente um fenótipo negativo - crabtree incluem, sem limitação, células de levedura dos seguintes gêneros: Kluyveromyces, Pichia, Hensenula, Candida, Trichosporon, e Yamadazyma.

Como aqui descrito, a invenção provê muitos tipos diferentes de células de leveduras recombinantes capazes de produzirem uma ampla variedade de diferentes produtos orgânicos. Por exemplo, uma célula de levedura pode conter uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um polipeptídeo tendo atividade lactato desidrogenase de modo que lactato é produzido. Exemplos de um tal polipeptídeo inclui, sem limitação, lactato desidrogenase bovina, lacto desidrogenase bacterial e lactato desidrogenase de fungos {por exemplo, lactato desidrogenase de fungo K. lactis ou K. thermotolerans ) . Novamente, polipeptídeos tendo atividade enzimática tal como uma atividade lactato desidrogenase podem ser de ocorrência natural ou ocorrendo não- naturalmente. É importante notar que as células de levedura aqui descritas podem conter uma cópia simples, ou cópias múltiplas (por exemplo, cerca de 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 ou 150 cópias), de uma particular molécula de ácido nucléico exógena. Por exemplo, uma célula de levedura pode conter cerca de 50 cópias de molécula de ácidonucléico exógena X. É também importante notar que as células de levedura aqui descritas podem conter mais de uma particular molécula de ácido nucléico endógena. Por exemplo, uma célula de levedura pode conter cerca de 50 cópias de molécula de ácido nucléico exógena X assim como cerca de 75 cópias de molécula de ácido nucléico exógena Y. Nestes casos, cada diferente molécula de ácido nucléico pode codificar um diferente polipeptídeo tendo sua própria atividade enzimática única. Por exemplo, uma célula de levedura pode conter quatro diferentes moléculas de ácido nucléico exógenas de modo que acrilato seja produzido. Neste exemplo, uma tal célula de levedura pode conter uma primeira molécula de ácido nucléico exógena que codifica um polipeptideo tendo atividade lactato desidrogenase, uma segunda que codifica um polipeptídeo tendo atividade CoA-transferase, uma terceira que codifica um polipeptídeo tendo atividade lactil-CoA desidratase, e uma quarta que codifica um polipeptídeo tendo atividade acrilil-CoA hidratase. Em um outro exemplo, uma célula de levedura pode conter quatro diferentes moléculas de ácido nucléico exógenas de modo que D-xilose seja produzida.

Especificamente, uma tal célula de levedura pode conter uma primeira molécula de ácido nucléico exógena que codifica um polipeptídeo tendo atividade 2-desidro-3-desoxi-D-pentanoato aldolase, uma segunda que codifica um polipeptídeo tendo atividade xilonato desidratase, uma terceira que codifica um polipeptídeo tendo atividade xilono lactonase, e uma quarta que codifica um polipeptídeo tendo atividade D-xilose desidrogenase. Ainda em um outro exemplo, uma célula de levedura pode conter seis diferentes moléculas de ácido nucléico exógenas de modo que a vitamina, L-ascorbato, seja produzida. Especificamente, uma tal célula de levedura pode conter uma primeira molécula de acido nucléico exógena que codifica um polipeptídeo tendo atividade 2,5-dioxovalerato desidrogenase, uma segunda que codifica um polipeptídeo tendo atividade 5-desidro-4-desoxi-D-glucarato desidroge- nase, uma terceira que codifica um polipeptídeo tendo atividade glucarato desidrogenase, uma quarta que codifica um polipeptídeo tendo atividade aldeido desidrogenase, uma quinta que codifica um polipeptídeo tendo atividade glucurono lactona redutase, e uma sexta que codifica um polipeptídeo tendo atividade L-gulono lactona oxidase. É importante notar que polipeptídeos enzimãticos podem ser usados de modo que o desejado produto orgânico seja opticamente puro (por exemplo, cerca de 90, 95, 99% puro). Por exemplo, um polipeptídeo tendo uma atividade (L)- lactato desidrogenase pode ser usado para produzir (L) - lactato. Células de levedura dentro do escopo da invenção também podem ter reduzida atividade enzimãtica tal como reduzida atividade piruvato descarboxilase e/ou álcool desidrogenase. 0 termo "reduzida" como aqui usado com relação a uma célula e uma particular atividade enzimãtica refere-se a um nível inferior de atividade enzimãtica que aquele medido em uma célula de levedura comparável da mesma espécie. Assim, uma célula de levedura carecendo de atividade piruvato descarboxilase é considerada ter reduzida atividade piruvato descarboxilase uma vez que maior parte, se não todas, células de levedura comparáveis têm pelo menos alguma atividade piruvato descarboxilase. Tais atividades enzimãticas reduzidas podem ser o resultado de menor concentração de enzima, menor atividade específica de uma enzima, ou suas combinações. Muitos métodos diferentes podem ser usados para obtenção de uma célula de levedura tendo reduzida atividade enzimãtica. Por exemplo, uma célula de levedura pode ser engenheirada para ter um locus codificando enzima interrompido usando-se tecnologia comum de mutagênese ou de knock-out. Ver, por exemplo, Methods in Yeast Genetics (1997 edition), Adams, Gottschling, Kaiser, and Sterns, Cold Spring Harbor Press (1998).

Alternativamente, tecnologia anti - sentido pode ser usada para reduzir-se atividade enzimãtica. Por exemplo, uma célula de levedura pode ser engenheirada para conter um ADNc que codifica uma molécula anti - sentido que evita a formação de uma enzima. 0 termo "molécula anti - sentido" como aqui usado encampa qualquer molécula de ácido nucléico que contem sequências que correspondem à fita codificante de um polipeptídeo endógeno. Uma molécula anti - sentido também pode ter seqüências flanqueantes (por exemplo, seqüencias regulatórias). Assim, moléculas anti - sentido podem ser ribozimas ou oligonucleotídeos anti - sentido. Uma ribozima pode ter qualquer estrutura geral incluindo, sem limitação, estruturas de grampo, peixe - martelo, ou estruturas axhead, contanto que a molécula possa clivar ARN. Células de levedura tendo uma reduzida atividade enzimática podem ser identificadas usando-se qualquer método. Por exemplo, uma célula de levedura tendo reduzida atividade piruvato descarboxilase pode ser facilmente identificada usando-se métodos comuns. Ver, por exemplo, Ulbrich, Methods in Enzymology 18:109-115(1970). 2. Células de Levedura tendo um Fenótipo___Positivo — Crabtree ou Negativo - Crabtree A invenção também provê uma variedade de células de levedura geneticamente manipuladas que não precisam ter um fenótipo negativo - crabtree, isto é, tais células tanto podem ser positivas - crabtree como negativas - crabtree.

Tais células de levedura recombinantes podem ser usadas para produção de produtos orgânicos. Por exemplo, a invenção provê uma célula de levedura contendo uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica um polipeptídeo que promove catabolismo de um carbono pentose {por exemplo, ribose, arabmose, xilose e lixose) pela célula. Especificamente, uma célula de levedura pode ter uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica xilose redutase, xilitol desidrogenase, e/ou xilulo cinase de modo que xilose pode ser catabolizada em uma maneira mais eficiente. Em adição, as células de levedura capazes de catabolizar um carbono pentose também podem ser capazes de catabolização de um carbono hexose (por exemplo, alose, altrose, glicose, manose, gulose, iodose, galactose, e talose) tanto sequencialmente como simultaneamente. Por exemplo, uma célula de levedura pode ser engenheirada de modo que xilose e glicose sejam catabolizadas simultaneamente. É notado que células de levedura tendo uma crescente habilidade para catabolizar um carbono pentose podem ser usadas para engenheirar células de levedura que podem produzir produtos orgânicos a partir de fontes de carbono pentose. Esta característica é particularmente vantajosa uma vez que fontes de carbono pentose tais como xilose são genericamente mais baratas que fontes de carbono hexose tais como glicose.

Outras fontes de carbono que podem ser catabolizadas incluem, sem limitação, melibiose, sucrose, frutose, rafinose, estaquiose, amido (por exemplo, amido de milho e amido de trigo), e hidrolisato (por exemplo, hidrolisato de fibra de milho e outros hidrolisatos celulósicos).

Em adição, a invenção provê uma célula de levedura contendo molécula de ácido nucléico exógena que codifica um polipeptídeo que promove acumulação de acetil-CoA no citoplasma da célula. Por exemplo, uma célula de levedura pode ter uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um polipeptídeo tendo atividade citrato liase.

Alternativamente, uma célula de levedura pode ter uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um polipeptídeo de membrana mitocondrial que promove permeabilidade de acetil-CoA através de membrana mitocondrial. É notado que muitas células de levedura carecendo de habilidade para produzir etanol não podem crescer na ausência de etanol e acetato. Tipicamente, uma célula de levedura carecerá de habilidade de produzir etanol quando tanto atividade piruvato descarboxilase como álcool desidrogenase está carecendo em alguma maneira. Por exemplo, levedura positiva - crabtree (por exemplo, Saccharomyces) carecendo de atividade piruvato descarboxilase crescem pobremente na ausência de etanol e acetato. Assim, manipulação de tal levedura positiva - crabtree em uma maneira que reduz produção de etanol de modo a redirecionar a utilização de piruvato para outros produtos orgânicos (por exemplo, lactato e acrilato) resulta em pobres características de crescimento quando etanol e acetato estão ausentes, particularmente uma vez que levedura positiva - crabtree limita respiração celular quando na presença de glucose. Como aqui descrito, células de levedura que podem promover acumulação de acetil-CoA citoplãsmica de alguma maneira outra que não aquela que baseia-se em concentração de acetato citoplasmico e atividade de acetil-CoA sintase podem crescer na ausência de etanol e acetato quando incapazes de produzirem etanol. É notado que células de levedura tendo a habilidade de crescer na ausência de etanol e acetato enquanto carecendo da habilidade de produzir etanol podem redirecionar a utilização de piruvato para produzir produtos orgânicos outros que não etanol.

Qualquer tipo de levedura pode conter uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um polipeptídeo que promove acumulação de acetil-CoA no citoplasma da célula.

Por exemplo, uma célula de levedura tendo um fenótipo negativo - crabtree ou positivo - crabtree pode conter uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um polipeptídeo que promove acumulação de acetil-CoA no citoplasma da célula. Tipicamente, tais células de levedura podem ser identificadas por: (1) manipulação de célula que contem a molécula de ácido nucléico exógena de modo que ela careça de atividade piruvato descarboxilase ou álcool desidrogenase, (2) determinação de características de crescimento da célula enquanto cultivando a célula na presença de quantidades titulantes de um inibidor respiratório (por exemplo, antiraicina A, cianeto ou azida), e (3) comparando aquelas características de crescimento àquelas observadas para uma célula de levedura comparável que não contem a molécula de ácido nucléico exógena, ainda que também foi manipulada para carecer de atividade de piruvato descarboxilase ou álcool desidrogenase. Células de levedura determinadas terem características de crescimento mais favoráveis devido à presença da molécula de ácido nucléico exógeno através de uma tal comparação são consideradas conterem uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um polipeptídeo que promove acumulação de acetil-CoA no citoplasma da célula. Células de levedura contendo uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um polipeptídeo que promove acumulação de acetil-CoA no citoplasma da célula também têm reduzida atividade enzimática, tal como reduzida atividade piruvato descarboxilase e/ou álcool desidrogenase. Por exemplo, uma célula de levedura pode carecer de habilidade para produzir etanol. Tipicamente, tais células de levedura têm uma taxa de crescimento sob condições de cultura carecendo de etanol e acetato que é maior (por exemplo, cerca de 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100, 150, 200% ou mais) que a taxa de crescimento observada para células de levedura comparáveis (isto é, células de levedura com falta de habilidade para produzir etanol) que não contêm o ácido nucléico exógeno, ainda tenham sido cultivadas sob condições similares (isto é, condições de cultura carecendo de etanol e acetato) . A invenção também provê uma célula de levedura tendo reduzida atividade de um polipeptídeo. Tais células de levedura podem ter um fenótipo positivo - crabtree ou negativo - crabtree. Por exemplo, uma célula de levedura dentro do escopo da invenção pode ter reduzida atividade de um polipeptídeo de membrana de plasma (por exemplo, um transportador de membrana de plasma), um polipeptídeo citoplãsmico (por exemplo, piruvato descarxilase), e/ou um polipeptídeo mitocondrial (por exemplo, piruvato desidrogenase). 0 termo "transportador de membrana de plasma" refere-se a polipeptídeos que facilitam o movimento de produtos orgânicos através da membrana de plasma.

Exemplos de um tal polipeptídeo incluem, sem limitação, transportadores ácido carboxílico tais como JEN1 em S. cerevisiae (GenBank accession number U24155). O termo "polipeptídeo mitocondrial" refere-se a qualquer polipeptídeo que funciona dentro da mitocôndria incluindo, sem limitação, piruvato desidrogenase, polipeptídeos que participam no catabolismo de lactato ou acetil-CoA (por exemplo, polipeptídeos b2 citocroma), e enzimas do ciclo de Krebs. Enzimas do ciclo de Krebs incluem aconitase, isocitrato desidrogenase, cetoglutarato desidrogenase, succinato tiocinase, succinato desidrogenase, fumarase, malato desidrogenase, e citrato sintase. Como aqui descrito, uma célula de levedura tendo uma reduzida atividade de enzima inclui uma célula de levedura que carece completamente de uma atividade enzimãtica particular. Ê importante notar que o termo "reduzida" como aqui usado com relação a uma célula de levedura e atividade de polipeptídeo refere-se a um menor nível de atividade que aquele medido em uma célula de levedura comparável da mesma espécie sob condições similares. Assim, uma célula de levedura carecendo de uma particular atividade de transporte é considerada ter uma reduzida atividade de transporte se uma célula comparável tem pelo menos alguma atividade de transporte.

Tais reduzidas atividades de polipeptídeo pode ser o resultado de uma menor concentração de polipeptídeo, menor atividade específica do polipeptídeo, ou suas combinações.

