KR101533290B1

KR101533290B1 - Ｄ―갈락토네이트 고생산 대장균 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101533290B1
Application number: KR1020150026017A
Authority: KR
Inventors: 정욱진; 류 훠메이; 라모스 크리스틴; 발데후에사 크리스; 쑨 유엔장; 이성풍; 박시재
Original assignee: 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2015-02-24
Filing date: 2015-02-24
Publication date: 2015-07-02
Also published as: KR20150029662A

Abstract

본 발명은 D-갈락토네이트 고생산 재조합 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대사공학을 이용하여 E. coli 균주에서 P. syringae 유래 GalDH를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질도입시켜 상기 GalDH를 발현시키고, 숙주 균주 내에서 D-갈락토오스 및 D-갈락토네이트 대사 경로에 관여하는 갈락토키나아제 및 2-데히드로-3-데옥시-갈락토네이트 키나아제를 각각 암호화하는 유전자들을 유전자 파괴시켜 생산된 D-갈락토오스 및 D-갈락토네이트의 소비를 감소시켜, D-갈락토오스로부터 D-갈락토네이트를 대량으로 생산하는 재조합 E. coli 균주를 제조함으로써, 식품 및 화장품 원료로 사용되고 있는 D-갈락토네이트의 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｄ―갈락토네이트 고생산 대장균 균주 및 이의 용도{ESCHERICHIA COLI FOR HIGH PRODUCTION OF D―GALACTONATE AND USE THEREOF}

본 발명은 대사 공학(metabolic engineering)에 의해 제조된 D-갈락토네이트(D-galactonate)를 대량 생산하는 재조합 균주, 상기 균주의 제조 방법, 및 상기 균주를 이용하여 D-갈락토오스(D-galactose)로부터 D-갈락토네이트를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

D-갈락토오스(D-galactose)는 자연에서 발견된 많은 탄수화물 중 하나이고, 특히 거대 홍조류에 25 ~ 35% 건조 중량으로 존재한다(특허문헌 1). 이것은 생물학적 및/또는 화학적 방법을 통해 다양한 바이오연료 및 플랫폼 화학물질의 생산에 활용되어 진다. 최근 보고서는 폴리머 합성, 제약 및 기타 석유 유사 화학물질의 유용한 전구체 화합물인 푸르푸랄(furfural) 내로 D-갈락토오스의 화학적 전환을 강조한 바 있다.

D-갈락토오스 유도체인 D-갈락토네이트(D-galactonate)는 폴리에스테르 전구체, 식품첨가물, 약학적 중간체 및 화장품 원료로 사용되는 가치있는 유기산이다(특허문헌 2). D-갈락토네이트는 일반적으로 산소의 존재 하에서 pH 8-10 내에서 60℃로 알루미나(alumina) 담지된 금촉매를 거쳐서 D-갈락토오스의 대기의 산화를 통해 화학적으로 생산된다(도 1의 A). 이런 반응은 4시간 내에 완료되지만 상기 반응의 pH 감도가 종종 락톤 중간체 축적을 야기하는 촉매 활성을 감소시킨다.

한편, D-갈락토오스로부터 D-갈락토네이트의 생물학적 전환은 지금까지도 여전히 완전하게 탐구되지 않았다. 일부 미생물들이 D-갈락토오스를 D-갈락토네이트로 전환할 수 있음에도 불구하고, 이런 미생물들에 대한 유전적 정보의 부족 및 이용가능한 제한적인 유전적 툴(tool)이 D-갈락토네이트 생산에 대한 추가적인 대사 공학을 지연시켰다. D-갈락토오스가 대사 작용될 수 있는 여러 루트가 있다. 대장균(Escherichia coli) 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)과 같은 미생물들은 레르와르 경로(Leloir pathway)를 통해 D-갈락토오스를 본질적으로 대사 작용을 할 수 있다. 상기 경로는 처음 D-갈락토오스 인산화와 관련되고, 뒤이어 유리딜리디포스페이트 글루코즈(uridylyldiphosphate-glucose; UDP-glucose) 유래 유리딜리모노포스페이트(uridylylmonophosphate; UMP)를 갈락토오스-1-포스페이트(galactose-1-phosphate)로의 전환이 관련된다. 마지막으로, 분비된 글루코즈-1-포스페이트(glucose-1-phosphate)는 중앙의 해당경로로 들어간다(도 1의 B). D-갈락토네이트는 레르와르 경로로부터 생산된다. 또다른 D-갈락토오스 대사는 아조토박터 비넬란디이이(Azotobacter vinelandii), 카울로박터 크레센투스(CauLobacter crescentus) 및 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)에서 발견되는 디레이-도우돌오프 경로(DeLey-Doudoroff pathway)이다. 이런 경로에 있어서, D-갈락토오스에서 D-갈락토네이트로의 초기 환원은 갈락토오스 탈수소효소(galactose dehydrogenase enzyme; GalDH)에 의해 촉진되고, 그런 다음 2-케토-3-데옥시-갈락토네이트(2-keto-3-deoxy-D-galactonate)를 형성하도록 D-갈락토네이트 탈수가 잇따르고, 그런 다음 피루빈산염(pyruvate) 및 글리세르알데하이드 포스페이트(glyceraldehyde phosphate)를 분비하기 위해 절단되기 전에 인산화된다(도 1의 B). 그러므로, D-갈락토네이트는 디레이-도우돌오프 경로로부터 생산될 수 있다.

이와 같이, D-갈락토네이트 생산을 위한 적절한 생물학적 접근의 부족에 따라, D-갈락토네이트를 대량으로 생산할 수 있는 방법이 요구된다.

이에, 본 발명자들은 최소 배지로부터 D-갈락토네이트를 생산할 수 있는 대사 작용이 조작된 E. coli를 제작하였다(도 1의 B).

구체적으로, 본 발명자들은 E. coli는 그것의 잘 확립된 대사 배경, 실현 가능한 유전적 툴, 단순 배지에서의 빠른 성장률 및 D-갈락토오스를 포함하는 넓은 범위의 탄소원을 대사 작용하는 능력 때문에 숙주생물로 선별하였다. 그런 다음, 슈도모나스 시린가에(Pseudomona ssyringae)로부터 유래된 GalDH를 암호화하는 gld 유전자를 상기 E. coli 내로 도입하였고, 상기 E. coli는 D-갈락토오스 및 D-갈락토네이트 이화 경로(catabolic pathway)에 대한 관련된 천연의 galK 및 dgoK 유전자 둘 모두를 세포성장을 위한 그들의 소비를 방지하기 위해 블락시켜 대사경로를 조작하였다. 본 발명에 따라 제조된 재조합 균주의 D-갈락토네이트 생산성을 혼합된 탄소원을 포함하는 M9 최소 배지에서 확인한 결과, 발효 브루스로부터 D-갈락토네이트 생산을 현저히 증가시켰음을 확인하였다.

