EA025990B1 - Полипептиды с оксидоредуктазной активностью и их применение - Google Patents
Полипептиды с оксидоредуктазной активностью и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA025990B1 EA025990B1 EA201200398A EA201200398A EA025990B1 EA 025990 B1 EA025990 B1 EA 025990B1 EA 201200398 A EA201200398 A EA 201200398A EA 201200398 A EA201200398 A EA 201200398A EA 025990 B1 EA025990 B1 EA 025990B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- hmp
- acid
- cell
- nucleotide sequence
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 title claims abstract description 75
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 title claims abstract description 75
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 58
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 57
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 54
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 46
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical group C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 155
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 64
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 30
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 28
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 28
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 27
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 25
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 19
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 14
- PCSKKIUURRTAEM-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxymethyl-2-furoic acid Chemical compound OCC1=CC=C(C(O)=O)O1 PCSKKIUURRTAEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 241000404883 Pisa Species 0.000 claims description 12
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 12
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 11
- NOEGNKMFWQHSLB-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxymethylfurfural Chemical group OCC1=CC=C(C=O)O1 NOEGNKMFWQHSLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- CHTHALBTIRVDBM-UHFFFAOYSA-N furan-2,5-dicarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C(O)=O)O1 CHTHALBTIRVDBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- RJGBSYZFOCAGQY-UHFFFAOYSA-N hydroxymethylfurfural Natural products COC1=CC=C(C=O)O1 RJGBSYZFOCAGQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 8
- DSLRVRBSNLHVBH-UHFFFAOYSA-N 2,5-furandimethanol Chemical compound OCC1=CC=C(CO)O1 DSLRVRBSNLHVBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 6
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 claims description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 5
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 claims description 3
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 claims description 3
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 2
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 2
- 239000002029 lignocellulosic biomass Substances 0.000 claims description 2
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 claims description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 2
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 claims 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- VUTBELPREDJDDH-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(N)=N1 VUTBELPREDJDDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 220
- 102100026639 MICOS complex subunit MIC60 Human genes 0.000 description 117
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 58
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 20
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 20
- HYBBIBNJHNGZAN-UHFFFAOYSA-N furfural Chemical compound O=CC1=CC=CO1 HYBBIBNJHNGZAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 16
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 16
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 15
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 14
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 12
- XPFVYQJUAUNWIW-UHFFFAOYSA-N furfuryl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CO1 XPFVYQJUAUNWIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 11
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 7
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 7
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 7
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 7
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 5
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 5
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 5
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 150000002240 furans Chemical class 0.000 description 5
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150036449 SIRPA gene Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- PXJJKVNIMAZHCB-UHFFFAOYSA-N 2,5-diformylfuran Chemical compound O=CC1=CC=C(C=O)O1 PXJJKVNIMAZHCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TYNYLABSLJYTTH-UHFFFAOYSA-N 3-(hydroxymethyl)furan-2-carboxylic acid Chemical compound OCC=1C=COC=1C(O)=O TYNYLABSLJYTTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ICRNLRSCBXVFAL-UHFFFAOYSA-N 3-formylfuran-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C=1OC=CC=1C=O ICRNLRSCBXVFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010053754 Aldehyde reductase Proteins 0.000 description 3
- 102100027265 Aldo-keto reductase family 1 member B1 Human genes 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical group [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- -1 chloroperoxy Chemical group 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 3
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 102100038470 Retinoic acid-induced protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEXIPRQHXNUUAA-UHFFFAOYSA-N [5-(aminomethyl)oxolan-2-yl]methanamine Chemical compound NCC1CCC(CN)O1 XEXIPRQHXNUUAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YCZZQSFWHFBKMU-UHFFFAOYSA-N [5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]methanol Chemical compound OCC1CCC(CO)O1 YCZZQSFWHFBKMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- QPILZZVXGUNELN-UHFFFAOYSA-M sodium;4-amino-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonate;hydron Chemical compound [Na+].OS(=O)(=O)C1=CC(O)=C2C(N)=CC(S([O-])(=O)=O)=CC2=C1 QPILZZVXGUNELN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- KKEYFWRCBNTPAC-UHFFFAOYSA-L terephthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1 KKEYFWRCBNTPAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- ZFTFOHBYVDOAMH-XNOIKFDKSA-N (2r,3s,4s,5r)-5-[[(2r,3s,4s,5r)-5-[[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-2-(hydroxymethyl)oxolane-2,3,4-triol Chemical class O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@](CO)(OC[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@](O)(CO)O2)O)O1 ZFTFOHBYVDOAMH-XNOIKFDKSA-N 0.000 description 1
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 2,6-dichloroindophenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1N=C1C=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C1 CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- OQEBBZSWEGYTPG-UHFFFAOYSA-N 3-aminobutanoic acid Chemical compound CC(N)CC(O)=O OQEBBZSWEGYTPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHNRXUWGUKDPMA-UHFFFAOYSA-N 5-formyl-2-furoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C=O)O1 SHNRXUWGUKDPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 5-methylphenazinium methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 102100031936 Anterior gradient protein 2 homolog Human genes 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- HBSHPFODUZUCEX-UHFFFAOYSA-N C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1.C1=CNC2=C3C=CN=C3C=CC2=C1 Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1.C1=CNC2=C3C=CN=C3C=CC2=C1 HBSHPFODUZUCEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004970 Chain extender Substances 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 108010035722 Chloride peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 244000298479 Cichorium intybus Species 0.000 description 1
- 235000007542 Cichorium intybus Nutrition 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 240000001973 Ficus microcarpa Species 0.000 description 1
- 229920002670 Fructan Polymers 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 108050009034 Glucose-methanol-choline oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000001803 Glucose-methanol-choline oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 238000010268 HPLC based assay Methods 0.000 description 1
- 240000008892 Helianthus tuberosus Species 0.000 description 1
- 235000003230 Helianthus tuberosus Nutrition 0.000 description 1
- 102100039121 Histone-lysine N-methyltransferase MECOM Human genes 0.000 description 1
- 101000775021 Homo sapiens Anterior gradient protein 2 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101001033728 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase MECOM Proteins 0.000 description 1
- 101000581326 Homo sapiens Mediator of DNA damage checkpoint protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000985296 Homo sapiens Neuron-specific calcium-binding protein hippocalcin Proteins 0.000 description 1
- 101000596892 Homo sapiens Neurotrimin Proteins 0.000 description 1
- 101000935117 Homo sapiens Voltage-dependent P/Q-type calcium channel subunit alpha-1A Proteins 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 102100028524 Lysosomal protective protein Human genes 0.000 description 1
- 101710162021 Lysosomal protective protein Proteins 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 102100027643 Mediator of DNA damage checkpoint protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100496087 Mus musculus Clec12a gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100035107 Neurotrimin Human genes 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 101710150114 Protein rep Proteins 0.000 description 1
- 101710181816 Pyruvate-formate-lyase deactivase Proteins 0.000 description 1
- 102100026436 Regulator of MON1-CCZ1 complex Human genes 0.000 description 1
- 101710180672 Regulator of MON1-CCZ1 complex Proteins 0.000 description 1
- 101710152114 Replication protein Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102100025330 Voltage-dependent P/Q-type calcium channel subunit alpha-1A Human genes 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229920000180 alkyd Polymers 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 239000012152 bradford reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 125000005442 diisocyanate group Chemical group 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- AHIXHWRUDZFHEZ-UHFFFAOYSA-N furan-2,3-dicarbaldehyde Chemical compound O=CC=1C=COC=1C=O AHIXHWRUDZFHEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNXDYHALMANNEJ-UHFFFAOYSA-N furan-2,3-dicarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C=1C=COC=1C(O)=O DNXDYHALMANNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 101150085094 ger gene Proteins 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019534 high fructose corn syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 150000002762 monocarboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009206 nuclear medicine Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000012619 stoichiometric conversion Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004416 thermosoftening plastic Substances 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000005820 transferase reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F124/00—Homopolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a heterocyclic ring containing oxygen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к полипептиду с оксидоредуктазной активностью класса ЕС1.1 и ЕС1.2 в отношении как спиртовой, так и альдегидной группы, находящихся в положении С2 или С5 фуранового цикла, содержащему аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей заявленный полипептид; конструкции, содержащей данную нуклеиновую кислоту; вектору, включающему данную конструкцию; клетке, содержащей указанную нуклеиновую кислоту, конструкцию или вектор; способу получения заявленного полипептида посредством культивирования указанной клетки, а также к различным способам, основанным на использовании заявленного полипептида.
Description
Изобретение относится к полипептиду, обладающему оксидоредуктазной активностью, и к нуклеотидным последовательностям, включающим ген, который кодирует полипептид. Изобретение также относится к получению 2,5-фурандикарбоновой кислоты (РОСА). В изобретение также включаются все клетки, трансформированные полинуклеотидом по изобретению, подходящим для получения таких полипептидов, который также можно использовать для биотрансформации гидроксиметилфурфураля (НМР) в РИСА.
Предпосылки создания изобретения
2,5-Фурандикарбоновая кислота (РИСА) имеет большой потенциал для того, чтобы стать биологической альтернативой терефталата при получении сложных полиэфиров, таких как ПЭТФ (РЕТ). По указанной и по другим причинам РИСА идентифицирована как один из 12 самых приоритетных химических продуктов в сообщении ΌΘΕ на Тор Уа1ие-Аййей СЬеш1са18 £гош Вюшакк (Тор Уа1ие-Аббеб СЬеш1са18 1гош В1оша88, Уо1ите I - КекиИк о£ ксгеетпд Юг ро1еийа1 СаиФба1е8 £гот §идаг8 аиб §уЫЬе818 да§, ОераПтеи! о£ Еиегду (И8А), 2004). Такое соединение можно получить окислением 5-гидроксиметилфурфураля (НМР), который можно получить нагреванием сахаров-гексоз в кислой среде. В сообщении ΌΘΕ на с. 27 раскрываются некоторые возможные использования РИСА. К ним относится ее роль как субстрата для получения янтарной кислоты, 2,5-бис-(аминометил)тетрагидрофурана, 2,5-дигидроксиметилтетрагидрофурана, 2,5-дигидроксиметилфурана и 2,5-фурандикарбальдегида. Хотя получение РИСА окислительной дегидратацией С6-сахаров и использование РИСА хорошо известны и имеют некоторые технические препятствия, указанные в табл. 13 на с. 26, для биотрансформации - возможной ферментативной конверсии - таких данных нет.
Способ ферментативного получения РИСА приводится в АО 2009/023174. В данном раскрытии образец гидроксиметилфурфураля окисляют хлорпероксидоредуктазой и пероксидом водорода, причем окисленные продукты имеют карбоксильную группу в положении С1 гидроксиметилфурфураля, в частности формилфуранкарбоновая кислота или РИСА. Результаты приводятся, например, на фиг. 1. В другом воплощении НМР вводят в контакт с оксидоредуктазой в присутствии окисляющего субстрата, посредством чего НМР окисляется по меньшей мере до одной из кислот - диформилфуран- или формилфуранкарбоновой кислоты.
Недостатками известного способа по АО 2009/023174 является то, что для реакции требуется пероксид водорода, и что полученный продукт представляет собой смесь РИСА с двумя загрязняющими побочными продуктами гидроксиметилфуранкарбоновой кислотой (НтРСА) и формилфуранкарбоновой кислотой (РРСА). В результате образование РИСА из НМР снижается, и требуются дополнительные стадии извлечения для получения РИСА, по существу, в очищенной форме.
В базе данных ЕВ1, ишрой В2Т4К.9, идентифицирована последовательность из 577 аминокислот, которая на основе анализа гомологии была определена как глюкоза-метанол-холин-оксидоредутаза в полной последовательности хромосомы 1 Вигк1ю1бепа ркуЮйгтаик ΡδΙΝ.
В базе данных ЕВ1, Пирог! В21820, идентифицирована последовательность из 576 аминокислот, которая на основе анализа гомологии была определена как глюкоза-метанол-холин-оксидоредутаза в полной последовательности плазмиды 1 ВшккоЮейа ркутаЮт 8ТМ815.
В □енг/еи М.Р.1. е! а1., 1. СагЬоЬубга1е СНетМгу. 16(3), 299-309 (1997), раскрывается катализируемое хлорпероксидазой окисление 5-гидроксиметилфурфураля. Реакция протекает с 60-74% селективностью в отношении фуран-2,5-дикарбоксальдегида (РИС). Побочными продуктами являются гидроксиметил-2-фуранкарбоновая кислота (НРСА) и 5-формилфуран-2-карбоновая кислота (РРСА).
Сущность изобретения
Целью изобретения является оксидоредуктаза, которая может использовать для окислительновосстановительных реакций молекулярный кислород. Другой целью является оксидоредуктаза, которая имеет широкий спектр реакций. Другой целью является оксидоредуктаза, которая имеет высокую региоспецифичность. Другой целью изобретения является способ получения РИСА, при котором можно избежать образования значительного количества побочных продуктов. Другой целью изобретения является способ получения 5-гидроксиметил-2-фуранкарбоновой кислоты (НМР-кислоты), при котором можно избежать образования значительного количества побочных продуктов. Одна или несколько указанных целей достигаются согласно изобретению.
Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды с оксидоредуктазной активностью. Полинуклеотиды по изобретению типично кодируют полипептид с оксидоредуктазной активностью, в частности Нт£Н-оксидоредуктазной активностью.
Согласно изобретению, таким образом, предлагается полипептид с оксидоредуктазной активностью, который включает аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 3, или аминокислотную последовательность, кодированную нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 4, или вариант такого полипептида, имеющего 45% или большую идентичность последовательности с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3.
Такие полипептиды-оксидоредуктазы представляют ферментную альтернативу химических путей окисления для получения ценного соединения РИСА, допускающую умеренные условия реакции (30°С,
- 1 025990 рН 7) и образование меньшего количества отходов. Оксидоредуктаза является истинной оксидазой, т.е. для реакции окисления требуется только молекулярный кислород, причем снимается требование регенерации дорогостоящих кофакторов. Фермент предоставляет широкую реакционную специфичность и региоспецифичность, окисляя как спиртовые, так и альдегидные группы в итоге до карбоновой кислоты, безотносительно, находятся эти группы в положении С2 или С5 фуранового цикла.
Изобретение также относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, включающему нуклеотидную последовательность по изобретению, и клетке, включающей полипептид, полинуклеотид или вектор по изобретению.
Изобретение также относится к способу получения полипептида с оксидоредуктазной активностью, включающему культивирование клетки по изобретению в условиях, которые допускают экспрессию указанного полипептида, и, необязательно, извлечение экспрессированного полипептида, и полипептиду, который может быть получен таким способом.
Другое воплощение изобретения относится к комплексному способу получения РИСА из сырьевого потока, богатого (обогащенного) фруктозой, с использованием устойчивого биокатализатора на основе целых клеток.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Схема реакций окисления, катализируемых оксидоредуктазой НтРИ.
Фиг. 2. Плазмидная карта экспрессирующего вектора Нш£Н р1Т'Ьт£И. РРас' - промотор Рас; гер - ген, кодирующий белок репликации рК01600; дтК - ген устойчивости к гентамицину; Ыа - бета-лактамаза; ρΚ01600-οτί - область начала репликации для Р. рцййа; рИС οτί - область начала репликации для Е.соП.
Фиг. 3. Схематическое представление генетической организации генов метаболизма фурфураля и НМР в С. Ьа811еи818 НМР14 (верхняя строка на фиг. 3а и 3с) и других видах (оставшиеся строки на фиг. 3 а с продолжением на фиг. 3 с).