Qualquer um de vários métodos pode ser usado para obter-se uma célula de levedura tendo reduzida atividade de polipeptídeo. Por exemplo, o locus tendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo mitocondrial pode ser tornado inativa através de, por exemplo, mutagênese comum ou tecnologia knock-out. É notado que células de levedura tendo reduzida atividade de uma enzima mitocondrial pode acumular produtos de ciclo de Krebs (por exemplo, citrato, isocitrato, alfa- cetoglutarato, succinil-CoA, succinato, fumarato, malato, e oxalo acetato). Por exemplo, células de levedura tendo reduzida atividade fumarato podem acumular fumarato. Em adição, a célula de levedura pode conter uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um polipeptídeo tendo atividade enzimática que conduz à formação de um produto orgânico de modo que a célula produza o produto orgânico. É importante notar que alguns produtos do ciclo de Krebs não podem permear a membrana mitocondrial (por exemplo, alfa-cetoglutarato e succinil-CoA). Assim, redução de atividade de particulares enzimas de ciclo de Krebs resultará na acumulação de certos produtos do ciclo de Krebs dentro dolúmen da mitocôndria. Nestes casos, células de levedura tendo uma reduzida atividade de uma enzima de ciclo de Krebs podem ser engenheiradas para conterem uma ou mais diferentes moléculas de ácido nucléico exógeno, cada uma das quais codifica um polipeptídeo tendo uma diferente atividade enzimãtica, de modo que o desejado produto de ciclo de Krebs acumule-se dentro do citoplasma. Por exemplo, redução de atividade de cetoglutarato desidrogenase conduzirá a uma acumulação de alfa-cetoglutarato, que por sua vez conduzirá a uma acumulação de isocitrato. Alfa-cetoglutarato não pode permear a membrana mitocôndrial, enquanto isocitrato pode permear a membrana mitocôndrial. Assim, isocitrato pode acumular-se dentro do citoplasma da célula. Entretanto, células de levedura que também contêm uma molécula de ácido nucléico exógeno que codifica um polipeptídeo tendo atividade isocitrato desidrogenase, e expressa este polipeptídeo funcional dentro do citoplasma podem produzir alfa-cetoglutarato citoplásmico. Assim, redução de atividade de particulares enzimas do ciclo de Krebs enquanto provendo moléculas de ácido nucléico exógeno que codificam as mesmas (ou diferentes) enzimas de ciclo de Krebs de modo que elas sejam funcionais dentro do citoplasma pode conduzir à produção de vários produtos de ciclo de Krebs (ou produtos derivados de produtos do ciclo de Krebs) dentro do citoplasma.

Ainda, a invenção provê uma célula de levedura tendo reduzida atividade de uma enzima que desvia a utilização de uma fonte de carbono da produção de tanto biomassa como o produto orgânico desejado. Por exemplo, enzimas dentro de caminhos glicerol ou acetoína podem ser interrompidas de modo que a fonte de carbono dentro do meio de cultura seja utilizada predominantemente para a produção de biomassa ou o desejado produto orânico. Exemplos de enzimas de caminho glicerol incluem, sem limitação, diidroxi acetona fosfato redutase. Exemplos de enzimas de caminho acetoína incluem, sem limitação, alfa-aceto lactato sintase e alfa-aceto lactato descarboxilase. Novamente, qualquer método pode ser usado para reduzir a atividade de uma enzima.

Além disso, qualquer uma das células de levedura providas aqui pode conter uma molécula de ácido nucléico exógeno que funciona como um plasmídeo assassino. 0 termo "plasmídeo assassino" como aqui usado refere-se a uma molécula de ácido nucléico que provê uma espécie de levedura com a habilidade de matar outras espécies de levedura. Por exemplo, do gênero Kluyveromyces contendo um plasmídeo assassino podem evitar o crescimento de levedura do gênero Saccharomyces. Assim, células de levedura tendo um plasmídeo assassino podem ser usadas para evitar problemas de contaminação que surgem durante métodos de produção de larga escala. Em adição, qualquer tipo de plasmídeo assassino pode ser dado a uma célula de levedura. Por exemplo, um plasmídeo assassino isolado de K. lactis pode ser dado a uma célula de levedura K.marxianus. Células de levedura contendo um plasmídeo assassino podem ser facilmente identificadas usando-se métodos comuns. Ver, por exemplo. Gunge et al., J.Bacteriol. 145 (1):382-390 (1981); Gunge and Kitada, Eur.J.Epidemiol. , 4:409-414 (1988) ; e Wesolowski-Louvei et al., Nonconventional yeasts in Biotechnology: Kluyveromyces lactis, ed. Klaus Wolf, Springer verlag, Berlin, p. 138-201 (1996).

Da mesma maneira, qualquer uma das células de levedura aqui providas pode conter uma molécula de ácido nucléico exógeno que codifica um polipeptídeo tendo uma atividade ATPase modificada de modo que a célula e levedura torna-se mais tolerante a ambientes de baixo pH. Por exemplo, uma célula de levedura pode receber uma ATPase que efetivamente mantém uma baixa concentração de próton citoplasmico quando a concentração de próton extracelular é alta. Tais polipeptídeos podem ser engenheirados como descrito por Morsomme et al. (EMBO J. 15:5513-5526 (1996)). E importante notar que qualquer uma das células de levedura recombinantes aqui descritas pode conter qualquer combinação das manipulações genéticas descritas. Por exemplo, uma célula de levedura tendo um fenótipo positivo — crabtree pode conter uma molécula de ácido nucléico exógeno que codifica um polipeptídeo tendo atividade citrato liase assim como uma molécula de ácidonucléico exógeno que codifica um polipeptídeo tendo atividade enzimática que conduz a formaçao de um produto orgânico. 3. Organismos Apropriados Uma variedade de organismo são apropriados para uso de acordo com a invenção. Em adição a microorganismos de levedura positivos crabtree e negativos crabtree tais como Saccharomyces sp., incluindo S. cerevisiae e S. uvarum, Kluyveromyces, incluindo K. thermotolerans, K. lactis, e K. raarxianus, Pichia, Hansenula, incluindo H. polymorpha, Candidia, Trichosporon, Yamadazyma, incluindo Y. stipitis, ou Torulaspora pretoriensis, organismos de um amplo arranjo de espécies bacteriais também podem servir como hospedeiros para produção de ácido lãtico. Por exemplo, um organismo tal como Rhizopus oryzae, um produtor natural de ácido lático, pode ser geneticamente modificado para tolerância a ácido, aperfeiçoamento de rendimento, e ãcidolãtico opticamente puro. Aspergillus spp. também são conhecidos pela produção de uma variedade de ácidos orgânicos, tais como ácido cítrico, e toleram baixo pH. Métodos para modificação genética de Aspergillus spp. para produção de ácido lático são disponíveis. Além disso, fungos tais como Rhizopus and Aspergillus spp. produzem enzimas que permitem que os mesmos degradem amido e outros polímeros carboidratos para monômeros carboidratos para uso como uma fonte de carbono.

Procariotes tais como Escherichia coli, Zymomonas mobilis, e Bacillus spp. têm sido ou podem ser geneticamente modificados para produção de ácido lático. Microorganismos que foram identificados como Bacillus coagulans também são produtores naturais de ácido lãtico que podem ser ainda geneticamente modificados para aperfeiçoar produção de ácido lático de baixo pH.

Adicionalmente, organismos extremeófilos da família Archea podem tolerar pH extremamente baixo e altas temperaturas. Modificação genética de espécies selecionadas desta família podem prover uma linhagem produzindo ácido lãtico. 4. Aspectos Genéticos Uma molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo tendo atividade enzimática pode ser identificada e obtida usando-se qualquer método. Por exemplo, técnicas de seqüencialmente de ácido nucléico padrões e programas de software que traduzem sequências de ácidos nucléicos em seqüências de aminoãcidos baseado no código genético podem ser usados para determinar se ou não um particular ácido nucléico tem qualquer homogia de seqüência com polipeptídeos enzimáticos conhecidos. Software de alinhamento de seqüência tal como MEGALIGN (DNASTAR, Madison, WI, 1997) pode ser usado para comparar várias seqüências. Em adição, moléculas de ácido nucléico codificando polipeptídeos enzimáticos conhecidos podem sofrer mutação usando-se técnicas comuns de clonagem molecular {por exemplo, mutagênese direcionada - sítio).

Mutações possíveis incluem, sem limitação, supressões, inserções, e substituições de bases, assim como combinações de supressões, inserções, e substituições de bases. Ainda, bases de dados de ácidos nucléicos e aminoácidos (por exemplo, GenBank) podem ser usadas para identificar uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo atividade enzimática. Resumidamente, qualquer seqüência de aminoãcidos tendo alguma homologia a um polipeptídeo tendo atividade enzimática, ou qualquer seqüência de ácidos nucléicos tendo alguma homologia a uma seqüência codificando um polipeptídeo tendo atividade enzimatica pode ser usada como uma pergunta para busca GenBank. Os polipeptídeos identificados então podem ser analisados para determinar se ou não eles exibem atividade enzimatica.

Moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo tendo atividade enzimatica podem ser identificadas e obtidas usando-se clonagem molecular comum ou procedimentos e técnicas de síntese de ácido nucléico química, incluindo PCR. PCR refere-se a um procedimento ou técnica na qual ácido nucléico alvo é amplificado em uma maneira similar àquela descrita na patente US 4 683 195 e subsequentes modificações do procedimento ali descrito.

Genericamente, informação de seqüência a partir das extremidades da região de interesse ou além são usadas para desenhar primers oligonucleotídeos que são idênticos ou similares em seqüencia a fitas opostas de um molde potencial a ser amplificado. Usando-se PCR, uma seqüência de ácidos nucléicos pode ser amplificada a partir de ARN ou ADN. Por exemplo, uma seqüência de ácidos nucléicos pode ser isolada por amplificação de PCR a partir de ARN celular total, ADN genômico total, e ADNc assim como a partir de seqüências de bacteriófagos, seqüencias de plasmídeo, seqüências virais e semelhantes. Quando usando ARN como uma fonte de molde, transcriptase reversa pode ser usada para sintetizar fitas de ADN complementares.

Ainda, técnicas de hibridização de ácido nucléico podem ser usadas para identificar e obter uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo tendo atividade enzimática. Resumidamente, qualquer molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo enzimático conhecido, ou seu fragmento, pode ser usada como uma sonda para identificar moléculas de ácidos nuclêicos similares por hibridização sob condições de rigorosidade moderada a alta.

Tais moléculas de ácidos nuclêicos similares então podem ser isoladas, sequenciadas e analisadas para determinar se o polipeptídeo codificado tematividade enzimática.

Hibridização pode ser feita por análise Southern ou Northern para identificar uma seqüência de ADN ou ARN, respectivamente, que hibrideza a uma sonda. A sonda pode ser rotulada com um radio — isotopos tal como 32P, uma enzima, digoxigenina, ou através de biotinilação. O ADN ou ARN a ser analisado pode ser eletroforeticamente separado sobre um gel agarose ou poliacrilamida, transferido para nitrocelulose, nylon, ou outra membrana apropriada, e hibridizado com a sonda usando-se técnicas padrões bem conhecidas tais como aquelas descritas nas seções 7.39-7.52 de Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harboro Laboratory, Plainview, NY. Tipicamente, uma sonda é pelo menos cerca de 20 nucleotídeos em comprimento. Por exemplo, uma sonda correspondendo a uma seqüência de 20 nucleotídeos que codifica uma citrato liase de mamífero pode ser usada para identificar uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de fungo tendo atividade liase cítrica. Em adição, sondas maiores ou menores que 20 nucleotídeos podem ser usadas.

Qualquer método pode ser usado para introduzir uma molécula de ácido nucléico exógeno em uma célula. De fato, muitos métodos para introdução de ácido nucléico em células de levedura são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, transformação, eletroporação, conjugação, e fusão de protoplastos sao métodos comuns para introdução de ácido nucléico em células de levedura. Ver, por exemplo, Ito et al., J. Bacteriol. 153:163-168 (1983);

Durrens et al. , Curr. Genet. 18:7 12 (1990); e Becker and Guarente, Methods in Enzymology 194:182-187 (1991). É importante notar que a molécula e ácidonucléico exógena contida em uma célula de levedura da invenção pode ser mantida dentro daquela célula em qualquer forma. Por exemplo, moléculas de ácido nucléico exógeno podem ser integradas no genoma da célula ou mantidas em um estado epissomal. Em outras palavras, uma célula da invenção pode ser um transformante estável ou transiente. Em adição, as células de levedura aqui descritas podem conter uma cópia simples, ou cópias múltiplas (por exemplo, cerca de 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 ou 150 cópias), de uma particular molécula de ácido nucléico como descrito acima. Métodos para expressão de uma seqüência de aminoácidos a partir de uma molécula de acido nucléico exógena são bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

Tais métodos incluem, sem limitação, construção de um ácido nucléico de modo que um elemento regulador promova a expressão de uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica um polipeptídeo. Tipicamente, elementos reguladores são següências de ADN que regulam a expressão de outras seqüências de ADN no nível de transcrição. Assim, elementos reguladores incluem, sem limitação, promotores, aperfeiçoadores, e semelhantes. Além disso, métodos para expressão de um polipeptídeo a partir de uma molécula de ácido nucléico exógena em levedura são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, construções de ácido nucléico que são capazes de expressar polipeptídeos exógenos dentro de Kluyveromyces são bem conhecidas. Ver, por exemplo, patentes US 4 859 596 e 4 943 529.

Como aqui descrito, células de levedura dentro do escopo da invenção contêm uma molécula de ácido nucléico exógena que, por exemplo, codifica um polipeptídeo tendo atividade enzimática que conduz à formaçao de um produto orgânico. Métodos de identificação de células que contêm ácido nucléico exógeno são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais métodos incluem, sem limitação, PCR e técnicas de hibridização de ácido nucléico tais como análise Northern e Southern. Em alguns casos, técnicas de imuno - histoquímica e bioquímicas pode ser usadas para determinar se uma célula contem um particular ácido nucléico através de detecção do polipeptídeo enzimático codificado por aquela particular molécula de ácido nucléico. Por exemplo, um anticorpo tendo especificidade para uma enzima codificada pode ser usado para determinar se ou não uma particular levedura contem aquela enzima codificada. Ainda, técnicas bioquímicas podem ser usadas para determinar se uma célula contem uma particular molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo enzimático através de detecção de um produto orgânico produzido como um resultado da expressão do polipeptídeo enzimático. Por exemplo, detecção de lactato após introdução de uma molécula de ácido nucléico exógeno que codifica um polipeptídeo tendo atividade lactato desidrogenase em uma célula de levedura que normalmente não expressa um tal polipeptídeo pode indicar que aquela célula de levedura não somente contem a molécula de ácido nucléico exógeno introduzida mas também expressa o polipeptídeo enzimático codificado a partir daquela molécula de ácido nucléico exógeno introduzida. Métodos para detecção de específicas atividades enzimáticas ou a presença de particulares produtos orgânicos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a presença de lactato pode ser determinada como descrito em outro lugar.