US 2010/0124774 A1 US 5650436 B

본 발명의 목적은 대사공학을 이용하여 D-갈락토네이트를 효율적으로 생산할 수 있는 재조합 균주를 제작하고자, 1) 야생형 E. coli 균주는 D-갈락토오스를 D-갈로토네이트로 전환할 수 있는 천연의 효소를 포함하지 않기 때문에, 슈도모나스 시린가에(Pseudomona ssyringae; P. syringae) 유래 갈락토오스 탈수소효소(galactose dehydrogenase; GalDH)를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질도입시켜 상기 GalDH를 발현할 수 있게 하고, 또한 2) 야생형 E. coli 균주는 레르와르 경로(Leloir pathway) 및 디레이-도우돌오프 경로(DeLey-Doudoroff pathway)를 통하여 세포 성장을 위해 D-갈락토오스 및 D-갈락토네이트 둘 모두를 이용할 수 있으므로 두 대사 경로가 기질 경쟁 및 생산물 소비를 통하여 D-갈락토네이트를 감소시키는 것을 막기 위해, D-갈락토오스 및 D-갈락토네이트 대사 경로에 관여하는 갈락토키나아제 및 2-데히드로-3-데옥시-갈락토네이트 키나아제를 각각 암호화하는 유전자들을 유전자 파괴시켜 D-갈락토오스 및 D-갈락토네이트의 소비를 줄임으로써, 야생형에 비해 D-갈락토네이트를 현저히 대량으로 생산할 수 있는 재조합 E. coli를 개발함으로써, 상기 재조합 균주, 대사공학을 이용한 상기 균주의 제조 방법, 및 상기 균주를 배양하여 D-갈락토네이트를 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장균(Escherichia coli; E. coli)에 슈도모나스 시린가에(Pseudomona ssyringae; P. syringae) 유래 갈락토오스 탈수소효소(galactose dehydrogenase; GalDH)를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질도입시켜 제조된, D-갈락토네이트(D-galactonate) 고생산 대장균 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 갈락토키나아제(galactokinase)를 암호화하는 galK 유전자가 녹아웃(knock out)된 대장균에 슈도모나스 시린가에 유래 갈락토오스 탈수소효소를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질도입시켜 제조된, D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 갈락토키나아제를 암호화하는 galK 유전자 및 2-데히드로-3-데옥시-갈락토네이트 키나아제(2-dehydro-3-deoxy-galactonate kinase)를 암호화하는 dogK 유전자가 녹아웃된 대장균에 슈도모나스 시린가에 유래 갈락토오스 탈수소효소를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질도입시켜 제조된, D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 슈도모나스 시린가에 유래 갈락토오스 탈수소효소를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 발현벡터를 대장균에 형질도입하는 단계를 포함하는, D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 슈도모나스 시린가에 유래 갈락토오스 탈수소효소를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 대장균에서 갈락토키나아제를 암호화하는 galK 유전자를 녹아웃(knock out)시키는 단계; 및

3) 상기 단계 1)의 발현벡터를 상기 단계 2)의 대장균에 형질도입하는 단계를 포함하는, D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

2) 대장균에서 갈락토키나아제를 암호화하는 galK 유전자 및 2-데히드로-3-데옥시-갈락토네이트 키나아제를 암호화하는 dogK 유전자를 녹아웃시키는 단계; 및

또한, 본 발명은

1) 상기 대장균에 슈도모나스 시린가에 유래 갈락토오스 탈수소효소를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질도입시켜 제조된 재조합 대장균 균주를 배양하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)에서 배양된 배양액에서 D-갈락토네이트를 회수하는 단계를 포함하는, D-갈락토네이트의 대량 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 갈락토키나아제를 암호화하는 galK 유전자가 녹아웃된 대장균에 슈도모나스 시린가에 유래 갈락토오스 탈수소효소를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질도입시켜 제조된 재조합 대장균 균주를 배양하는 단계; 및

아울러, 본 발명은

1) 갈락토키나아제를 암호화하는 galK 유전자 및 2-데히드로-3-데옥시-갈락토네이트 키나아제를 암호화하는 dogK 유전자가 녹아웃된 대장균에 슈도모나스 시린가에 유래 갈락토오스 탈수소효소를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질도입시켜 제조된 재조합 대장균 균주를 배양하는 단계; 및

본 발명에서는 P. syringae로부터 D-갈락토오스 탈수소화효소 유전자를 클론시켜 이런 유전자를 E. coli 균주에서 발현시킴으로써, D-갈락토네이트 생산 균주를 제조하였다. 또한, D-갈락토네이트 생산을 최대화하기 위해, 숙주 E. coli 균주에서 천연의 D-갈락토오스 및 D-갈락토네이트 대사경로 모두를 블락시켰다. 이렇게 제조된 재조합 균주에 대해 실험실 규모의 비연속 발효(Lab-scale batch fermentation)를 수행한 결과, 20 g L^-1 D-갈락토오스로부터 17.6 g L^-1의 D-갈락토네이트를 생산하고(즉, 88% 수율) 평균 생산성이 0.24 g L^-1 h^- ¹를 가지는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 재조합 균주를 이용하여 D-갈락토오스로부터 D-갈락토네이트를 산업적으로 대량 생산할 수 있다.

도 1은 화학적 방법(A) 및 대사 조작 E. coli(B)에 의한 D-갈락토네이트 생산 과정을 보여주는 그림이다:
여기서, galK은 갈락토키나아제(galactokinase)를 암호화하는 유전자이고;
galT는 UDP-글루코즈:α-D-갈락토오스-1-포스페이트 유리딜일트랜스퍼라아제(UDT-glucose:α-D-galactose-1-phosphate uridylyltransferase)를 암호화하는 유전자이며;
dgoD는 D-갈락토네이트 데히드라타아제(D-galactonate dehydratase)를 암호화하는 유전자이고;
dgoK는 2-데히드로-3-데옥시갈락토네이트 키나아제(2-dehydro-3-deoxygalactonate kinase)를 암호화하는 유전자이며;
dgoA는 2-데히드로-3-데옥시갈락토네이트-6-포스페이트 알도라아제(2-dehydro-3-deoxygalactonate-6-phosphate aldolase)를 암호화하는 유전자이고;
gld는 D-갈락토오스 데하이드로게나아제(D-galactose dehydrogenase)를 암호화하는 유전자이며;
X는 상기 유전자가 파괴된 것을 나타내고;
점선은 상기 유전자가 도입된 것을 나타낸다.
도 2는 pH에 따른 GalDH의 활성을 보여주는 그래프이다.
도 3은 탄소원으로 D-갈락토오스 또는 D-갈락토네이트를 포함하는 고체 배지에서 E. coli BW25113 야생형, 및 galK 및/또는 dgoK 유전자가 파괴된 균주의 성장을 보여주는 그림이다.
도 4는 진탕 플라스크 배양 동안 EWG1, EWG2 및 EWG3의 바이오매스, 글루코즈, D-갈락토오스 및 D-갈락토네이트의 농도를 보여주는 그래프이다.
도 5는 5L 반응기에서 비연속 발효 동안 EWG3의 D-갈락토오스 및 D-갈락토네이트 농도를 보여주는 그래프이다.
도 6은 5L 반응기에서 비연속 발효 동안 EWG3의 성장, 글루코즈 및 아세트산 농도를 보여주는 그래프이다.
도 7은 NMR 분석을 통해 비연속 발효로부터 회수된 D-갈락토네이트 생산물을 동정한 확인을 보여주는 그래프이다:
(a) 13C-NMR: C1, 179.88 ppm; C2, 71.62 ppm; C3, 70.29 ppm; C4, 69.94 ppm; C5, 71.98 ppm; C6, 63.52 ppm. (b) 1H-NMR: σ 4.22 (d, 1H, J 1.5, H2), σ3.89 (m, 2H, J 1.5, J5.5, J 9.5, H3, H4), σ 3.61 (dd, 2H, J 1.5, J 5.5, H6), σ 3.57 (dd, 1H, J 1.5, J 9.5, H5).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 대장균(Escherichia coli; E. coli)에 슈도모나스 시린가에(Pseudomona ssyringae; P. syringae) 유래 갈락토오스 탈수소효소(galactose dehydrogenase; GalDH)를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질도입시켜 제조된, D-갈락토네이트(D-galactonate) 고생산 대장균 균주를 제공한다.