Фиг. 4. Образование РИСА, НМР-спирта (НМР-о1) и НМР-кислоты (Н-кислота) из НМР в неочищенном клеточном экстракте Р. риййа 812 рРТЬтРН.
Фиг. 5. Образование НМР-кислоты и РИСА в культуре с подпиткой Р. риИ<4а_р.1Т'11тРН. Стрелка слева показывает начало подпитки НМР; стрелка справа показывает добавление глицерина к подпитке.
Фиг. 6. Образование НМР-кислоты и РИСА в культуре с подпиткой Р. риР1Йа_р4Т'ЬтРН.
Фиг. 7А. Концентрации НМР-кислоты, РИСА и биомассы при ферментации с подпиткой в примере
VIII.
Фиг. 7В. Скорости подачи глицерина и НМР при ферментации с подпиткой в примере VIII.
Краткое описание перечня последовательностей
8ЕО ГО N0: 1 представляет последовательность ДНК праймера ΕΝ23: 5'С00ААТТССАСАТ0АСАА0000А0АСС0-3'. Подчеркнутая последовательность показывает сайт рестрикции ЕсоКР
8Е0 ГО N0: 2 представляет последовательность ДНК праймера РШ4; 5'СССААТТСССТТСОРТСТТСААСТСССАТ0-3'. Подчеркнутая последовательность показывает сайт рестрикции ЕсоКР
8Е0 ГО N0: 3 представляет аминокислотную последовательность Р НтРН.
8Е0 ГО N0: 4 представляет кодирующую последовательность ПтГН.
Подробное описание изобретения
В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения слова заключать в себе и включать и такие вариации, как заключает в себе, заключающий в себе, включает и включающий следует интерпретировать как включительно. Иными словами, указанные слова предназначены для выражения возможного включения, где это допускает контекст, других не перечисленных конкретно элементов или целых чисел.
Единственное число, используемое в данном описании, относится к одному или больше, чем одному (т.е. по меньшей мере одному) объекту. Например, элемент может означать один элемент или больше одного элемента.
Широкий спектр реакций в данном описании означает, что оксидоредуктаза может действовать как катализатор для нескольких различных субстратов, например НМР, НМР-кислоты, НМР-спирта, фурфураля, фурфурилового спирта. Региоспецифичность означает, что она окисляет только определенные атомы С.
Полипептид-оксидоредуктаза.
Полипептид по изобретению, обладающий оксидоредуктазной активностью, включает аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0: 3, или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной 8Е0 ГО N0: 4, или его вариант, имеющий по меньшей мере 45% идентичность с последовательностью, представленной 8Е0 ГО N0: 3.
В одном воплощении вариант молекулы нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, включающую, по существу, гомологичную нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 66, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или больше гомологичную нуклеотидной последовательностью, представленной 8Е0 ГО N0: 4. В другом воплощении вари- 2 025990 ант белка включает, по существу, гомологичную аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или больше гомологичную аминокислотной последовательностью, представленной 8ЕС ГО N0: 3.
Воплощением изобретения является полинуклеотид, который включает (а) нуклеотидную последовательность, представленную 8ЕС ГО N0: 4; (Ь) нуклеотидную последовательность, которая селективно гибридизируется с полинуклеотидом, который обратно комплементарен 8ЕС ГО N0: 4; (с) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 66% или большую идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью 8ЕС ГО N0: 4; (б) фрагмент нуклеотидной последовательности, определенной в (а), (Ь) или (с), который имеет по меньшей мере примерно 100 нуклеотидов в длину; (е) вырожденная последовательность, как результат вырожденности генетического кода до последовательности, определенной в любом из (а), (Ь), (с) или (б); (ί) нуклеотидная последовательность, обратно комплементарная нуклеотидной последовательности, определенной в (а), (Ь), (с), (б) или (е), или кодирует полипептид; и родственные полипептиды.
Одним воплощением является конструкция нуклеиновой кислоты, включающая полинуклеотид, при этом содержание СС может составлять 56% или больше, 58% или больше или 58-65%. Другим воплощением является вектор, включающий нуклеотидную последовательность или конструкцию нуклеиновой кислоты.
Термины гомология, идентичность последовательности и т.п. используются в данном описании как взаимозаменяемые. Для цели данного изобретения в данном описании определяется, что для того, чтобы определить степень идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеотидных последовательностей, последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, в последовательность первой аминокислоты или нуклеотидной последовательности могут быть введены гэпы (пробелы) для оптимального выравнивания со второй нуклеотидной последовательностью). Такое выравнивание можно осуществить по всей длине сравниваемых последовательностей. С другой стороны, выравнивание можно осуществить для сравнения по меньшей длине, например, по примерно 20, примерно 50, примерно 100 или больше нуклеиновым кислотам/основаниям или аминокислотам.
Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих позициях аминокислот или нуклеотидных позициях. Когда позиция в первой последовательности занята таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом как и в соответствующей позиции во второй последовательности, тогда молекулы являются идентичными в указанной позиции. Степень идентичности между двумя последовательностями типично выражается в процентах идентичности между двумя последовательностями и является функцией числа идентичных позиций, у последовательностей (т.е. % идентичности = число идентичных позиций/общее число позиций (т.е. перекрывающихся позиций) х 100). Предпочтительно две сравниваемые последовательности имеют одинаковую или по существу одинаковую длину.
Специалисту будет известен тот факт, что для определения гомологии между двумя последовательностями доступно несколько различных компьютерных программ. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно выполнить с использованием математического алгоритма. В предпочтительном воплощении идентичность в процентах между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма №еб1ешаи апб Щиизсй (1. Μοί. ΒίοΙ. (48): 444-453 (1970)), который включен в программу САР в программном обеспечении Ассе1г\ь ССС (доступно на Ьйр://№№№.ассе1гу8.сот/ргобис18/дсд/), с использованием или матрицы Вю88ош 62 или матрицы РАМ250 и штраф за открытие гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штраф за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалисту следует иметь в виду, что все указанные различные параметры будут давать несколько различные результаты, но что общая идентичность двух последовательностей, выраженная в процентах, существенно не изменяется с использованием различных алгоритмов.
В еще одном воплощении идентичность в процентах между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы САР в программном обеспечении Ассе1гуз ССС (доступно на Ьйр://№№№.ассе1гу8.сот/ргобис18/дс§/), с использованием матрицы ЖУЗдарбпа.СМР и штрафа за открытие гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 и штрафа за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом воплощении идентичность двух аминокислотных последовательностей, выраженную в процентах, определяют с использованием алгоритма Е. Меуегз апб Щ. Мб1ег (САВЮ8, 4: 11-17 (1989), который включен в программу АЫСЫ (версия 2.0) (доступна на АЙЮН Снегу с использованием данных о последовательностях сервера Сеиезйеаш 1СН Мои1ре11ег Ргаисе Ьйр://уеда.1дЬ.сиг8.£г/Ь1и/а11ди-дие88.сд1) с использованием таблицы веса замен аминокислотных остатков РАМ120, штрафа за продолжение гэпа 12 и штрафа за открытие гэпа 4.
Нуклеотидные и белковые последовательности по настоящему изобретению также можно использовать в качестве запросной (диету) последовательности для осуществления поиска в базах данных общего пользования для, например, идентификации других членов семейства или родственных последовательностей. Такой поиск можно выполнять с использованием программ ВЬАЗТи и ВЬАЗТх (версия 2.0) АЙ8сйи1 е! а1. (1990), ί. Мо1. Вю1., 215: 403-10. Поиск нуклеотидов по ВЬА§Т можно выполнять с помо- 3 025990 щью программы МВЬЛ§Т, количество = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты кодирующим оксидоредуктазу по изобретению. Поиск белков по ВЬА3Т можно выполнять с помощью программы ВЬА3Тх, количество = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белка оксидоредуктазы по изобретению. Для того чтобы получить выравнивания с гэпами для целей сравнения, можно использовать Саррей ВЬА3Т, как описано в ЛЙ8сЬи1 е! а1. (1997), Ыискю Лс1Й8 Кее., 25(17): 33893402. Когда используют программы ВЬА3Т и Саррей ВЬА3Т, можно использовать принимающие значение по умолчанию параметры соответствующих программ (например, ВЬА3Тх и ВЬА3Тп). См. собственную страницу Ναΐίοηαΐ Сеп!ег £от В|о1есНпо1оду 1пГотта!юп на 1Шр://\у\у\\\псЬинтлн11.8оу/.
Используемый в данном описании термин селективная гибридизация, гибридизуется селективно и подобные термины предназначены для описания условий гибридизации и отмывки, при которых нуклеотидные последовательности по меньшей мере на 66%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, предпочтительнее по меньшей мере на 85%, даже предпочтительнее по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, предпочтительнее по меньшей мере на 98% или предпочтительнее по меньшей мере на 99% гомологичные друг другу, типично остаются гибридизированными друг с другом. Иначе говоря, такие гибридизирующие последовательности могут иметь последовательности, идентичные по меньшей мере на 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, предпочтительнее по меньшей мере 85%, даже предпочтительнее по меньшей мере 90%, предпочтительнее по меньшей мере 95%, предпочтительнее по меньшей мере 98% или предпочтительнее по меньшей мере 99%.
Предпочтительным неограничительным примером таких условий гибридизации является гибридизация в 6Х буфере хлорид натрия/цитрат натрия (33С) при примерно 45°С с последующей одной или несколькими отмывками 1 X 33С, 0,1% 3Ό3 при примерно 50°С, предпочтительно 3Ό3 при примерно 55°С, предпочтительно при примерно 60°С и даже предпочтительнее при примерно 65°С.
Особенно жесткие условия включают, например, гибридизацию при примерно 68°С в 5х 33С/5х раствор Денхардта/0,1% 3Ό3 и отмывку в 0,2 33С/0,1% 3Ό3 при комнатной температуре. С другой стороны, промывку можно осуществлять при 42°С.
Специалистам в данной области техники будет известно, какие условия применяются для гибридизации в жестких и особенно жестких условиях. Дополнительные указания, касающиеся таких условий, легко доступны в уровне техники, например, из 3атЬтоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошп§, А ЬаЬота1оту Мапиа1, Со1й 3рйпд НагЬог Рге88, Ν.Υ.; и Аи8иЬе1 е! а1. (ей8.), 1995, Сиггеп! РгоЮсок ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1оЬп \УПеу & 3оп8, Ν.Υ.).
Конечно, полинуклеотид, который гибридизирует только с последовательностью поли-А (такой как 3'-концевой участок поли(А) мРНК) или с комплементарным участком остатков Т (или и), не включается в полинуклеотид по изобретению, используемый для специфической гибридизации с частью нуклеиновой кислоты по изобретению, так как такой полинуклеотид может гибридизировать с любой молекулой нуклеиновой кислоты, включающей участок поли(А) или его комплемент (например, практически любым клоном двухцепочечной кДНК).
При типичном подходе можно скринировать библиотеки генов, сконструированные из других организмов, например, бактерии, в частности, из микроорганизма семейства Тйскотасеае, например, из рода ВшкЬо1йепа, такго как Вигк1ю1йепа рку!ойттап8.
Например, штаммы Вигк1ю1йепа можно скринировать на гомологичные полинуклеотиды оксидоредуктазы анализом методом саузерн-блоттинга. После детекции гомологичных фрагментов рестрицированной ДНК по изобретению библиотеки генов можно сконструировать из хромомосомных фрагментов такого же размера из соответствующего штамма с использованием стандартных методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. С другой стороны, если микроорганизм является эукариотом, можно идентифицировать транскрипт мРНК Нт1Н оксидоредуктазы норзерн-гибридизаций, и после идентификации транскрипта можно получить библиотеки кДНК с использованием РНК, выделенной из эукариотического микроорганизма.
Гомологичные последовательности генов можно выделить, например, осуществляя ПЦР с использованием двух пулов вырожденных олигонуклеотидных праймеров, созданных на основе нуклеотидных последовательностей по данному описанию.
Матрица для реакции может представлять собой тотальную хромосомную ДНК из штамма, о котором известно или предполагается, что он экспрессирует полинуклеотид по изобретению. Продукт ПЦР можно субклонировать и секвенировать для того, чтобы гарантировать, что амплифицированные последовательности представляют последовательности нуклеотидной последовательности новой оксидоредуктазы или их функциональный эквивалент.
С другой стороны, матрица для реакции может представлять собой кДНК, полученную обратной транскрипцией мРНК, полученной из штаммов, о которых известно или предполагается, что они экспрессируют полинуклеотид по изобретению. Продукт ПЦР можно субклонировать и секвенировать для того, чтобы гарантировать, что амплифицированные последовательности представляют собой последо- 4 025990 вательности нуклеотидной последовательности новой оксидоредуктазы или их функциональный эквивалент.
Затем можно использовать фрагмент ПЦР для выделения полноразмерного клона ДНК различными известными методами. Например, амплифицированный фрагмент можно пометить и использовать для скрининга бактериофаговой или космидной библиотеки кДНК. С другой стороны, меченный фрагмент можно использовать для скрининга геномной библиотеки.
Технологию ПЦР также можно использовать для выделения полноразмерных последовательностей кДНК из других организмов. Например, следуя стандартным процедурам можно выделить РНК из соответствующего клеточного или тканевого источника. Реакцию обратной транскрипции можно выполнить на РНК с использованием олигонуклеотидного праймера, специфичного для большей части 5'-конца амплифицированного фрагмента, для затравки синтеза первой цепи.
Затем полученный гибрид РНК/ДНК можно нарастить (например, гуанинами) с использованием стандартной реакции с концевой трансферазой, гибрид можно гидролизовать РНКазой Н, и затем можно начать синтез второй цепи (например, с помощью праймера поли-С). Таким образом, можно легко выделить последовательности кДНК, локализованные выше (ир-8!теат) амплифицированного фрагмента. Обзор по применимым стратегиям клонирования см., например, в ЗатЬгоок е! а1., цитировано выше, и Аи8иЬе1 е! а1., цитировано выше.
Другой аспект изобретения относится к векторам, включая клонирующие и экспрессирующие векторы, включающие полинуклеотид по изобретению, кодирующий белок оксидоредуктазы, или его функциональный эквивалент, и способам наращивания, трансформации или трансфекции таких векторов в подходящей клетке-хозяине, например, в условиях, в которых происходит экспрессия полипептида по изобретению. Используемый в данном описании термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена.
Полинуклеотиды по изобретению могут быть введены в рекомбинантный реплицирующийся вектор, например, клонирующий и экспрессирующий вектор. Вектор может быть использован для репликации нуклеиновой кислоты в совместимой клетке-хозяине. Таким образом, в другом воплощении изобретение относится к способу получения полинуклеотидов по изобретению путем введения полинуклеотида по изобретению в реплицирующийся вектор, введения вектора в совместимую клетку-хозяина и выращивания клетки-хозяина в условиях, которые вызывают репликацию вектора. Вектор можно извлечь из клетки-хозяина. Подходящие клетки-хозяева описываются ниже.
Вектор, в который встраивают экспрессирующую кассету или полинуклеотид по изобретению, может представлять собой любой вектор, с которым можно работать методами работы с рекомбинантной ДНК, и выбор вектора обычно будет зависеть от клетки-хозяина, в которую его вводят.
Вектор по изобретению может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует как внехромосомный объект, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например плазмиду. С другой стороны, вектор может представлять собой вектор, который, когда введен в клетку-хозяина, интегрируется в геном клетки-хозяина и реплицирует вместе с хромосомой(ами), в которую(ые) он интегрирован.