Ver, Witte et al., J. Basic Microbiol. 29:707-716 (1989). A invenção também provê uma construção de ácido nucléico contendo uma seqüência de recombinação e uma sequência selecionada. 0 termo "seqüência de recombinação" como aqui usado refere-se a qualquer seqüência de ácidos nucléicos que corresponde a uma seqüência genômica encontrada dentro da célula. As seqüências de recombinação aqui descritas podem ser usadas para direcionar eventos recombinantes durante a geração de organismos knock-out. Em outras palavras, uma seqüência de recombinação pode ser usada para interromper especificamente um locus contendo uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma particular enzima. 0 termo "seqüência selecionada" como aqui usado inclui qualquer sequência de ácidos nucléicos. Tipicamente, uma seqüência selecionada codifica um polipeptídeo tendo atividade enzimãtica que conduz a formação de um produto orgânico dentro da célula. Assim, as construções de ácido nucléico da invenção podem ser usadas para knockout uma atividade de enzima endógena e adicionar uma atividade de enzima exógena em uma única etapa. Na maioria dos casos, a seqüência selecionada está dentro da seqüência de recombinação de modo que a seqüência selecionada e flanqueada em cada extremidade pela seqüência de recombinação. 5, produção de Produto Orgânico e Métodos de Cultura A invenção provê métodos para produção de produtos orgânicos usando-se qualquer uma das células de levedura ou outras células microbiais aqui providas. Tais métodos envolvem provimento de células de levedura e cultura das células de levedura providas com meio de cultura de modo que um produto orgânico (por exemplo, glicerol, acrilato, xilose, ascorbato, lactato, citrato, isocitrato, alfa- cetoglutarato, succinil-CoA, succinato, fumarato, malato, e oxalo acetato) é produzido. Em termos gerais, os meios de cultura e/ou condições de cultura podem ser classificados em uma de duas categorias: aqueles que promovem respiração celular e/ou a produção de biomassa e aqueles que reduzem respiração celular. Tipicamente, meios de cultura e/ou condições de cultura que promovem respiração celular são usados em situações onde é necessário rápido crescimento, ou onde o produto orgânico a. ser produzido nao pode ser produzido sem respiração celular. Tais produtos orgânicos podem incluir, sem limitação, produtos de ciclo de Krebs.

Por outro lado, meio de cultura e/ou condições de cultura que reduzem respiração celular sao usados em situações onde rápido crescimento não é necessário ou indesejado, ou onde o produto orgânico a ser produzido pode ser produzido sem respiração celular. Tais produtos orgânicos incluem, sem limitação, lactato, acrilato, e xilose. Como aqui usada, a frase "promove respiração celular" ou "promove produção de biomassa" quando referindo-se a condiçoes de cultura, significa que as condições de cultura de célula são mantidas de modo que a fonte de carbono dentro do meio de cultura é predominantemente metabolizada por respiração oxidativa ou para produzir biomassa. Como aqui usado, o termo "biomassa refere-se ao peso seco do organismo. Como aqui usada, a frase "predominantemente metabolizada para produzir biomassa" significa que pelo menos cerca de 0,3 gramas de biomassa são produzidos por grama de fonte de carbono (na forma de carboidrato) consumido (por exemplo, pelo menos cerca de 0,4, 0,45, 0,5 ou 0,6 gramas de biomassa).

Genericamente, entre cerca de 0,3 a cerca de 0,6 gramas de biomassa são produzidos por grama de fonte de carbono. Métodos para determinação de quantidade de biomassa (peso seco de célula) em uma cultura são conhecidos e incluem, por exemplo, os métodos descritos por Postma et al., "Enzymic analysis of the Crabtree effect in glucose-limited chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae", Appl. Environ.

Microbiol., 53, 468-477 (1989); e Kiers et al. , "Regulation of alcoholic fermentation in batch and chemostat cultures of Kluyveromyces lactis CBS 2359" Yeast, 14,459-469 (1998) . Métodos para determinação da quantidade de fonte de carbono consumida são conhecidos, e incluem, por exemplo, metodologias de HPLC.

Deve ser notado que a eficiência de utilização de fonte de carbono pode depender da fonte de carbono e o organismo. Assim, embora meios de crescimento complexos que incluem outras fontes de carbono que não carboidrato podem ser usados, a quantidade de biomassa produzida por grama de fonte de carbono refere-se somente à quantidade de biomassa produzida por grama de fonte de carbono carboidrato consumida.

Em geral, meio de cultura contendo um inibidor de respiração celular (por exemplo, antimicina A, cianeto, e azida) pode reduzir respiração celular, enquanto a ausência de tais inibidores pode promover respiração celular. Da mesma maneira, condições de cultura anaeróbicas podem reduzir respiração celular, enquanto condições de cultura aeróbicas podem promover respiração celular. Uma condição aeróbica é qualquer condição onde oxigênio é introduzido ou ocorre naturalmente e serve como um substrato para o caminho respiratório. Genericamente, o termo "aeróbico" refere-se a uma condição de cultura na qual os meios de cultura são mantidos sob um fluxo de ar de pelo menos 0,1 WM (volume de ar / volume líquido / minuto) (ou maior que 0,2,. 0,3, 0,4, 0,5, 1,0,1,5 ou 2,0 WM) . Se um gás outro que não ar é usado então WM nominal é ajustado para um equivalente de ar baseado em teor de oxigênio do gãs. Alternativamente, "aeróbico" pode ser definido como um meio de cultura que tem um teor de oxigênio dissolvido de pelo menos 2% (por exemplo, pelo menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75 ou 80%) em relação â quantidade presente em condições saturadas com ar em pressão atmosférica.

Uma condição anaerõbica é qualquer condição onde oxigênio é propositalmente ou naturalmente feito essencialmente indisponível para o caminho respiratório, conduzindo a, por exemplo, a produção de um produto reduzido tal como um etanol. Genericamente, uma condição onde meio de cultura tem um teor de oxigênio dissolvido (DO) de menos que cerca de 2,0% (por exemplo, menos que cerca de 1,5, 1,0 ou 0,5ΐ, ou igual a cerca de 0%) é considerada uma condição anaeróbica. Da mesma maneira, uma condição tendo WM (volume de ar/volume líquido/minuto) de menos que cerca de 0,1 (por exemplo, menos que cerca de 0,05, ou igual a cerca de 0) e considerada uma condição anaeróbica. Tipicamente, o termo "ar" usado aqui com relação a WM refere-se a ar como ele existe na atmosfera. Outras condições de cultura que podem influenciar respiração celular incluem, sem limitação, pH, temperatura, e a presença de particulares fontes de carbono (por exemplo, glicose). É importante notar que alguns meios de cultura e/ou condições de cultura que promovem respiração celular dentro de uma espécie de levedura pode reduzir respiração celular dentro de outras espécies. Por exemplo, a presença de glicose dentro do meio de cultura reduz respiração celular em células de levedura tendo um fenõtipo positivo - crabtree enquanto tendo pequeno ou nenhum efeito sobre respiração celular em células de levedura tendo um fenótipo negativo - crabtree.

Manipulação direcionada de condições de cultura durante uma produção comercial pode ser uma etapa importante em obtenção de ótimos níveis de um desejado produto orgânico como aqui descrito. Tipicamente, uma célula de levedura dentro do escopo da invenção é crescida sob condições de cultura que promovem respiração celular para produzir uma significante densidade de célula. Por exemplo, células de levedura podem ser colocadas em um vaso de cultura, e dadas uma abundância de glicose e oxigênio.

Tipicamente, sob condições de promovem respiração celular, o tempo de duplicação para os microorganismos aqui providos é menos que cerca de 10 horas (por exemplo, menos que cerca de 8, 5 ou 3 horas) . Uma vez as células atinjam uma densidade significante, as condições de cultura podem ser comutadas para condições que reduzem respiração celular de modo que um produto orgânico não requerendo respiração celular é produzido. Por exemplo, as células de levedura podem ser transferidas para um vaso de cultura e dadas uma abundância de glicose, mas não oxigênio. Neste caso, manipulando-se diretamente as condições de cultura de modo que elas sejam comutadas de aeróbicas para anaeróbicas pode produzir ótimos níveis de um desejado produto orgânico. Alternativamente, em alguns casos, as células podem ser cultivadas unicamente sob condições que promovem respiração celular de modo que um produto orgânico requerendo respiração celular é produzido. É notado que a massa de células dentro de vaso de produção tipicamente é maior que cerca de 2 g/L (por exemplo, maior que cerca de 4, 6, ou 8 g/L).

Durante cultura, a temperatura pode ser maior que cerca de 35°C (por exemplo, maior que cerca de 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ou 45°C). Em adição, o meio de cultura pode ser líquido. Os meios de cultura tipicamente contêm uma fonte de carbono. Genericamente, a fonte de carbono inclui materiais brutos contendo carboidrato.

Tipicamente, os meios nutrientes também contêm uma fonte de nitrogênio. Preferivelmente a fonte de nitrogênio inclui uma combinação de compostos nitrogenosos orgânicos e inorgânicos.

Em um modo de operação, pode ser desejado encher uma grande vaso de fermentação com um meio de cultura incluindo todos os nutrientes requeridos e todo o carboidrato, suficiente para ambos, produção de biomassa e para a produção do produto desejado. 0 vaso pode ser operado sob condições de modo que produção de biomassa seja inicialmente promovida, por exemplo, através de provimento de condições aeróbicas, e então comutadas para condições anaerobicas para a produção do desejado produto.

Em um modo alternativo de operação, um vaso menor é usado para produção de biomassa, com um alto nível de nutrientes e suficiente carboidrato para produzir, por exemplo, cerca de 100 g/1 de biomassa. 0 conteúdo do vaso então pode ser transferido para um vaso maior, contendo um segundo meio de cultura que contem menos nutrientes, por exemplo, somente glicose como uma fonte de carbono ou outra fonte de carbono carboidrato em água. Este vaso pode ser operado sob condições anaeróbicas para a produção do desejado produto orgânico. Crescimento de biomassa é reduzido devido ao reduzido nível de nutrientes e as condições anaeróbicas.

Em uma realizaçao preferida, os meios nutrientes são mantidos para somente os materiais requeridos de modo a simplificar recuperação do produto desejado. Uso de crescimento aeróbico pode permitir que meios simplificados sejam usados, em relação àquele necessário se crescimento sob condições anaeróbicas fosse necessário. Muitas das leveduras aqui descritas podem ser crescidas, sob condições aeróbicas, sobre um meio consistindo somente em açúcar, uma fonte de nitrogênio inorgânica, minerais em traços e algumas vitaminas.

Antes de adição de produto orgânico ao meio de cultura como um resultado de fermentação ou outros métodos, o meio de cultura genericamente tem um pH entre cerca de 5,0 a 7,0. Entretanto, quando produtos orgânicos tais como ácidos orgânicos são secretados no meio de cultura pelo microorganismo, o pH do meio de cultura tende a diminuir. O termo "pH orgânico" como aqui usado refere-se ao pH do meio de cultura atribuído a compostos orgânicos presentes no meio tais como carboxilatos, por exemplo, ácido lático. 0 termo "pH inorgânico" como aqui usado refere-se ao pH atribuído a compostos inorgânicos tais como HCl e H2S04. 0 meio de cultura pode ter um valor de pH orgânico de menos que cerca de 3,0 (por exemplo, menos que cerca de 2,9, 2,8, 2,7, 2,6 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, ou 1,5), ou um valor de pH inorgânico de menos que cerca de 3,0 (por exemplo, menos que cerca de 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, ou 1,5). Qualquer fonte de carbono pode ser usada durante o procedimento de cultura. Por exemplo, meio contendo um carbono pentose (por exemplo, ribose, arabinose, xilose e lixose) pode ser usado.

Em adição, meio contendo um hidrolisato de fibra de milho pode ser usado. Um hidrolisato de fibra de milho pode ter um valor de pH entre 2,0 e 6,5. Tipicamente, hidrolisato de fibra de milho contem glicose, xilose, e arabinose. Por exemplo, um hidrolisato de fibra de milho pode conter cerca de 40 gramas/L de glicose, cerca de 40 gramas/L de xilose, e cerca de 20 gramas/L de arabinose.

Para métodos de produção de larga escala, os seguintes métodos podem ser usados. Primeiro, um grande tanque (por exemplo, um tanque de 50, 100, 200 galões ou mais) contendo meio de cultura apropriado com, por exemplo, carbonos hexose e/ou pentose é inoculado com um microorganismo particular. Após inoculação, as condições de cultura podem ser manipuladas de modo que a fonte de carbono é usada predominantemente para produzir biomassa. Por exemplo, o meio de cultura pode ser manipulado para ter um valor de pH de cerca de 7,0, uma temperatura de cerca de 35°C, e um teor de oxigênio dissolvido que cria um ambiente aeróbico por todo o tanque. É notado que o desejado produto orgânico pode ser produzido durante esta fase de produção de biomassa. Uma vez uma biomassa suficiente seja alcançada, o caldo contendo os microorganismos pode ser transferido para um segundo tanque. Este segundo tanque pode ser de qualquer tamanho. Por exemplo, o segundo tanque pode ser maior, menor ou do mesmo tamanho como o primeiro tanque. Tipicamente, o segundo tanque é maior que o primeiro de modo que adicional meio de cultura pode ser adicionado ao caldo do primeiro tanque. Em adição, o meio de cultura dentro deste segundo tanque pode ser o mesmo como, ou diferente daquele usado no primeiro tanque. Por exemplo, o primeiro tanque pode conter meio com xilose e arabinose, enquanto o segundo tanque contem meio com glicose.

Uma vez transferida, as condições de cultura dentro do segundo tanque podem ser manipuladas de modo que a fonte de carbono seja usada predominantemente para produzir produto orgânico onde "produto orgânico" inclui, entre outras coisas, produtos derivados de piruvato e dióxido de carbono (C02) mas não inclui biomassa (isto é, peso seco de célula). Como aqui usada, a frase "produz predominantemente um "produto orgânico selecionado" ou um "produto derivado piruvato selecionado" quando referindo-se a condições de cultura, significa que a fonte de carbono dentro do meio de cultura ê metabolizada, tipicamente através de um método de fermentação (embora não necessariamente) , para formar pelo menos 0,5 gramas de produto orgânico por grama de fonte de carbono consumida (por exemplo, pelo menos 0,6, 0,75 ou 0,8 gramas de produto orgânico). Métodos para determinação da quantidade de produto orgânico produzido e/ou fonte de carbono consumida são conhecidos e incluem, por exemplo, HPLC.