상기 gld 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되고, 상기 galK 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성되며, 상기 dogK 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 것이 바람직하며, 상기 유전자는 상기 염기서열에 한정되지 않으며, 상기 서열에서 하나 또는 소수의 염기가 첨가, 결실 또는 치환된 서열로서 동일한 기능을 나타내는 염기서열을 가질 수 있다.

상기 대장균은 E. coli BL21(DE3)인 것이 바람직하나 상기 종에 한정되지 않으며 당업계에 알려진 대장균 종은 모두 사용가능하다.

상기 발현벡터는 pET28a 발현벡터인 것이 바람직하나 상기 벡터의 종류는 이에 한정되지 않으며 당업계에 일반적으로 사용되는 발현벡터는 모두 사용가능하다.

본 발명에서는 야생형 E. coli 균주가 D-갈락토오스를 D-갈로토네이트로 전환할 수 있는 천연의 효소를 포함하지 않으나, 레르와르 경로(Leloir pathway) 및 디레이-도우돌오프 경로(DeLey-Doudoroff pathway)를 통하여 세포 성장을 위해 D-갈락토오스 및 D-갈락토네이트 둘 모두를 이용할 수 있는 점(도 1의 B 및 도 3)을 고려하여, 대사공학을 이용하여 대사경로를 조작하였다.

우선, 본 발명자들은 야생형 E. coli 균주는 D-갈락토오스를 D-갈로토네이트로 전환할 수 있는 천연의 효소를 포함하지 않기 때문에, 슈도모나스 시린가에 유래 갈락토오스 탈수소효소(GalDH)를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질도입시켜 상기 GalDH를 발현할 수 있는 재조합 E. coli 균주를 제조하였다. 상기 균주를 진탕 플라스크 배양한 후, D-갈락토네이트 생산량을 분석한 결과, EWG1는 0.17 g L^-1 D-갈락토네이트를 생산하였고 8.3%의 동등한 수율을 나타내었다

또한, 본 발명자들은 D-갈락토오스에서 D-갈락토네이트로의 전환을 선호하고 최대화하는 것으로 합리적으로 조작하기 위해, 야생형 E. coli 균주는 2개의 다른 대사 경로를 통해 기질 경쟁 및 생산물 소비를 통하여 D-갈락토네이트를 감소시키는 것을 고려하여, 천연의 D-갈락토오스 대사 경로를 통하여 D-갈락토오스 소비를 방지하도록 D-갈락토오스 대사의 첫번째 단계를 촉진시키는 갈락토키나아제를 암호화하는 유전자 galK를 파괴시킨 다음, 슈도모나스 시린가에 유래 갈락토오스 탈수소효소(GalDH)를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질도입시켜 상기 GalDH를 발현할 수 있는 재조합 E. coli 균주를 제조하였다. 상기 균주를 진탕 플라스크 배양한 후, D-갈락토네이트 생산량을 분석한 결과, 0.44 g L^-1 D-갈락토네이트를 생산하였고 22.0%의 수율을 나타내었다.

또한, 본 발명자들은 D-갈락토네이트 대사 경로를 막기 위한 대체적인 접근으로서 D-갈락토네이트 대사의 두 번째 단계를 촉진시키는 2-데히드로-3-데옥시-갈락토네이트 키나아제를 암호화하는 유전자 dgoK를 파괴시킨 다음, 슈도모나스 시린가에 유래 갈락토오스 탈수소효소(GalDH)를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질도입시켜 상기 GalDH를 발현할 수 있는 재조합 E. coli 균주를 제조하였다. 상기 균주를 진탕 플라스크 배양한 후, D-갈락토네이트 생산량을 분석한 결과, 1.24 g L^-1 D-갈락토네이트를 생산하였으며, 62.0%의 동등한 수율을 나타내었다.

또한, 본 발명은

상기 방법들에 있어서, 대장균은 E. coli BL21(DE3)인 것이 바람직하나 상기 종에 한정되지 않으며 당업계에 알려진 대장균 종은 모두 사용가능하다.

상기 방법들에 있어서, 발현벡터는 pET28a 발현벡터인 것이 바람직하나 상기 벡터의 종류는 이에 한정되지 않으며 당업계에 일반적으로 사용되는 발현벡터는 모두 사용가능하다.

상기 방법들에 있어서, 유전자 녹아웃은 유전자 파괴 카세트(gene disruption cassette)를 이용하여 유전자를 파괴시키는 것으로 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 당업계에 사용되고 있는 유전자 녹아웃 방법은 모두 사용가능하다.

상기 방법들에 있어서, 유전자의 삽입은 전기 천공법(electroporation)을 이용하여 수행하는 것이 바람직하나 상기 방법에 한정되지 않으며, 당업계에 사용되고 있는 형질전환 방법은 모두 사용가능하다.

또한, 본 발명은

아울러, 본 발명은

상기 방법들에 있어서, 배양은 탄소원 및 D-갈락토오스(D-galactose)를 포함하는 최소 배지인 것이 바람직하나 상기 배지의 종류는 특별히 한정되지 않는다.

상기 방법들에 있어서, 배양은 배지가 pH 7 내지 8로 유지시키는 것이 바람직하고, pH 7.5로 유지시키는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법들에 있어서, 배양은 36시간 이상 배양시키는 것이 바람직하고, 36 내지 72시간 동안 배양시키는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법들에 있어서, 상기 D-갈락토네이트의 회수는 세포를 제거하고 침전시켜 회수할 수 있으며, 회수된 D-갈락토네이트는 추가적으로 정제시킬 수 있다.

이하, 본 발명은 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 슈도모나스 시린가에 유래 D-갈락토오스 탈수소효소가 발현되는 재조합 대장균의 제조

<1-1> 균주의 준비

슈도모나스 시린가에(Pseudomona ssyringae; P. syringae)는 미생물자원센터(Korean Collection for Type CuLture; KCTC)에서 구입하였고, E. coli BL21(DE3)는 인비트로겐(Invitrogen)(USA) 사로부터 구입하였다. E. coli BW25113 야생형은 내셔널 바이오리소스 프로젝트(National BioResource Project; NIG)(Japan)로부터 획득하였다.

<1-2> 유전자의 클로닝 및 형질도입

슈도모나스 시린가에로부터 갈락토오스 탈수소효소(galactose dehydrogenase; GalDH)를 암호화하는 유전자 gld(GeneBank 등록번호: YP_237399)(서열번호: 1)를 클로닝하였다.

그런 다음, 상기 gld를 E. coli 발현벡터 pET28a 내로 연결시켜 pET28a-gld 플라스미드를 제조하였다. 구체적으로, E. coli 숙주에서 T7 프로모터의 조절 하에 gld를 위치하기 위해, 69734 λDE3 용원화 키트(Lysogenization Kit)(Novagen, EMD Millipore, USA)를 E. coli 염색체 내로 λDE3 프로파아지를 삽입하는데 사용하였다. 용원(lysogen)은 Novagen 유저 프로토콜 TB031에 따라 T7 테스터 파아지를 이용하여 확인하였다. gld는 주형으로 슈도모나스 시린가에 게놈 DNA를 이용하여 증폭시켰다. 상기 증폭된 서열을 NdeI 및 BamHI로 절단시킨 다음, E. coli 발현벡터 pET28a 내로 연결시켰다. 최종 컨스트럭트는 'pET28a-gld'로 명명하였다.

그런 다음, 상기 pET28a-gld 플라스미드를 gld의 발현을 위해 전기천공(electroporation)을 이용하여 E. coli BL21(DE3) 내로 형질도입하여 'E. coli BL21 (DE3)/pET28a-gld'를 제조하였다. 이하, 본 발명의 실험예에서는 'E. coli BL21 (DE3)/pET28a-gld' 균주를 EWG1으로 나타내었다(표 1).