Одним типом вектора является плазмида, которая относится к кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы с бактериальной областью начала репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) после введения в клетку-хозяина интегрируются в геном клетки-хозяина и в связи с этим реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном описании отнесены к экспрессирующим векторам. Вообще, экспрессирующие векторы, применимые в методах рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. Термины плазмида и вектор в данном описании могут использоваться как взаимозаменяемые, так как плазмида является наиболее традиционно используемой формой вектора. Однако предполагается, что изобретение включает все другие формы экспрессирующих векторов, такие как космида, вирусные векторы (например, реплицирующие дефектные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы) и фаговые векторы, которые обслуживают эквивалентные функции.
Векторы по изобретению могут использоваться ίη νίΐτο, например, для получения РНК, или использоваться для трансфекции или трансформации клетки-хозяина.
Вектор по изобретению может включать два или больше, например, три, четыре или пять, полинуклеотидов по изобретению, например, для сверхэкспрессии.
Рекомбинантные экспрессирующие векторы включают нуклеиновую кислоту по изобретению в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что рекомбинантный экспрессирующий вектор включает одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных с учетом клеток-хозяев, используемых для экспрессии, которые функционально соединены с экспрессируемой нуклеотидной последовательностью.
- 5 025990
Для вектора, такого как экспрессирующий вектор, термин функционально соединенный предназначен для обозначения того, что нуклеотидная последовательность, представляющая интерес, соединена с регуляторной(ыми) последовательностью(ями) способом, который допускает экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в системе транскрипция/трансляция ίη νίΐτο или в клетке-хозяине, когда вектор введен в клетку-хозяина), т.е. термин функционально соединенный относится к непосредственному соседству, при этом описанные компоненты находятся в соотношении, позволяющем им функционировать предназначенным для них образом. Регуляторная последовательность, такая как промотор, энхансер или другой фактор, регулирующий экспрессию, функционально соединенный с кодирующей последовательностью, размещается таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условии совместимости с регулярными последовательностями, или последовательности располагаются так, что они функционируют вместе для цели, для которой предназначены, например, транскрипция инициируется в промоторе и протекает через последовательность ДНК, кодирующую полипептид.
Термин регуляторная последовательность или управляющая последовательность предназначен для включения промоторов, энхансеров и других регулирующих экспрессию элементов (например, сигнала полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Соеййе1; Сепе Ехртеккюп ТесИпо1оду: МеОюДк ίη Еп7ушо1оду, 185, Асайеш1с Ргекк, §ап И1едо, СА (1990).
Термин регуляторные или управляющие последовательности включает такие последовательности, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и такие, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в некоторых клетках-хозяевах (например, тканеспецифические регуляторные последовательности).
Вектор или экспрессирующая конструкция для данной клетки-хозяина может включать, таким образом, следующие элементы, функционально соединенные друг с другом в последовательном порядке от 5'-конца к З'-концу относительно кодирующей цепи, кодирующей полипептид по изобретению: (1) промоторную последовательность, способную управлять транскрипцией нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, в данной клетке-хозяине; (2) необязательно, сигнальную последовательность, способную управлять секрецией полипептида из данной клетки-хозяина в культуральную среду; (3) последовательность ДНК по изобретению, кодирующую зрелую и предпочтительно активную форму полипептида, имеющего активность целлобиогидролазы; и предпочтительно также (4) участок терминации транскрипции (терминатор), способный терминировать транскрипцию расположенный ниже (До\\п к!геаш) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид.
После нуклеотидной последовательности по изобретению может быть расположен 3'нетранслируемый участок, содержащий один или несколько сайтов терминации транскрипции (например, терминатор). Источник терминатора является менее критическим. Терминатор може, например, являться нативным для последовательности ДНК, кодирующей полипептид. Однако предпочтительно используют терминатор дрожжей в дрожжевых клетках-хозяевах, и терминатор мицелиальных грибов используют в клетках-хозяевах мицелиальных грибов. Предпочтительнее, терминатор является эндогенным для клетки-хозяина (в которой должна экспрессироваться нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид). В транскрибированном участке для трансляции может присутствовать сайт связывания рибосом. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессированных конструкциями, будет включать инициирующий трансляцию АИС в начале и терминирующий кодон, соответственно расположенный в конце транслированного полипептида.
Усиленной экспрессии полинуклеотида по изобретению также можно достичь путем отбора гетерологичных регуляторных участков, например, промотора, лидерной последовательности секреции и/или участков терминации, которые могут служить для усиления экспрессии и, если желательно, уровней секреции белка, представляющего интерес, из экспрессирующего хозяина и/или для обеспечения индуцибельного управления экспрессией полипептида по изобретению.
Специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что конструкция экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии нужного белка и т.д. Векторы по изобретению, такие как экспрессирующие векторы, могут быть введены в клетки-хозяев для того, чтобы посредством этого получать белки или пептиды, кодированные нуклеиновыми кислотами, как описано в данном описании (например, белки-оксидоредуктазы, мутантные формы белков-оксидоредуктаз, их фрагменты, варианты или функциональные эквиваленты, слитые белки и т.д.).
Векторы по изобретению, такие как рекомбинантные экспрессирующие векторы, могут быть сконструированы для экспрессии белков-оксидоредуктаз в клетках прокариот или эукариот. Например, белки-оксидоредуктазы могут быть экспрессированы в бактериальных клетках, таких как клетки Е.соП. клетках насекомых (с использованием бакуловирусных экспрессирующих векторов), клетках мицелиальных грибов, дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева также обсуждаются в Соеййе1, Сепе Ехртеккюп ТесИпо1оду: МеШойк ш Еп7ушо1оду, 185, Асайешю Ргекк, 8ап И1едо, СА (1990). Репрезентативные примеры соответствующих хозяев описываются в данном описании далее.
- 6 025990
Соответствующие культуральные среды и условия для вышеописанных клеток-хозяев известны в технике.
Как указано выше, термин управляющие последовательности или регуляторные последовательности определяется в данном описании как включающий, по меньшей мере, любой компонент, который может быть необходим и/или выгоден для экспрессии полинуклеотида. Любая управляющая последовательность может быть нативной или чужеродной для нуклеотидной последовательности по изобретению, кодирующей полипептид. Такие управляющие последовательности могут включать, но не ограничиваются указанным, промотор, лидерную последовательность, оптимальные последовательности инициации трансляции (как описано в Ко/ак, 1991, 1. ΒίοΙ. Сйеш., 266: 19867-19870), сигнальную последовательность секреции, пропептидную последовательность, последовательность полиаденилирования, терминатор транскрипции.
Как минимум, управляющая последовательность типично включает промотор и стоп-сигналы транскрипции и трансляции.
Устойчиво трансформировнный микроорганизм представляет собой микроорганизм, который имеет один или больше фрагментов ДНК, введенных таким образом, что введенные молекулы сохраняются, реплицируются и сегрегируются в растущей культуре. Устойчивая трансформация может иметь место из-за нескольких или одной хромосомной интеграции или за счет внехромосомного(ых) элемента(ов), такого(их) как плазмидный(е) вектор(ы). Плазмидный вектор способен управлять экспрессией полипептида, кодировнного определенными фрагментами ДНК.
Экспрессия может быть конститутивной или регулируемой индуцируемыми (или репрессируемыми) промоторами, что делает возможным достичь высоких уровней транскрипции функционально ассоциированных фрагментов ДНК, кодирующих специфические полипептиды.
Выделение оксидоредуктазы.
Оксидоредуктазу или материал ДНК, экспрессирующий оксидоредуктазу, можно выделить из организма, предпочтительно микроорганизма, который экспрессирует оксидоредуктазу. Предпочтительно микроорганизм способен использовать НМР, но это не является необходимостью. Микроорганизм предпочтительно выбирают из группы, состоящей из СирпаОбих. Вигк1ю16епа. ВгабуНп/оЬшт. Ме1ку1оЪас1епит: Сирпа\зби8 Ъа818Неп818, Вигк1ю1бепа рйу1ойттап8, ВгабуНп/оЪшт _)аротсит, Ме1йу1оЬас1ег1ит габю1о1егаи8, Сирпа\зби8 Ъа818Йеп818 НМР14, Вигк1ю1бепа рНуЮПгтащ ΡδΙΝ, ВгабуНп/оЪшт _)аротсит υδΌΆ110, Ме1ку1оЪас1ег1ит габюЮ1егап8 1СМ2831.
Наиболее предпочтительной оксидоредуктазой, применимой в настоящем изобретении, является оксидоредуктаза, использующая НМР, и оксидоредуктаза, выделенная в данном случае из Сирпа\зби8 Ъа818Йеи818 НМР14, депонированного согласно Будапештскому соглашению о международном признании депозитов микроорганизмов для цели патентных процедур при О§М2: Сирпау1би8 Ъа818Йеи818 НМР14 = О§М 22875, дата депонирования 19 августа 2009 г., депозитор ΤΝΟ, 8сйоетакегх1гаа1 97, 2628УК Ое1Й Нидерланды.
Таким образом, авторы изобретения выделил использующую НМР бактерию штамм Сирпау1би8 Ъа818Неп818 НМР14 и идентифицировали гены, вовлеченные в путь разрушения НМР. Один из генов (в данном описании определенный как Ьт£Н) кодирует РАЭ-зависимую оксидоредуктазу из 579 аминокислот в 62 кД, которая, как обнаружено, окисляет фурфуриловый спирт, фурфураль, НМР и 5гидроксиметилфуроиновую кислоту.
Спиртовые/альдегидные группы при С2 и С5 в таких молекулах окисляются, не требуя дополнительной полинуклеотидной конструкции, кодирующей редуктазу, хотя присутствие таких активностей может быть выгодным (см. фиг. 1).
Таким образом, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, например, ферментам с оксидоредуктазной активностью (активности ЕС 1.1 + ЕС 1.2). В данном случае ферменты являются подклассом полипептидов.
Реакция окисления.
Реакция окисления в данном случае представляет собой одно или несколько взаимодействий окислителя с производным фурана в присутствии оксидоредуктазы по изобретению и одного или нескольких коферментов (описанных в данном описании ниже). Реакция окисления может включать стадию реакции окисления, приводящую к продукту (например, окисление НМР-кислоты до РОСА). С другой стороны, она может включать более одной стадии реакции окисления, причем каждая стадия приводит к промежуточному соединению, где последнее промежуточное соединение представляет собой конечный продукт (например, окисление НМР до РОСА). Примеры реакций окисления приводятся на фиг. 1.
Одна стадия реакции окисления представляет собой получение 2,5-фурандикарбоновой кислоты (РОСА), при этом один или несколько фурановых предшественников РОСА превращаются в РОСА путем взаимодействия с окислителем в присутствии оксидоредуктазного катализатора и одного или нескольких коферментов, при этом оксидоредуктазный катализатор включает полипептид по изобретению. Фурановый предшественник РОСА можно выбрать из группы, состоящей из 5-гидроксиметилфурфураля (НМР), 2,5-дигидроксиметилфурана (НМР-спирт) и 5-гидроксиметил-2-фуранкарбоновой кислоты (НМР-кислота), предпочтительно фурановый предшественник представляет собой НМР. НМР можно
- 7 025990 получить из одного или нескольких сахаров-гексоз путем нагревания в присутствии кислоты обычным путем. Сахара-гексозы можно получить из биомассы. Реакция окисления также может представлять собой способ получения 5-гидроксиметил-2-фуранкарбоновой кислоты (НМР-кислоты), при этом один или несколько фурановых предшественников НМР-кислоты превращаются в НМР-кислоту путем взаимодействия с окислителем в присутствии оксидоредуктазного катализатора и одного или нескольких коферментов, при этом оксидоредуктазный катализатор включает полипептид по изобретению. В одном воплощении фурановый предшественник НМР-кислоты выбирают из группы, состоящей из 5гидроксиметилфурфураля (НМР) и 2,5-дигидроксиметилфурана (НМР-спирта). Возможны другие способы окисления.
Реакции окисления предпочтительно проводят при относительно умеренной температуре, т.е. 1080°С, предпочтительнее 20-45°С, наиболее предпочтительно около 25-45°С. Во время реакции рН предпочтительно составляет 3-8, предпочтительнее, рН составляет примерно 7. Время реакции составляет 618 час с использованием атмосферного кислорода или чистого кислорода, и предпочтительно фермент является реакционноспособным в течение более длительного времени.
Реактор может представлять собой подходящий (продуваемый воздухом) биореактор. Он может работать периодически, непрерывно или предпочтительно с периодической подпиткой.
Продукты окисления, такие как РЭСЛ. НМР-кислота и т.д. можно извлечь из реакционной смеси путем охлаждения/перекристаллизации и отделения кристаллизованного продукта окисления, например, кристаллизованной ΡΌΟΆ. Однако подходящими являются и другие способы извлечения, известные в технике, такие как, но без ограничения, осаждение кислотой и экстракция растворителем.
Необязательно реакция происходит в присутствии кофермента. Кофермент может представлять собой никотинамидадениндинуклеотид (ΝΛΌ+) и/или флавинадениндинуклеотид (ΡΆΌ) и/или пирролохинолинхинолон (РЦЦ). В реакции окисления по изобретению обнаружен синергический эффект с дегидрогеназной активностью, например, обнаружена эндогенная активность дегидрирования в клетке, в которой происходит реакция окисления, или присутствует в клеточном экстракте таких клеток. Способ получения полимера из одного или нескольких мономеров, при этом один из мономеров представляет собой ΡΌΟΆ.
Окислитель.
Окислитель в реакциях по изобретению может представлять собой любой окислитель, предпочтительно кислород. Наиболее экономичным источником кислорода является воздух. Это выгодно в том отношении, что воздух легко получить из атмосферы бесплатно, он нетоксичен и нет необходимости удалять его после реакции. С другой стороны, можно использовать систему, высвобождающую молекулярный кислород. Систему, генерирующую кислород, в основном можно выбрать из различных генерирующих кислород систем, которые раскрыты в технике. Например, для генерации кислорода из пероксида водорода можно использовать ферменты каталазы, уже присутствующие в реакционной смеси.
Производные фурана.
Производные фурана, как понимается в данном описании, представляют собой любые соединения, имеющие фурановую группу, которые могут окисляться до 2,5-фурандикарбоновой кислоты или ее предшественника. Предпочтительные производные фурана включают гидроксиметилфурфураль (НМР), гидроксиметилфуранкарбоновую кислоту (НМР-кислоту), 2,5-дигидроксиметилфуран (НМР-спирт). Фурановый цикл или его любая способная замещаться подгруппа могут быть замещены, например, ОН, (С1-С10)-алкилом, алкилом, аллилом, арилом или простой эфирной КО-группой, включая циклические группы, в любом подходящем положении фуранового цикла.
Экспрессия оксидоредуктазы.