Como descrito anteriormente, a eficiência de utilização de fonte de carbono pode variar dependendo do substrato e organismo. Assim, enquanto um meio de crescimento complexo que inclui fontes de carbono outras que não carboidrato (por exemplo, aminoãcidos) podem ser usadas, a quantidade de produto orgânico ou produto derivado de piruvato produzida por grama de fonte de carbono refere-se somente à quantidade de produto orgânico ou produto derivado - piruvato produzida por grama de fonte de carbono carboidrato consumido. Preferivelmente neste estágio, não mais que 0,3 gramas de biomassa por grama de fonte de carbono são produzidos (por exemplo, não mais que 0,2, 0,1 ou 0,05 gramas de biomassa).

Por exemplo, o meio de cultura pode ser manipulado para ter um teor de oxigênio dissolvido que cria um ambiente anaeróbico por todo o tanque, ou para conter um inibidor de respiração celular. Em adição, o meio de cultura pode ser manipulado de modo que um particular valor de pH (por exemplo, um valor de pH ácido, neutro ou básico) seja mantido. Alternativamente, o pH da cultura pode ser ajustado periodicamente sem manutenção de qualquer valor de pH particular. Tipicamente, quando produzindo um ácido orgânico, o valor de pH do meio de cultura é mantido acima de pelo menos cerca de 1,5 (por exemplo, pelo menos cerca de 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, ou 7,0).

Ainda, quando o microorganismo cataboliza as fontes de carbono providas, a temperatura dentro do tanque aumentará.

Assim, o meio de cultura pode ser manipulado de modo que uma particular temperatura seja mantida. Alternativamente, a temperatura do meio de cultura pode ser ajustada periodicamente sem manutenção de qualquer particular temperatura. Tipicamente, uma temperatura de menos que cerca de 35 °C (por exemplo, menos que cerca de 34, 33, 32, 31, ou 30°C) é mantida quando usando-se microorganismos termo - sensíveis, enquanto uma temperatura de menos que cerca de 45°C (por exemplo, menos que cerca de 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36 ou 35°C) é mantida quando usando-se microorganismos insensíveis ao calor. É notado que biomassa pode ser produzida durante esta fase de produção de produto orgânico. Em adição, as condições de cultura dentro do segundo tanque podem ser comutadas a partir daquelas que promovem produção de produto para aquelas que promovem produção de biomassa, e vice versa, uma ou mais vezes. Por exemplo, as condições de cultura dentro do segundo tanque podem ser anaeróbicas na maior parte do tempo com breves pulsos de oxigênio dissolvido de modo que condições aeróbicas existam periodicamente.

Em um outro método, as condições de cultura anaeróbicas podem ser modificadas para aumentar-se a energia metabólica do microorganismo cultivado, por exemplo, através da adição de um aceptor de elétrons terminal. Como aqui usado, o termo "energia metabólica" refere-se â energia (em termos de ATP) derivada pelo organismo a partir de uma fonte de energia (tal como uma fonte de carbono) . Sob algumas condições, a quantidade de energia metabólica obtida pelo organismo a partir do metabolismo de uma fonte de carbono é maior que a quantidade de energia obtida da mesma fonte de carbono sob diferentes condições. Células vivas são altamente ordenadas e têm de criar ordem dentro de si mesmas de modo a sobreviverem e crescerem. Para manter ordem dentro do organismo, milhares de diferentes reações químicas estão ocorrendo dentro do organismo em qualquer instante de tempo. Por exemplo, células precisam de energia para reações biossintéticas tais como reações de polimerização de proteína e ARN, ADN e formação de produtos metabólicos. Células também precisam de energia para trazer substratos na célula, manter metabólitos dentro da célula, manter uma própria pressão turgor e pH interno, e para motilidade.

Porque energia não pode ser criada ou destruída, a célula requer uma entrada de energia a partir do ambiente para manter a ordem. Energia é genericamente suprida a partir do ambiente na forma de radiação eletromagnética ou energia química. A energia obtida a partir do ambiente é aproveitada pela célula usada através de um de dois mecanismos bioquímicos genéricos: fosforilação de nível de substrato e transporte de elétrons.

Genericamente, sob condições anaeróbicas, ATP (a "vigência celular" para energia) é produzida por fosforilação de nível de substrato. Em fosforilação de nível substrato, energia ê liberada a partir de ligações químicas e é estocada principalmente na forma de ATP.

Um exemplo de formação de nível substrato é a conversão de glicose a piruvato através de glicólise: Glicose = 2 piruvato + 2 ATP + 2 H2 Piruvato então pode ser convertido em ácido lãtico: Piruvato + 2H2 = lactato A energia líquida produzida pela transformação acima é equivalente a 2 ATP. Piruvato ainda pode ser processado para ciclo de ácido tricarboxílico (TCA)e gerar energia adicional e átomos de hidrogênio: Piruvato + 3 H20 = 3 C02 + ATP + 5 H2 A reação líquida para respiração glicose: Glicose + 6H20 = 6 C02 + 4 ATP + 12 H2 Assim, através de fosforilação de nível de substrato, a completa respiração de glicose a C02 proverá uma energia líquida equivalente de 4 ATP e 24 átomos de hidrogênio.

Em "transporte de elétrons", os potenciais de oxidação - redução dos compostos que constituem membros de uma "cadeia de transporte de elétrons" são estabilizados de modo que cada membro pode ser reduzido pela forma reduzida do membro anterior. Assim, energia de redução, como elétrons, pode fluir através da cadeia de moléculas carreadoras para um terminal receptor de elétrons tal como oxigênio (02) , nitrato (NO3’) e fumarato. Adição de um aceptor de elétrons terminal tal como oxigênio, nitrato ou fumarato para um outro meio de cultura pode prover o microorganismo com aumentada energia metabólica (por exemplo, aumentada produção de ATP para a mesma quantidade de fonte de carbono consumida). Oxigênio é o receptor de elétrons terminal mais preferido.

Por exemplo, se oxigênio é usado como um receptor de elétrons terminal, hidrogênio pode ser processado através de cadeia de transporte de elétrons e prover a célula com adicionais 1,5 ATP por átomo de hidrogênio e 3 ATP por átomo de oxigênio. Genericamente, a quantidade de energia metabólica pode ser determinada por medição de razão da quantidade de oxigênio consumido para a quantidade de glicose consumida. A Tabela 1 apresenta aperfeiçoamentos máximos e mínimos esperados de rendimento de energia (moles de ATP por moles de glicose) quando oxigênio é adicionado durante produção como uma função do rendimento de produto que está diminuindo devido a perda de piruvato para ciclo TCA (e, consequentemente para respiração) . 0 percentual de aperfeiçoamento máximo foi calculada assumindo-se uma razão P/0 de 3 onde % de aperfeiçoamento mínima assumiu uma razão P/0 de 0,5. A Tabela 2 mostra a quantidade máxima estimada de oxigênio consumida por mol de glicose consumido. Adição de oxigênio pode promover crescimento mínimo que irá seqüestrar carbono para biossíntese deixando uma pequena quantidade de carbono disponível para respiração (e, por isso, utilização de oxigênio). TABELA 1 TABELA 2 Assim, para aperfeiçoar a energia metabólica dos microorganismos na cultura de célula, oxigênio pode ser adicionado à cultura de célula como um receptor de elétrons terminal. Enquanto o rendimento molar máximo de ácido lático a partir de glicose é 2 moles de lactato por mol de glicose e o rendimento molar de ATP a partir de glicose é 2 moles ATP por mol de glicose, adição de oxigênio como um receptor de elétrons terminal permite algum do piruvato ser canalizado para o ciclo de ácido cítrico (TCA) onde ele é convertido a C02 e energia. Assim, suprimento de um receptor de elétrons terminal "aumenta a energia metabólica" do microorganismo.

Desvio de piruvato para o ciclo TCA tenderá a reduzir a quantidade de outros produtos derivados - piruvato (tais como ácido lático) produzidos. Por exemplo, uma redução de 10% em rendimento pode resultar na regeneração de 2,6 vezes mais energia metabólica para o microorganismo, uma redução de 20% em rendimento pode resultar na geração de 4,2 vezes mais energia metabólica para o microorganismo, e uma redução de 50% em rendimento pode resultar na geração de 9 vezes mais energia metabólica para o microorganismo. E antecipado que nos estágios posteriores de um método, quando altos níveis de produtos metabólicos tais como ácido lático estão presentes, esta célula pode requerer mais energia metabólica para manter função.

Assim, pode ser desejável expor os microorganismos dentro de um meio de cultura anaeróbico a breve pulsos de oxigênio dissolvido. Preferivelmente, o "breve pulso de oxigênio dissolvido" resulta no meio de cultura tendo uma concentração de oxigênio dissolvida não maior que 0,5 porcento, preferivelmente entre cerca de 0,1 e 0,5 porcento.

Alternativamente, a taxa de crescimento ou manutenção celular dos microorganismos durante fermentação anaeróbica pode ser aumentada pela adição de outros receptores de elétrons terminais tais como nitrato.-ou fumarato. O oxigênio é adicionado em um nível justo suficiente para aumentar a energia metabólica do micro organismo enquanto mantendo produtividade em um nível desejado. Deve ser tomado cuidado para evitar-se excessiva perda de rendimento. Esta técnica também pode ser usada para auxiliar consumo de açúcares residuais e pelo que ainda simplificar métodos de recuperação. 6. Métodos de Purificação de Produto Orgânico Uma vez produzido, qualquer método pode ser usado para isolar o produto desejado. Por exemplo, técnicas de separação comuns podem ser usadas para remoção de biomassa do caldo, e procedimentos de isolamento comuns (por exemplo, extração, destilação, e procedimentos de troca de íons) podem ser usados para obter-se o produto orgânico a partir do caldo livre de microorganismos. Ver, por exemplo, patente US 4 275 234; patente US 5 510 526; patente US 5 831 122; patente US 5 641 406; e pedido de patente internacional número W093/00440. Em adição, o desejado produto orgânico pode ser isolado enquanto esta sendo produzido, ou ele pode ser isolado do caldo após a fase de produção de produto ter sido terminada. É importante notar que as condições de cultura dentro do segundo tanque podem ser manipuladas de modo que o método de isolamento seja aperfeiçoado. Por exemplo, o pH e temperatura dentro do segundo tanque podem ser manipulados de modo que o desejado produto orgânico precipite da solução, ou esteja em uma forma mais propxcia a isolamento. Especificamente, o valor de pH de ácidos orgânicos pode precipitar for a de solução quando o pH do caldo é menos que o valor de pKa para o acido orgânico. Por exemplo, as condições de cultura enquanto produzindo ácido glutâmico podem ser tais que o pH seja menos que 2,19, que é ó valor de pKa para ácido glutâmico. Assim, manipulação de pH, temperatura, e teor do caldo podem facilitar isolamento de produto orgânico. Em adiçao, particular levedura geneticamente manipulada pode ser selecionada e/ou específicas condições de cultura podem ser manipuladas de modo que quaisquer subprodutos dentro do caldo são tais de modo que eles não interferem com a recuperação do desejado produto orgânico.

Será apreciado que os métodos e materiais aqui descritos podem ser adaptados e usados em qualquer tipo de método de cultura incluindo, sem limitação, os métodos comumente referidos como métodos de "fermentação continua" e "fermentação de hatelada". Em adiçao, os microorganismos usados durante um método de produção podem ser recuperados e reutilizados em subsequentes métodos de produção. Por exemplo, os microorganismos podem ser reutilizados múltiplas vezes para produção de um desejado produto orgânico. Ainda, qualquer fonte de carbono pode ser usada. Por exemplo, alose, altrode, glicose, manose, gulose, iodose, galactose, talose, melibiose, sucrose, frutose, rafinose, estaquiose, ribose, arabinose, xilose, lixose, amidos tais como amido de milho e amido de trigo, e hidrolisatos tais como hidrolisatos de fibra de milho e outros hidrolisatos celulósicos podem ser usados como uma fonte de carbono para a produção de tanto biomassa como o desejado produto orgânico. Além disso, qualquer meio pode ser usado. Por exemplo, meios de cultura padrões (por exemplo, meio mínimo de levedura e meio YP (extrato de levedura 10 g/L, caldo de peptona 20 g/L)) assim como meios tais como água de infusão de milho r licor de infusão de milho podem ser usados.

Uma significante vantagem da presente invenção é que os microorganismos preferidos, especialmente quando crescidos sob condições aeróbicas, podem utilizar meios mínimos. A produção anaeróbica tipicamente não requererá nutrientes adicionais, de modo que o produto final possa ser isolado a partir de um caldo de fermentação relativamente limpo usando-se qualquer uma de uma variedade de técnicas de separação. Extração líquido - líquido uma técnica bem conhecida para a separação de ácidos orgânicos a partir de caldos de fermentação, e resulta em considerável purificação. Com a presente invenção é acreditado que sistemas de menos consumo de energia, mais baratos, mais simples também podem ser úteis.

Em uma realização, a presente invenção usa levedura geneticamente modificada tendo um fenótipo negativo crabtree em um método tipo - trem que induz uma "comutação" no caminho metabólico após uma densidade de célula crítica ter sido atingida e em cujo momento é desejado aumentar-se dramaticamente a produtividade específica do produto orgânico desejado. Um método típico para indução de comutação de caminho metabólico é através de movimento de biomassa a partir de um vaso altamente aerado para um vaso substancialmente anaeróbico, causando míngua de oxigênio. Ê notado que um carboidrato comum (por exemplo, glicose ou xilose) pode ser usado como a fonte de carbono durante a fase de crescimento e a fase de produção. O uso de uma célula de levedura geneticamente modificada tendo um fenótipo negativo - crabtree pode ser crítico para o sucesso nesta realização. Em adição, a específica produtividade do desejado produto orgânico pode ser crítica para sucesso. 0 termo "produtividade específica" como aqui usado reflete a quantidade de produto produzido e é representada como o número de gramas de produto orgânico produzido por grama de biomassa (peso seco) por hora, isto é, g/(g*hora).