< 실시예 2> 대장균내 갈락토키나아제 ( galactokinase ) 유전자가 파괴되고, 슈도모나스 시린가에 유래 D-갈락토오스 탈수소효소가 발현되는 재조합 대장균의 제조

D-갈락토오스 대사의 첫번째 단계를 촉진시키는 갈락토키나아제(galactokinase)를 암호화하는 유전자 galK(서열번호: 2)를 E. coli BW25113에서 파괴시킨 균주(△galK 균주)를 내셔널 바이오리소스 프로젝트(National BioResource Project; NIG)(Japan)로부터 획득하였다.

그런 다음, 상기 △galK(E. coli BW25113 △galK::kan^r) 균주 내로 pET28a-gld를 형질도입하여 'E. coli BW25113 △galK (DE3)/pET28a-gld' 균주를 제조하였다. 이하, 본 발명의 실험예에서는 'E. coli BW25113 △galK (DE3)/pET28a-gld' 균주를 EWG2로 나타내었다(표 1).

< 비교예 1> 대장균내 갈락토키나아제 유전자 및 D- 갈락토네이트 데히드라타아제(D-galactonate dehydratase ) 유전자가 파괴된 재조합 대장균의 제조

상기 △galK 균주에서 D-갈락토네이트 대사의 첫 번째 단계를 촉진시키는 D-갈락토네이트 데히드라타아제(D-galactonate dehydratase)를 암호화하는 유전자 dgoD(서열번호: 3)를 파괴시킨 균주(△galK△dgoD)를 제조하였다.

구체적으로, 유전자 파괴 및 제거 실험은 OPENWETWARE의 상세한 프로토콜에 따라 수행하였다(Liu H, et al., Bioresour Technol 115:244-248, 2012). 이때 유전자 파괴를 위해 사용된 프라이머 및 이에 상응하는 입증을 위해 사용된 프라이머들은 하기 표 2에 나타내었다. 유전자 파괴 카세트는 주형으로 pKD3를 이용하고 표 2에 기재된 관련된 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. pKD46 플라스미드는 레드 재조합효소(Red recombinase) 발현 벡터로 사용하였고, pCP20은 저항성 유전자 제거 플라스미드로 사용하였다. 이하, 본 발명의 실험예에서는 'E. coli BW25113 △galK::Kan^r, △dgoD::Cm^r)' 균주를 '△galK△dgoD'로 나타내었다(표 1).

< 실시예 4> 대장균내 갈락토키나아제 유전자 및 2- 데히드로 -3- 데옥시 - 갈락토네이트 키나아제(2- dehydro -3- deoxy - galactonate kinase ) 유전자가 파괴되고, 슈도모나스 시린가에 유래 D-갈락토오스 탈수소효소가 발현되는 재조합 대장균의 제조

D-갈락토네이트 대사 경로를 막기 위한 대체적인 접근으로서, 상기 △galK 균주에서 D-갈락토네이트 대사의 두 번째 단계를 촉진시키는 2-데히드로-3-데옥시-갈락토네이트 키나아제(2-dehydro-3-deoxy-galactonate kinase)를 암호화하는 유전자 dgoK(서열번호: 4)를 파괴시킨 균주(△galK△dgoK)를 제조하였다.

구체적으로, 유전자 파괴 및 제거 실험은 OPENWETWARE의 상세한 프로토콜에 따라 수행하였다(Liu H, et al., Bioresour Technol 115:244-248, 2012). 이때 유전자 파괴를 위해 사용된 프라이머 및 이에 상응하는 입증을 위해 사용된 프라이머들은 하기 표 2에 나타내었다. 유전자 파괴 카세트는 주형으로 pKD3를 이용하고 표 2에 기재된 관련된 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. pKD46 플라스미드는 레드 재조합효소(Red recombinase) 발현 벡터로 사용하였고, pCP20은 저항성 유전자 제거 플라스미드로 사용하였다.

그런 다음, 상기 △galK△dgoK(E. coli BW25113 △galK::Kan^r, △dgoK::Cm^r) 균주 내로 pET28a-gld를 형질도입하여 'E. coli BW25113 △galK△dgoK (DE3)/ pET28a-gld' 균주를 제조하였다. 이하, 본 발명의 실험예에서는 'E. coli BW25113 △galK△dgoK (DE3)/ pET28a-gld' 균주를 EWG3로 나타내었다(표 1).

실험에 사용된 균주들

균주(Strain)	특징/유전형	자원
P. syringae	야생형(Wild-type)	KCTC No. 23665
BL21(DE3)	E. coli B F-dcm ompT hsdS(r_B-m_B-)gal λDE3)	Invitrogen
BW25113	E. coli BW25113F-, △(araD-araB)567, △ lacZ4787(::rrnB-3), λ-1, rph-1, △(rhaD-rhaB)568, hsdR514	NBRP No. ME9092
△galK	E. coli BW25113 △galK::Kan^r	NBRP No. JW0740
△galK△dgoD	E. coli BW25113 △galK::Kan^r, △dgoD::Cm^r	직접 제조
△galK△dgoK	E. coli BW25113 △galK::Kan^r, △dgoK::Cm^r	직접 제조
BL21(DE3)-gld	E. coli BL21 (DE3)/ pET28a-gld	직접 제조
EWG1	E. coli BW25113 (DE3)/ pET28a-gld	직접 제조
EWG2	E. coli BW25113 △galK (DE3)/ pET28a-gld	직접 제조
EWG3	E. coli BW25113 △galK△dgoK (DE3)/ pET28a-gld	직접 제조

유전자 파괴 및 PCR 증폭에 사용된 프라이머들

프라이머	서열(5'－3')	기능
KdgoD-F	GCCTGGTTCGCGACAAAATTAAAGCCTACAGTTGGGTTGGCATATGAATATCCTCCTTAGT (서열번호: 5)	dgoD 파괴 카세트(disruption cassette)의 증폭용
KdgoD-R	CTCTGCTACGCTGTTATCTTCATGACGCCAGAGCGGATTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG (서열번호: 6)	dgoD 파괴 카세트(disruption cassette)의 증폭용
KdgoK-F	GCCTGAACGGAAAATCTCCGGCTGCGGTGTTAGCAGAAGTCATATGAATATCCTCCTTAGT (서열번호: 7)	dgoK 파괴 카세트의 증폭용
KdgoK-R	GCATGAGCGATGCTCCTTATACCAGCCTGAAATGCCGTGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG (서열번호: 8)	dgoK 파괴 카세트의 증폭용
dgoD-F	CGGTCTGGCAACTGATGG (서열번호: 9)	dgoD 파괴의 PCR 확인용
dgoD-R	GGCTTACGTGGCAGGAAT (서열번호: 10)	dgoD 파괴의 PCR 확인용
dgoK-F	GCAGGCAATCAGAAGCAG (서열번호: 11)	dgoK 파괴의 PCR 확인용
dgoK-R	CGATCAGCGGGAGTTTAGT (서열번호: 12)	dgoK 파괴의 PCR 확인용
gld-F	CGATCCATGGATGCAATCGATTCG (서열번호: 13)	gld 파괴의 PCR 확인용
gld-R	CGATGGATCCTCAATCGTAGAACGG (서열번호: 14)	gld 파괴의 PCR 확인용

< 실험예 1> 본 발명에 따른 재조합 대장균의 표현형 및 효소 활성 분석

<1-1> 표현형 분석

E. coli BW25113, 및 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 3>의 각각의 균주들에 대해, PCR을 통해 각 균주의 유전형을 확인한 후 표현형을 테스트하였다.