Независимо от точного механизма, используемого для экспрессии фермента, предполагается, что такая экспрессия может быть передана путем введения генов, кодирующих эти ферменты в другой клетке-хозяине, что может быть осуществлено способами, известными из уровня техники. Генетические элементы по определению в данном описании включают нуклеиновые кислоты (как правило, ДНК или РНК), имеющие экспрессируемые кодирующие последовательности для продуктов, таких как белки, специфические ферменты, апопротеины или антисмысловые РНК, которые экспрессируются или регулируют экспрессию релевантных ферментов. Экспрессированные белки могут функционировать как ферменты, репрессировать или дерепрессировать ферментативную активность или регулировать экспрессию ферментов. Рекомбинантные ДНК, кодирующие такие экспрессирующие последовательности, могут быть или хромосомными (интегрированными в хромосому клетки-хозяина, например, путем гомологичной рекомбинации) или внехромосомными (например, находящимися на одной или нескольких плазмидах, космидах и других векторах, способных к саморепликации). Понятно, что рекомбинантные ДНК, используемые для трансформации клетки-хозяина согласно изобретению, могут включать, кроме структурных генов и факторов транскрипции, последовательности, регулирующие экспрессию, включая промоторы, репрессоры и энхансеры, которые действуют, регулируя экспрессию или дерепрессию кодирующих последовательностей для белков, апопротеинов или антисмысловой РНК. Например, такие управляющие последовательности можно встроить в клетки-хозяев дикого типа для промотирования сверхэкспрессии выбранных ферментов, уже кодированных в геноме клетки-хозяина, или, с другой сто- 8 025990 роны, их можно использовать для регулируемого синтеза кодированных ферментов вне хромосом.
Рекомбинантную ДНК можно ввести в клетку-хозяина с помощью любых средств, включая, но не ограничиваясь указанным, плазмиды, космиды, фаги, искусственные дрожжевые хромосомы или другие векторы, которые опосредуют перенос генетических элементов в клетку-хозяина. Такие векторы могут включать область начала репликации вместе с цис-действующими управляющими элементами, которые регулируют репликацию вектора, и генетические элементы, которые несет вектор. На векторе могут иметься селективные маркеры для облегчения идентификации тех клеток-хозяев, в которые введены генетические элементы.
Способы введения генетических элементов в клетку-хозяина (например, клонирование) хорошо известны специалистам в данной области техники. Можно использовать внехромосомный многокопийный плазмидный вектор для встраивания генетических элементов по настоящему изобретению. Вызванное плазмидой введение генетического элемента в клетки-хозяев включает начальное расщепление плазмидного вектора рестриктазой с последующим лигированием плазмиды и генетических элементов, кодирующих ферменты-мишени по изобретению. После рециркуляризации лигированной рекомбинантной плазмиды используют инфекцию (например, упаковку в фаге-лямбда) или другой механизм переноса плазмиды (например, электропорацию, микроинъекцию и т.д.) для переноса плазмиды в клетку-хозяина. Плазмиды, подходящие для встраивания генетических элементов в клетку-хозяина, хорошо известны специалистам в данной области техники.
Другие методы клонирования генов включают, но не ограничиваются указанным, прямую интеграцию генетического материала в хромосому. Это можно осуществить различными способами, включая клонирование генетических элементов, описанных в данном описании, в нереплицирующиеся плазмиды, фланкированные последовательностями, гомологичными ДНК хозяйской хромосомы; после трансформации указанной рекомбинантной плазмиды в хозяина генетические элементы можно ввести в хромосому рекомбинацией ДНК. Такие рекомбинантные штаммы можно извлечь, если интегрирующиеся фрагменты ДНК содержат селектируемый маркер, такой как устойчивость к антибиотику. С другой стороны, генетические элементы можно непосредственно ввести в хромосому клетки-хозяина без использования нереплицирующейся плазмиды. Это можно осуществить путем синтетического получения фрагментов ДНК генетических элементов согласно настоящему изобретению, которые также содержат последовательность, гомологичную ДНК хозяйской хромосомы. Снова, если такие синтетические фрагменты ДНК также содержат селектируемый маркер, генетические элементы можно встроить в хозяйскую хромосому.
Клетка-хозяин.
Другим воплощением изобретения является клетка, включающая полипептид, полинуклеотид, полинуклеотидную конструкцию или вектор по изобретению. Клетка-хозяин представляет собой клетку, в которой соответственно могут быть экспрессированы полипептид, полинуклеотид, полинуклеотидная конструкция или вектор по изобретению.
В клетке-хозяине может быть благоприятно экспрессирована оксидоредуктаза. Клетка-хозяин по изобретению может представлять собой любую клетку-хозяина. Клетка может представлять собой клетку прокариот, клетку эукариот, клетку растения или клетку животного. В такой клетке один или несколько генов могут быть делетированы, нокаутированы или разрушены полностью или частично, при этом необязательно эти один или несколько генов кодируют протеазу. Согласно воплощению клеткахозяин по изобретению представляет собой эукариотическую клетку-хозяина. Предпочтительно эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, насекомого, растения, гриба или водоросли. Предпочтительные клетки млекопитающих включают, например, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки СО8, клетки 293, клетки РегСб и гибридомы. Предпочтительные клетки насекомых включают, например, клетки 8Г9 и 8Г21 и их производные. Предпочтительнее, эукариотическая клетка представляет собой клетку гриба, например, дрожжевую клетку, такую как клетка Саиб1ба, Напкепи1а, К1иууегошусек, РюЫа, 8ассйаготусек, 8с1и/окассйаготусек или штамма Уагго\\аа. Предпочтительнее, клетка представляет собой клетку К1иууегошусек 1асИк, 8. сегеуыае, Напкепи1а ро1утогрйа, Уаггсщаа йро1уИса и РюЫа ракЮпк или клетку мицелиального гриба. Предпочтительнее эукариотическая клетка представляет собой клетку мицелиального гриба.
Мицелиальный гриб включает мицелиальные формы подотдела Еишусо1а и Оотусо1а (как определено НауккуогШ е1 а1. в Атк\уог111 апб В1кйу'к Июбопагу оГ Тйе Риидц 81й ебШоп, 1995, САВ 1п1егпа1юпа1, ИшуегкИу Ргекк, Сатйпбде, ИК). Мицелиальные грибы характеризуются стенкой мицелия, состоящей из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и других сложных полисахаридов. Вегетативный рост происходит путем удлинения гифов, и углеродный катаболизм обязательно аэробный. Штаммы мицелиальных грибов включают, но не ограничиваются указанным, штаммы Асгетопшт, Адапсик, АкрегдШик, Аигеойаыбиич Сйгукокрогшш, Соргшик, Сгур1ососсик, РШйабабшт, Рикагшт, Нитюо1а, Мадпаробйе, Мисог, МусейорйШога, ЫеосаШтакбх, Ыеигокрога, Раесботусек, РетсШшт, Рботусек, Рапегосйае1е, Р1еиго1ик, 8сШ7орйу11ит, Та1аготусек, Тйегтоаксик, ТШе1ау1а, То1урос1абшт и Тпсйобегта.
Предпочтительные клетки мицелиальных грибов принадлежат видам АкрегдШик, Сйгукокрогшш, РетсШшт, Та1аготусек или роду Тпсйобегта и наиболее предпочтительно видам АкрегдШик шдег, АкрегдШик ауашогг, АкрегдШик Гоейбик, АкрегдШик ко.)ае, АкрегдШик ГитгдаШк, Та1аготусек етегкопл, Ак- 9 025990 рсгдШик огу/ас, СЬгукокрогшт 1искпо\усп5с. ТпсЬобсгта гсскс1 или РсшсгШит сЬгукодспит. Когда клетка-хозяин по изобретению представляет собой клетку-хозяина АкрсгдШик, клетка-хозяин предпочтительно представляет собой СВ8 513.88, СВ8124.903 или их производные.
Некоторые штаммы мицелиальных грибов легко общедоступны в ряде коллекций культур, таких как Американская коллекция типовых культур (АТСС), ПсйксЬс 8атт1ипд уоп МПаоогдашктсп ииб 2с11ки11игсп СтЬН (ΌδΜΖ), Ссп1гаа1Ьигсаи Уоог 8сЫттс1си11игск (СВ8) и Адггси11ига1 КсксагсЬ 8сгугсс Ра1си1 СиНигс Со11сс1юп, ЫойЬсгп Ксдюпа1 КсксагсЬ Ссп1сг (ИККЬ), например, штаммы АкрсгдШик тдсг СВ8 513.88, АкрсгдШик огу/ас АТСС 20423, 1РО 4177, АТСС 1011, АТСС 9576, АТСС14488-14491, АТСС 11601, АТСС12892, Р. сЬгукодспит СВ8 455.95, РсшсгШит сШгпит АТСС 38065, РсшсгШит сЬгукодспит Р2, Та1аготусск стсгкопи СВ8 124.902, Асгстошит сЬгукодспит АТСС 36225 или АТСС 48272, ТггсЬобсгта гссксг АТСС 26921 или АТСС 56765 или АТСС 26921, АкрсгдШик ко)ас АТСС11906, СЬгукокроггит Шскпозуспкс АТСС44006. Также можно использовать их производные.
Согласно другому воплощению клетка-хозяин по изобретению представляет собой клетку прокариот. Предпочтительно прокариотическая клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку. Термин бактериальная клетка включает как грамотрицательные, так и грамположительные микроорганизмы. Подходящие бактериальные клетки можно выбрать, например, из ЕксЬсггсЫа, Аткаспа, Саи1оЬас1сг, С1исопоЬас1сг, КЬобоЬас1сг, Рксиботопак, Рагасоссик, ВасШик, ВгсугЬас1сгшт, СогупсЬас1сгшт, КЫ/оЬгит (8шогЫ/оЬшт), Р1ауоЬас1сгшт, К1сЬкгс11а, Еп1сгоЬас1сг, Ьас1оЬасг11ик, Ьас1ососсик, МсШу1оЬас1сгшт, 81арЬу1ососсик или 81гср1отусск. Предпочтительно бактериальную клетку выбирают из группы, состоящей из В. киЫШк, В. ату1о1гдис1асгспк, В. ЦсЬстйгтгк, В. рипИк, В. тсда1сгшт, В. Ьа1обигапк, В. ритПик, С1исопоЬас1сг охубапк, Саи1оЬас1сг сгскссйик СВ 15, Мс1Ьу1оЬас1сгшт схШтцист, КЬобоЬас1сг крЬасгогбск, Рксиботопак ζсаxайЫп^1ас^спк. Рксиботопак рйгба, Рксиботопак рийба 812, Рагасоссик бсйШйсапк, Е.соИ, С. д1йатгсит, 81арЬу1ососсик сагпокик, 81гср1отусск Иугбапк, 81погЫ/оЬ1ит тсПоЦ и КЫ/оЫит гаФоЬайсг.
Для специфического использования соединения, полученного в клетке-хозяине по изобретению, можно осуществить отбор клетки-хозяина для такого использования. Когда, например, соединение, полученное в клетке-хозяине по изобретению, следует использовать в применениях к пищевым продуктам, клетку-хозяина можно выбрать из пищевых микроорганизмов, таких как 8ассЬаготусск ссгсуыас. Специфическое использование включает, но не ограничивается указанным, применения в пищевых продуктах, кормах (для животных), в фармации, сельском хозяйстве, например, для защиты посевов, и/или для личной гигиены.
Изобретение также относится к способу получения полипептида с оксидоредуктазной активностью, который включает культивирование клетки по изобретению в условиях, в которых возможна экспрессия указанного полипептида, и, необязательно, извлечение экспрессированного полипептида, и к полипептиду, который можно получить таким способом.
Исходный материал.
Сельскохозяйственные культуры, по природе богатые фруктанами (например, корни топинамбура или цикория), можно превратить в богатый НМР исходный материал обычным (комбинированным) гидролизом и термохимической обработкой. Технология получения НМР из фруктозы хорошо отработана и является надежной. Также можно использовать исходный материал, богатый глюкозой, но термохимическое получение НМР проходит более эффективно из фруктозы. Поэтому может быть включена дополнительная ферментативная стадия для превращения глюкозы во фруктозу с использованием глюкозоизомеразы. Последний процесс хорошо отработан в пищевой промышленности для получения кукурузной патоки с высоким содержанием фруктозы (НРС8) из гидролизованного крахмала. Для того чтобы избежать конкуренции с применениями в пищевых продуктах, для получения НМР/РИСА предпочтительным исходным материалом может быть гидролизат лигноцеллюлозы.
Биотрансформация.
Для биотрансформации НМР в РИСА используют надежный биокатализатор на основе целых клеток (свободные или иммобилизованные клетки), который экспрессирует НМР-оксидоредуктазу Сирпаугбик ЬакПспкй описанную в данном описании ранее. Цельноклеточный биокатализатор имеет некоторые преимущества перед ферментным катализатором в данном способе: НМР-оксидоредуктаза защищена от химической инактивации высоко реакционноспособным субстратом и собственные дегидрогеназы хозяина могут помогать НМР-оксидоредуктазе на первых двух стадиях окисления, ведущих от НМР до (возможно) соответствующей монокислоты, которая затем превращается в дикислоту с помощью Нт1Н. Предпочтительно могут потребоваться дополнительные меры для обеспечения регенерации кофакторов. Цельноклеточный биокатализатор должен делать возможной минимальную переработку потока сырья НМР, т.е. предпочтительно он устойчив к низкому рН, высокой Т и токсичным соединениям (среди которых субстрат), которые образуются при гидролизе/термохимической конверсии исходного материала.
Рксиботопак рийба 812 можно квалифицировать как подходящий организм-хозяин с точки зрения его устойчивости к различным химических стрессорам, его относительно широкого интервала рН и наличия собственных дегидрогеназ, которые помогают НМР-оксидоредуктазе, что приводит к более эффективной биотрансформации НМР в РИСА.
- 10 025990
Как альтернативу цельноклеточному катализатору, таким же путем как цельноклеточный катализатор можно использовать клеточный лизат, очищенный фермент или иммобилизованный фермент один или в виде смеси ферментов.
Продукт и извлечение биомассы.
После биотрансформации клетки можно отделить от питательной среды известными способами и использовать повторно. ЕЭСЛ. в том случае, если это желательно, можно извлечь с высокой чистотой в форме дикислоты осаждением кислотой и экстракцией растворителем или другими способами очистки, известными в технике.
Использование РИСА.
РИСА можно использовать в качестве альтернативы терефталату при получении сложных полиэфиров. Ее также можно использовать в качестве субстрата для самых разных ценных соединений. Например, она является известным субстратом для получения янтарной кислоты, 2,5-бис(аминометил)тетрагидрофурана, 2,5-дигидроксиметилтетрагидрофурана, 2,5-дигидроксиметилфурана и 2,5-фурандикарбальдегида. РОСА можно использовать при получении покрытий, например, в покрытиях на основе алкидных смол и термопластичных покрытиях. Ее также можно использовать в качестве эквивалента ксилола в биотопливе и в качестве растворителя.
РОСА можно этерифицировать, и эфиры можно использовать в качестве пластификаторов. Ее можно превратить в диамин, диамин можно использовать в качестве удлинителя цепи, и диамин можно превратить в диизоцианат, который можно использовать при получении полиуретанов. Благодаря способу по изобретению, РОСА и продукты, получаемые из РОСА, можно получить через биотрансформацию из биомассы, в том числе, лигноцеллюлозной биомассы.
Примеры
Общая методология.
Штаммы и плазмиды. Сирпа\аа\аби8 Ьа8беи818 НМР14, депонированный в ΌδΜΖ: Сирпа\аа\аби8 Ьа811еи818 НМР14 = ΌδΜ 22875, дата депонирования 19 августа 2009, является почвенным изолятом, который способен использовать фураны в качестве единственного источника углерода. Р8еиботоиа8 рибба §12 используют в качестве хозяина для экспрессии НМР-оксидоредуктазы. ЕксбебсЫа соб ΌΗ5α (Ιηνίбодеи) используют для общих целей клонирования. Челночную плазмиду р1Т'тс8 рИСР22, полученную из Е.соб-Р. рибба (не опубликовано), используют для экспрессии НМР-оксидоредуктазы под контролем конститутивного промотора 1ас. Для репликации в Е.соб используют область начала репликации рИС; для репликации в Р. рцбба используют область начала репликации рК01600. Экспрессия гена ЬтШ идет от конститутивного промотора 1ас. Маркерный ген β-лактамазы (Ь1а) используют для отбора по антибиотику (устойчивость к ампициллину) в Е.соб. Для отбора по антибиотику в Р. рибба используют маркерный ген гентамецин-ацетилтрансферазы (дтК).