Tipicamente, a produtividade específica para produtos orgânicos tais como lactato e acrilato é maior que cerca de 0,1 g/(g*hora), por exemplo, maior que cerca de 0,2 g/(g*hora), ou maior que cerca de 0,5g/(g*hora). Através de provimento de uma alta produtividade específica como aqui descrito, a energia requerida para manutenção de célula pode ser obtida via o caminho de produto fermentativo sob condições substancialmente anaeróbicas, antes que baseando- se em aeração para gerar altas quantidades de energia via o caminho respiratório. É notado que vasos substancialmente anaeróbicos são aerados em uma taxa de menos que cerca de 0,1 WM. Sob certas situações de produção, nenhuma aeração será usada. Em adição, o rendimento (isto é, g produto orgânico / g fonte de carbono consumida) nesta realização é tipicamente maior que cerca de 70% em peso, e é produzido sem a adição de fontes de carbono tais como etanol e acetato. Em alguns casos, de modo a obter-se a específica produtividade requerida para gerar a requerida energia para manutenção de célula, pode ser necessário aperfeiçoar-se o caminho a partir de glicose para piruvato em adição a provimento de necessárias enzimas para produção de produto desej ado.

Em uma outra realização, o método tipo trem pode ser desenhado de modo que somente o vaso de crescimento altamente aerado seja equipado com capacidade de esterilização. O vaso de produção anaeróbica é tipicamente operado em temperaturas maiores que cerca de 35°C(por exemplo, maior que cerca de 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, ou 45°C). Poucas leveduras tipo selvagem serão capazes de sobreviver e competir com a levedura geneticamente modificada em tais temperaturas quando o pH cai durante produção de produto, especialmente uma vez que elas não terão um caminho de fermentação aperfeiçoado que possa gerar energia para manutenção de célula. Em adição, a levedura pode ser engenheirada para conter "plasmídeos assassinos "como aqui descritos, que podem evitar que leveduras de outras espécies sobrevivam. A invenção também provê vários métodos para cultura de células de levedura. Por exemplo, uma célula de levedura tendo um fenótipo negativo - crabtree pode ser cultivada com meio de cultura tanto tendo um valor de pH orgânico de menos que cerca de 3,0, como contendo um hidrolisato de fibra de milho. Outros métodos para cultura de células de levedura incluem, sem limitação, cultura de células de levedura tendo um fenótipo crabtree negativo em uma temperatura maior que cerca de 35°C como meio de cultura tanto tendo um valor de pH inorgânico de menos que cerca de 3,0, como contendo um carbono pentose ou hidrolisato de fibra de milho.

Ainda, a invenção provê um método para fabricação de um produto orgânico. Este método inclui crescimento de um microorganismo sob condições de cultura, e mudança de condições de cultura para promover produção do produto orgânico. Neste método, o microorganismo tem reduzida atividade piruvato descarboxilase, álcool desidrogenase, aldeído desidrogenase, e/ou acetil-CoA sintase, e exibe uma taxa de crescimento na ausência de etanol e acetato que é pelo menos cerca de 30% (por exemplo, cerca de 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200%, ou mais) daquela observada em um microorganismo correspondente não tendo reduzida atividade de piruvato descarboxilase, álcool desidrogenase, aldeído desidrogenase e/ou acetil-CoA sintase. Tipicamente, condições de cultura que promovem respiração celular são usadas em situações onde rápido crescimento é necessário, ou onde o produto orgânico a ser produzido não pode ser produzido sem respiração celular, enquanto condições de cultura que reduzem respiração celular são usadas em situações onde crescimento rápido não é necessário, ou onde o produto orgânico a ser produzido pode ser produzido sem respiração celular. A invenção será ainda descrita nos exemplos que se seguem, os quais não limitam o escopo da invenção descrito nas reivindicações.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1 - Plasmídeo Recombinante pHES/pSEH O^g de plasmídeo pGAD424 descrito por Chien et al. (Proc. Nat'l Acad. Sei., 88(21):9578-9582 (1991)) foram digeridos com a enzima de restrição HindIII. A mistura digerida foi separada por eletroforese de gel sobre um gel agarose 0,8% usando tampão TBE. Um fragmento de 5,9 kbp foi então purificado do gel como descrito em Sambrook et al., (Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY(1989)). Um par complementar de 92 bp de oligômeros sintéticos com múltiplos sítios de reconhecimento de enzima de restrição foi designado. O primeiro foi designado fwd hes oligo e tem a seguinte sequência: 5'-CCCAAGCTTGAATTCCCCGGGGGATCCCTGCAGGGTACCACGCGTAGA TCTACTAGTGCGGCCGCCTCGAGTCTAGAGGGCCCAAGCTTGGG-3' (SEQ ID NO: 1). O segundo foi designado comp hes oligo e tem a seguinte seqüência: 5'-CCAAGCTTGGGCCCTCTAGACTCGAGGCGGCCGCACTAGTAGATCTAC GCGTGGTACCCTGCAGGGATCCCCCGGGGAATTCAAGCTTGGG-3' (SEQ ID NO: 2) . Os 500 nmoles dos dois oligômeros complemen- tares foram anelados um ao outro através de ebulição por dez minutos e resfriamento gradual para temperatura ambiente. O ADN de fita dupla de 92bp foi digerido com HindIII e ligado ao pGAD424 de 5,9 kbp digerido com HindIII. A mistura de ligação foi usada para transformar E.coli DH10B (electromax cells, Life Technologies, Rockville, MD) por eletroporação como descrito em Sambrook et al., (Molecular Cloning, second edition, Cold Sprin Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). E. coli recombinante foi revestido sobre placas de caldo Luria-Bertani, e células contendo plasmídeo foram selecionadas usando-se 100 μg/ml do antibiótico ampicilina. 0 ADN plasmídeo de clones E.coli resistentes a ampicilina foram selecionados para obter-se os dois plasmídeos pHES e pSEH (Figuras 1 e 2) .Os dois plasmídeos diferem na orientação do oligômero sintético com relação à álcool desidrogenase - promotor ADH1 sobre o vetor. EXEMPLO 2 - Amplificação PCR de Ácido Nucléico Codificando Lactato Desidrogenase de Lactobacillus Helveticus e Pediococcus Acidilactici ADN genômico foi isolado de culturas de toda a noite de Lactobacillus helveticus (ATCC 10797) e Pediococcus acidilactici (ATCC 25741) usando-se kit de isolamento de ADN genômico PUREGENE® (Gentra systems, Minneapolis, MN) .

Primers PCR foram designados para isolar ácido nucléico codificando lactato desidrogenase de ADN genômico de L. helveticus (lh-ldh oligos) e P. acidilactici (pa-ldh- oligos). Estes primers foram designados baseados nas seqüências de gene disponíveis para lactato desidrogenases nas bases de dados GenBank, e têm as seguintes seqüências: 5' lh-ldh, 5'-CCGGGATCCATGGCAAGAGAGGAAAAACCTC-3' (SEQ ID NO : 3 ) ; 3 ' lh-ldh, 5'-CCAAGATCTTTATTGACGAACCTTAACGCCAG-3' (SEQ ID N:4); 5' pa-ldh, 5'- CCGGGATCCATGTCTAATATTCAAATCATCAAAAAG-3' (SEQ ID NO:5); e 3' pa-ldh, 5'-CCAAGATCTTTATTTGTCTTGTTTTTCAGCAAG-3' (SEQ ID NO:6). Os primers foram otimizados usando-se Primer Designer software obtido de Sci-ed software (Durham, NC) . Um pmol do ADN genômico foi usado junto com 100 nmoles de primers. Pfu DNA polimerase (New England Biolabs) foi usada para amplificar PCR ácido nucléico lactato desidrogenase (LDH) como descrito em Sambrook et al., (Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989) ) .

Uma estratégia similar é empregada para isolar ácido nucléico codificando L-lactato desidrogenase a partir de ADN genômico de microorganismos tais como Bacillus sp., por exemplo, Bacillus megaterium (ATCC 6458) ou Rhizopus oryzae (ATCC 76275) ou qualquer outro organismo produzindo lactato (incluindo microorganismos tais como fungos e bactérias e organismos multicelulares tais como mamíferos) ou a partir de tecido de um organismo produzindo lactato. ADN genômico é isolado de uma cultura crescendo do organismo usando kit de isolamento de ADN genômico PUEGENE® (Gentra systems, Minneapolis, MN) . Primers PCR apropriados são designados para isolar o ácido nucléico codificando lactato desidrogenase baseado nas seqüências de gene LDH para estas espácies disponíveis de Genbank. Genericamente, um μπιοί do ADN genômico é usado junto com 100 nmoles dos primers apropriados. Pfu ADN polimerase (New England Biolabs) ou qualquer outra ADN polimerase apropriada é usada para amplificar ácido nucléico lactato desidrogenase (LDH) a partir do respectivo ADN genômico usando-se tecnologia PCR, por exemplo, como descrito em Sambrook et al., (Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview,NY (1989)).

Alternativamente, ácido nucléico codificando lactato desidrogenase é isolado de Kluyveromyces theromotolerans ATCC 52709, Trichoderma Reesei ATCC 13631, Torulaspora pretoriensis ATCC 36245, ou qualquer outro microorganismo produzindo lactato desidrogenase usando qualquer uma das seguintes metodologias. 1) Uma biblioteca de ADNc genômico de um destes organismos ê clonada em um vetor de expressão E.coli padrão tal como pUC19 usando-se técnicas padrões (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Uma linhagem mutante E.coli (ldh-pfl) NZN111 (Bunch et al.,(1997) "The IdhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli", Microbiology, 143:187- 95) é transformada com esta biblioteca e as células são crescidas sob condições anaeróbicas em meio M9 suplementado com ácido casamino. Qualquer E.coli que cresce sob estas condições codifica tanto uma lactato desidrogenase como é um revertente em ldh ou pfl. Positivos (colônias que formam sob as condições anaeróbicas) são selecionados para atividade LDH usando-se ensaio colorimétrico de sobrecamada de agar- macio especifico ácido lático (LASSO) que é capaz de diferenciar entre (L)-LDH e (D)-LDH {Witte et al. , (J. Basic Microbiol. 29:707-716 (1989)). ADN plasmídeo de clones suspeitos de expressarem L-lactato desidrogenase são então isolados e sequenciados.

2) K.thermotolerans ATCC 52709, T. Reesei ATCC 13631 e Torulaspora pretoriensis ATCC 36245 são todos eucariotes que produzem ácido L-lático quando cultivados sob condições anaeróbicas (Witte et al., (J. Basic Microbiol. 29:707-716 (1989)). Assim, de acordo com este método, pelo menos uma destas linhagens é crescida sob condições anaeróbicas para induzir atividade de enzima lactato desidrogenase. Um extrato livre de células é então obtido usando-se métodos padrões e submetido a estratégias conhecidas de purificação de proteína para isolar a enzima lactato desidrogenase. Métodos para purificação de lactato desidrogenase são conhecidos (Kelly et al., (1978)" Affinity chromatography of bacterial lactate dehydrogenases", Biochem J, 171(3):543-7). Após a proteína ser purificada, ela é parcialmente clivada e sequenciada para determinar a seqüência de aminoácidos. Esta sequência de aminoácidos é então usada para designar primers degenerados para isolar o gene codificando lactato desidrogenase a partir de ADN genômico.

Um LDH eucariótico, tal como o isolado de K. thermotolerans ou Trichoderma reseei ou Torupaspora pretoriensis, pode funcionar melhor (em termos de eficiência de transcrição, eficiência translacional e/ou atividade de proteína) na levedura K. marxianus comparado a um LDH de fontes bacteriais tais como Bacillus ou Lactobacillus. 3) Usando as conhecidas seqüências de gene lactato desidrogenase eucariotico disponíveis de Genbank, primers degenerados sao designados para isolar o gene para lactato desidrogenase a partir de ADN genômico de K. thermotolerans ATCC 52709, T. Reesei ATCC 13631 ou Torulaspora pretoriensis ATCC 36245. O sítio ligante NAD+ conservado e sítio ligante piruvato entre seqüências de gene LDH são usados para designar primers degenerados. Um μιηοΐ de ADN genômico é usado junto com 100 nmoles de primers. Pfu ADN polimerase (New England Biolabs), ou qualquer outra ADN polimerase apropriada, ê usada para amplificar fragmentos do ácido nucléico de L+lactato desidrogenase (LDH) de acordo com métodos PCR conhecidos, por exemplo, aqueles descritos em Sambrook et al. , (Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)) . EXEMPLO—3___- Clonagem de L. Helveticus e P.

acidilactici em Vetor pÇRH

Produtos LDH ADN amplificados PCR foram ligados com vetores pCRII (Figuras 3 e 4) usando-se o kit de clonagem TA obtido de Invitrogen (Carlsbad, CA) . A mistura de ligação foi então usada para transformar E.coli DH10B usando-se métodos descritos em Sambrook et al. , (Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Os vetores pCRII supridos com o kit permitiram rápida clonagem dos produtos PCR de acordo com as instruções do fabricante. Os vetores pCRII com os genes LDH de L. helveticus e P. Acidilactici são mostrados na Figura 4. EXEMPLO 4 - Plasmídeo Recombinante pLh ldh-HES/pPa ldh-HES tendo Genes LDH de L.helveticus e P.acidilactici em Vetor pHES

Os vetores pCRII contendo gene LDH de L. helveticus e P. acidilactici foram digeridos com as apropriadas endonucleases de restrição. O vetor pHES foi similarmente digerido com as mesmas endonucleases de restrição. Uma inserção de 1 kbp contendo LDH de vetores pCRII foi então ligada ao vetor pHES de 6,0 kbp usando-se T4 ADN ligase como descrito em Sambrook et al., (Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (198 9) ) . A mistura de ligação foi usada para transformar E.coli DH10B (electromax cells, Life Technologies, Rockville, MD) , e clones recombinantes foram selecionados para resistência a ampicilina. ADN isolado de clones recombinantes foi analisado para confirmar os vetores pLh ldh-HES e pPa ldh-HES (Figura 5) . Estes vetores contêm os genes codificando LDH de L. helveticus e P. acidilactici no vetor pHES sob o controle do promotor de álcool desidrogenase (ADH1). EXEMPLO 5 - Clonagem de Gene LDH de Bacillus sp. .

Rhizopus orvzae, K. thermotolerans. Trichoderma reseei ou Torupaspora pretoriensis para Expressão Usando o Promotor de Gene PDC1 de Saccharomvces Embora seja possível usar-se o promotor de lactato desidrogenase encontrado em Rhizopus oryzae, K. thermotolerans, Trichoderma reseei ou Torulspora pretoriensis para controlar expressão de um gene lactato desidrogenase clonado em K. marxianus, o promotor PDC1 de Saccharomyces cerevisiae pode ser usado para controlar expressão do gene lactato desidrogenase isolado. Promotores glicolíticos de Saccharomyces cerevisiae foram usados com sucesso para expressarem genes em linhagens Kluyveromyces. (Gellissen and Hollenberg, (1997)"Application of yeasts in gene expression studies: a comparisson of Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorph and Kluyvermyces lactis - a review", Gene, 190(1):87-97).

Da mesma maneira, o promotor PDC1 de Saccharomyces cerevisiae é obtido através de designação de apropriados primers oligoméricos usando-se a seqüência de genoma de Saccharomyces cerevisiae, disponível em GenBank. A seqüência de gene PDC1 e regiões de 1 Kb circundantes do gene PDC1 são amplificadas através de tecnologia PCR. 0 resultante fragmento de ADN de 4 Kb contem ambos o promotor e terminadores que controlam expressão de gene PDC1. Sítios de enzima de restrição múltiplos são incluídos entre o promotor e terminadores que controlam a expressão de gene PDC1 de modo que uma variedade de genes LDH podem ser inseridos sob o controle do promotor PDC1 e terminadores. 0 fragmento de DNA de 4 Kb é inserido em um vetor apropriado, tal como um vetor lançador E.coli ou Saccharomyces cerevisiae baseado em pUC 19. 0 gene LDH é então introduzido no vetor em um dos múltiplos sítios de clonagem sob o controle do promotor e terminadores de modo que a expressão do gene lactato desidrogenase é controlada pelo promotor PDC1 e terminador (Fig. 14) . Alternativamente, outros promotores glicolíticos de Saccharomyces tais como aqueles que controlam a expressão dos genes fosfo glicerato cinase ou gliceraldeído-3 fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae podem ser usados similarmente para expressão de gene LH clonado em K. marxianus. EXEMPLO 6 - Amplificação de Fragmentos Lineares de ADN Homólogo para Interrupções de Gene de Piruvato Descarboxilase Um primer oligomérico de 82 bp (5'kmPDClKo) foi designado de modo que ele conteve 51bp idênticos â extremidade 5' da piruvato descarboxilase (PDC) de K. marxianus e 30bp idêntica â extremidade 5' do promotor ADH1 de vetores pHES. A seqüência de 5'KmPDClKo é como de segue: TAAACAGTACAATCGCAAAGAAAAGCTCCACACCCA

AACCAAATAATTGCAATGCAACTTCTTTTCTTTTTTTTTCTTTTCT-3' (SEQ ID NO:7) . A seqüência para os genes PDC de leveduras (K. marxianus ou Y. stipitis ou H. polymorpha) foi obtida a partir da seqüência GenBank submetida. Similarmente, um oligômero 79 bp reverso (3'kmPDClKo) foi designado de modo que 54bp foram idênticos â extremidade 3' do gene PDC e 22bp foram idênticos à extremidade 3' do terminador ADH1. A seqüência de 3'KmPDClKo é como se segue: TTATAAAATCATTAAAATCCAAAATCGTAATTTATCTCTTTATCCTCTCC CTCTCTACATGCCGGTAGAGGTGTGGTCA-3' (SEQ ID NO:8). Os primers foram designados para ampliação de um fragmento de ADN linear dos plasmideos pLhldh-HES e pPaldh-HES de modo que o fragmento contem o inteiro gene lactato desidrogenase junto com o promotor ADH1 e terminador (Figura 6) . 0 produto amplificado por PCR também contem extremidades que foram homólogas a seqüências de tanto K. marxianus PDC1, Yamadazyma stipitis PDC1 e PDC2 e Hansenula polymorpha PDC1 e PDC2. A reação de amplificação foi realizada usando-se Pfu ADN polimerase (New England Biolabs; Beverly, MA) . lOOng de pLldh-HES ou pPaldh-HES foram usados na reação junto com 5 unidades de polimerase e lOOnmoles dos oligômeros. A reação foi realizada de acordo com protocolos descritos em Sambrook et al. , (Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). A Figura 6 mostra o produto linear final com as homologias descritas.

Construções alternativas foram preparadas para aperfeiçoar a probabilidade de obtenção de uma linhagem negativa pdc de K. marxianus. Para preparar estas construções, um fragmento de 5,5 kbp circundando o gene PDC1 de 1,7 kbp de K. marxianus foi isolado (Figura 6b) usando-se PCR e técnicas de caminhada (walking) de genoma (Clonetech). O fragmento de 5,5 kbp foi então clonado no vetor de clonagem pCRII TA (Invitrogen) usando-se métodos padrões.

Uma porção de aproximadamente 370 bp próxima do meio da região codificante de 1,7 kbp de PDC1 foi removida do fragmento de 5,5 kbp de K. marxianus por digestões de restrição (Sambrook) . 0 fragmento removido tem a seguinte seqüência: CCGGTTCTTTCTCTTACTCTTACAAGACCAAGAACATTGTCGAATTCCAC

TCCGACTACATCAAGGTCAGAAACGCCACTTTCCCAGGTGTCCAAATGA

AGTTCGTCTTGCAAAAGTTGTTGACCAAGGTC AAGG ATGCTGCTAAGGG

TTAC AAGCC AGTTCC AGTT CCT CACGCT CC AAGAGACAACAAGCC AGTT

GCTG ACTCTACTCC ATTGAAGC AAGAATGGGTCTGGACT C AAGTCGGT A

AGTTCCTACAAGAAGGTGATGTTGTTCTAACTGAAACCGGTACCTCCGCT

TTCGGTATCAACCAAACCCACTTCCCAAATGACACCTACGGTATCTCCCA AGTCTTGTGGGGTTCCATTGGTTTCA (seqüência id n°io) Um gene de resistência a canamicina e seu promotor foram então isolados de um vetor pPIC9K (Invitrogen) usando- se tecnologia de restrição padrão (Ver Sambrook et al.), e clonado no sítio no 5,5 kbp a partir do qual fragmento identificado acima foi removido. 0 gene de resistência a canamicina pPIC9K (Invitrogen) e seu promotor foram inseridos de modo que a seqüência da região inserida foi como se segue: GTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAA

CGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAAC

TTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCC

TACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGT

AGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAG

AAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATC

CTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCT

GAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAAT

CGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGÁGAGCT

TTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGA

ACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAA

AAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGC

TCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCG

AGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATA

TTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAG

TTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCC

AACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAA

GTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAG

CTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGT

CATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCC

TGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAG

GAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT

TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGG

GGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATG

CTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCA

TCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAAC

AACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGA

TTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCA tgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatgg CTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTT

CATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGA

CACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCA

CAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGA

TCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGG

TGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATG (Seqüência ID No.9). A resultante construção contem o gene de resistência G418 circundado por aproximadamente 5 kbp da região pdc como mostrado na figura 6c. Uma construção de ADN similar foi feita a qual conteve o gene G418 interno circundado por 2,3 kbp de K. marxianus PDC1 no vetor pCRII como mostrado na figura 6d. EXEMPLO 7 - Uso de Fragmento de ADN Linear para Interromper a Seqüência Codificante PDC Endóaena e Inserir uma Seqüência Codificante LDH Simultaneamente O fragmento de ADN linear gerado por PCR descrito no Exemplo 5 é usado para transformar K. marxianus, Yamadazyma stipitis, ou Hansenula polymorpha. 0 protocolo usado para transformação é como descrito por Wesolowski- Louvel et al., (Nonconventionalyeasts in Biotechnology: Kluyeromyces lactis, ed. Klaus Wolf, Springer verlag, Berlin, p. 138-201 (1996)). M resumo, 5ml de uma cultura por toda a noite são centrifugados e lavados com tampão de eletroporação (Tris-Hcl 10nM, sucrose 270 nM, MgCl2 lnM, pH 7,5) . As células lavadas são então incubadas por 30 minutos a 30°C em tampão de incubação (extrato de levedura 5g/L, caldo de peptona 10 g/L, glicose 10 g/L, DTT 25nM, HEPES 20 nM, pH 8,0) . No fim deste período, as células são novamente lavadas e re-suspensas em 400μ1 de tampão de incubação. 200ng de ADN são adicionados a estas células, e as células são pulsadas usando-se o Bio-Rad Gene Pulser em 1800 volts, 1000Ω e 25 μΡ em uma cubeta de 0,4 cm.

As células são revestidas sobre placas YPD regular (extrato de levedura lOg/L, caldo de peptona 20 g/L, glicose 20 g/L, agar 15%), e colonias são deixadas regenerar por 72 horas. Cada uma das placas com colonias é revestida em réplica sobre placas YPD frescas e incubadas por 48 horas.

As colonias então são sobrepostas com agar mole 6,5% (agar 0,5% em Tris-HCl 300mM, glutamato 187 mM, pH 8,3). Uma mistura de manchamento (3,2ml de agar 1%, l,6ml de Tris 120 mM, glutamato 75 mM, pH 8,3, 0,4ml de 2mg/ml de metossulfato de fenazina, 7 unidades de glutamato piruvato transaminase, e 7 unidades de L(+)-lactato desidrogenase de músculo de porco) é adicionada às placas sobrepostas. Linhagens de leveduras com alto L{+) formam halos azuis dentro de 10-120 minutos. Este método ê similar ao método sugerido por Subden et al. (Canadian J. Microbiol., 28:883-886(1982)), e modificado por Witte et al. (J. Basic Microbiol. 29:707-716 (1989)). As colonias são selecionadas, e o ADN selecionado das colonias é testado por análise PCR e sequenciado para detectar-se o gene piruvato descarboxilase interrompido.

Em uma outra realização, os clones descritos no Exemplo 6 acima e mostrados nas Figuras 6c e 6d são digeridos com duas enzimas de restrição (Ver, Sambrook et al.) para renderem aproximadamente 3 microgramas de fragmento de ADN contendo a região PDC homóloga que inclui a seqüência-média inserida gene de resistência a canamicina. K. marxianus é transformada com o fragmento usando-se técnicas conhecidas, tal como eletroporação, para interromper o pdc de K. marxianus.

Genericamente, eletroporação é realizada como se segue: a) desenvolver uma cultura do microorganismo em YPAD por toda a noite (~15h) em um volume de 20ml; b) transferir 500ul da cultura para um tubo de microcentrífuga, girar @4K, 4 minutos, descartar sobrenadante; c) lavar a pelota com lml de EB frio (EB = tampão de eletroporação: Tris-HCl lOmM, pH

7,5; Sucrose 270 mM; MgCl2 lmM) ; d) re-suspender emlml de IB

(IB = tampão de incubação : YPD; DTT 25 mM; Hepes 20 mM, pH 8,0); e) agitar @ 800rpm, 30°C por 30 minutos em um Eppendorf Thermomixer; f) diminuir rotação, lavar uma vez com EB, re-suspender em 400ul EB; g) adicionar três microgramas de fragmento de ADN (em água Tris-HCl lOrriM, pH 8,5), incubar sobre gelo 30 minutos; h) transferir para cubeta de eletroporação de 0,4cm. Bio-Rad Gene Pulser settings: 1000V, 1000Ω, 50 μΡ. Constante de tempo após pulso: ~20ms; I) transferir para tubo Morton Closure de 3ml, incubar sem agitação a 3 0°C por 1 hora. Adicionar 400ul de meio YPAD líquido (YPAD: lOg extrato de levedura; 20g peptona; 20g glicose; lOOmg hemi sulfato de adenina. Volume = 1L. Sem ajuste de pH), agitar @ SOOrpm, 30°C por 1 hora em Eppendorf Thermomixer. Adicionar 400ul de YPAD líquido e recuperar 4-6 horas; j) centrifugar em tubo de microcentrífuga @4K, 4 minutos, descartar sobrenadante, re- suspender em 400ul de Sorbitol 1M; k) revestir sobre placas seletivas G418 200ug/ml; e 1) incubar a 30°C por três a cinco dias.

As colonias são selecionadas primeiro através de um segundo patching sobre G418 300ug/ml. 0 ADN genômico é isolado do emplastro de levedura secundário através de preparações genômicas padrões (Sambrook). Estes são então selecionados via PCR para 1) a presença do fragmento canamicina usando-se primers e condições apropriadas (Sambrook) e 2) a ausência da região pdc interrompida usando-se primers apropriados e condições de PCR. Colonias positivas para o marcador de seleção e negativas para a região de interrupção de pdc foram então desenvovlidas e analisadas por HPLC para fisiologia. ADN genômico daquelas linhagens foi ainda analisado por análise de hibridização Southern. EXEMPLO a - Características de______Crescimento—de Células 1. Raim pH/alta Temperatura Culturas de noite inteira de K. marxianus foram inoculadas em 50ml de meio mínimo de levedura de acordo com Kiers et al. (Yeast, 14(5):459-469 (1998)). 100 g/L de glicose foram usados como a fonte de carbono. As culturas de toda a noite foram mantidas a 40 °C, e inoculadas em mio que foi também mantido a 40°C. Adição do inoculante alterou o pH

do meio de 5,5 para 2,5. Durante o experimento, o pH permaneceu 2,5. Concentração de glicose por medida por membrana-YSI, e densidade ótica (OD) foi medida usando-se um espectrofotômetro.

Glicose foi utilizada em 72 horas, indicando que atividade metabólica ocorre sob condições de cultura de baixo pH e alta temperatura durante este período de tempo (Figura 7). Em adição, biomassa diminuiu levemente durante o período de 48 a 72 horas, indicando que catabolismo de célula fora do passo anabolismo (Figura 7). 2. Fontes de Carbono Pentose Culturas de noite inteira de K. marxianus foram inoculadas em três frascos de 50ml contendo meio mínimo de levedura de acordo com Kiers et al. (Yeast, 14 (5):459-469 (1998)). Cada um dos três frascos conteve uma diferente fonte de carbono. 0 primeiro conteve glicose 10 porcento, o segundo conteve D-xilose 10 porcento, e o terceiro conteve L-arabinose 10 porcento. Os frascos foram incubados a 30°C, e as medições OD foram feitas periodicamente.

Apôs 40 horas, o rendimento de biomassa para levedura cultivada com glicose ou xilose foi similar, enquanto o rendimento de biomassa para levedura cultivada com arabinose foi inferior (Figura 8). Comparação do crescimento de levedura cultivada com glicose àquela cultivada com xilose ou arabinose revelou um tempo de retardo inicial em crescimento. A levedura cultivada com arabinose exibiu um tempo de retardo de umas poucas horas, enquanto o tempo de retardo para levedura cultivada com xilose foi muito mais pronunciado (Figura 8) . A presença deste tempo de retardo indica que as células de levedura necessitam de tempo para adaptarem-se às fontes de carbono xilose e arabinose. Presumivelmente, este tempo ê necessário para induzir a síntese de polipeptídeos não normalmente expressos.

3 . Hidrolisato de Fibra de Milho em Baixo t?H

Culturas de noite inteira de K. marxianus foram inoculadas em frascos contendo meio mínimo de levedura de acordo com Kiers et al. (Yeast, 14(5):459-469 (1998)). Cada frasco conteve hidrolisato de fibra de milho 30% como a fonte de carbono. Em resumo, o hidrolisato de fibra de milho foi fabricado através de reação de fibra de milho com ácido sulfúrico 1,2% a 145°C por 25 minutos. Durante a reação, a hemicelulose foi partida nos produtos monoméricos arabinose, xilose e glicose. Devido â alta temperatura durante a reação, alguma arabinose e xilose foram degradadas em furfural, enquanto alguma glicose foi degradada em hidroximetil furfural. Análises HPLC do hidrolisato revelaram a presença de 38,7 gramas /L de glicose, 39,1 g/L de xilose, 20,7 gramas/L arabinose, e 1,6 gramas/L furfural.

Em adição, o hidrolisato teve um pH de 1,51. Antes de cultura de levedura o pH do hidrolisato de fibra de milho foi ajustado para 3,0. Durante o experimento de cultura, medições de OD foram feitas periodicamente.

As células de levedura foram capazes de gerar biomassa quando cultivadas com hidrolisato de fibra de milho (Figura 9) .

4. Várias Condições de pH

Culturas de noite inteira de K. marxianus foram inoculadas em quatro frascos contendo 50ml de meio YPD de levedura (extrato de levedura 10 g/L, caldo de peptona 20 g/L, glicose 20 g/L). Cada frasco teve um pH diferente, que foi ajustado usando-se HCl. Durante o experimento de cultura, a temperatura foi mantida a 30°C, e medições de OD foram feitas periodicamente. Crescimento foi observado dentro de cada frasco (Figura 10). 5. Várias Condições de pH/Ácido Lático Culturas de noite inteira de K. marxianus foram inoculadas em quatro frascos contendo 50ml de meio YPD de levedura (extrato de levedura 10 g/L, caldo de peptona 20 g/L, glicose 20 g/L) assim como 40 g/L ácido lático. A

adição do ácido lático resultou em um pH de 2,8. Assim, o pH dentro de três frascos foi ajustado para o pH indicado usando-se noa. Durante o experimento de cultura, a temperatura foi mantida em 30°C, e medições de OD foram feitas periodicamente. Crescimento foi observado dentro de cada frasco (Figura 11). EXEMPLO__9__ Células Recombinantes Capazes de* Produzir Acrilil-CoA

Um organismo incapaz de utilizar acrilato como uma fonte de carbono (por exemplo, E.coli) é transformado com uma biblioteca de ADN genômico de Clostridium propionicum. A biblioteca genômica de C. propionicum é gerada usando-se o plasrrúdeo pHES de modo que ele expressa fragmentos de lOkbp do genoma de C. propionicum. Os E.coli transformados são revestidos sobre meios de seleção com somente ácido acrílico como uma fonte de carbono. Somente aquelas células que têm a habilidade de assimilar acrilato crescerão. Acrilato é normalmente assimilado através de sua conversão mediada - enzima em lactato. Por sua vez, lactato pode ser convertido em piruvato e utilizado pelas células via o ciclo de Krebs.

Uma vez um E.coli transformado seja selecionado, o plasmídeo ADN da biblioteca genômica é isolado, e o fragmento inserido sequenciado. Uma vez sequenciado, o fragmento é explorado para quadros de leitura abertos para determinar a sequência codificante para enzimas envolvidas na conversão entre lactato e acrilato {por exemplo, lactoil- CoA desidrogenase e CoA transferases).

Os clones isolados contendo a seqüência codificante para estas enzimas são introduzidos nas células de levedura descritas no Exemplo 6, que contêm lactato desidrogenase e carecem de atividade piruvato descarboxilase. Seleção de células de levedura recombinantes que contêm o ácido nucléico introduzido é realizada usando- se G418 (300 g/L). Uma vez isoladas, as células de levedura recombinantes são crescidas aerobicamente sobre glicose, e então comutadas para condições anaeróbicas. 0 caldo é então coletado e ensaiado para acrilato usando-se métodos de HPLC padrões como descrito por Danner et al. (Biotechnological production of acrylic acid from biomass, In: Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 70-72 (1998)) . EXEMPLO 10 - Células Recombinantes Capazes de Produzir Ascorbato Vetores de expressão são engenheirados de modo que os seguintes polipeptídeos são expressos: 2,5-dioxovalerato desidrogenase, 5-desidro-4-desoxi-D-glucarato desidratase, glucarato desidratase, aldeído desidrartase, glucurono- lactona redutase e L-gluonolactona. A seqüência de ácido nucléico codificando estes polipeptídeos é isolada de vários microorganismos. Uma vez engenheirada, os vetores de expressão são transformados em células de leveduras por eletroporação. Uma vez transformadas, as células de levedura são analisadas para determinar se ou não elas produzem L- ascorbato. EXEMPLO 11 - Células Recombinantes Capazes de Produzir D-xilose Vetores de expressão são engenheirados de modo que os seguintes polipeptídeos são expressos: 2-desiro-3-desoxi- D-pentanoato aldolase, xilonato desidratase, xilonolac- tonase, e D-xilose desidrogenase. As sequências de ácido nuclêico codificando estes polipeptídeos são isoladas de Pseudomonas sp. Uma vez engenheirados, os vetores de expressão são transformados em células de levedura por eletroporação. Uma vez transformadas, as células de levedua são analisadas para determinar se ou não elas produzem D- xilose ou outros compostos carbono pentose. EXEMPLO 12 - Células Recombinantes Capazes de Produzir Gitrato Primers PCR são designados baseado na seqüência de ácidos nucléicos de S. cerevisiae aconitase (AC01, GenBank accession number M33131). Estes primers são usados para clonar o ácido nuclêico codificando aconitase de uma espécie Kluyveromyces, Yamadazyma ou Hansenula. Uma vez sequenciada, construções lineares são feitas como descrito no Exemplo 5, e usadas para interromper o ácido nuclêico codificando aconitase dentro de células de levedura. 0 marcador de seleção usado é o antibiótico G418 ao invés de produção de lactato como descrito no Exemplo 5. 0 ácido nuclêico provendo resistência a antibiótico G418 é o gene neomicina / canamicina. Este gene é obtido do vetor PPIC9K (mvitrogen) . e inserido no vetor pHES. Células de levedura são transformadas com fragmentos lineares gerados PCR que são engeheirados para terem extremidades homólogas à AC01 como descrito acima. 0 fragmento linear é designado para codificar o gene de resistência 0418. Somente células que tenham integrado o fragmento linear na localização do ácido nucleíco codificando aconitase são resistentes antibiótico. Aquelas células são analisadas para a apropriada integração usando-se PCR. As células de levedura obtidas através deste método têm um ciclo TCA parcialmente funcional, e assim pode super produzir citrato. 0 citrato e transportado através de membrana mitocondrial e então no caldo. Em adição, estas células de levedura recebem uma molécula de ácido nucléico exógeno que codifica uma enzima tal como ATP-citrato liase de modo que elas podem catalisar a conversão de citrato acumulado em oxalo acetato (ver Exemplo 13). ρτγε-μρτ,Ο 13 - Células Eeoombinantes Capazes de Rvprpssar Citrato Liase no Cytosol Uma célula de levedura positiva crabtree e transformada com o plasmídeo pHES contendo uma sequência de ácidos nucléicos que codifica um polipeptideo tendo atividade ATP-citrato liase. Este ácido nucleíco é isolado de E.coli, Klebsiella pneumoniae (Genbank acessron number X79817), OU outras fontes publicadas. Uma vez transformadas, as células de levedura são analisadas para determinar-se se ou não elas podem utilizar açúcares para produzir grandes quantidades de acumulação de lipídeo. Em adição, as células de levedura são analisadas para determinar se ou não elas exibem atividade ATP-citrato liase como descrito por Holdsworth et al. (J.Gen Microbiol., 134:2907-2915 (1998)).

As células de levedura tendo atividade ATP-citrato liase são capazes e prover acetato citosólico sob condições aeróbicas através de uma rota outra que não a quebra de aldeído a acetato via aldeído desidrogenase. Em adição, quando tal levedura carece de atividade piruvato descarboxilase ou aldeído desidrogenase, elas devem ser capazes de prover acetato para biossíntese via o ciclo de Krebs. EXEMPLO 14 - Células Recombinantes Incapazes____de Utilizar Lactato como Fonte de Carbono Células de levedura são engeheiradas de modo que a atividade de um transportador de ácido carboxílico similar ao polipeptídeo JEN1 de S. cerevisiae é reduzida. Tais células de levedura terão uma reduzida habilidade para transportar lactato, e portanto utilizam lactato menos eficientemente. A atividade do transportador de ácido carboxílico dentro de células de levedura é reduzida por i^Q^ej^-Qpção de locus contendo a seqüencia coditicante para este polipeptídeo. Primeiro, o homologo do polipeptídeo JEN1 é isolado de uma célula hospedeira usando-se primers degenerados designados baseado na sequência disponível para JEN1 (Genbank accession number U24155). Uma vez o ácido nucléico seja isolado da célula hospedeira, ele é sequenciado. Interrupção da seqüência codificante para este polipeptíeo é feita usando-se os procedimentos descritos no Exemplo 11. Fragmentos lineares são gerados codificando regiões homólogas à seqüência JEN1 assim como o inteiro gene de resistência G418. Este fragmento linear é integrado na seqüência genômica de JEN1 causando interrupção da atividade. Células carecendo de atividade de transportador de ácido carboxilico são identificadas por sua incapacidade de transportar ácido carboxilico, e portanto sua incapacidade para crescer quando cultivadas sobre lactato.

Em adição, células são modificadas de modo que a atividade de um equivalente funcional do polipeptíeo b2 de citocroma de S. cerevisiae seja reduzida. 0 polipeptídeo b2 de citocroma permite que células de S. cerevisiae metabolizem lactato dentro da mitocôndria. Primeiro, primers degenerados são designados a partir da seqüência b2 de citocroma de Saccharomyces (Genbank accession number Z46729). Uma vez isolado, o clone é sequenciado. A interrupção do homólogo hospedeiro de levedura de b2 de citocroma é feita usando-se métodos descritos em Methods in Yeast Genetics (Eds. Alison et al., Cold Spring Harbor Press (1997)). Esta célula e levedura recombinante será incapaz de utilizar lactato como uma fonte de carbono. EXEMPLO 15 - Produção em Larga Escala de Lactato Variantes múltiplas de células de K. marxianus tendo reduzida atividade PDC são produzidas e isoladas. Cada variante é engenheirada para conter um número de cópias diferente de uma molécula e ácido nucléico exogeno codificando um polipeptídeo tendo atividade LDH. 0 polipeptídeo LDH é de múltiplas fontes diferentes. Tais células variantes podem ter diferentes produtividades específicas para ácido latico a 40°C.

Cada variante é crescida em um vaso sob condições aeróbicas comum fluxo de ar de 1,5 WH e um teor de oxigênio dissolvido de 30% para atingir uma densidade de célula de cerca de 60g/L, base seca. Uma vez a densidade seja suficiente, o fluxo de ar é desligado, e as condições dentro do vaso são comutadas para condições anaeróbicas. Nenhuma base é adicionada. As variantes com a mais alta produtividade específica durante a fase anaerobica podem ser verificadas não somente produzirem ácido lãtico mais rápido, mas também alcançarem uma maior concentração em um menor pH, que as variantes com menor produtividade especifica.

Rendimento de produto sobre glicose durante a fase de produção excede 90%.

Certas variantes são selecionadas e submetidas aos mesmos métodos de cultura exceto que o fluxo de ar ê reduzido para 0,1 WM, antes que sendo completamente cortado. Sob tais condições, o pH final dentro do vaso pode ser menor, e a concentração de lactato pode ser maior que as condições sem fluxo de ar. Rendimento de produto sobre glicose pode ser reduzido mas pode permanecer em cerca de 90%. Quando o teste é repetido, mas com um fluxo de ar de 0,5 WM, o rendimento de produto sobre glicose pode ser reduzido para menos que 80%. EXEMPLO 16 - Produção em Larga Escala___de__Lactato, TTgantio uma Série de Fermentações em Bateladas Uma cultura de K. marxianus carecendo de atividade PDC e tendo atividade LDH é usada como inoculam em uma série de fermentações em bateladas. Cada fermentação é realizada em vasos progressivamente maiores, cada um dos quais é esterilizado imediatamente antes de uso. Em adição, cada vaso ê provido com um fluxo de ar de 1,5 WM e agitação suficiente para manter um teor de oxigênio dissolvido acima 10%. O vaso final tem um volume de 60 0 0L. Os vasos também são mantidos em uma temperatura de 45°C para aperfeiçoar sobrevivência das células de K. marxianus geneticamente modificadas sobre a levedura tipo selvagem e outros microorganismos. Cada vaso é enchido com meio de cultura padrão para ótimo crescimento. O conteúdo do vaso final, com uma densidade de célula de 100 gramas de células/L, base seca, é transferido para um vaso de produção recentemente vaporizado tendo um volume de 300.000 L. Opcionalmente, células adicionais obtidas da filtração de um prévio método de produção são adicionadas. A densidade de célula no vaso de produção é 6 gramas de células/L, base seca. Glicose é adicionada para um nível de 80 g/L. As condições dentro do vaso são anaeróbicas com a temperatura sendo 42°C por um período de 25 horas. A produtividade específica é maior que 0,5 gramas de lactato/(grama biomassa*hora) até próximo do fim do método, em cujo momento a produtividade começa a cair. Uma vez a produtividade comece a cair, as células são removidas e salvas para reutilização. A concentração final de lactato pode ser 75 g/L com o ph sendo 2,8. Após remoção de biomassa, a solução é concentrada por evaporação para uma concentração de 50% lactato. 0 ácido livre (cerca de 86% de lactato total) é extraído por extração líquida em orgânico e contra-extraído em uma maior temperatura em água. 0 refinado contendo o sal lactato ê tanto limpo e reciclado como um tampão no vaso de crescimento, como acidulado com, por exemplo, ácido sulfúrico e purificado. EXEMPLO 17 - Comparação de Produção Aeróbica de um Organismo Negativo Crabtree (K, marxianus) e um Positivo Crabtree (S. uvarum) Um organismo negativo crabtree (K. marxianus) e um positivo crabtree (S. uvarum) foram cada um crescidos em fermentadores de batelada aeróbica e anaeróbica. Cultivo de batelada foi realizado a 30°C em fermentadores de laboratório com um volume de trabalho de 1,5L. 0 pH foi mantido em 5,0 ± 0,1 através de adição automatizada de 2 mol.L'1 de hidróxido de potássio (KOH) . O fermentador foi lavado com ar (culturas aeróbicas) ou gás nitrogênio (culturas anaeróbicas) em uma taxa de fluxo de 0,8 1.minuto 1 e agitado em 800rpm. A concentração de oxigênio dissolvido foi continuamente monitorada com um eletrodo de oxigênio (Ingold, type 34 100 3002). Nas culturas aeróbicas, a concentração de oxigênio dissolvido foi mantida acima de 60%. Amostras de lOml foram retiradas em intervalos apropriados para determinação de peso seco e concentrações de metabólitos. Tween-80 e ergosterol são adicionados a culturas anaeróbicas para suprirem os compostos requeridos para síntese de ácido graxo.

Durante crescimento exponencial, ambos, o peso seco e OD660 de culturas de levedura, e a concentração de glicose e etanol no sobrenadante foram determinadas em intervalos apropriados. A específica taxa de produção de etanol (^etanoi/ mmol .g"1. h'1) foi calculada através da seguinte equação usando análise de regressão linear: dE/dt (a taxa de aumento da concentração de etanol na cultura; mmol. I”1. h'1) e dCx/dt {a taxa de aumento da concentração de biomassa; g.l^.h'1) foram calculadas usando- se diferenciação de gráficos de concentração de etanol e concentração de biomassa versus tempo. jXmaxth"1) · A taxa de crescimento específico máxima sobre glicose foi estimada a partir da parte exponencial de um gráfico de Cx versus tempo. Para calcular a taxa de consumo de glicose específica (^glicose, mmol. g'1. h'1) , dE foi substituído por dG (quantidade de glicose consumida por hora).

Nas culturas de batelada aeróbica, as linhagens Kluyveromyces e Saccharomyces exibiram uma taxa de crescimento específico máxima sobre glicose de 0,4 h'1 e 0,28 h'1, respectivamente. A alta concentração de glicose e a resultante alta taxa de crescimento específico da cultura de Saccharomyes resultou em altas taxas de fermentação alcoólica aeróbica (Tabela 3, Fig. 1). A taxa específica de consumo de glicose foi cerca de 2-vezes maior na linhagem Saccharomyces comparada à linhagem Kluyveromyces devido â vigorosa fermentação alcoólica. A partir do ponto de vista energético, fermentação alcoólica é um caminho menos eficiente para a célula gerar ATP. 0 rendimento de biomassa sobre glicose foi 0,38 g/g para Kluyveromyces e 0,14 g/g para a Saccharomyces uvarum. 0 rendimento de etanol sobre glicose foi zero para a linhagem Kluyveromyces de fenótipo negativo crabtree e 1,83 mmoles/mmoles para a cultura de fenótipo positivo- crabtree, de Saccharomyces. TABELA 3 - Taxa de crescimento específico máxima,, taxas específicas (cr, mmol Γα biomassal h"1) de produção de etanol e consumo de glicose, o rendimento de biomassa (g/g), rendimento de produto (mmol/mmol) . e recuperação de carbono (em %: somente calculada para culturas anaeróbicas) durante crescimento exponencial em culturas de batelas __de Saccharomyces uvarum e KluYveromyces marxianus sobre meio mineral contendo 2% (peso/volume) glicose^ Em culturas de batelada anaeróbica, a taxa de crescimento específico e rendimento de biomassa para ambas linhagens foi muito baixo comparado àquele encontrado sob condições aeróbicas (Tabela 3, Figs. 1 e 2). Para as linhagens Kluyveromyces e Saccharomyces, o rendimento de biomassa foi 0,07 e 0,09 g/g, respectivamente. Ambas as linhagens desempenham igualmente bem com relação a específica taxa de fermentação alcoólica sob condições anaeróbicas. Isto foi confirmado usando-se dados de produção de C02.

Genericamente, este exemplo demonstra que produção aeróbica de biomassa é muito mais rápida que anaeróbica, e que rendimento de biomassa sob condições aeróbicas é maior para organismos negativos crabtree (porque, em organismos positivos crabtree, alguma fermentação alcoólica ocorre, usando glicose). Este exemplo também demonstra que o produto de fermentação (etanol, neste caso) é produzido na mesma taxa para ambos organismos positivos e negativos crabtree sob condições anaeróbicas. Assim, um estágio de crescimento aeróbico provê o alto rendimento de biomassa, e um subsequente estágio de fermentação anaeróbico canaliza energia metabólica em formação de produto (antes que mais crescimento). No total, um método no qual produção é separada de crescimento provê maior flexibilidade e método e melhor controle sobre o rendimento de método total. EXEMPLO 18: Aperfeiçoada Produção de Lactato em uma Linhagem Hospedeira que Produz Naturalmente Ácido L- lático: Amplificação de Fragmentos Lineares de ADN Homólogo para Interrupções de Gene de Piruvato Descarboxilase A levedura Kluyveromyces thermotolerans (K. thermotolerans) é um produtor natural de ácido L-lãtico (Kurtzman and Fell, (1998) "The Yeasts, A Taxonomic Study" pp. 240-241; Elsevier Science B.V.; Amsterdam, The Netherlands). K. thermotolerans tem um gene lactato desidrogenase (ldh) ocorrendo naturalmente que permite a produção de ácido L-lático. A quantidade de ácido lático produzida sob condições anaeróbicas é aproximadamente 4% g/g de glicose utilizada, enquanto o restante da glicose é essencialmente convertido em etanol (42,5% g/g glicose consumida), glicerol (3% g/g de glicose consumida) e acetato (0,3% g/g de glicose consumida). TABELA 4. Resultados de fermentação anaeróbica usando K. thermotolerans partindo com lOOg/1 de glicose_____em meios YPAD (meios ricos) Uma região de 60 0bp do PDC1 foi isolada de K. thermotolerans usando primers consenso construídos de uma seqüência derivada por comparação de seqüência de gene PDC1 de K. marxianus e K. lactis. O fragmento de PDC1 foi então sequenciado (Sanger) e usado para isolar um fragmento de 7,5 kbp circundando o pdcl de K. thermotolerans (Figura 6e) usando-se PCR e técnicas de caminhada de genoma (Clonetch). 0 fragmento de 7,5 kbp foi então clonado no vetor de clonagem pCRII TA (Xnvitrogen). Uma porção de aproximadamente 730bp próxima do meio da região codificante de PDC1 foi removida do fragmento de 7,5 kbp de K. thermotolerans. A porção de pdcl de K. thermotolerans removida por digestões de restrição (Sambrook) conteve a seguinte seqüência: TTACCACTGTCTTCGGTCTGCCAGGTGACTTCAATCTGCGTCTGTTGGAC

GAGATCTACGAGGTCGAGGGTATGAGATGGGCCGGTAACTGTAACGAGT

TGAACGCTTCTTACGCTGCCGACGCTTACGCCAGAATCAAGGGTATGTCC

TGTTTGATCACCACCTTCGGTGTCGGTGAGTTGTCCGCTTTGAACGGTAT

CGCCGGTTCTTACGCTGAGCACGTCGGTGTCTTGCACATTGTCGGTGTCC

CATCCGTCTCCGCCCAGGCCAAGCAGCTATTGTTGCACCACACCTTGGGT

AACGGTGACTTCACTGTCTTCCACAGAATGTCCGCCAACATCTCTGAGAC

CACTGCTATGATCACTGATCTAGCTACCGCCCCATCTGAGATCGACAGAT

GTATCAGAACCACCTACATTAGACAGAGACCTGTCTACTTGGGTTTGCCA

TCTAACTTCGTTGACCAGATGGTCCCAGCCTCTCTATTGGACACCCCAAT

TGACTTGGCCTTGAAGCCAAACGACCAGCAGGCTGAGGAGGAGGTCATC

TCTACTTTGTTGGAGATGATCAAGGACGCTAAGAACCCAGTCATCTTGGC

TGACGCTTGCGCTTCCAGACACGATGTCAAGGCTGAGACCAAGAAGTTG

ATTGACATCACTCAGTTCCCATCTTTCGTTACCCCAATGGGTAAGGGTTC

CATTGACGAGAAGCACCCAAGATTCGGTGGTGTCTACGTCGGTACCTTGT (Seqüência ID No. XX) . Um gene codificando resistência a canamicina, incluindo seu promotor, foi então isolado de vetor pPIc9K (Invitrogen) por digestões de restrição (sambrook), e clonado no sítio no 7,5 kbp a partir do qual o fragmento de 730bp foi removido. A seqüência do gene de resistência a canamicina e seu promotor de pPIC9K (Invitrogen) foi como se segue: GTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAA

CGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAAC

TTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCC

TACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGT

AGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAG

AAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATC

CTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCT

GAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAAT

CGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCT

TTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGA

ACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAA

AAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGC

TCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCG

AGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATA

TTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAG

TTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCC

AACATCAAT AC AACCTATT AATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAA

GTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAG

CTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGT

CATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCC

TGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAG

GAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT

TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGG

GGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATG

CTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCA

TCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAAC

AACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGA

TTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCA

TGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGG

CTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTT

CATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGA

CACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCA

CAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGA

TCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGG

TGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATG (Seqüência ID No.9). As construções resultantes incluem o gene de resistência a canamicina (G418) circundado por região PDC de aproximadamente 6,8 kbp como mostrado na figura 6f. A construção mostrada na figura 6f é digerida com duas enzimas de restrição (Sambrrok) para render aproximadamente 3 microgramas de fragmento de ADN contendo a região PDC homóloga e o gene de resistência a canamicina inserido seqüência-média. K. thermotolerans é transformado com o fragmento usando-se técnicas de transformação conhecidas, tal como eletroporação para interromper PDC de K. thermotolerans. 0 método de eletroporação é como se segue: a) crescer cultura em YPAD por toda a noite (~15h) em um volume de 20ml; b) transferir 500ul de cultura para um tubo de microcentrífuga, girar @4K, 4 minutos, descartar sobrenadante; c) lavar com lml de EB frio (EB = tampão de eletroporação: Tris-HCl lOmM, pH 7,5; sucrose 270mM; MgCl2 lmM); d) re-suspender em lmlde IB (IB = tampão de incubação: YPD; DTT 25mM; Hepes 20 mM, pH 8,0) ; e) agitar @ 800rpm, 30°C por 30 minutos em um Eppendorf Thermomixer; f) centrifugar, lavar uma vez com EB, re-suspender em 400ul EB; g) adicionar três microgramas de fragmentos de ADN (em água Tris-HCl lOiriM,. PH 8,5), incubar sobre gelo 30 minutos; h) transferir para cubeta de eletroporação de 0,4cm. Bio-Rad Gene Pulser settings: 1000V, 1000Ω, 50 μΡ. Constante de tempo apôs pulso: ~20ms; I) transferir para tubo Morton Closure de 3ml, incubar sem agitação a 30°C por 1 hora; j) adicionar 400ul de meios YPAD líquidos (YPAD: extrato de levedura lOg; peptona 20g; glicose 20g; hemi-sulfato de adenina lOOmg. Volume = 1L. Nenhum ajuste de pH),agitar @ SOOrpm, 3 0°C por 1 hora em Eppendorf Thermomixer; k)adicionar 400ul de YPAD líquido e recuperar 4-6 horas; 1) centrifugar em tubo de microcentrífuga @4K, 4 minutos, descartar sobrenadante, re-suspender em 400ul de sorbitol 1M e revestir sobre placas seletivas G418 lOOug/ml; e m) incubar a 30°C por três a cinco dias.

Colonias são selecionadas primeiro por um segundo emplastro sobre uma placa de cultura contendo 200 ug/ml de G418. O ADN genômico é isolado do emplastro de levedura secundário usando-se preparações genômicas padrões (Sambrook). 0 genômico isolado é então selecionado via PCR para 1) a presença do fragmento canamicina usando-se primers e condições apropriados (Sambrook); e 2) a ausência da região PDC interrompida usando-se primers de condições de PCR apropriadas. Colonias positivas para o marcador de seleção e negativas para a região de interrupção de PDC são então crescidas para ainda estudo, por exemplo, ADN genômico destas linhagens é ainda analisado por análise de hibridização Southern.

OUTRAS REALIZAÇÕES É para ser entendido que embora a invenção tenha sido descrito em conjunção com a sua descrição detalhada, a descrição anterior é pretendida para ilustrar e não listar o escopo da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações apostas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações que se seguem.

Claims

1. Processo para fabricação de lactato, o dito processo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a) fornecimento de levedura geneticamente modificada tendo um fenótipo crabtree-negativo; b) cultura de levedura geneticamente modificada em um primeiro meio de cultura que inclui uma fonte de carbono e possui um teor de oxigênio dissolvido menor que 2,0 por cento, em que não mais que 0,3 gramas de biomassa são produzidas por grama de fonte de carbono consumido; e c) cultura de levedura geneticamente modificada em um segundo meio de cultura que inclui uma fonte de carbono e possui um teor de oxigênio dissolvido menor que 2,0 por cento, em que não mais que 0,3 gramas de biomassa são produzidas por grama de fonte de carbono consumido.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a levedura geneticamente modificada tem uma atividade reduzida de piruvato descarboxilase ou atividade reduzida da álcool desidrogenase.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a levedura geneticamente modificada possui uma molécula de ácido nucléico exógena que codifica um peptideo tendo atividade lactato desidrogenase.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa c) é realizada a uma temperatura de 30 a 40°C.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que na etapa c), o teor de oxigênio dissolvido é menor que 1,0%.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a levedura é do gênero Kluyveromyces.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO por adicionalmente compreender: d) cultura da levedura geneticamente modificada sob um terceiro conjunto de condições de cultura que compreende um meio de cultura que inclui oxigênio.