구체적으로, 표현형 테스트는 2 g L^-1 아가 및 단독 탄소원으로서 2 g L^-1의 D-갈락토오스 또는 D-갈락토네이트를 포함하는 M9 최소 염 배지에서 각 균주들에 대해 테스트하였다. 상기 균주들을 밤새 배양한 배양물을 OD600에서 0.1 AU, 0.01 AU 및 0.001 AU으로 희석시켰다. 연속적으로 희석된 배양물의 부분 표본(5 μL)을 고체 배지의 표면에 떨어뜨린 후 37℃에서 배양한 다음, 성장을 관찰하였다.

<1-2> 효소 활성 분석

E. coli BW25113, 및 상기 <실시예 1> 내지 <실시예 3>의 각각의 균주들에 대해, Berghall 등(Biotechnol Lett 8:541-546, 1986)에서 보고된 방법에 따라 조세포 추출물(crude cell extract)로부터 GalDH 활성을 측정하였다.

구체적으로, GalDH 활성 측정을 위해, 반응 혼합물은 1.46 mL 탈이온화된 물(de-ionized water), 200 μL pH 8.5 Tris-HCl 완충용액(1 M), 200 μL 조효소(crude enzyme), 100 μL D-갈락토오스 저장액(300 gL^-1), 20 μL MgCl₂ 저장액(200 mM) 및 20 μL NAD⁺ 또는 NADP⁺ 저장액(100 mM)을 포함시켰다. 단백질 농도는 브래드포드에 의해 개발된 방법(Pao SS, et al., MicrobiolMol Biol Rev 62:1-34, 1998)을 기초로 하는 바이오-래드 단백질 키트(Bio-Rad protein kit)를 이용하여 측정하였다. 효소 활성의 한가지 단위를 분(minute)당 1 μmol의 D-갈락토오스가 D-갈락토네이트로 전환할 수 있는 효소의 농도로 정의하였고, 특이적 활성은 mg 단백질 당 효소 활성으로 산출하였다. GalDH 활성에 대한 최적의 pH는 아세트산 칼륨(potassium acetate)(100 mM, pH 5.3-6.8), Tris-HCl(100 mM, pH 8.0-9.8) 및 글리신(Glycine)(100 mM, pH 10.4-11.6) 완충용액을 이용하여 5.3 내지 11.6 범위에서 결정하였다. 기질 특이성 및 운동 분석은 100 mM Tris-HCl 완충용액(pH=8.5), 0.1 mg D-갈락토오스 탈수소효소 조효소, 2 mM MgCl₂ 및 연속적으로 희석된 농도의 기질을 포함하는 시스템에서 수행하였다.

<1-3> D- 갈락토네이트의 생합성을 위한 배양 조건

2 g L-1 글루코즈를 포함하는 100 mL M9 최소 염 배지, 2 g L^-1 D-갈락토오스 및 40 mg L^-1 카나마이신을 포함하는 250 mL 삼각 플라스크에서 진탕 플라스크 배양을 수행하였다. 상기 배지는 2 mL의 밤새 배양한 배양액으로 접종하였고, 150 rpm 교반으로 37℃에서 배양하였다. gld 발현을 유도하기 위해, OD600 값이 0.3 AU에 도달할 때 0.5 mM IPTG(Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하였고, 24시간 후에 다시 첨가하였다. pH 7.0을 유지하기 위해, 1 N NaOH를 주기적으로 첨가하였다.

<1-4> D- 갈락토네이트 생산에 대한 배양 배지의 pH 효과

GalDH는 pH 9.8에서 가장 높은 활성을 가지는 반면, E. coli는 중성 및 미 알칼리성 환경을 선호한다. 이런 이유로, D-갈락토네이트 생산에 대한 세포외 pH의 영향을 확인하였다.

구체적으로, D-갈락토네이트 생산에 대한 배지의 pH의 효과는 무균 NaOH 용액(2M) 및 HCl 용액(3M)의 첨가를 통해 배지에서 pH 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 각각을 유지시키고, 진탕 플라스크 배양에서의 동일한 조건을 이용하여 테스트하였다.

상기 각각의 분석 결과, EWG1(E. coli BL21 (DE3)/pET28a-gld) 균주는 GalDH 활성의 존재를 나타내었다. 다만, 동력학적 분석(kinetic analysis) 결과는 NAD+의 Km이 NADP+의 그것에 비해 낮아지는 것을 나타내었으며, 이는 GalDH가 그것의 공동인자로서 NAD+를 선호하는 것을 나타내는 것이다(표 3). 한편, EWG1 균주는 글루코즈 산화에 대한 활성은 검출되지 않았으며, 이는 GalDH가 혼합된 탄소원의 존재 하에서 선택적으로 D-갈락토네이트 생산을 위한 좋은 후보물질인 것을 나타내는 것이다.

재조합 대장균으로부터 획득된 GalDH의 동력학적 분석^a

K_m (mM)				V_max (μM/min)	K_cat ^c (min^-1)	특이적 활성 (U/mg)
NADP+	NAD+	D-갈락토오스^b	D-글루코즈^b	V_max (μM/min)	K_cat ^c (min^-1)	특이적 활성 (U/mg)
3.37±0.86	0.67±0.03	0.75±0.27	N.d	4.22±0.16	47.34±3.37	1.42±0.11

^a제시된 데이타는 두번의 독립적인 실험 결과이다.

^bNAD⁺는 공동인자로 사용하였으며, N.d(not detected)는 검출되지 않은 것이다.

^cD-갈락토오스 칼수소효소는 33.3 kDa 분자량을 갖는 모노-효소로 추정된다.

EWG1 균주는 진탕 플라스크 배양을 수행하여 72시간 후, EWG1는 0.17 g L^-1 D-갈락토네이트를 생산하였고 8.3%의 동등한 수율을 나타내었다(표 4). 처음에 D-글루코즈가 소비되었고 36시간 배양 후 D-갈락토오스가 고갈되었다. 게다가, 생산된 D-갈락토네이트의 소비가 관찰되었는데, 이는 생산물이 연장된 배양 시간 하에서 D-갈락토네이트 대사 경로로 들어가는 것을 입증한 것이다.

EWG2(E. coli BW25113 △galK (DE3)/pET28a-gld) 균주는 표현형 테스트 결과, △galK 균주가 D-갈락토오스에 대한 성장 능력을 잃은 것으로 나타내었다(도 3). 상기 균주는 0.44 g L^-1 D-갈락토네이트를 생산하였고 22.0%의 수율을 나타내었으며, 이는 EWG1에 비해 2.6배 높은 것이었다(표 4). 이런 결과는 천연의 D-갈락토오스 대사 경로의 블라킹이 D-갈락토네이트 생산을 연속적으로 증가시켰던 기질 경쟁을 제거시켰음을 입증하였다. 그러나, EWG2에 의해 생상된 최종 바이오매스는 EWG1의 그것과 유사하였다. 게다가, D-갈락토네이트의 농도는 그것이 소비되는 것으로 나타내어졌다(도 4).

△galK△dgoD(E. coli BW25113 △galK::Kan^r, △dgoD::Cm^r) 균주는 표현형 테스트 분석 결과, D-갈락토네이트에 대해 성장되는 것을 보여주었으나, 여전히 D-갈락토네이트의 농도는 그것이 소비되는 것으로 나타내어졌다.