Плазмидная карта НтГН экспрессирующего вектора рТГ'бтГН приводится на фиг. 2. Р1ас' - промотор 1ас; гер - область начала репликации от плазмиды с широким кругом хозяев; дтК - ген устойчивости к гентамицину; Ь1а - бета-лактамаза; рИС об - область начала репликации для Е.соб.
Среды и условия культивирования. Среду с минеральными солями (ММ) используют как среду определенного состава. ММ содержит следующее (на литр деминерализованной воды): 3,88 г К2НР04, 1,63 г ЫаН2Р04, 2,0 г (ИН4)2§04, 0,1 г МдС12-6Н20, 10 мг ЭДТК, 2 мг ΖηδΟ^'^Ο, 1 мг СаС12-2Н2О, 5 мг Ре§04-7Н20, 0,2 мг Ыа2Мо04-2Н20, 0,2 мг Си§04-5Н20, 0,4 мг СоС12-6Н2О и 1 мг МиС12-2Н2О, с добавлением определенного источника углерода. Среду Луреа (Ь-среда: 10 г/л триптона ВасЮ (Эбсо), 5 г/л дрожжевого экстракта (ЭгГсо), 5 г/л ЫаС1) используют в качестве полной среды для размножения Р. рибба §12 и производных штаммов, С. Ьа8беи818 НМР14 и Е.соб ЭН5а и производных. Твердая Ь-среда отверждается 2% (мас./об.) агаром (Эбео).
В случае экспериментов с подпиткой начальную фазу загрузки осуществляют в 1 л адаптированной среды с минеральными солями следующего состава: 3,88 г К2НР04, 1,63 г МаН2Р04, 2,0 г (ИН4)2§04, 0,2 г МдС12-6Н20, 20 мг ЭДТК, 4 мг Ζи§04·7Η20, 2 мг СаС12-2Н2О, 10 мг Ре§04-7Н20, 0,4 мг Ыа2Мо04-2Н20, 0,4 мг Си804-5Н20, 0,8 мг СоС12-6Н20, 2 мг МиС12-2Н2О, 10 мг/л гентамицина и 100 мМ глицерина. После исчерпывания исходного глицерина начинают подпитку и регулируют для возможности максимального роста, в то же время сохраняя глицерин в культуре как лимитирующий субстрат. Подпитывающий раствор содержит (на л) 368,4 г глицерина, 10 г/л МдС12-6Н20 и 12,6 г/Л НМР.
Антибиотики. Ампициллин добавляют для Е.соб до 100 мкг/мл. Гентамицин (дт) добавляют до 30 мкг/мл к среде Луриа и 10 мкг/мл к среде с минеральными солями для Р. рибба §12. Антибиотики закупают у §1дта-А1ббсб.
Культивирование. Р. рибба и С. Ва8беи818 культивируют при 30°С. Е.соб культивируют при 37°С. Эксперименты в ММ во встряхиваемой колбе выполняют в склянках Во81он (А1беаб аррбеб 8шеисе8 ВУ; Вгеба, Нидерланды) в термостате с горизонтальным перемешиванием. Эксперименты в Ь-среде во встряхиваемой колбе выполняют в колбах Эрленмейера с ватными пробками в термостате с горизонтальным перемешиванием. Эксперименты с подпиткой выполняют в 1-л ферментерах (Ыете ВгидеМск §с1еиббс) с использованием контроллера ВюР1о1 10. Начальную периодическую ферментацию начинают с промы- 11 025990 тыми клетками от предварительного культивирования в течение ночи в 100 мл ММ с добавлением 40 мМ глицерина и 2 мМ глюкозы. Начальную скорость перемешивания устанавливают в 200 об/мин, и воздух подают в пространство над смесью при 1 л-мин-1 с использованием регулятора массового расхода Ό5111, приборы Μ+\ν. Давление растворенного кислорода (ТОО) непрерывно контролируют зондом 1пРго, модель 6900 (МеШег То1ейо ВУ; Τίοΐ. Нидерланды) и поддерживают при 30% насыщения воздуха путем автоматического регулирования скорости перемешивания до максимального значения 1000 об/мин. Когда достигается максимальная скорость перемешивания, воздух заменяют очищенным кислородом с расходом 0,2 л-мин-1, и устанавливают максимальную скорость перемешивания 800 об/мин. Величину рН 7,0 поддерживают путем автоматического добавления 25% раствора ΝαΟΗ во время фазы начальной загрузки, во время фазы подпитки рН поддерживают постоянным путем автоматического добавления 10 мМ раствора ΝαΟΗ. Температуру поддерживают на уровне 30°С.
Анализы и аналитические методы. Содержание клеточной сухой массы (ί'Ό\ν) в бактериальных культурах определяют путем измерения оптической плотности при 600 нм (ΟΌ600) с использованием измерителя плотности клеток Вюмасе (\νΡΑ Ыф или универсального спектрофотометра для прочтения микропланшетов μΟιιαηΙ МЦХ200 (Вю1ек). Для Р. риййа ΟΌ600 1,0 соответствует 0,56 г СГОТОл (Вюмасе) или 1,4 г ί'Ό\ν/.ι (μφυαηΐ).
Анализы ВЭЖХ. ГЭСА. НМР, НМР-спирт и НМР-кислоту анализируют ОФ-ВЭЖХ (система АдИеШ 1100) с использованием детектора с диодной матрицей, установленного на 230 нм. Используемая колонка представляет собой колонку 2огЬах ЕсБрсе ХЭВ-С8 (размер пор 80А, площадь поверхности 180 м2/г, АдПепЦ работающую при 25°С. В качестве элюента используют градиент ацетонитрила в 20 мМ растворе КН2РО4 (рН 2 или рН 6) с 1% ацетонитрила при скорости потока 1,2 мл/мин, с возрастанием от 0 до 5% за 3,5 мин и от 5 до 40% за 2,5 мин.
Получение клеточных экстрактов. Клеточные экстракты С. ЬазПепМз НМР14 дикого типа или трансформантов Р. риййа 812, экспрессирующих НМР-оксидоредуктазу, получают из 50-мл культур поздней экспоненциальной фазы роста с использованием ММ с добавлением или 12 мМ сукцината (С. Ьа811еп818 НМР14, ΟΌ600 «1,5) или 20 мМ глюкозы (Р. риййа 812, ΟΌ600 «4). Культуры собирают центрифугированием и ресуспендируют в 3 мл буфера для анализа. Клетки разрушают ультразвуковой обработкой с использованием или ультразвуковой установки Вгаизои (микронаконечник в импульсном режиме, установка выходной мощности 3, и установка процента рабочего цикла 40%; 3 цикла ультразвуковой обработки: 45 с импульс и 15 с пауза) или 8ошс5 У1Ьга-Се11 (8ошс5 & Ма1ег1а18, США) (5 мм суженый микронаконечник; установка импульсного режима до 1 мин (импульс 5 с, 2 с пауза). После ультразвуковой обработки дебрис удаляют центрифугированием при 8228 х д в течение 3 мин при 4°С. Супернатант обессоливают с использованием колонки для гель-фильтрации РЭ 10 (СЕ ЬеаИБсаге) и используют в качестве клеточного экстракта для анализов НМР-оксидоредуктазы. Концентрацию белка измеряют с использованием реагента Брэдфорда (81дта-А1Фтсф.
Анализ НМР-оксидоредуктазы. Анализы НМР-оксидоредуктазы выполняют в клеточных экстрактах С. Ьа811еп818 НМР14 дикого типа или трансформантов Р. риййа 812, экспрессирующих НМРоксидоредуктазу. В качестве отрицательного контроля используют Р. риййа 812 дикого типа или мутаната С. ЬахПегМх НМР14, которые содержат транспозонную вставку в гене ΙιιηΙΗ. Клеточный экстракт инкубируют с фурафуралем, фурфуриловым спиртом, НМР или НМР-кислотой при 30°С в условиях насыщения кислородом. Реакционная смесь содержит 1 мл клеточного экстракта, 976 мкл насыщенной кислородом ММ, 20 мкл 2 мМ раствора флавинадениндинуклеотида (РАО) и 4 мкл 0,5 М исходного субстрата (фурфураль, фурфуриловый спирт, НМР или НМР-кислота). Образцы отбирают с установленными интервалами, и реакцию сразу же останавливают путем добавления НС1 до конечной концентрации 1 М. Концентрации субстрата и продукта в образцах определяют ВЭЖХ. Для контроля за исчерпыванием кислорода различные компоненты реакционной смеси очищают от кислорода с помощью непрерывного потока газа азота, и ту же самую реакционную смесь инкубируют в сосудах с резиновыми пробками с азотом в пространстве над смесью.
Химикаты. Аналитический стандарт РЭСА закупают у Нптипохоигсе В.У. (На11е-2оег8е1, Бельгия). 5-Гидроксиметилфуроиновую кислоту (НМР-кислоту) закупают у Майтх 8с1еп11Пс (Со1итЫа 8С, Соединенные Штаты). Обнаружено, что указанное соединение является высоко этерифицированным. Непосредственно перед использованием 10 мМ раствор этерифицированной НМР-кислоты кипятят в течение 2 ч с 2 М 428Ο4, охлаждают и доводят до рН 7,0 №ГОН после добавления 50 мМ фосфатного буфера. Все другие химикаты закупают у 81дта-А1йпсН СЬет1е В.У. (ΖΜφΦΐΛΐ, Нидерланды).
Молекулярные и генетические методы. Г еномную ДНК выделяют с использованием набора Эпеаху 1188ие (Ц1АСЕЦ). Плазмидную ДНК выделяют с помощью набора Ц1А1ргер хрт пишргер (Ц1АСЕЦ). Фрагменты ДНК из агарозы выделяют с помощью набора для гель-экстракции φΙΑΕΧΙΙ (Ц1АСЕЦ).
Реакции ПЦР осуществляют с полимеразой Ассирпте Р£х (БкаПодеп) согласно инструкциям изготовителя. Праймерами, используемыми для амплификации НМР-оксидоредуктазы из геномной ДНК С. ЬазПепМз НМР14, являются ΪΝ23: 5'-СССААТТССАСАТСАСААССССАСАССС-3' (81 У) ΙΌ ΝΟ: 1) и РШ4: 5'-СССААТТСССТТСССТСТТСААСТСССАТС-3' (81 У) ГО ΝΟ: 2). Подчеркнутые последова- 12 025990 тельности показывают сайт рестрикции ЕсоКТ
Плазмидную ДНК вводят в электрокомпетентные клетки с использованием устройства для электропорации Сеие Ри1кег (ВюРаб).
Хромосомную ДНК, фланкирующую транспозон, идентифицируют стандартными методами, известными в технике {АикиЬе1, Р.М. е1 а1. Сиггей рго1осо1к ίη то1еси1аг Ыо1оду (Сгееп риЬШЫпд аккоаайоп Ыете Уогк; 1987)}, и последовательность полных генных локусов получают праймеропосредованной прогулкой. Синтез олигонуклеотидов и секвенирование ДНК выполнены М\УС Вю1есН АС (Германия).
Другие стандартные методы молекулярной биологии выполняют согласно §атЬгоок апб Кикке11 {§атЬгоок, 1., Кикке1, Ό.\ν. Мо1еси1аг с1ошпд; а 1аЬота1оту тапиа1 (Со1б крппд НагЬог ЬаЬотаФу Ргекк, №\ν Уогк: 2001)}.
Пример I. Продуцирование РОСА в клеточном экстракте С. ЬакПепмк НМР14.
Когда клеточный экстракт С. Ьак11епк1к из прекультуры поздней логарифмической фазы (ΘΌ600 «1,5), выращенной в ММ с добавлением 12 мМ сукцината и 3 мМ НМР, инкубируют или с НМР или с НМР-кислотой, наблюдают образование РОСА.
Когда в качестве субстрата используют НМР, наблюдают быстрое временное накопление НМРкислоты и НМР-спирта, конкурирующее с образованием РОСА. В обессоленном клеточном экстракте концентрация НМР-кислоты уменьшается с меньшей скоростью, и получение РОСА замедляется по сравнению с неочищенным клеточным экстрактом. Так как РОСА получают в обессоленном клеточном экстракте, а также в неочищенном клеточным экстракте, оказывается, что конверсия НМР в РОСА не включает кофакторы. Тем не менее, оказывается, что кофакторы или другие низкомолекулярные компоненты из неочищенного клеточного экстракта оказывают синергическое действие на образование РОСА. Когда в качестве субстрата добавляют НМР-кислоту, сразу же наблюдают образование РОСА как в неочищенном, так и в обессоленном клеточном экстракте. Кроме того, показано, что для образования ГОСА требуется присутствие кислорода, так как РОСА не вырабатывается в анаэробных условиях. Наблюдают стехиометрическую конверсию НМР-кислоты в РОСА.
Пример II. Выделение и характеризация гена 1тГН, кодирующего НМР-оксидоредуктазу.
Обнаружено, что ген ЬтГН кодирует белок в 62317 Д, принадлежащий к семейству РАЭ-зависимых глюкозо-метанол-холин-оксидоредуктаз (СМС). Показано, что такой фермент имеет способность окислять НМР-кислоту до фурандикарбоновой кислоты (РОСА). Кроме того, фермент также принимает НМР как субстрат, который окисляется через НМР-кислоту до РОСА. Самая высокая гомология с ЬтГН в нерезервированной базе данных ΝΟΒΙ обнаружена с СМС-оксидоредуктазой ВшкЬо1бепа рЬуЮПгтапк ΡδΙΝ (локус 1ад ВрЬу1_2180; 68 % идентичность по отрезку из 562 аминокислот). На основании данных о последовательности НМР/фурфураль-оперон С. ЬакПегМк НМР14 идентифицируют другие возможные вещества, разлагающие НМР/фурфураль (бедгабегк). Отобранные штаммы проверяют на рост в среде с минеральными солями или с НМР или с фурфуралем как единственным источником углерода. Штаммы, которые способны расти на НМР, имеют ортолог ЬтГН кодирующий оксидоредуктазы, которые имеют идентичность с НтГН между 45 и 68%. Один штамм (ВшкЬо1бепа хепоуотапк ЬВ400) неспособен использовать НМР, хотя его оксидоредуктаза имеет 44% идентичность с НтГН.
Фиг. 3 дает схематическое представление о генетической организации генов метаболизма фурфураля и НМР в С. Ьак11епк1к НМР14 (А) и других видах (В), которые идентифицированы как возможные утилизаторы фурфураля и/или НМР. Цвета соответствуют активностям фермента на фиг. 1. Числа под стрелками, изображенные жирным шрифтом (х/у), показывают процент идентичности (х) к соответствующему белку С. ЬакПепмк НМР14 в аминокислотном отрезке у. Ортологичные гены идентифицируют поиском по гомологии в ВЬА§Т в базе данных о структуре белков поп-тебипбай рго!ет кециепсек Национального центра биотехнологической информации. Хиты фурфуральных кластеров определяют как релевантные, когда ортологичные гены для ЬтГА, В, С, Ό и Е присутствуют в одном геноме, причем ортолог ЬтГНА кодирует фермент, который имеет, по меньшей мере, 50% идентичность с НтГА. Такой же критерий используют для определения ортологов НтГР и НтГС, в то время как для ортологов 1тГН в качестве критерия используют 40% идентичность с НтГН. Числами, изображенными курсивом, отмечены геномные локусы указанного штамма. Незаштрихованные стрелки отображают гены с отсутствием функции метаболизма. С. Общий вид роста фенотипа испытываемых штаммов не среде с минеральными солями или с фурфуралем или с НМР (3 мМ) как единственным источником углерода. ΝΏ - не определено.