EWG3(E. coli BW25113 △galK△dgoK (DE3)/ pET28a-gld) 균주는 1.24 g L^-1 D-갈락토네이트를 생산하였으며, 62.0%의 동등한 수율을 나타내었다. 즉, EWG3의 생산성은 EWG1의 그것에 비해 7.3배 높으며, EWG2의 그것에 비해 2.8배 높은 것으로 나타내었다(표 4).

따라서, D-갈락토네이트 생산이 EWG3에서 유의적으로 증진된 반면, 그것의 바이오매스 생산은 EWG1 및 EWG2의 그것에 비해 유의적으로 감소하였다(도 4). 즉, EWG3는 세포 성장을 위한 D-갈락토네이트의 소비가 방지되는 것으로 나타났다. 이런 결과는 생산물 소비의 제거가 E. coli의 D-갈락토네이트 생산을 위해 필수적이었음을 제시하는 것이다.

진탕 플라스크 배양에서 재조합 대장균 균주의 D-갈락토오스 및 바이오매스 생산

균주	갈락토네이트 (g L^-1)	수율 (g D-갈락토네이 per g D-갈락토오스)	omass (g L^-1)
EWG1	0.17±0.00	0.08±0.00	0.55±0.11
EWG2	0.44±0.01	0.22±0.01	0.57±0.00
EWG3	1.24±0.11	0.62±0.06	0.28±0.02

GalDH는 pH 9.8에서 가장 높은 활성을 가지는 반면, E. coli는 중성 및 미 알칼리성 환경을 선호한다. 이런 이유로, D-갈락토네이트 생산에 대한 세포외 pH의 영향을 다양한 pH 수준(6.5 - 8.0)에서 EWG3의 진탕 플라스크 배양으로 테스트하였다. 그 결과, EWG3는 pH7.5에서 가장 높은 D-갈락토네이트 생산을 보여주는 것으로 나타났다(표 5).

한편, GalDH 활성에 대한 pH 효과의 측정 결과, EWG 3은 pH 9.8에서 가장 높은 효소 활성을 나타내었고, pH 6.8 및 11.6 사이의 넓은 범위 내에서 유의적인 활성을 나타내었다(도 2 참조).

< 실험예 2> 실험실 스케일의 비연속 발효를 통한 본 발명에 따른 재조합 균주의 D-갈락토네이트의 생산 및 수율 확인

<2-1> 비연속 발효( Batch fermentation )

EWG3의 D-갈락토네이트 생산성 및 수율을 평가하기 위해, 5L 스케일의 실험실 비연속 발효기를 사용하여 비연속 발효를 수행하였다.

구체적으로, 비연속 발효는 2L의 M9 최소 염 배지, 20 g L^-1의 D-글루코즈 및 20 g L^-1의 D-갈락토오스가 포함된 5L 실험실 스케일 발효기에서 수행하였다. 카나마이신(40 mg L^-1)는 발효 시작에 첨가하였다. 접종제는 아가 플레이트로부터 단일 콜로니를 선발함으로써 초기에 성장시키고, 40 mgL-1 카나마이신을 포함하는 5 mL 배지에 이동시켰다. 배양물은 150 rpm 교반으로 37℃에서 성장시켰다. 그리고 12시간 후에, 40 mgL^-1 카나마이신을 포함하는 100 mL 새 배지에 이동시키고 또다른 12시간 동안 추가적으로 배양시켰다. 그런 다음, 접종제를 발효기 내로 이동시킨 후 비연속 발효를 개시하였다(t = 0 h). 발효는 pH 7.5로 37℃에서 650 rpm의 속도로 교반시키고 0.5vvm 기류에서 수행하였다. OD600 값이 3.0 AU에 도달할 때 0.5 mM IPTG를 첨가하였고, 온도는 34℃로 감소하였다. 교반 속도는 20% 공기포화(air saturation)에서 용존산소(dissolved oxygen; D.O.)를 유지시키기 위해 PID에 의해 조절하였다. 거품 발생은 거품억제제의 첨가에 의해 조절하였고, pH는 2N H₂SO₄ 산, 또는 30% NH₄OH 또는 30% CaCO₃ 용액 중 어느 하나인 염기를 이용하여 유지시켰다.

<2-2> 세포 성장 및 대사 산물 분석

세포 성장은 측정된 건조 세포 중량과 관련된 표준곡선(standard curve)을 근거로 OD600 값의 관점에서 측정하였다. 샘플은 2 mL 전건조되고 전계량된 원심분리 튜브에 채취하고, 10분 동안 8,000 xg에서 펠릿화하고, 희석된 물로 2번 세척한 후 105℃에서 건조시켰다. 한 개의 OD600 단위는 0.32 gdry cellL^- ¹으로 동등화시켰다.

D-글루코즈, 아세트산, 젖산, D-갈락토오스 및 D-갈락토네이트와 같은 세포 밖 및 세포 내의 대사물질은 HPLC로 분석하였다. 세포 내 샘플은 다음과 같이 제조하였다: 세포를 4,000 xg 및 4℃에서 원심분리에 의해 채취하였다. 채취된 세포를 Tris-HCl(25 mM, pH 8.0), NaCl(20 mM) 및 10 mg mL^-1의 라이소자임을 포함하는 용해 완충용액에서 재현탁하였다. 샘플 혼합액은 30분 동안 37℃에서 배양한 다음, 뒤이어 2번 동결-융해 주기를 거쳤다. 마지막으로 4℃에서 10분 동안 세포 용해물의 원심분리(20,000 xg) 후 상등액으로서 세포 내 샘플을 획득하였다.

대사산물을 Bio-Rad Aminex HPX-87H 컬럼(300×7.8 mm)이 장착된 Waters HPLC를 이용하여 분석하였다. 용리액(5 mM H₂SO₄)은 0.4 mL min-1의 흐름율로 펌프하였다. 컬럼 온도는 55℃으로 유지시켰고, 피크는 Waters 2414 시처 굴절률 검출기(refractive index detector)를 이용하여 검출하였다. D-갈락토네이트는 D-갈락토오스와 부분적으로 함께 용해되기 대문에 HPLC 방법을 이용하여 정확히 정량될 수 없다. 그러므로, D-갈락토네이트 농도는 이전에 보고된 하이드록시아마이트(hydroxamate)를 이용하여 측정하였다(Puigbo P, et al., Nucleic Acids Res 35:W126-131, 2007). 샘플(300 μL)를 1 mL의 0.7 M HCl에서 희석하고 15분 동안 100℃에서 끓였다. 끓인 샘플(500 μL)을 1 mL 히드록실 아민 시약(hydroxylamine reagent)(2 M 히드록실아민 HCl를 포함한 2 M NaOH)에 첨가한 다음, 650 μL의 3.2 M HCl를 첨가한 후, 마지막으로 500 μL의 FeCl₃ 용액(100 g/L를 포함하는 0.1 M HCl)를 첨가하였다. 흡광도는 550 nm에서 즉시 측정하였다. D-갈락토네이트 농도는 표준곡선에 대하여 흡광도를 비교함으로써 결정하였다.

상기 분석 결과, 72시간의 발효 후에 D-갈락토네이트 농도는 17.6 g L^-1(즉, D-갈락토오스 당 0.88 g D-갈락토네이트)에 달하였고, 88%의 동등한 수율 및 0.24 g L^-1 h^-1의 평균 생산성을 나타내었다(도 5).

한편, 세포 내 대사물질 분석 결과, D-갈락토네이트의 축적이 없는 것으로 나타냄으로써 효율적인 생산 분비를 나타내는 것으로 보여주었다. 또한, EWG3는 글루코즈로부터 거대한 양의 아세트산을 생산함으로써, 균주 성장의 강한 억제가 관찰되었는데(도 6), 이것은 모든 D-갈락토오스의 불완전한 전환을 야기하는 이유 중 하나이다.