На фигурах приводятся нуклеотидные последовательности открытой рамки считывания, кодирующей НтГН НМР-оксидоредуктазы (фиг. 4), и установленные аминокислотные последовательности (фиг. 3).
Пример III. Клонирование ЬтГН в Р. риОба §12 и экспрессия кодированной оксидоредуктазы.
Ген ЬтГН, кодирующий НМР-оксидоредуктазу, клонируют в экспрессирующий вектор р1Т'тск. ПЦР-фрагмент, полученный с праймерами ΓΝ23 и ΓΝ24 на геномной ДНК С. Ьак11епк1к НМР14, гидролизуют с ЕсоШ (Реттейак). Гидролизованный фрагмент лигируют в гидролизованный ЕсоЫ и обработанный РаЧАР (Реттейак) вектор рТГ'тск, получая экспрессирующую НтГН плазмиду рТГЪтГН. Правиль- 13 025990 ную ориентацию вставки ктГН проверяют контрольным гидролизом и секвенированием нуклеиновой кислоты, известными в технике. Экспрессию НМР-оксидоредуктазы показывают в клеточном экстракте Р. рибба_рТТ'ЬтГН, выращенного в ММ + 20 мМ глюкозы и 10 мг/л гентамицина (ОЭ600 «4) путем образования РЭСА с использованием НМР или НМР-кислоты в качестве субстрата (табл. 1).
Таблица 1
Образование РЭСА из НМР или НМР-кислоты в клеточном экстракте Р. рибба_рТТ'ЬтГН.
В качестве контроля используют клеточный экстракт Р. риОба §12, содержащего пустой вектор рТТ'тск
| Кислород | ||
| Клеточный экстракт | Да | Нет |
| Обессоленный | + | - |
| Необессоленный | + | - |
| Контроль, обессоленный | - | - |
| Контроль, необессоленный | - | - |
Полученные результаты подтверждают, что образование РЭСА происходит только в присутствии кислорода и катализируется кодированной ктГН оксидоредуктазой. Когда в качестве субстрата используют НМР, наблюдают временное накопление НМР-кислоты как в обессоленном, так и в неочищенном клеточном экстракте. Образование НМР-кислоты в обессоленном клеточном экстракте (низкомолекулярные кофакторы удалены) показывает, что НтГН не только окисляет НМР-кислоту до РЭСЛ. но также может окислять НМР до формы его монокарбоновой кислоты.
Кроме НтГН образовывать НМР-кислоту из НМР очевидно также могут неспецифические дегидрогеназы, свойственные для Р. риОба §12 (табл. 2), при условии, что восстанавливающие эквиваленты не удалены обессоливанием. Альдегидредуктазная/Алкогольдегидрогеназная активность является ЫаОН/МАО+-зависимой, в то время как альдегидредуктазная активность может быть поддержана сочетанием двух искусственных носителей электронов - РМ§ и ЭСР1Р, в котором РМ§ является первичным носителем электронов и ЭСР1Р является финальным акцептором электронов. Подобные активности также наблюдают в клеточном экстракте С. Ьа811еп818 НМР14.
Таблица 2
Неспецифические НМР-дегидрогеназные активности, измеренные в клеточном экстракте Р. риОба §12
| Ферментная активность | Субстрат | Продукт | Кофактор | Ρ. ριΜκΐίί 512 |
| Альдегид | НМР | НМР- | ΝΑϋΗ | 1106 |
| редуктаза | спирт | |||
| Алкоголь | НМР- | |||
| НМР | ΝΑϋ+ | Νϋ | ||
| дегидрогеназа | спирт | |||
| Альдегид | НМР | НМР- | РМ5/ОСР1Р | 8 |
| дегидрогеназа | кислота |
ΝΏ: не определено в случае отсутствия коммерчески доступного субстрата. Активности выражены в Е г-1 белка. РМ§/ЭСР1Р: метосульфат феназина/2,6-дихлорфенолиндофенол.
Образование РЭСА, НМР-спирта (Н-ок) и НМР-кислоты (Н-кислота) из НМР в неочищенном клеточном экстракте Р. риОба §12 р1Т'ктГН показано на фиг. 4. Фиг. 4 иллюстрирует синергическое действие эндогенных дегидрогеназ и НтГН в клеточном экстракте Р. рибба §12 р1Т'1ипГН. Сначала наблюдают быстрое убавление НМР, сопутствующее образованию НМР-спирта, которое вероятно катализируется альдегидредуктазой. В то же время также начинают накапливаться НМР-кислота (вероятно, благодаря альдегиддегидрогеназе) и РЭСА (благодаря НтГН). Сразу же после образования НМР-спирт исчезает, вероятно, через повторное окисление до НМР, НМР-кислоты и РЭСА. Только НМР-кислота показывает существенное накопление за промежуток времени 25 час. Такие результаты предполагают, что окисление НМР-кислоты до РЭСА является стадией, ограничивающей скорость реакции в бесклеточной системе.
Пример IV. Превращение НМР в РЭСА целыми клетками Р. рибба §12, экспрессирующего НтГН.
Поскольку эндогенные дегидрогеназы Р. рибба §12 могут действовать синергично с НтГН при окислении НМР до РЭСА путем обеспечения дополнительных средств генерации НМР-кислоты из НМР, способ биотрансформации целыми клетками НМР в РЭСА может иметь преимущества перед ферментативным способом. Для того чтобы исследовать такую возможность, покоящиеся клетки, растущие клетки и разрушенные клетки испытывают на продуцирование РЭСА из НМР.
Культуры, выращиваемые во встряхиваемых колбах, выращивают в 150 мл ММ + 40 мМ глицерина и 2 мМ глюкозы с добавлением 10 мг/л гентамицина в 1-л колбах Эрленмейера. Клетки собирают в конце логарифмической фазы (ОЭ600 «4), промывают и концентрируют в ММ с добавлением 19,4 г/л К2НРО4, 8,15 г/л NаН2РО4, 40 мМ глицерина и 10 мг/л гентамицина. Аликвоты (10 мл) концентрированных клеточных суспензий (соответствующие СЭ\У 1,65 г) инкубируют с НМР в 250-мл колбах Эрленмейера, и отбирают образцы с равномерными интервалами для анализа на РЭСА. В случае покоящихся клеток в ресуспензионную среду не включают глицерин, и разрушенные клетки получают обработкой ультразвуком.
- 14 025990
Как отмечалось ранее, НМР быстро превращается в НМР-спирт и НМР-кислоту с последующей убылью НМР-кислоты и конкурентным образованием РИСА. Как скорости продуцирования РИСА, так и скорости убыли НМР-кислоты представлены в табл. 1У-а для двух испытываемых концентраций НМР.
Таблица 3
Продуцирование РИСА из НМР и скорость убыли НМР-кислоты при использовании растущих клеток, покоящихся клеток и обработанных ультразвуком клеток Р. риНйа 812 рТГ'ЬтГН при различных начальных концентрациях НМР
| Скорость убыли НМР-кислоты мкмоль/г СОА'/час) | Скорость продуцирования РОСА (мкмоль/г СОУ/час) | |||||
| Концентрац ия НМР (мМ) | Растущие клетки | Покоящи еся клетки | Разрушен ные клетки | Растущие клетки | Покоящи еся клетки | Разрушен ные клетки |
| 25 | 194±10ь | 120а | 73а | 145 ± 3.5Ь | 115’ | 115а |
| 50 | 377 ± 27ь | 450±~80ь' | МО1 | МУ |
а Наблюдают неполную конверсию НМР-кислоты в РИСА.
Ь Двукратные эксперименты; разброс представляет собой максимальное отклонение от среднего для двух независимых экспериментов.
с ΝΏ = не определено
Табл. 3 показывает, что продуцирование РИСА проходит более эффективно растущими клетками Р. риНйа 812, экспрессирующими НтГН. Общая скорость продуцирования РИСА, эффективность конверсии, а также скорость убыли НМР-кислоты выше в случае инкубации растущих клеток. Кроме того, скорость продуцирования РИСА зависит от начальной концентрации НМР, что приводит к предположению, что система не является насыщенной.
Пример V. Продуцирование РИСА из НМР Р. риййа 812, экспрессирующим НтГН, в способе с подпиткой.
Обнаружено, что продуцирование РИСА наиболее эффективно растущими клетками Р. риНйа 812, экспрессирующим НтГН. Поэтому выполняют эксперименты с подпиткой для демонстрации продуцирования РИСА целыми клетками Р. риНйа 812 рТГ'ЬтГН.
В начальной фазе Р. ри11Йа_р1Т'ЬтГН культивируют в ММ с подпиткой глицерином до плотности клеток 13 г СЭ\У/л. По окончании такой фазы начинают подпитку НМР, причем НМР вводят со скоростью 0,8 ммоль/л/ч. Без соподпитки глицерином НМР-кислота и РИСА образуются при равномерной скорости 0,41 ммоль/л/ч (см. фиг. 5). Затем подпитку заменяют раствором, содержащим 0,21 М НМР и 4 М глицерина, которые подают при приблизительно 5 мл/ч. С такой соподпиткой глицерином концентрация НМР-кислоты быстро падает, в то время как образование РИСА продолжается приблизительно с той же скоростью (фиг. 5). Эксперимент прекращают, когда с подпиткой добавлен НМР в общем количестве 44,6 ммоль. Результаты показывают почти полную конверсию в РЭСА (т.е. эффективность 96,5%).
В подобном эксперименте глицерин подают со средней скоростью 0,7 ммоль/л/ч совместно с НМР. В такой культуре с подпиткой накапливания промежуточного соединения НМР-кислоты не наблюдают, и весь НМР превращается непосредственно в РЭСА (фиг. 6).
Пример VI. Очистка РЭСА от среды для ферментации.
Обнаружено, что растворимость РЭСА в воде при рН 1,0 составляет примерно 1,5 г/л. Данное свойство выгодно используют для извлечения продукта РЭСА из среды для ферментации. После удаления клеток центрифугированием (9500 х д в течение 5 мин) к 100 мл очищенной среды, для того, чтобы осадить РЭСА. при комнатной температуре при непрерывном перемешивании добавляют приблизительно 10 мл 96% Н28О4 до рН 1. Осадок извлекают центрифугированием при 8228 х д в течение 10 мин, и высушенный на воздухе осадок снова растворяют в метаноле при 60°С. После удаления нерастворившегося дебриса фильтрацией через предварительно нагретый 0,22-мкм фильтр фильтрат анализируют ВЭЖХ на чистоту. Чистота РОСА, извлеченной из среды для ферментации описанной выше процедурой, составляет приблизительно 65%. Дополнительной очистки РЭСА можно добиться с использованием способов, хорошо известных в технике.
Пример VII. Продуцирование РЭСА из НМР Р. риййа 812, экспрессирующим НтГН, в способе с подпиткой.
Выполняют второй эксперимент по продуцированию РЭСА в способе с подпиткой с целыми клетками Р. риОйа 812 р1Т'НтГН для того, чтобы повысить титр РЭСА и производительность.
В начальной периодической фазе Р. риРйа_р1Т'ЬшГН культивируют на ММ до тех пор, пока после 23,2-часовой ферментации не будет исчерпан начальный глицерин (ОЭ600 ~8). В данный момент начинают подпитку глицерином со скоростью, которая допускает возрастание биомассы в приблизительно 0,45 г СЭ\У/л/ч. После 50,7-часовой ферментации подпитку глицерином уменьшают до скорости, которая допускает возрастание биомассы в приблизительно 0,045 г СЭ\У/л/ч. После 123,4-часовой ферментации подпитку глицерином повышают до скорости, которая допускает возрастание биомассы в приблизитель- 15 025990 но 0,25 г СОХУ/л/ч, до завершения ферментации. В течение указанного периода применяют подпитку НМР. Подпитку НМР начинают при скорости 0,65 ммоль/ч/г СОУ после 26,7 ч ферментации, что приводит к накоплению как НМР-кислоты, так и РОСА. Скорость подпитки НМР снижают до 0,28 ммоль/ч/г СОХУ после 72,8 ч ферментации, и подпитку прекращают после 117,4 ч ферментации. Уменьшение подпитки НМР ведет к постепенному снижению концентрации НМР-кислоты в ферментере, в то время как концентрация РОСА продолжает возрастать. Ферментацию прекращают, когда НМР более нельзя детектировать. В этот момент в ферментер добавляют 188 ммоль НМР, что ведет к продуцированию приблизительно 182 ммоль РОСА (т.е. 97% эффективности) при концентрации 30,8 г/л. Фиг. 7А показывает образование биомассы, НМР-кислоты и РОСА в культуре Р. ρиΐ^άа_ρ^Т'ЬшРИ с подпиткой. Фиг. 7В показывает скорости подпитки глицерином и НМР для той же культуры.
Пример VIII. Очистка РОСА от среды для ферментации.
Обнаружено, что растворимость РОСА в воде при рН 0,5 составляет примерно 0,4 г/л. Так как такая концентрация остается в растворе после осаждения, возросший титр, полученный в примере VII, ведет к значительно меньшей потере продукта при очистке осаждением.
После удаления клеток центрифугированием (9500 х д в течение 15 мин) очищенную среду кипятят в течение 3 минут для осждения белков и центрифугируют в течение 20 мин при 9500 х д. К супернатанту, для того чтобы осадить РОСА, при 4°С при непрерывном перемешивании добавляют приблизительно 50 мл 96% Н2§04 до рН 0,5. Осадок извлекают центрифугированием при 8228 х д в течение 20 мин, промывают один раз 250 мл воды и снова центрифугируют при 8228 х д в течение 20 мин. Полученный осадок сушат на воздухе и затем растворяют в приблизительно 1200 мл тетрагидрофурана (ТГФ) при 30°С. После удаления нерастворимого дебриса фильтрацией очищенный раствор в ТГФ упаривают в вакууме при 50°С до тех пор, пока не останется 11,8 г порошка сухой РОСА высокой чистоты (>99%), что составляет 78% РОСА, изначально присутствовавшей в среде для ферментации. При необходимости очистку РОСА можно дополнительно оптимизировать с использованием способов, хорошо известных в технике.
- 16 025990
Список последовательностей <110> ОБМ ΙΡ Α55ΘΪ5 Β.ν.
<120> РОЬУРЕРТЮЕБ ΗΑνΐΝ6 ОХЮОКЕОиСТАБЕ АСТ1У1ТУ ΑΝΟ ΤΗΕΙΚ Ы5Е5 <130> 27470-ИО-РСТ <160> 4 <170> РаГепНп уегатоп 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> ϋΝΑ <213> АгьтПста! Зециепсе <220>
<223> БуптНеТтс ϋΝΑ <400> 1 сддааттсса саΐдасаадд ддадассд 28 <210> 2 <211> 30 <212> ϋΝΑ <213> АгП'Г1ста1 Бечиепсе <220>
<223> БуптКеТтс ϋΝΑ <400> 2 сддааттсдс тгсддтсттс аастсддатд 30 <210> 3 <211> 579 <212> ΡΚΤ <213> Сиргтаутбиа ЬааПепата <400> 3
| Мет Аар 1 | тНг | Рго | Агд 5 | с!и | Агд | РКе | Аар туг уа! 10 | 11е | уа1 | С1у | б1у 15 | б1у | |||
| Бег | А1а | с!у | Суз | Уа1 | Ьеи | А1а | АЗП | Агд | Ьеи | Бег | С1п | Аар | РГО | А1а | Не |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Агд | Уа1 | А1а | Ьеи | Не | б1и | А1а | б!у | уа1 | дар | тНг | РГО | РГО | Аар | А1а | Уа1 |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Рго | А1а | б!и | 11е | Ьеи | Аар | Бег | Туг | РГО | мет | РГО | ьеи | РКе | РКе | С1у | Аар |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Агд | Туг | Не | Тгр | Рго | 5ег | Ьеи | 61 η | А1а | Агд | А1а | Уа! | А1а | 61 у | с1у | Агд |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Бег | ьуа | Уа1 | туг | б1и | 61П | б1у | Агд | Уа1 | Мет | с1у с!у | б1у | Бег | Бег | 11е | |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| А5П | Уа! | С1п | А1а | А1а | Аап | Агд | с!у | Ьеи | Рго | Агд | Аар | Туг | Аар | 61 и | Тгр |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| а1 а | А1а | зег | б!у | А1а | 5ег | С1у | тгр | 5ег | Тгр | б1п | Азр | Уа1 | Ьеи | рго | Туг |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| рНе | Агд | НТ 5 | Ьеи | С1 и | Агд | А5Р | УаТ | А5р | туг | б1у | Азп | зег | Рго | ьеи | НТ 5 |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| б1у | Зег | НТ 5 | С1у | РГО | УаТ | РГО | Пе | Агд | Агд | 11 е | Ьеи | РГО | С1п | А1а | Тгр |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Рго | рго | рНе | Суз | ТНг | С1и | РЬе | л1а | НТ 5 | А1а | мег | б!у | Агд | Зег | С1у | ьеи |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Зег | А1а | ьеи | А1а | АЗр | 6ΐη | Азп | л1а | С1и | рНе | 61 у | А5р | с1у | тгр | РНе | РГО |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Αΐ а | А1а | РЬе 195 | Зег | АЗП | ьеи | Азр | Азр 200 | ьуз | Агд | Уа1 | Зег | тНг 205 | л1а | 11 е | л1а |
| туг | Ьеи | АЗр | А1а | АЗр | тНг | Агд | Агд | Агд | А1а | АЗП | ьеи | лгд | 11 е | туг | А1а |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| б1и | ТНг | ТНг | УаТ | Агд | ьуз | Ьеи | Уа1 | Уа1 | зег | б!у | Агд | С1и | А1а | Агд | С1у |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Уа1 | Пе | А1а | мег | Агд | А1а | А5р | С1у | 5ег | Агд | Ьеи | А1а | Ьеи | АЗр | А1а | СТу |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| С1и | уа1 | ίί е | УаТ | Зег | А1а | с! у | А1а | Ьеи | С1п | Зег | Рго | л1а | Пе | Ьеи | мег |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Агд | А1а | с1у | Пе | с!у | Азр | А1а | с1у | Αΐ а | Ьеи | с1п | АТ а | Ьеи | С1у | 11 е | б1и |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| уа! | уа1 | л1а | Азр | Агд | РГО | С1у | УаТ | С1у | Агд | АЗП | Ьеи | С1п | Азр | НТ 5 | Рго |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| А1а | Ьеи | ТЬг | РНе | Суз | С1 η | РНе | Ьеи | А1а | Рго | С1п | туг | Агд | мег | РГО | ьеи |
| 305 | зю | 315 | 320 | ||||||||||||
| 5ег | Агд | Агд | Агд | А1а 325 | Зег | мег | тНг | Αΐ а | А1а 330 | Агд | рНе | зег | Зег | С1у 335 | уа! |
| рго | б!у | с!у | с1и | А1а | Зег | Азр | мег | туг | Ьеи | Зег | Зег | Зег | тНг | Агд | л1а |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| С1у | Тгр | Нт 5 355 | А1 а | Ьеи | С1у | Азп | Агд 360 | Ьеи | 61 у | Ьеи | РНе | РНе 365 | геи | Тгр | Суз |
| АЗП | Агд | РГО | РНе | Зег | Агд | С1у | С1п | Уа1 | Зег | Ьеи | А1а | СТу | А1а | С1п | РГО |
- 18 025990
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Азр | Уа1 | Рго | Рго | Мех | Уа1 | 61 и | ьеи | АЗП | Ьеи | Ьеи | АЗр | Азр | б1и | Агд | АЗр |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| ьеи | Агд | Агд | Мех | Уа1 | А1а | б1у | Уа! | Агд | ьуз | Ьеи | Уа1 | б1п | Пе | Уа1 | б1у |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| л!а | Зег | А1а | хеи | Нтз | 61 п | НТ 5 | РГО | б1у | Азр | РНе | РНе | Рго | А1а | ТНг | РНе |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Зег | Рго | Агд | Уа1 | 1_уз | А1а | Ьеи | 5ег | Агд | Уа1 | Зег | Агд | 61 у | АЗП | уа! | ьеи |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| ьеи | тНг | б1и | ьеи | ьеи | 61 у | А1а | Уа1 | ьеи | Азр | уа! | зег | б1у | РГО | ьеи | Агд |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Агд | 5ег | ьеи | Не | А1а | Агд | Р|те | Уа1 | тНг | С1у | б1у | А1а | Азп | Ьеи | А1а | Зег |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Ьеи | Ьеи | Тпг | Азр | с!и | 5ег | А1а | Ьеи | б1и | 61 у | РНе | Уа1 | Агд | б1п | 5ег | Уа1 |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| РНе | б!у | уа! | тгр | НТ 5 | А1а | зег | С1у | ТНг | Суз | Агд | мех | б!у | А1а | нтз | А1а |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Азр | Агд | Зег 515 | А1а | Уа1 | Тпг | Азр | А1а 520 | А1а | б1у | Агд | Уа1 | Нтз 525 | Азр | Уа1 | б1у |
| Агд | Ьеи | Агд | Уа1 | Пе | Азр | А1а | Зег | Ьеи | мех | РГО | Агд | ьеи | РГО | ТНг | А1а |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| Азп | ТНг | Азп | Пе | Рго | ТНг | Пе | Мех | Ьеи | А1а | С1и | ьуз | Пе | А1а | Азр | тНг |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| Мех | с1п | А1а | б!и | Агд | Агд | А1 а | Уа1 | Агд | Рго | А! а | Зег | Зег | б!и | Уа1 | А1а |
| 565 | 570 | 575 |
Нт 5 Рго Зег <210> 4 <211> 1740 <212> ϋΝΑ <213> Сиргтаутйиз ЬазНепзтз <400> 4 аХддаХасдс дхасхддсса дХсдаХасдс
ХХсХХсддХд сдадддадсд ахсдссхдхс сдссддасдс ассддХаХаХ
ХХХсдасХас дсаддасссд хдхдссддсд сХддссаХсд дХдаХХдХХд дсддсдддхс сдссддххдс дссаХссдсд ХсдсдсХдаХ сдаддсдддс дадахссхсд аеадехахее даХдссеХХд схдсаадссс дсдссдхддс адддддеадд
120
180
240
- 19 025990
| ХссааддХсХ | асдадсаадд | дсдсдхсахд | ддсддсддсх | ссадсахсаа | сдХдсаддсд | 300 |
| дсааассдсд | ддсхдссдсд | сдасхасдах | дадхдддссд | сдхсдддсдс | дхссддахдд | 360 |
| Хсдхддсадд | ахдхдсхдсс | дхахххссдс | сассххдадс | дсдахдхдда | ххасддсаас | 420 |
| адсссдсХдс | асддсадсса | сддассддхд | ссдахссдсс | дсаХссХдсс | дсаддсХХдд | 480 |
| ссдссдххсх | дсасддадхх | Хдсдсасдсд | ахдддссдса | дсддсххдхс | сдсдсхддсс | 540 |
| дассадаасд | сддадххсдд | сдахддсхдд | хххссддссд | ссххсхсдаа | ссХддаХдас | 600 |
| аадсдддххх | сдассдссах | сдссхахсхс | дасдсддаха | сдсдссддсд | ддссааХсхд | 660 |
| сддаХсХаХд | ссдадасаас | ддхдсдсаад | сХсдХсдХаХ | ссддссддда | адсдсдхддд | 720 |
| дХдаХсдсса | Хдсдддссда | хдддХсдсдд | схддсдсхдд | асдссдддда | ддХсаХсдХд | 780 |
| Хссдсдддсд | ссХХдсадХс | дсссдссаХс | схдахдсдсд | сддддахсдд | сдасдссддс | 840 |
| дсдсхдсадд | сссхсддсах | сдаддхсдха | дссдассдас | ссддсдххдд | ссдсаахсхс | 900 |
| саддаХсаХс | ссдсдсхдас | дХХсХдссад | ХХссХсдсдс | сссадХассд | саХдссдсХс | 960 |
| Хсдсдссддс | дсдсхадсах | дасддсддсд | сддххсхсах | сдддддхдсс | аддхддсдад | 1020 |
| дсдхсддаса | хдхассхдхс | садххссаса | сдддсаддсх | ддсахдсасх | сддхаахсдд | 1080 |
| сХсддссХсХ | ХсХХссХдХд | дХдсааХсдд | ссаХХсХсдс | дсдддсаддх | дадссХХдсд | 1140 |
| ддадсссадс | сддахдхдсс | дсссаХддХд | дадсхсаасс | ХдсХсдасда | сдадсдддах | 1200 |
| сХдсддсдса | ХддХддссдд | сдХасдсаад | ХХддХдсада | ХсдХдддХдс | дХсддссХХд | 1260 |
| сахсадсахс | ссддхдаххх | сХХссссдсХ | асдххххсдс | сдсдсдхсаа | ддсдсхдадс | 1320 |
| сдсдхдадсс | дсддсаахдх | дхХдсхсасд | дадххдсхдд | дддсадхдсх | хдахдхсхсд | 1380 |
| дддссдсхдс | дсадаадссх | даХсдсдсдс | ХХХдХсасдд | дсддсдсааа | ссхддссадс | 1440 |
| сХдсХдасдд | аХдадХссдс | дсХададддс | ХХсдХдсдсс | ададсдХсХХ | сддддхсхдд | 1500 |
| сахдссадсд | дсасххдссд | даХдддсдсд | сахдсддасс | ддадсдсддх | дасддахдсд | 1560 |
| дсдддссдсд | ХХсасдаХдХ | ХддсаддсХд | сдсдххаххд | асдссхсхсх | дахдссдсдд | 1620 |
| схдссдасдд | ссаахассаа | сахссссасс | ахсахдсхсд | сддаааадах | хдссдасасс | 1680 |
| ахдсаадссд | адсдссдсдс | ддхссддссд | дсахсдадсд | аадххдссса | хссдадххда | 1740 |
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Claims (19)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Полипептид с оксидоредуктазной активностью класса ЕС1.1 и ЕС1.2 в отношении как спиртовой, так и альдегидной группы, находящихся в положении С2 или С5 фуранового цикла, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную последовательности §ЕЦ ГО N0: 3, или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 4.
- 2. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п.1.
- 3. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п.1 и выбранную из группы, включающей:(a) нуклеотидную последовательность §ЕЦ ГО N0: 4;(b) нуклеотидную последовательность, которая избирательно гибридизируется с полинуклеотидом, который комплементарен §ЕЦ ГО N0: 4;(c) нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 66% нуклеотидной последовательности §ЕЦ ГО N0: 4;(б) последовательность, которая является вырожденной вследствие избыточности генетического кода по отношению к последовательности, определенной в любом из (а), (Ь) или (с); или (е) нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, определенной в (а), (Ь), (с) или (б).
- 4. Конструкция, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п.1, где нуклеотидная последовательность функционально соединена с регуляторной последовательностью.
- 5. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.2, 3 или конструкцию по п.4.
- 6. Клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.2, 3, конструкцию по п.4 или вектор по п.5.
- 7. Клетка по п.6, представляющая собой бактерию, выбранную из группы, состоящей из родов ЕксНепсЫа. Аи^ает, Саи1оЬас1ег. 01исоиоЬас1ег, Е1юбоЬас1ег. Ркеиботоиак, Рагасоссик, ВасШик, Вге\аЬас1епит. СогуиеЬас1егшт, ВЫ/оЬшт (ЗшогЫ/оЬшт), Р1ауоЬас1ег1ит, К1еЬк1е11а, Еи1егоЬас!ег, ЬасЮЬасШик, ЬасЮсоссик, МеЮу1оЬас1егшт, §1арЬу1ососсик или §1гер1отусек; или видов В. киЫШк, В. ату1оНдие- 20 025990Гас1еп8, В. ПсНешГопт, В. рипЙ8, В. теда!егшт, В. Ьа1ойигап8, В. ритЛи8, С. охуйап8, Саи1оЬас!ег сге8сеп!и8 СВ 15, Ме!Ьу1оЬас!егшт ех1ощиеп8, К1ойоЬас!ег 8рЬаего1йе8, Р8еийотопа8 риййа, Рагасосси8 /еахап!ЫтГас1еп8, Рагасосси8 йепйййсап8, Е.соП, С. дЫатюит, 31арку1ососси8 сагпо8И8, 31герЮтусе8 Ьу1йап8, 3тог1п/оЬшт тейой и К1й/оЬшт гайюЬас!ег.
- 8. Клетка по п.6, представляющая собой дрожжевую клетку, выбранную из группы, состоящей из родов СапФйа, Нап8епи1а, К1иууеготусе8, Р1сЫа, 3ассЬаготусе8, 3сЫ/о8ассПаготусе8 или Υа^^ο\у^а: или видов К1иууеготусе8 1асЙ8, 3. сегеу181ае, Нап8епи1а ро1утогрйа, Υа^^ο\у^а йро1уйса и РюЫа ра8!оЙ8, или клетку мицелиального гриба, выбранную из группы родов А8регдШи8, Сйгу8о8ройит, РетсШшт, Та1аготусе8 или Тйсйойегта; или видов А8регдй1и8 тдег, А8регдШи8 а\\атоп, А8регдШи8 Гоеййи8, А8регдШи8 8о.)ае, А8регдй1и8 Гит1да!и8, Та1аготусе8 етегеопи, А8регдШи8 огу/ае, Сйгу8о8ройит 1искпо\уеп8е, ТпсПойегта гее8е1 или РетсШшт сйгу8одепит.
- 9. Способ получения полипептида по п.1, включающий культивирование клетки по любому из пп.68 в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного полипептида.
- 10. Полипептид по п.1, полученный способом по п.9.
- 11. Способ получения 2,5-фурандикарбоновой кислоты (РИСА), согласно которому один или несколько фурановых предшественников РИСА превращают в РИСА взаимодействием с окислителем в присутствии оксидоредуктазного катализатора, содержащего полипептид по п.1 или 10.
- 12. Способ по п.11, где фурановый предшественник РИСА выбирают из группы, состоящей из 5гидроксиметилфурфураля (НМР), 2,5-дигидроксиметилфурана (НМР-спирта) и 5-гидроксиметил-2фуранкарбоновой кислоты (НМР-кислоты), предпочтительно фурановый предшественник представляет собой НМР.
- 13. Способ по п.11 или 12, где фурановым предшественником РИСА является НМР, который получают из одного или нескольких сахаров-гексоз путем нагревания в присутствии кислоты.