< 실험예 3> 본 발명에 따른 재조합 균주에 의해 생산된 D- 갈락토네이트의 회수, 순도 및 구조 분석

EWG3에 의해 생산된 D-갈락토네이트를 회수한 후, 순도 및 구조를 분석하였다.

구체적으로, D-갈락토네이트는 이전 보고된 방법에 의해 배양 브로스(culture broth)로부터 회수하였다(Zeng AP, et al., Curr Opin Biotechnol 22:749-757, 2011). D-카보네이트 회수를 촉진시키기 위해 발효 동안 배양액에 칼슘카보네이트(Calcium carbonate; CaCO₃) 슬러리를 첨가하였고, 또한 배양액의 pH를 유지시켰다. 1몰의 Ca² ⁺은 2몰의 당산(sugar acid)으로 활용할 수 있다(Kuivanen J, et al., Appl Environ Microbiol 78:8676-8683, 2012). 발효시킨 후, 원심분리하여 세포가 제거된 상등액을 획득하였다. 우선, 세포를 10분 동안 2,500 xg에서의 원심분리를 통해 제거하였다. 상등액을 활성화된 탄소를 이용하여 탈색하고 진공에서 1 L 내지 200 mL로 농축한 다음, 뒤이어 EtOH (3:1, v/v)를 첨가하였다. 4℃에서 12시간 저장한 후, D-갈락토네이트 침전물을 채취하고 진공 건조시켰다.

D-갈락토네이트의 구조는 5 mm PFG indirect NMR 프로브를 갖는 500 MHz에서의 Varian Unity Inova 분광기를 이용하여 13C- 및 1H-NMR 분석을 통해 확인하였다. 건조된 D-갈락토네이트 샘플은 NMR 분석 이전에 중수소화된 물로 재용해시켰다.

상기 분석 결과, 회수 절차를 통해 발효 브로스로부터 82.9%의 D-갈락토네이트를 회수하였다.

또한, 회수된 D-갈락토네이트의 순도를 확인하기 위해 HPLC 분석을 수행한 결과, 순도가 97.6% 만큼 높게 나타내는 것을 보여주었다.

또한, 정제된 D-갈락토네이트의 구조를 확인하기 13C-NMR 및 1H-NMR 분석을 수행한 결과, 생산물은 활성형에 존재하고 락톤 중간체가 검출되지 않는 것을 보여주었다(도 7).

본 발명에서 개발된 대사공학적 전략 기술은 D-갈락토네이트의 산업적 생산이 가능하여, D-갈락토네이트가 사용되고 있는 폴리에스테르 전구체, 식품첨가물, 약물 중간체 및 화장품 원료 공급을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

<110> MYONGJI UNIVERSITY INDUSTRY AND ACADEMIA COOPERATION FOUNDATION <120> ESCHERICHIA COLI FOR HIGH PRODUCTION OF D-GALACTONATE AND USE THEREOF <130> P13-0171 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 927 <212> DNA <213> Pseudomonas syringae <400> 1 atgcaatcga ttcgtctcgg tctggtgggc tacggcaaga ttgcgcagga tcaacacgtc 60 ccggcgatcc acgccaaccc cgcgtttgag ctggtggccg tggccacgca aggccagccg 120 tgcgccgggg tagagaattt caaatccctg ggcgaactgc ttgcgagcgg gctgcaggtt 180 gacgcgattg cgttctgtac gcccccgcaa ggtcgctttg ccctggtgca ggaagcgttg 240 gcggctggca aacatgtgtt ggtcgagaaa ccgccgtgcg cgaccctggg ggaggcgatg 300 gcgttggtag cccaggtgca agagcagggc gtcagcggtc tgtttgcctg gcattcgcgt 360 tacgcgcaag gtatcgaagc ggcgcgtgag tggttgtcca cccgcaccct gcacagcgtg 420 cagatcgact ggaaagaaga cgtgcgcaaa tggcaccccg gtcaggcgtg gatctggcag 480 cccggtggcc ttggcgtgtt cgatccgggc atcaatgccc tgtcgatcgt gacccacctg 540 ctgccactgt cattgttcgt cgagtctgcc gaactgcgcg tgccgagcaa ttgccagtcg 600 cctatcgctg cgtccatcaa aatgtccgac acgcgccatc tcgatatccg cgccgagttc 660 gatttcgatc atggtcacga cgagctttgg agcatcgaga ttcgctgcgc tgaggggacg 720 ttgcgcctgg acagcggcgg tgcagtgttg agtatcgatg gcgtgcgtca ggctgtttcg 780 gaagagggcg agtacgcagc ggtgtatcgc cacttccaac agttgatcgg cgataaagcc 840 agtgacttgg acctgcaacc gttgcggctg gtcgcggaca gttttttcgt gggcggtcgg 900 gcatccgttg aaccgttcta cgattga 927 <210> 2 <211> 1149 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atgagtctga aagaaaaaac acaatctctg tttgccaacg catttggcta ccctgccact 60 cacaccattc aggcgcctgg ccgcgtgaat ttgattggtg aacacaccga ctacaacgac 120 ggtttcgttc tgccctgcgc gattgattat caaaccgtga tcagttgtgc accacgcgat 180 gaccgtaaag ttcgcgtgat ggcagccgat tatgaaaatc agctcgacga gttttccctc 240 gatgcgccca ttgtcgcaca tgaaaactat caatgggcta actacgttcg tggcgtggtg 300 aaacatctgc aactgcgtaa caacagcttc ggcggcgtgg acatggtgat cagcggcaat 360 gtgccgcagg gtgccgggtt aagttcttcc gcttcactgg aagtcgcggt cggaaccgta 420 ttgcagcagc tttatcatct gccgctggac ggcgcacaaa tcgcgcttaa cggtcaggaa 480 gcagaaaacc agtttgtagg ctgtaactgc gggatcatgg atcagctaat ttccgcgctc 540 ggcaagaaag atcatgcctt gctgatcgat tgccgctcac tggggaccaa agcagtttcc 600 atgcccaaag gtgtggctgt cgtcatcatc aacagtaact tcaaacgtac cctggttggc 660 agcgaataca acacccgtcg tgaacagtgc gaaaccggtg cgcgtttctt ccagcagcca 720 gccctgcgtg atgtcaccat tgaagagttc aacgctgttg cgcatgaact ggacccgatc 780 gtggcaaaac gcgtgcgtca tatactgact gaaaacgccc gcaccgttga agctgccagc 840 gcgctggagc aaggcgacct gaaacgtatg ggcgagttga tggcggagtc tcatgcctct 900 atgcgcgatg atttcgaaat caccgtgccg caaattgaca ctctggtaga aatcgtcaaa 960 gctgtgattg gcgacaaagg tggcgtacgc atgaccggcg gcggatttgg cggctgtatc 1020 gtcgcgctga tcccggaaga gctggtgcct gccgtacagc aagctgtcgc tgaacaatat 1080 gaagcaaaaa caggtattaa agagactttt tacgtttgta aaccatcaca aggagcagga 1140 cagtgctga 1149 <210> 3 <211> 1149 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atgaaaatca ccaaaattac cacgtatcgt ttacctcccc gctggatgtt cctgaaaatt 60 gaaaccgatg aaggcgtggt cggttggggc gagcccgtga tcgaaggccg cgcccgtacg 120 gtggaagcgg cagttcacga gctgggtgac tatttgattg gtcaggatcc atcgcgcatc 180 aatgacttat ggcaagtgat gtatcgcgcc ggattctatc gcggcggtcc gatcctgatg 240 agcgccatcg ccgggattga ccaggcgtta tgggatatca aaggtaaagt gctgaatgcg 300 ccggtctggc aactgatggg cggcctggtt cgcgacaaaa ttaaagccta cagttgggtt 360 ggcggcgatc gtccggcgga tgttatcgac ggcattaaaa cgctacgcga aatcggcttc 420 gataccttca aactgaacgg ttgtgaagaa ctggggctaa ttgataactc ccgcgcggta 480 gatgcggcgg ttaacaccgt ggcacaaatt cgtgaagctt ttggcaatca gattgagttt 540 ggtcttgatt tccacggtcg cgtcagcgcg ccgatggcga aagtgctgat taaagaactg 600 gagccgtatc gcccgctgtt tattgaggag ccggtgctgg cggaacaagc cgaatactac 660 ccgaaactgg cggcacaaac gcatattcca ctggcggcgg gtgaacgcat gttctcacgc 720 ttcgatttta aacgcgtgct ggaggcaggt ggtatttcga ttctgcaacc ggatctctcc 780 cacgcgggcg gtattaccga atgctacaaa atcgccggaa tggcagaagc ctatgacgtg 840 acccttgcgc cgcactgtcc gctcggaccg attgcactgg cggcttgcct gcatatcgac 900 tttgtttcct ataacgccgt acttcaggaa caaagtatgg gaattcatta caacaaaggc 960 gcggagttac tcgactttgt gaaaaacaaa gaagacttca gcatggtcgg cggcttcttt 1020 aaaccgttaa cgaaaccggg cttaggcgtg gaaatcgacg aagctaaagt gattgagttc 1080 agtaaaaatg ccccggactg gcgtaatccg ctctggcgtc atgaagataa cagcgtagca 1140 gagtggtaa 1149 <210> 4 <211> 879 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 atgacagctc gctacatcgc aattgactgg ggatcgacca atctgcgcgc ctggctttat 60 cagggcgacc actgcctgga gagcaggcaa tcagaagcag gcgtcacgcg cctgaacgga 120 aaatctccgg ctgcggtgtt agcagaagtc acgaccgact ggcgtgaaga gaaaacgcca 180 gtggtaatgg caggaatggt tggcagcaac gtcggctgga aagttgcacc gtatttatct 240 gttcctgcct gtttttcgtc tattggcgaa caattaacgt cagttggcga caatatctgg 300 attattcccg gattatgtgt ctctcatgac gataaccaca atgtgatgcg cggcgaagaa 360 acacaattga tcggcgcgcg agctctggct ccttcctctc tttatgtcat gcccggaacc 420 cattgcaaat gggtgcaggc cgatagccag caaatcaacg attttcgcac cgtgatgacc 480 ggtgaattac atcatttact gttaaatcac tcattgattg gcgcaggttt gccgccgcag 540 gaaaactctg ccgatgcctt cacagctggc cttgagcgtg gtcttaatac gcccgccata 600 ttgccgcagc tttttgaagt tcgcgcctcg catgtgctgg gaacacttcc ccgcgaacag 660 gtcagcgaat ttctctctgg tttgttgatt ggcgcagagg tcgccagtat gcgcgactat 720 gtggcccatc aacacgccat cacccttgtc gccggaacat cgctgaccgc gcgctaccag 780 caagcctttc aggcgatggg ttgcgacgtg acggcggtgg cgggcgacac ggcatttcag 840 gctggtataa ggagcatcgc tcatgcagtg gcaaactaa 879 <210> 5 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KdgoD <400> 5 gcctggttcg cgacaaaatt aaagcctaca gttgggttgg catatgaata tcctccttag 60 t 61 <210> 6 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KdgoD <400> 6 ctctgctacg ctgttatctt catgacgcca gagcggatta gtgtaggctg gagctgcttc 60 g 61 <210> 7 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for KdgoK <400> 7 gcctgaacgg aaaatctccg gctgcggtgt tagcagaagt catatgaata tcctccttag 60 t 61 <210> 8 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for KdgoK <400> 8 gcatgagcga tgctccttat accagcctga aatgccgtgt gtgtaggctg gagctgcttc 60 g 61 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for dgoD <400> 9 cggtctggca actgatgg 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for dgoD <400> 10 ggcttacgtg gcaggaat 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for dgoK <400> 11 gcaggcaatc agaagcag 18 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for dgoK <400> 12 cgatcagcgg gagtttagt 19 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for gld <400> 13 cgatccatgg atgcaatcga ttcg 24 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for gld <400> 14 cgatggatcc tcaatcgtag aacgg 25

Claims

갈락토키나아제(galactokinase)를 암호화하는 galK 유전자가 녹아웃(knock out)된 대장균에 슈도모나스 시린가에 유래 갈락토오스 탈수소효소를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질도입시켜 제조된, D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주.
갈락토키나아제를 암호화하는 galK 유전자 및 2-데히드로-3-데옥시-갈락토네이트 키나아제(2-dehydro-3-deoxy-galactonate kinase)를 암호화하는 dogK 유전자가 녹아웃된 대장균에 슈도모나스 시린가에 유래 갈락토오스 탈수소효소를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 형질도입시켜 제조된, D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 gld 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 galK 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주.
제 2항에 있어서, 상기 dogK 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주.
1) 슈도모나스 시린가에 유래 갈락토오스 탈수소효소를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 대장균에서 갈락토키나아제(galactokinase)를 암호화하는 galK 유전자를 녹아웃(knock out)시키는 단계; 및
3) 상기 단계 1)의 발현벡터를 상기 단계 2)의 대장균에 형질도입하는 단계를 포함하는, D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주의 제조방법.
1) 슈도모나스 시린가에 유래 갈락토오스 탈수소효소를 암호화하는 gld 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 대장균에서 갈락토키나아제를 암호화하는 galK 유전자 및 2-데히드로-3-데옥시-갈락토네이트 키나아제를 암호화하는 dogK 유전자를 녹아웃시키는 단계; 및
3) 상기 단계 1)의 발현벡터를 상기 단계 2)의 대장균에 형질도입하는 단계를 포함하는, D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주의 제조방법.
제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 단계 1)의 발현벡터는 pET28a 발현벡터인 것을 특징으로 하는 D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주의 제조방법.
제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 단계 2)의 대장균은 E. coli BL21(DE3)인 것을 특징으로 하는 D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주의 제조방법.
제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 녹아웃은 유전자 파괴 카세트(gene disruption cassette)를 이용하여 유전자를 파괴시키는 것으로 수행하는 것을 특징으로 하는 D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주의 제조방법.
제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 형질도입은 전기 천공법(electroporation)을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 D-갈락토네이트 고생산 대장균 균주의 제조방법.
1) 제 1항의 대장균 균주를 배양하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 배양된 배양액에서 D-갈락토네이트를 회수하는 단계를 포함하는, D-갈락토네이트의 대량 생산 방법.
1) 제 2항의 대장균 균주를 배양하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 배양된 배양액에서 D-갈락토네이트를 회수하는 단계를 포함하는, D-갈락토네이트의 대량 생산 방법.
제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 단계 1)의 배양은 탄소원 및 D-갈락토오스(D-galactose)를 포함하는 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 D-갈락토네이트의 대량 생산 방법.
제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 단계 1)의 배양은 pH 7 내지 8에서 수행하는 것을 특징으로 하는 D-갈락토네이트의 대량 생산 방법.
제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 단계 1)의 배양은 36 내지 72시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 D-갈락토네이트의 대량 생산 방법.
제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 단계 2)에서 회수한 후 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 D-갈락토네이트의 대량 생산 방법.