- 14. Способ по п.13, где один или несколько сахаров-гексоз получают из лигноцеллюлозной биомассы.
- 15. Способ получения 5-гидроксиметил-2-фуранкарбоновой кислоты (НМР-кислоты), согласно которому один или несколько фурановых предшественников НМР-кислоты превращают в НМР-кислоту взаимодействием с окислителем в присутствии оксидоредуктазного катализатора, содержащего полипептид по п.1 или 10.
- 16. Способ по п.15, где фурановый предшественник НМР-кислоты выбирают из группы, состоящей из 5-гидроксиметилфурфураля (НМР) и 2,5-дигидроксиметилфурана (НМР-спирта).
- 17. Способ по любому из пп.11-16, где фурановый предшественник РИСА превращают в РИСА или фурановый предшественник НМР-кислоты превращают в НМР-кислоту в присутствии одного или нескольких коферментов, представляющих собой никотинамидадениндинуклеотид (ΝΆΌ+), и/или пирролохинолинхинолон (РЦЦ), и/или флавинадениндинуклеотид (РАИ).
- 18. Способ по любому из пп.11-17, где оксидоредуктазный катализатор представляет собой бесклеточный экстракт клетки, содержащий полипептид по п.1 или 10.
- 19. Способ по любому из пп.11-17, где оксидоредуктазный катализатор является цельноклеточным биокатализатором, представляющим собой клетку, содержащую полипептид по п.1 или 10.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP09169227 | 2009-09-02 | ||
| EP09172555 | 2009-10-08 | ||
| PCT/EP2010/062896 WO2011026913A1 (en) | 2009-09-02 | 2010-09-02 | Polypeptides having oxidoreductase activity and their uses |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201200398A1 EA201200398A1 (ru) | 2012-09-28 |
| EA025990B1 true EA025990B1 (ru) | 2017-02-28 |
Family
ID=43027577
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201200398A EA025990B1 (ru) | 2009-09-02 | 2010-09-02 | Полипептиды с оксидоредуктазной активностью и их применение |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9045787B2 (ru) |
| EP (2) | EP2473494B1 (ru) |
| JP (2) | JP5868320B2 (ru) |
| KR (1) | KR101946649B1 (ru) |
| CN (1) | CN102834386B (ru) |
| AU (1) | AU2010291208B2 (ru) |
| BR (1) | BR112012004802A2 (ru) |
| CA (1) | CA2777503C (ru) |
| DK (2) | DK3560915T3 (ru) |
| EA (1) | EA025990B1 (ru) |
| ES (2) | ES2885723T3 (ru) |
| IN (1) | IN2012DN01652A (ru) |
| WO (1) | WO2011026913A1 (ru) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2473494B1 (en) * | 2009-09-02 | 2019-06-12 | Purac Biochem B.V. | Polypeptides having oxidoreductase activity and their uses |
| JP5878524B2 (ja) * | 2010-06-14 | 2016-03-08 | 株式会社アモーレパシフィックＡｍｏｒｅｐａｃｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | 新規土壌微生物、前記土壌微生物から分離された新規な酸化還元酵素、前記酸化還元酵素をコード化する遺伝子、及びこれらを利用した無糖体の生産方法 |
| NL2006359C2 (en) * | 2011-03-08 | 2012-04-24 | Bird Engineering B V | Genetically modified cell and process for use of said cell. |
| US9550712B2 (en) | 2011-08-16 | 2017-01-24 | Purac Biochem B.V. | Acid/salt separation |
| KR101217137B1 (ko) * | 2012-03-05 | 2012-12-31 | 한국생산기술연구원 | 프록토오스를 포함하는 옥수수시럽으로부터 5-히드록시메틸-2-푸르푸랄을 제조하는 방법 |
| US8609884B2 (en) * | 2012-03-19 | 2013-12-17 | Awi Licensing Company | Biobased plasticizer and surface covering employing same |
| CN104781412A (zh) * | 2012-07-20 | 2015-07-15 | 诺维信公司 | 5-羟甲基糠醛及其衍生物的酶氧化 |
| NL2011027C2 (en) * | 2013-06-24 | 2014-12-29 | Univ Delft Tech | Process for the preparation of 2,5-furandicarboxylic acid. |
| CN104371955B (zh) * | 2014-10-30 | 2017-02-08 | 江南大学 | 一种合成2,5‑呋喃二甲酸的土生拉乌尔菌及其应用 |
| BR112017017525A2 (pt) * | 2015-02-17 | 2018-04-17 | Purac Biochem Bv | produção de fdca catalisada por desidrogenase |
| CN107406401B (zh) | 2015-03-17 | 2021-04-02 | 普拉克生化公司 | 用于由固体盐制造呋喃-2,5-二甲酸(fdca)的方法 |
| US9321744B1 (en) | 2015-06-26 | 2016-04-26 | Industrial Technology Research Institute | Method for preparing 2,5-furan dicarboxylic acid |
| EP3353289A1 (en) | 2015-09-21 | 2018-08-01 | Purac Biochem B.V. | Fungal production of fdca |
| EP3387038B1 (en) | 2015-12-11 | 2025-07-09 | Société Anonyme des Eaux Minérales d'Evian et en Abrégé "S.A.E.M.E" | Pet polymer with an anti-crystallization comonomer that can be bio-sourced |
| EP3402787A4 (en) | 2016-01-13 | 2019-11-27 | Stora Enso Oyj | PROCESS FOR THE PREPARATION OF 2,5-FURANDIC ACETIC ACID AND INTERMEDIATES AND DERIVATIVES THEREOF |
| EP3378931A1 (en) | 2017-03-21 | 2018-09-26 | Purac Biochem B.V. | Fdca-decarboxylating monooxygenase-deficient host cells for producing fdca |
| KR102568266B1 (ko) | 2017-07-12 | 2023-08-17 | 스토라 엔소 오와이제이 | 정제된 2,5-푸란디카르복실산 경로 생성물 |
| WO2019094740A1 (en) | 2017-11-10 | 2019-05-16 | Shell Oil Company | Methods of producing 2,5-furandicarboxylic acid |
| CN108611380A (zh) * | 2018-04-17 | 2018-10-02 | 华南理工大学 | 一种选择性合成2,5-二羟甲基呋喃的方法 |
| CN109536466B (zh) * | 2018-11-19 | 2022-04-22 | 华南理工大学 | 醛脱氢酶及其基因、重组菌构建及其在呋喃羧酸合成中的应用 |
| MX2021010457A (es) * | 2019-03-01 | 2021-12-10 | Braskem Sa | Método para la síntesis in vivo del 4-hidroximetilfurfural y sus derivados. |
| CN109811020B (zh) * | 2019-03-20 | 2022-03-29 | 南京工业大学 | 利用乌鲁木齐奇异球菌催化合成5-羟甲基糠酸的方法 |
| BR112021022271A2 (pt) | 2019-06-06 | 2021-12-28 | Purac Biochem Bv | Processo para fabricar hidroximetilfurfural |
| CN110331174B (zh) * | 2019-07-15 | 2020-12-25 | 南京林业大学 | 一种以石花菜为原料联产半乳糖酸和5-羟甲基-2-呋喃甲酸的方法 |
| CN110511198A (zh) * | 2019-08-31 | 2019-11-29 | 贵州大学 | 一种利用黑曲霉孢子粉分离提取5-羟甲基-呋喃甲酸的方法 |
| CN114836395B (zh) * | 2022-04-28 | 2024-04-26 | 华东理工大学 | 硫醚单加氧酶突变体及其在制备手性拉唑药物中的应用 |
| CN116024184B (zh) * | 2022-07-26 | 2024-03-15 | 南京科技职业学院 | 醛脱氢酶突变体及其在制备5-羟甲基-2-呋喃甲酸中的应用 |
| CN118931775A (zh) * | 2024-08-07 | 2024-11-12 | 秦皇岛果阳生物科技有限公司 | 一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070243594A1 (en) * | 2003-06-18 | 2007-10-18 | Iep Gmbh | Oxidoreductase from Pichia Capsulata |
| WO2009023174A2 (en) * | 2007-08-10 | 2009-02-19 | Archer Daniels Midland Company | Enzymatic oxidation of hmf |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5217142B2 (ja) * | 2006-10-04 | 2013-06-19 | 三菱化学株式会社 | フラン誘導体の製造法 |
| EP2473494B1 (en) * | 2009-09-02 | 2019-06-12 | Purac Biochem B.V. | Polypeptides having oxidoreductase activity and their uses |
| EP2295534A1 (en) * | 2009-09-02 | 2011-03-16 | Shell Internationale Research Maatschappij B.V. | Novel microorganism and its use in lignocellulose detoxification |
-
2010
- 2010-09-02 EP EP10751918.3A patent/EP2473494B1/en not_active Not-in-force
- 2010-09-02 CN CN201080039317.6A patent/CN102834386B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-09-02 IN IN1652DEN2012 patent/IN2012DN01652A/en unknown
- 2010-09-02 CA CA2777503A patent/CA2777503C/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-09-02 ES ES19178456T patent/ES2885723T3/es active Active
- 2010-09-02 DK DK19178456.0T patent/DK3560915T3/da active
- 2010-09-02 EP EP19178456.0A patent/EP3560915B1/en active Active
- 2010-09-02 EA EA201200398A patent/EA025990B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-09-02 DK DK10751918.3T patent/DK2473494T3/da active
- 2010-09-02 BR BR112012004802A patent/BR112012004802A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-09-02 JP JP2012527325A patent/JP5868320B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-09-02 ES ES10751918T patent/ES2744466T3/es active Active
- 2010-09-02 KR KR1020127008293A patent/KR101946649B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2010-09-02 US US13/393,496 patent/US9045787B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-09-02 WO PCT/EP2010/062896 patent/WO2011026913A1/en active Application Filing
- 2010-09-02 AU AU2010291208A patent/AU2010291208B2/en not_active Ceased
-
2015
- 2015-04-03 US US14/678,745 patent/US9481900B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2015-11-09 JP JP2015219228A patent/JP6372889B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070243594A1 (en) * | 2003-06-18 | 2007-10-18 | Iep Gmbh | Oxidoreductase from Pichia Capsulata |
| WO2009023174A2 (en) * | 2007-08-10 | 2009-02-19 | Archer Daniels Midland Company | Enzymatic oxidation of hmf |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| DATABASE UniProt "SubName: Full=Glucose-methanol-choline oxidoreductase;", XP002559847 * |
| DATABASE UniProt "SubName: Full=Glucose-methanol-choline oxidoreductase;", XP002559848 * |
| DEURZEN VAN M P J, RANTWIJK VAN F, SHELDON R A: "CHLOROPEROXIDASE-CATALYZED OXIDATION OF 5-HYDROXYMETHYLFURAL", JOURNAL OF CARBOHYDRATE CHEMISTRY, TAYLOR & FRANCIS, UK, vol. 16, no. 03, 1 January 1997 (1997-01-01), UK, pages 299 - 309, XP009002072, ISSN: 0732-8303 * |
| KRÖGER M, PRÜBE U, VORLOP K-D: "A new approach for the production of 2,5-furandicarboxylic acid by in situ oxidation of 5-hydroxymethylfurfural starting from fructose", TOPICS IN CATALYSIS, BALTZER SCIENCE PUBLISHERS, BUSSUM, NL, vol. 13, 1 January 2000 (2000-01-01), NL, pages 237 - 242, XP002519332, ISSN: 1022-5528, DOI: 10.1023/A:1009017929727 * |
| MITSUKURA KOICHI, ET AL: "Oxidation of heterocyclic and aromatic aldehydes to the corresponding carboxylic acids by Acetobacter and Serratia strains", BIOTECHNOLOGY LETTERS, SPRINGER NETHERLANDS, NL, vol. 26, no. 21, 1 November 2004 (2004-11-01), NL, pages 1643 - 1648, XP002510697, ISSN: 0141-5492, DOI: 10.1007/s10529-004-3513-4 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20150203882A1 (en) | 2015-07-23 |
| AU2010291208A1 (en) | 2012-03-29 |
| AU2010291208B2 (en) | 2015-04-09 |
| JP5868320B2 (ja) | 2016-02-24 |
| JP2016073289A (ja) | 2016-05-12 |
| KR20120083367A (ko) | 2012-07-25 |
| ES2885723T3 (es) | 2021-12-15 |
| CA2777503A1 (en) | 2011-03-10 |
| ES2744466T3 (es) | 2020-02-25 |
| KR101946649B1 (ko) | 2019-02-11 |
| EP2473494B1 (en) | 2019-06-12 |
| CA2777503C (en) | 2018-10-16 |
| EA201200398A1 (ru) | 2012-09-28 |
| US20120309918A1 (en) | 2012-12-06 |
| EP2473494A1 (en) | 2012-07-11 |
| EP3560915B1 (en) | 2021-06-02 |
| US9481900B2 (en) | 2016-11-01 |
| CN102834386A (zh) | 2012-12-19 |
| JP6372889B2 (ja) | 2018-08-15 |
| US9045787B2 (en) | 2015-06-02 |
| DK3560915T3 (da) | 2021-06-28 |
| BR112012004802A2 (pt) | 2015-09-08 |
| JP2013503614A (ja) | 2013-02-04 |
| EP3560915A1 (en) | 2019-10-30 |
| DK2473494T3 (da) | 2019-07-29 |
| WO2011026913A1 (en) | 2011-03-10 |
| CN102834386B (zh) | 2016-12-07 |
| IN2012DN01652A (ru) | 2015-06-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA025990B1 (ru) | Полипептиды с оксидоредуктазной активностью и их применение | |
| JP2021101708A (ja) | Ｆｄｃａのデヒドロゲナーゼ触媒による生産 | |
| EA023764B1 (ru) | Генетически модифицированная клетка и способ использования упомянутой клетки | |
| EP2308959A1 (en) | Novel microorganism and its use in lignocellulose detoxifixcation | |
| JP2022025108A (ja) | Ｆｄｃａの真菌による生産 | |
| JP2010207094A (ja) | プロトカテク酸の製造法 | |
| KR20120027354A (ko) | Ｄ-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 ｄ-락트산의 제조 방법 | |
| CN110651034A (zh) | 用于制备fdca的fdca-脱羧单加氧酶-缺陷的宿主细胞 | |
| CN112458108A (zh) | 一种在谷氨酸棒状杆菌中利用木糖生成谷氨酸的合成路径的构建方法 | |
| JPWO2008018640A1 (ja) | プラスミド、形質転換体、及び３−カルボキシムコノラクトンの製造方法 | |
| KR101541034B1 (ko) | Ｄ―갈락토네이트 고생산 대장균 균주 및 이의 용도 | |
| JP2006006271A (ja) | 乳酸生産酵母および乳酸生産方法 | |
| JP2024534505A (ja) | Ｏｈｄ由来有機炭素からのバイオポリマーの産生のための改変微生物 | |
| JP5807867B2 (ja) | フェルロイルＣｏＡシンテターゼ遺伝子およびフェルロイルＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ遺伝子を用いたＰＤＣの生産 | |
| KR101533290B1 (ko) | Ｄ―갈락토네이트 고생산 대장균 균주 및 이의 용도 | |
| CN114806902A (zh) | 一种获取非转基因的里氏木霉定向基因工程改良株的方法和应用 | |
| CN115896152A (zh) | 一种谷氨酸棒状杆菌及其应用 | |
| EA013412B1 (ru) | Новый ген sms 27 | |
| JP2011229425A (ja) | ３−メチルガリク酸３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子導入によるｐｄｃの生産 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM |