KR101946649B1

KR101946649B1 - 산화환원효소 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101946649B1
Application number: KR1020127008293A
Authority: KR
Inventors: 하랄드 요한 루이세나아르스; 닉 요하네스 페트루스 비르크스; 프란크 바우터 쿠프만; 아드리아누스 요하네스 요제프 스트라아트호프; 데 요하네스 헨드릭 빈데
Original assignee: 푸락 바이오켐 비.브이.
Priority date: 2009-09-02
Filing date: 2010-09-02
Publication date: 2019-02-11
Also published as: AU2010291208B2; JP2016073289A; EP3560915A1; KR20120083367A; JP2013503614A; CA2777503C; WO2011026913A1; JP5868320B2; DK2473494T3; EA201200398A1; US9481900B2; US9045787B2; EA025990B1; EP2473494B1; ES2885723T3; EP3560915B1; JP6372889B2; BR112012004802A2; EP2473494A1; AU2010291208A1

Abstract

본 발명은 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는, 산화환원효소 활성을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 3의 서열과 45% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 2,5-퓨란-다이카복실산(FDCA)의 제조 또는 5-하이드록시메틸-2-퓨란카복실산(HMF 산)의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

산화환원효소 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그의 용도{POLYPEPTIDES HAVING OXIDOREDUCTASE ACTIVITY AND THEIR USES}

본 발명은 산화환원효소 활성을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 2,5-퓨란-다이카복실산(FDCA)의 제조에 관한 것이다. 본 발명에는 또한 하이드록시메틸퍼퓨랄(HMF)의 FDCA로의 생물전환에 사용될 수 있는, 상기 폴리펩티드를 제조하기에 적합한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포도 또한 포함된다.

2,5-퓨란-다이카복실산(FDCA)은 PET와 같은 폴리에스터의 제조에서 테레프탈레이트에 대한 바이오계(bio-based) 대체물이 될 가능성이 크다. 따라서, 다른 이유로 FDCA는 바이오매스로부터 최고 부가 가치 화학물질(Top Value-Added Chemicals from Biomass)에 관한 DOE 보고서에서 상위-12개 우선 화학물질 중 하나로서 확인되었다[Top Value-Added Chemicals from Biomass, Volume 1 - Results of screening for portential Candidates from Sugars and Synthesis gas, Department of Energy (USA), (2004)]. 상기 화합물은 산성 조건하에서 육탄당을 가열시켜 생성될 수 있는 5-하이드록시메틸퍼퓨랄(HMF)의 산화에 의해 수득될 수 있다. DOE 보고서는 27 쪽에서 FDCA에 대한 다소의 잠재적 유용성을 개시하고 있다. 상기 유용성으로는 숙신산, 2,5-비스(아미노메틸)-테트라하이드로퓨란, 2,5-다이하이드록시메틸테트라하이드로퓨란, 2,5-다이하이드록시메틸퓨란 및 2,5-퓨란다이카브알데하이드의 제조를 위한 기질로서의 역할이 포함된다. C6 당의 화학적 산화적 탈수에 의한 FDCA의 생성 및 FDCA의 용도가 공지되어 있고 26 쪽의 표 13에 나타낸 기술적 장벽을 제기하고 있지만, 생물전환 - 아마도 효소적 전환 -에 대해 그 위치는 알려지지 않았다.

FDCA의 효소적 제조를 위한 방법은 WO 2009/023174 호에 나와 있다. 상기 개시내용에서는, 하이드록시메틸퍼퓨랄 종을 클로로퍼산화환원효소, 및 하이드록시메틸퍼퓨랄의 C1 위치에 카복실산 기를 갖는 과산화수소 산화 생성물, 특히 포밀퓨란 카복실산 또는 FFCA로 산화시킨다. 결과는, 예를 들면, 도 1에 나와 있다. 또 다른 태양에서, HMF는 산화 기질의 존재하에 산화환원효소와 접촉함으로써, HMF는 다이포밀퓨란 또는 포밀퓨란 카복실산 중 하나 이상으로 산화된다.

WO 2009/023174 호에서 알려진 방법의 불리한 점은 반응이 과산화수소를 필요로 하며 생성된 생성물이 FDCA와 2개의 오염 부산물, 즉, 하이드록시메틸퓨란 카복실산(HmcFCA) 및 포밀퓨란 카복실산(FFCA)의 혼합물이란 점이다. 결과적으로, HMF로부터 FDCA의 수율이 감소되고, 실질적으로 정제된 형태의 FDCA를 수득하기 위해 추가의 회수 단계가 필요하다.

데이터베이스 EBI, 유니프롯(Uniprot) B2T4R9에서, "버크홀더리아 피토퍼만스(Burkholderia phytofirmans) PsJN의 염색체 1의 완전 서열"에서 글루코스-메탄올-콜린 산화환원효소로서 상동성으로부터 추정된 577개 아미노산의 서열이 확인되었다.

데이터베이스 EBI, 유니프롯 B2JSZ0에서는, "버크홀더리아 피마툼(Burkholderia phymatum) STM815의 플라스미드 1의 완전 서열"에서 글루코스-메탄올-콜린 산화환원효소로서 상동성으로부터 추정된 576개 아미노산의 서열이 확인되었다.

문헌 [Deurzen, M.P.J. et al., J. Carbohydrate Chemistry 16(3), 299-309(1997)]에는, 5-하이드록시메틸퍼퓨란의 클로로퍼옥시다제-촉진된 산화가 개시되어 있다. 상기 반응은 60 내지 74%의 선택성하에 퓨란-2,5-다이카복스알데하이드(FDC)로 진행된다. 부산물은 5-하이드록시메틸-2-퓨란카복실산(HFCA) 및 5-포밀퓨란-2-카복실산(FFCA)이었다.

본 발명의 목적은 산화환원반응에 분자 산소를 사용할 수 있는 산화환원효소를 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 광범위한 반응 스펙트럼을 갖는 산화환원효소를 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 높은 위치-특이성을 갖는 산화환원효소를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 실질적인 양의 부산물이 배제될 수 있는, FDCA의 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 실질적인 양의 부산물이 배제될 수 있는, 5-하이드록시메틸-2-퓨란카복실산(HMF 산)의 제조 방법을 제공하는 것이다. 하나 이상의 상기 목적이 본 발명에 따라 달성된다.

본 발명은 산화환원효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 산화환원효소 활성, 특히 HmfH 산화환원효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다.

따라서, 본 발명에 따르면, 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는, 산화환원효소 활성을 갖는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 3의 서열과 45% 이상의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체 폴리펩티드가 제공된다.

상기 산화환원효소 폴리펩티드는, 온화한 반응 조건(30 ℃, pH 7)을 허용하고 폐기물을 덜 생성하는, 부가 가치 화합물 FDCA를 생성하기 위한 화학적 산화 경로에 대한 효소적 대안을 제공한다. 산화환원효소는 전형적인 산화효소이다, 즉, 산화 반응에 분자 산소만 필요하여 고가의 보조인자의 재생 필요성을 배제시킨다. 상기 효소는 광범위한 반응 특이성 및 위치-특이성을 제공하여, 알콜 및 알데하이드 기가 퓨란 주쇄의 C2 또는 C5 위치상에 존재하는지 여부에 관계없이, 알콜 및 알데하이드 기를 결국 카복실산으로 산화시킨다.

본 발명에 따르면 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 예를 들면, 발현 벡터, 및 본 발명에 따른 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.

본 발명은 또한, 본 발명의 세포를 산화환원효소 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고, 선택적으로, 발현된 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 산화환원효소 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조 방법, 및 상기 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 또 다른 태양은 강력한 전세포(whole-cell) 생물촉매를 사용하여 프럭토스-풍부 공급물 스트림으로부터 FDCA를 생성하기 위한 통합 공정에 관한 것이다.

도 1은 HmfH 산화환원효소에 의해 촉진된 산화 반응 도식이다.
도 2는 HmfH 발현 벡터 pJT'hmfH의 플라스미드 지도이다. Ptac', tac 프로모터; rep, pRO1600 복제 단백질을 암호화하는 유전자; gmR, 젠타마이신 내성 유전자; bla, 베타-락타마제; pRO16000-ori, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)에 대한 복제 기점; pUC ori, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 대한 복제 기점.
도 3은 큐프리아비더스 바실렌시스(Cupriavidus basilensis) HMF14(A) 및 잠재적 퍼퓨랄 및/또는 HMF 사용자로 확인된 다른 종(B)에서 퍼퓨랄 및 HMF 대사성 유전자의 유전적 구성을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 슈도모나스 푸티다 S12 pJT'hmfH의 조 세포 추출물에서 HMF로부터 FDCA, HMF-알콜(H-oh) 및 HMF-산(H-산)의 생성을 나타낸 것이다.
도 5는 슈도모나스 푸티다_pJT'hmfH의 유가식 배양물에서 HMF 산 및 FDCA의 생성을 나타낸 것이다. 왼쪽 화살표는 HMF 공급물의 개시를 나타내고; 오른쪽 화살표는 공급물에 글리세롤의 첨가를 나타낸다.
도 6은 슈도모나스 푸티다_pJT'hmfH의 유가식 배양물에서 HMF 산 및 FDCA의 생성을 나타낸 것이다. 화살표는 혼합 HMF 및 글리세롤 공급물의 개시를 나타낸다.
도 7a는 실시예 VIII의 유가식 발효에서 HMF 산, FDCA 및 바이오매스의 농도를 나타낸 것이다. 도 7b는 실시예 VIII의 유가식 발효에서 글리세롤 및 HMF의 공급 속도를 나타낸 것이다.
서열목록의 간단한 설명
서열 번호 1은 프라이머 FN23: 5'-CGGAATTCCACATGACAAGGGGAGACCG-3'의 DNA 서열을 나타낸다. 밑줄 친 서열은 EcoRI 제한효소 부위를 나타낸다.
서열 번호 2는 프라이머 FN24: 5'-CGGAATTCGCTTCGGTCTTCAACTCGGATG-3'의 DNA 서열을 나타낸다. 밑줄 친 서열은 EcoRI 제한효소 부위를 나타낸다.
서열 번호 3은 HmfH의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 번호 4는 hmfH의 암호화 서열을 나타낸다.

본 명세서 및 첨부한 특허청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "구성하다" 및 "포함하다", 및 "구성하다", "구성하는", "포함하다" 및 "포함하는"이란 변형은 총괄적으로 해석된다. 즉, 상기 단어들은, 문맥상 허용되는 경우, 특별히 열거되지 않은 다른 요소 또는 정수의 가능한 포함을 시사하는 것이다.

본원에서 단수형 용어는 하나 또는 하나보다 많은(즉, 하나 또는 하나 이상의) 대상을 나타내기 위해 사용된다. 예로서, "요소(element)"는 하나의 요소 또는 하나 보다 많은 요소를 의미할 수 있다.

본원에서 광범위한 반응 스펙트럼은 산화환원효소가 많은 상이한 기질, 예를 들면, HMF, HMF 산, HMF 알콜, 퍼퓨랄, 퍼퓨릴 알콜에 촉매로 작용할 수 있음을 의미한다. 입체-특이성은 특정 C-원자만을 산화시키는 것을 의미한다.

산화환원효소 폴리펩티드

산화환원효소 활성을 갖는 본 발명에 따른 폴리펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 3의 서열과 45% 이상의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체 폴리펩티드를 포함한다.

한 태양에서, 변이체 핵산 분자는, 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 66%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 상동성인 실질적으로 상동성 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또 다른 태양에서, 변이체 단백질은, 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대해 적어도 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 상동성인 실질적으로 상동성 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 한 태양은 (a) 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열; (b) 서열 번호 4의 역 보체인 폴리뉴클레오티드와 선택적으로 하이브리드화되는 뉴클레오티드 서열; (c) 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열과 적어도 66% 이상의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; (d) 길이가 약 100개 뉴클레오티드 이상인, 상기 (a), (b) 또는 (c)에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 단편; (e) 상기 (a), (b), (c) 또는 (d) 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 서열에 대한 유전자 코드의 결과로 변성되는 서열; (f) 상기 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)에 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 역 보체인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 관련 폴리펩티드에 관한 것이다.

한 태양은 GC 함량이 56% 이상, 58% 이상, 또는 58 내지 65%일 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물이다. 또 다른 태양은 폴리뉴클레오티드 서열 또는 핵산 구조물을 포함하는 벡터이다.

용어 "상동성", "서열 동일성" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명에 있어서, 본원에서 두개의 아미노산 서열에 의해 또는 두개의 핵산 서열에 의해 공유된 서열 동일성 정도를 측정하기 위해 서열들은 최적의 비교 목적으로 정렬되는 것으로 정의된다(예를 들면, 제 2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제 1 아미노산의 서열 또는 핵산 서열에 간극(gap)이 도입될 수 있다). 상기 정렬은 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 수행될 수 있다. 또는, 상기 정렬은 보다 짧은 비교 길이, 예를 들면, 약 20, 약 50, 약 100 개 이상의 핵산/염기 또는 아미노산에 수행될 수 있다.

그 다음에, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제 1 서열에서의 위치를 제 2 서열에서의 상응하는 위치에서 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 차지한 경우, 상기 분자는 그 위치에서 동일하다. 서열들 사이에 공유된 동일성의 정도는 전형적으로 두 서열 사이의 동일성%의 항으로 나타내며, 서열들에 의해 공유된 동일 위치의 수의 함수이다(즉, 동일성% = 동일 위치 수/위치 총수(즉, 중복 위치) x 100). 바람직하게, 비교되는 두 서열은 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 길이를 갖는다.

숙련된 자라면 두 서열간의 상동성을 측정하기 위한 여러 다양한 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다는 사실을 인지할 것이다. 예를 들면, 서열의 비교 및 두 서열간 동일성%의 측정은 수학 연산을 이용하여 달성될 수 있다. 바람직한 태양에서, 두 아미노산 서열간의 동일성%는, 블로섬(Blossom) 62 행렬 또는 팜(PAM)250 행렬, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 간극 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, 액셀라이스(Accelrys) GCG 소프트웨어 패키지(http://www.accelrys.com/products/gcg/에서 시판)중 GAP 프로그램내에 통합된 니들만 및 운쉬(Needleman and Wunsch)[J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)] 연산을 이용하여 측정한다. 숙련된 자라면 모든 상기 다양한 파라미터들이 약간 상이한 결과를 제공할 것이지만 두 서열의 전체 동일성%는 상이한 연산을 사용하는 경우에 별로 영향받지 않음을 인지할 것이다.

또 다른 태양에서, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성%는 NWSgapdna.CMP 행렬, 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 간극 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하여, 액셀라이스 GCG 소프트웨어 패키지(http://www.accelrys.com/products/gcg/에서 시판)중 GAP 프로그램을 사용하여 측정한다. 또 다른 태양에서, 두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성%는 팜120 가중치 유수 표, 12의 간극 길이 패널티 및 4의 간극 패널티를 사용하여, 얼라인(ALIGN) 프로그램(버전 2.0)[진스트림(Genestream) 서버 IGH 몽펠리에 프랑스(Montpellier France)(http://www.vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cqi)의 서열 데이터를 이용하는 얼라인 퀘리(ALIGN Query)에서 시판]내에 통합된 이. 메이어스(E. Meyers) 및 더블유. 밀러(W. Miller)의 연산[CABIOS, 4:11-17 (1989)]을 사용하여 측정한다.

본 발명의 핵산 및 단백질 서열은 또한, 예를 들면, 다른 부류 구성원 또는 관련 서열을 확인하기 위해 공공 데이터베이스에 대한 탐색을 수행하기 위한 "쿼리(query) 서열"로 사용될 수 있다. 상기 탐색은 문헌 [Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]의 BLASTn 및 BLASTx 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 탐색은 본 발명의 산화환원효소 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어길이 = 12를 이용하여 수행할 수 있다. BLAST 단백질 탐색은 본 발명의 산화환원효소 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해 BLASTx 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3을 이용하여 수행할 수 있다. 비교 목적을 위한 간극 정렬을 수득하기 위해, 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402 (1997)]에 기술된 바와 같이 갭(Gapped) BALST를 사용할 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각 프로그램(예를 들면, BLASTx 및 BLASTn)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/에서 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)의 홈페이지 참조).

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "선택적으로 하이브리드화시키는", "선택적으로 하이브리드화시키다" 및 유사한 용어들은 서로에 66% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상 또는 보다 더 바람직하게는 99% 이상 상동성인 뉴클레오티드 서열이 전형적으로 서로에 하이브리드화된 채 유지되는 하이브리드화 및 세척 조건을 기술하기 위해 사용된다. 즉, 상기 하이브리드화 서열들은 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상 또는 보다 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 공유할 수 있다.

상기 하이브리드화 조건의 바람직한 비-제한 예는 약 45 ℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)중에서 하이브리드화후, 약 50 ℃, 바람직하게는 약 55 ℃, 바람직하게는 약 60 ℃, 훨씬 더 바람직하게는 약 65 ℃에서 1X SSC, 0.1% SDS 중에서 1 회이상 세척하는 것이다.

매우 엄격한 조건은, 예를 들면, 약 68 ℃에서 5x SSC/5x 덴하르트(Denhardt) 용액/1.0% SDS 중에서 하이브리드화 및 실온에서 0.2x SSC/0.1% SDS 중에서의 세척을 포함한다. 또는, 세척은 42 ℃에서 수행될 수 있다.

숙련된 전문가라면 엄격한 조건 및 매우 엄격한 하이브리드화 조건을 위해 어떤 조건을 적용할 지를 알 것이다. 상기 조건에 관한 추가의 지침은 당해 분야에서, 예를 들면, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (1989); and Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.) (1995)]에서 용이하게 이용가능하다.

물론, 폴리 A 서열(예를 들면, mRNA의 3' 말단 폴리(A) 계통) 또는 T(또는 U) 잔기의 상보성 연장부(stretch)에만 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 핵산의 일부에 특이적으로 하이브리드화되기 위해 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않는데, 그 이유는 상기 폴리뉴클레오티드는 폴리 (A) 연장부 또는 그의 보체(예를 들면, 실제로 임의의 이중-가닥 cDNA 클론)를 함유하는 임의의 핵산 분자에 하이브리드화되기 때문이다.

전형적인 접근방법에서, 다른 유기체, 예를 들면, 세균, 특히 미생물 부류 트리코마세아(Trichomaceae), 예를 들면, 버크홀데리아 피토퍼만스(Burkholderia phytofirmans)와 같은 버크홀데리아 속으로부터 제작된 유전자 라이브러리를 스크리닝할 수 있다.

예를 들면, 버크홀데리아 균주는 서던 블롯(Sourthern blot) 분석에 의해 상동성 산화환원효소 폴리뉴클레오티드에 대해 스크리닝될 수 있다. 본 발명에 따른 상동성 DNA 제한 단편의 검출시, 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 적절한 균주로부터 동일 크기의 염색체 단편으로부터 유전자 라이브러리를 제작할 수 있다. 또는, 미생물이 진핵생물인 경우, 산화환원효소 HmfH의 mRNA 전사체를 노던(Northern) 하이브리드화에 의해 확인할 수 있으며, 전사체의 동정시, 진핵 미생물로부터 분리된 전체 RNA를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제작할 수 있다.

상동성 유전자 서열은, 예를 들면, 본원에 교지된 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 근거하여 설계된 2개의 변성 올리고뉴클레오티드 프라이머 풀을 사용하여 PCR을 수행함으로써 분리될 수 있다.

반응을 위한 주형은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 발현하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 균주로부터의 전체 염색체 DNA일 수 있다. 증폭된 서열이 새로운 산화환원효소 핵산 서열 또는 그의 기능적 등가물의 서열을 나타내게 하기 위해 PCR 산물을 서브클로닝하고 서열화할 수 있다.

또는, 반응을 위한 주형은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 발현하는 것으로 알려져 있거나 의심되는 균주로부터 제조된 mRNA의 역전사에 의해 수득된 cDNA일 수 있다. 증폭된 서열이 새로운 산화환원효소 핵산 서열 또는 그의 기능적 등가물의 서열을 나타내게 하기 위해 PCR 산물을 서브클로닝하고 서열화할 수 있다.

이어서, PCR 단편을 사용하여 다양한 공지된 방법에 의해 전장(full-length) cDNA 클론을 분리할 수 있다. 예를 들면, 증폭된 단편을 표지화하고 박테리오파지 또는 코스미드 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용할 수 있다. 또는, 게놈 라이브러리를 스크리닝하기 위해 표지화된 단편을 사용할 수 있다.

PCR 기술은 또한 다른 유기체로부터의 전장 cDNA 서열을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, RNA는 적절한 세포 또는 조직 공급원으로부터, 표준 절차에 따라 분리될 수 있다. 역전사 반응은 1차 가닥 합성을 프라이밍하기 위한 증폭된 단편의 5' 가장 말단에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 RNA 상에서 수행될 수 있다.

생성된 RNA/DNA 하이브리드는 이어서 표준 말단 트랜스퍼라제 반응을 이용하여 "테일링(tailed)"(예를 들면, 구아닌으로)될 수 있으며, 상기 하이브리드는 RNase H로 절단될 수 있으며, 그 후에 2차 가닥 합성이 프라이밍될 수 있다(예를 들면, 폴리-C 프라이머로). 따라서, 증폭된 단편 상류의 cDNA 서열은 용이하게 분리될 수 있다. 유용한 클로닝 방법의 개관은, 예를 들면, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (1989); and Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.) (1995)]을 참조하시오.

본 발명의 또 다른 태양은 클로닝 및 발현 벡터를 포함하여, 산화환원효소 단백질 또는 그의 기능적 등가물을 암호화하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드의 발현이 일어나는 조건하에서 상기 벡터를 적절한 숙주 세포에서 성장, 형질전환 또는 형질감염시키는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 복제성 벡터, 예를 들면, 클로닝 또는 발현 벡터내에 혼입될 수 있다. 상기 벡터는 양립가능한 숙주 세포에서 핵산을 복제하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 태양에서, 본 발명은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 복제성 벡터내에 도입하고, 벡터를 양립가능한 숙주 세포내에 도입하고, 숙주 세포를 벡터의 복제를 야기하는 조건하에서 성장시킴으로써 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다. 벡터는 숙주 세포로부터 회수될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 하기에 기술된다.

발현 카세트 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 삽입되는 벡터는 재조합 DNA 절차에 편리하게 적용될 수 있는 임의의 벡터일 수 있으며, 벡터의 선택은 종종 상기 벡터가 도입될 숙주 세포에 따라 달라진다.

본 발명에 따른 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터, 즉, 그 복제가 염색체 복제와 독립적인, 염색체외 독립체로서 존재하는 벡터, 예를 들면, 플라스미드일 수 있다. 또는, 벡터는 숙주 세포내에 도입되는 경우 숙주 세포 게놈에 통합되어 그것이 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 벡터일 수 있다.

벡터의 한 유형은 "플라스미드"로, 이것은 추가의 DNA 절편이 접합될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 벡터의 또 다른 유형은 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내에 접합될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다(예를 들면, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들면, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내에 도입시 숙주 세포의 게놈 내에 통합됨으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작용적으로 연결되는 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는, 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태이므로, 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 상기 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 코스미드, 바이러스 벡터(예를 들면, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스) 및 등가의 작용을 하는 파아지 벡터를 포함한다.

본 발명에 따른 벡터는 시험관내에서, 예를 들면, RNA 제조를 위해 사용되거나 또는 숙주 세포를 형질감염 또는 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 벡터는 2개 이상, 예를 들면, 3개, 4개 또는 5개의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를, 예를 들면, 과발현을 위해 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태의 본 발명의 핵산을 포함하는데, 이것은 재조합 발현 벡터가 발현될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된, 발현에 사용될 숙주 세포를 기준으로 선택된 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 것을 의미한다.

발현 벡터와 같은 벡터내에서, "작동가능하게 연결된"은 해당 뉴클레오티드 서열이 (예를 들면, 시험관내 전사/번역 시스템에서, 또는 벡터가 숙주 세포내에 도입되는 경우 숙주 세포에서) 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결되는 것을 의미한다, 즉, 용어 "작동가능하게 연결된"은 기술된 성분들이 그 의도한 방식으로 작용하도록 하는 관계로 존재하는 병렬배치를 말한다. 암호화 서열에 "작동가능하게 연결된" 프로모터, 인핸서 또는 다른 발현 조절 신호와 같은 조절 서열은, 암호화 서열의 발현이 제어 서열과 상용성 조건하에서 달성되도록 하는 방식으로 배치되거나, 또는 상기 서열들은 그의 의도한 목적을 위해 일제히 작용하도록, 예를 들면, 전사가 프로모터에서 개시되어 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 통해 진행하도록 정렬된다.

용어 "조절 서열" 또는 "제어 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소(예를 들면, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것이다. 상기 조절 서열은, 예를 들면, 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기술되어 있다.

용어 조절 또는 제어 서열은 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 유도하는 서열, 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하는 서열(예를 들면, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다.

따라서, 해당 숙주 세포에 대한 벡터 또는 발현 구조물은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 암호화 가닥에 대해 5'-말단으로부터 3'-말단으로 연속적 순서로 서로에게 작동가능하게 연결된 하기의 요소들을 포함할 수 있다: (1) 해당 숙주 세포에서 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 유도할 수 있는 프로모터 서열; (2) 선택적으로, 해당 숙주 세포로부터 배양 배지내로 폴리펩티드의 분비를 유도할 수 있는 신호 서열; (3) 셀로바이오하이드롤라제 활성을 갖는 폴리펩티드의 성숙하고 바람직하게는 활성인 형태를 암호화하는 본 발명의 DNA 서열; 및 바람직하게는 또한 (4) 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 하위에 전사를 종료할 수 있는 전사 종료 영역(터미네이터).

본 발명의 뉴클레오티드 서열의 하위에, 하나 이상의 전사 종료 부위(예를 들면, 터미네이터)를 함유하는 3' 미번역 영역이 존재할 수 있다. 터미네이터의 기점은 덜 중요하다. 터미네이터는, 예를 들면, 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열에서 유래할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 효모 터미네이터는 효모 숙주 세포에 사용되고, 사상균 터미네이터는 사상균 숙주 세포에 사용된다. 보다 바람직하게는, 터미네이터는 (폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 발현될) 숙주 세포에 내인성이다. 전사된 영역에, 번역을 위한 리보솜 결합 부위가 존재할 수 있다. 구조물에 의해 발현된 성숙한 전사체의 암호화 부분은 번역될 폴리펩티드의 말단에 적절히 위치한 개시 및 종료 코돈에서 번역 개시 AUG를 포함할 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드의 증대된 발현은 또한 이종 조절 영역, 예를 들면, 프로모터, 분비 리더 및/또는 터미네이터 영역의 선택에 의해 달성될 수 있는데, 이들은 발현, 및 바람직한 경우 발현 숙주로부터 해당 단백질의 분비 수준을 증가시키고/시키거나 본 발명의 폴리펩티드의 발현의 유도성 제어를 제공하는 작용을 할 수 있다.

당해 분야에 숙련된 자에 의해, 발현 벡터의 설계가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인들에 따라 달라질 수 있음이 인지될 것이다. 본 발명의 벡터, 예를 들어, 발현 벡터는 숙주 세포내에 도입되어 본원에 기술된 핵산에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드(예를 들면, 산화환원효소 단백질, 산화환원효소 단백질의 돌연변이 형태, 그의 단편, 변이체 또는 기능적 등가물, 융합 단백질 등)를 생성할 수 있다.

본 발명의 벡터, 예를 들면, 재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서 산화환원효소 단백질의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들면, 산화환원효소 단백질은 에스케리키아 콜라이와 같은 세균 세포, 곤충 세포(바큘로바이러스 발현 벡터 사용), 사상균, 효모 세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 더 논의되어 있다. 적절한 숙주의 대표적인 예는 하기에서 기술한다.

전술한 숙주 세포에 적절한 배양 배지 및 조건은 당해 분야에 공지되어 있다.

상기에 나타낸 바와 같이, 용어 "제어 서열" 또는 "조절 서열"은 본원에서 폴리펩티드의 발현에 필수적이고/이거나 유리할 수 있는 적어도 임의의 성분을 포함하는 것으로 정의된다. 임의의 제어 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산 서열에서 유래하거나 외래성일 수 있다. 상기 제어 서열은 프로모터, 리더, 최적 번역 개시 서열(문헌 [Kozak, J. Biol. Chem. 266:19867-19870 (1991)]에 기술된 바와 같은), 분비 신호 서열, 전구-펩티드 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 터미네이트를 포함할 수 있으나, 이로 한정되지는 않는다. 최소한, 제어 서열은 전형적으로 프로모터, 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함한다.

안정하게 형질전환된 미생물은 도입된 분자가 성장 배지중에서 유지, 복제 및 분비되도록 도입된 하나 이상의 DNA 단편을 갖는 것이다. 안정한 형질전환은 다중 또는 단일 염색체 통합(들)에 기인하거나 또는 플라스미드 벡터(들)과 같은 염색체외 요소(들)에 의한 것일 수 있다. 플라스미드 벡터는 특정 DNA 단편에 의해 암호화된 폴리펩티드의 발현을 유도할 수 있다.

발현은 구성적일 수 있거나 또는 특정 폴리펩티드를 암호화하는 기능적으로 관련된 DNA 단편의 높은 수준의 전사를 가능케 하는 유도성(또는 억제성) 프로모터에 의해 조절될 수 있다.

산화환원효소의 분리

산화환원효소, 또는 산화환원효소를 발현하는 DNA 물질은 산화환원효소를 발현하는 유기체, 바람직하게는 미생물로부터 분리할 수 있다. 바람직하게, 상기 미생물은 HMF를 사용할 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 미생물은 바람직하게는 다음으로 이루어진 군에서 선택된다: 큐프리아비더스(Cupriavidus), 버크홀더리아(Burkholderia), 브래디리조븀(Bradyhrizobium), 메틸로박테리움(Methylobacterium); 큐프리아비더스 바시스리엔시스(Cupriavidus basisliensis), 버크홀더리아 피토퍼만스(Burkholderia phytofirmans), 브래디리조븀 자포니쿰(Bradyhrizobium japonicum), 메틸로박테리움 라디오톨레란스(Methylobacterium radiotolerans), 큐프리아비더스 바시스리엔시스 HMF14, 버크홀더리아 피토퍼만스 PsJN, 브래디리조븀 자포니쿰 USDA110, 메틸로박테리움 라디오톨레란스 JCM2831.

본 발명에 유용한 가장 바람직한 산화환원효소는 HMF를 사용하며, 본원에서 DSMZ에서 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약(the Budapest Treaty on International Recognition of the Deposits of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedures)에 따라 기탁된 큐프리아비더스 바실렌시스 HMF14로부터 분리된 산화환원효소이다: 큐프리아비더스 바실렌시스 HMF14 = DSM 22875, 기탁일: 2009년 8월 19일, 기탁자 TNO, 네덜란드 2628VK 델프트 쇼마커스트라트 97.

따라서, HMF-이용 세균인 큐프리아비더스 바실렌시스 균주 HMF14를 분리하고 HMF 분해 경로에 수반되는 유전자를 동정하였다. 유전자들(본원에서 hmfH로 정의)중 하나는 퍼퓨릴 알콜, 퍼퓨랄, HMF 및 5-하이드록시메틸-퓨로산을 산화시키는 것으로 밝혀진 579-아미노산, 62 kDa FAD-의존성 산화환원효소를 암호화하였다. 상기 분자들에서 C2 및 C5에서 알콜/알데하이드기는 환원효소를 암호화하는 추가의 핵산 구조물의 필요없이 산화되었으나, 상기 활성의 존재가 유리할 수 있다(도 1 참조).

따라서, 본 발명은 폴리펩티드, 예를 들면, 산화환원효소(EC 1.1 + EC 1.2 활성) 활성을 갖는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 효소들은 본원에서 폴리펩티드의 서브클래스이다.

산화 반응

산화 반응은 본원에서 본 발명의 산화환원효소 및 하나 이상의 조효소(본원 하기에 기술)의 존재하에 퓨란 화합물과 산화제의 하나 이상의 반응이다. 산화 반응은 생성물을 야기하는 하나의 산화 반응 단계(예를 들면, HMF-산의 FDCA로의 산화)를 포함할 수 있다. 또는, 상기 반응은 하나보다 많은 산화 반응 단계를 포함할 수 있으며, 각 단계는 중간체를 생성하고, 이때 최종 중간체가 최종 생성물이다(예를 들면, HMF의 FDCA로의 산화). 산화 반응의 예는 도 1에 나타내었다.

하나의 산화 반응은 FDCA의 하나 이상의 퓨란 전구체가, 산화환원효소 촉매 및 하나 이상의 조효소의 존재하에 산화제와의 반응에 의해 FDCA로 전환되는 2,5-퓨란다이카복실산(FDCA)의 생성으로, 이때 산화환원효소 촉매는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함한다. FDCA의 퓨란 전구체는 5-하이드록시메틸퍼퓨랄(HMF), 2,5-다이하이드록시메틸 퓨란(HMF 알콜) 및 5-하이드록시메틸-2-퓨란카복실산(HMF 산)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게 퓨란 전구체는 HMF이다. HMF는 편리한 방법으로 산의 존재하에 가열함으로써 하나 이상의 육탄당으로부터 수득될 수 있다. 육탄당은 바이오매스로부터 수득될 수 있다. 산화 반응은 또한 5-하이드록시메틸-2-퓨란카복실산(HMF 산)의 제조 방법일 수 있는데, 여기서 HMF 산의 하나 이상의 퓨란 전구체는 산화환원효소 촉매 및 하나 이상의 조효소의 존재하에 산화제와의 반응에 의해 HMF 산으로 전환되며, 산화환원효소 촉매는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함한다. 한 태양에서, HMF 산의 퓨란 전구체는 5-하이드록시메틸(HMF) 및 2,5-다이하이드록시메틸 퓨란(HMF 알콜)로부터 선택될 수 있다. 다른 산화 방법도 가능하다.

산화 반응은 바람직하게는 비교적 온화한 온도, 즉, 10 내지 80 ℃, 보다 바람직하게는 20 내지 45 ℃, 가장 바람직하게는 약 25 내지 40 ℃에서 수행된다. 반응중 pH는 바람직하게는 pH 3 내지 8, 보다 바람직하게는 약 pH 7이다. 반응 시간은 대기 산소 또는 순수한 산소를 사용하여 6 내지 18 시간이며, 효소는 더 오랜 시간동안 반응성인 것이 바람직하다.

반응기는 임의의 적합한 (통기성) 생물반응기일 수 있다. 상기 반응기는 회분식, 연속식 또는 바람직하게는 유가식으로 작동될 수 있다.

FDCA, HMF-산 등과 같은 산화 생성물은 결정화 산화 생성물, 예를 들면, 결정화된 FDCA의 냉각/재결정화 및 분리에 의해 반응 혼합물로부터 회수될 수 있다. 그러나, 당해 분야에 공지된 바와 같은 산 침전 및 용매 추출과 같은 다른 회수 방법도 적합하나, 이로 한정되지는 않는다.

선택적으로, 반응은 조효소의 존재하에 일어난다. 조효소는 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+) 및/또는 플라빈 아데닌 다이뉴클레오티드(FAD) 및/또는 피롤로퀴놀린 퀴놀론(PQQ)일 수 있다. 본 발명의 산화 반응에서 데하이드로게나제 활성, 예를 들면, 산화 반응이 세포의 세포 추출물에서 일어나거나 존재하는 세포에서 밝혀진 내인성 탈수소화 활성과 상승적 효과가 발견되었다. 단량체 중 하나가 FDCA인, 하나 이상의 단량체로부터 중합체의 제조 방법.

산화제

본 발명에 따른 반응중 산화제는 임의의 산화제, 바람직하게는 산소일 수 있다. 산소의 가장 경제적인 공급원은 공기이다. 이것은 공기가 비용없이 독성없이 반응후 제거할 필요없이 대기로부터 용이하게 수득된다는 점에서 유리하다. 또는, 분자 산소 유리 시스템을 사용할 수 있다. 산소-발생 시스템은 원칙적으로 당해 분야에 개시된 다양한 산소-발생 시스템으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 반응 혼합물에 이미 존재하는 카탈라제 효소를 이용하여 과산화수소로부터 산소를 발생할 수 있다.

퓨란 화합물

본원에서 퓨란 화합물은 2,5-퓨란-다이카복실산 또는 그의 전구체로 산화될 수 있는 퓨란기를 갖는 임의의 화합물인 것으로 이해된다. 바람직한 퓨란 화합물로는 하이드록시메틸퍼퓨랄(HMF), 하이드록시메틸퓨란 카복실산(HMF 산), 2,5-다이하이드록시메틸퓨란(HMF 알콜)이 포함된다. 퓨란 고리 또는 임의의 또는 그의 치환가능한 측면기는, 퓨란 고리에서 임의의 이용가능한 위치상에서, 예를 들면, 사이클릭기를 포함하여 OH, C1-C10 알킬, 알킬, 알릴, 아릴 또는 RO-에터 잔기로 치환될 수 있다.

산화환원효소의 발현

효소의 발현에 사용된 정확한 메카니즘과 무관하게, 상기 발현은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 상기 효소들을 암호화하는 유전자를 또 다른 숙주 세포내에 도입시킴으로서 전달가능한 것으로 생각된다. 본원에 정의된 바와 같은 유전 요소들로는 단백질, 특히 효소와 같은 생성물에 대한 발현가능한 암호화 서열을 갖는 핵산(일반적으로 DNA 또는 RNA), 아포단백질, 또는 관련 효소를 발현하거나 그 발현을 조절하는 안티센스 RNA가 포함된다. 발현된 단백질은 효소로서 작용하거나, 효소 활성을 억제 또는 활성화하거나, 효소의 발현을 조절할 수 있다. 이들 발현가능한 서열을 암호화하는 재조합 DNA는 염색체성(예를 들면, 상동성 재조합에 의해 숙주 세포 염색체내에 통합됨) 또는 염색체-외(예를 들면, 하나 이상의 플라스미드, 코스미드, 및 자가 복제할 수 있는 다른 벡터에 의해 운반됨)일 수 있다. 본 발명에 따른 숙주 세포를 형질전환시키기 위해 사용되는 재조합 DNA는, 구조 유전자 및 전사 인자 이외에, 프로모터, 리프레서 및 인핸서를 포함하여, 단백질, 아포단백질 또는 안티센스 RNA에 대한 암호화 서열의 발현 또는 활성화를 조절하는 작용을 하는 발현 제어 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 제어 서열은 숙주 세포 게놈에서 이미 암호화된 선택된 효소의 과발현을 촉진하기 위해 야생형 숙주 세포내에 삽입될 수 있거나, 또는 이들은 염색체외로 암호화된 효소의 합성을 제어하기 위해 사용될 수 있다.

재조합 DNA는 플라스미드, 코스미드, 파아지, 효모 인공 염색체, 또는 숙주 세포내에 유전 요소의 전달을 매개하는 다른 벡터를 포함하여(이로 한정되지는 않는다), 임의의 수단에 의해 숙주 세포내에 도입될 수 있다. 이들 벡터는 벡터 및 벡터에 의해 운반된 유전 요소의 복제를 제어하는 시스-작용 제어 요소와 함께, 복제 기점을 포함할 수 있다. 그 중에 유전 요소가 도입된 숙주 세포의 동정을 돕기 위해 선택성 마커가 벡터상에 존재할 수 있다.

숙주 세포내에 유전 요소를 도입하기 위한 수단(예를 들면, 클로닝)은 숙련된 전문가에게 공지되어 있다. 본 발명에 따른 유전 요소를 삽입하기 위해 염색체외 다중-복제 플라스미드 벡터를 이용할 수 있다. 숙주 세포내에 유전 요소의 플라스미드 도입은 제한 효소에 의한 플라스미드의 초기 절단에 이어, 본 발명에 따른 표적화 효소 종을 암호화하는 유전 물질 및 플라스미드의 접합을 포함한다. 접합된 재조합 플라스미드의 재환상화시, 감염(예를 들면, 파아지 람다중에 패키징) 또는 플라스미드 전달을 위한 다른 메카니즘(예를 들면, 전기천공, 미세주입 등)을 이용하여 플라스미드를 숙주 세포내에 전달한다. 숙주 세포내에 유전 요소의 삽입에 적합한 플라스미드는 숙련된 전문가에게 공지되어 있다.

다른 유전자 클로닝 방법으로는 염색체내에 유전 물질의 직접 통합이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 이것은 숙주 염색체의 상동성 DNA 서열이 접해 있는 비-복제 플라스미드 상에 본원에 기술된 유전 요소를 클로닝하는 것을 포함하여 다양한 수단에 의해 일어날 수 있고, 상기 재조합 플라스미드를 숙주내로 형질전환시, 유전 요소는 DNA 재조합에 의해 염색체내로 도입될 수 있다. 상기 재조합 균주는, 통합 DAN 단편이 항생물질 내성과 같은 선택성 마커를 함유하는 경우 회수될 수 있다. 또는, 유전 요소는 비-복제 플라스미드를 사용하지 않고 숙주 세포의 염색체내에 직접 도입될 수 있다. 이것은 숙주 염색체의 상동성 DNA 서열을 또한 함유하는 본 발명에 따른 유전 요소의 DNA 단편을 합성적으로 제조함으로써 이루어질 수 있다. 또한, 상기 합성 DNA 단편들이 또한 선택성 마커를 함유하는 경우, 유전 요소는 숙주 염색체내에 삽입될 수 있다.

숙주 세포

본 발명의 또 다른 태양은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산 구조물 또는 벡터를 포함하는 세포이다. 숙주 세포는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산 구조물 또는 벡터가 적절히 발현될 수 있는 세포이다.

산화환원효소는 숙주 세포에서 유리하게 발현될 수 있다. 본 발명에 따른 숙주 세포는 임의의 숙주 세포일 수 있다. 상기 세포는 원핵 세포, 진핵 세포, 식물 세포 또는 동물 세포일 수 있다. 상기 세포에서, 하나 이상의 유전자가 전체적으로 또는 부분적으로 결실되거나, 녹아웃(knock-out)되거나, 파괴될 수 있으며, 이때 선택적으로 하나 이상의 유전자가 프로테아제를 암호화한다. 한 태양에 따르면, 본 발명에 따른 숙주 세포는 진핵 숙주 세포이다. 바람직하게, 진핵 세포는 포유동물, 곤충, 식물, 진균류 또는 조류 세포이다. 바람직한 포유동물 세포로는, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, 293 세포, PerC6 세포 및 하이브리도마가 포함된다. 바람직한 곤충 세포로는, 예를 들면, Sf9 및 Sf21 세포 및 그의 유도체가 포함된다. 보다 바람직하게, 진핵 세포는 진균류 세포, 즉, 효모 세포, 예를 들면, 캔디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 또는 야로이야(Yarrowia) 균주이다. 보다 바람직하게, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 야로이야 리포라이티카(Yarrowia lipolytica) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 사상균 세포이다. 가장 바람직하게, 진핵 세포는 사상균 세포이다.

"사상균"은 세분된 진균문(Eumycota) 및 난균문(Oomycota)의 모든 사상 형태를 포함한다(문헌 [Hawksworth et al., Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, CAB International, University Press, Cambridge, UK (1995)]에 정의된 바와 같음). 사상균은 키틴, 셀룰로스, 글루칸, 키토산, 만난 및 다른 복합 폴리사카라이드로 이루어진 균사체 벽을 특징으로 한다. 식물 성장은 균사 신장에 의하며, 탄소 이화작용은 절대 호기성이다. 사상균 균주로는 아크레모늄(Acremonium), 아가리쿠스(Agaricus), 아스퍼질러스(Aspergillus), 오레오바시듐(Aureobasidium), 크리소스포륨(Chrysosporium), 코프리누스(Coprinus), 크립토코커스(Cryptococcus), 필리바시듐(Filibasidium), 푸사리움(Fusarium), 휴미콜라(Humicola), 마그나포르테(Magnaporthe), 뮤코(Mucor), 마이셀리오프토라(Myceliophthora), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 패실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 피로마이세스(Piromyces), 파네로카에테(Panerochaete), 플레우로투스(Pleurotus), 쉬조필럼(Schizophyllum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 터모아스커스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라듐(Tolypocladium) 및 크리코더마(Trichoderma)의 균주가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.

바람직한 사상균 세포는 아스퍼질러스, 크리소스포륨, 페니실리움, 탈라로마이세스 또는 트리코더마 속의 종, 및 가장 바람직하게는 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 포에티더스(Aspergillus foetidus), 아스퍼질러스 소재(Aspergillus sojae), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 탈라로마이세스 에머소니(Talaromyces emersonii), 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 크리소스포륨 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei) 또는 페니실리움 크리소게넘(Penicillium chrysogenum)의 종에 속한다. 본 발명에 따른 숙주 세포가 아스퍼질러스 숙주 세포인 경우, 숙주 세포는 바람직하게는 CBS 513.88, CBS124.903 또는 그의 유도체이다.

또 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 숙주 세포는 원핵 세포이다. 바람직하게, 원핵 숙주 세포는 세균 세포이다. 용어 "세균 세포"는 그람-음성 및 그람-양성 미생물 둘 다를 포함한다. 적합한 세균은, 예를 들면, 에스케리키아(Escherichia), 아나베나(Anabaena), 카울로박터(Caulobacter), 글루코노박터(Gluconobacter), 로다박터(Rhodabacter), 슈도모나스(Pseudomonas), 파라코커스(Paracoccus), 바실러스(Bacillus), 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 리조븀(Rhizobium)(시노리조븀(Sinorhizobium)), 플라보박테리움(Flavobacterium), 클렙시엘라(Klebsiella), 엔테로박터(Enterobacter), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 스태필로코커스(Staphylococcus) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 세균 세포는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 푼티스(Bacillus puntis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans), 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 카울로박터 크레센터스(Caulobacter crescentus) CB 15, 메틸로박테리움 엑스토르퀀스(Methylobacterium extorquens), 로다박터 스페로이데스(Rhodabacter sphaeroides), 슈도모나스 제아잔티니파시엔스(Pseudomonas zeaxanthinifaciens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 푸티다 S12, 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans), 에스케리키아 콜라이, 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 스태필로코커스 카르노서스(Staphylococcus carnosus), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 시노리조븀 멜리오티(Sinorhizobium melioti) 및 리조븀 라디오박터(Rhizobium radiobacter)로 이루어진 군에서 선택된다.

사상균의 여러 균주는 많은 미생물 보존센터, 예를 들면, 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection, ATCC), 독일 미생물 균주 보존 센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), 네덜란드 미생물 보존 센터(Centraalbureau Voor Schimmelcultures, CBS) 및 농업 연구소 특허 미생물 보존센터, 북부 지역 연구 센터(Northern Regional Research Center, NRRL)에서 대중에게 용이하게 접근가능하다; 예를 들면, 균주 아스퍼질러스 니거 CBS 513.88, 아스퍼질러스 오리재 ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC 14488-14491, ATCC 11601, ATCC 12892, 페니실리움 크리소게넘 CBS 455.95, 페니실리움 시트리넘(Penicillium citrinum) ATCC 38065, 페니실리움 크리소게넘 P2, 탈라로마이세스 에머소니 CBS 124.902, 아크레모늄 크리소게넘 ATCC 36225 또는 ATCC 48272, 트리코더마 리세이 ATCC 26921 또는 ATCC 56765 또는 ATCC 26921, 아스퍼질러스 소재 ATCC 11906, 크리소스포륨 루크노웬스 ATCC 44006. 또한 이들의 유도체도 사용될 수 있다.

또 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 숙주 세포는 원핵 세포이다. 바람직하게, 원핵 숙주 세포는 세균 세포이다. 용어 "세균 세포"는 그람-음성 및 그람-양성 미생물 둘 다를 포함한다. 적합한 세균은, 예를 들면, 에스케리키아, 아나베나, 카울로박터, 글루코노박터, 로다박터, 슈도모나스, 파라코커스, 바실러스, 브레비박테리움, 코리네박테리움, 리조븀(시노리조븀), 플라보박테리움, 클렙시엘라, 엔테로박터, 락토바실러스, 락토코커스, 메틸로박테리움, 스태필로코커스 또는 스트렙토마이세스로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 세균 세포는 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 푼티스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 할로듀란스, 바실러스 푸밀러스, 글루코노박터 옥시단스, 카울로박터 크레센터스 CB 15, 메틸로박테리움 엑스토르퀀스, 로도박터 스페로이데스, 슈도모나스 푸티다, 파라코커스 제아잔티니파시엔스, 파라코커스 데니트리피칸스, 에스케리키아 콜라이, 코리네박테리움 글루타미컴, 스태필로코커스 카르노서스, 스트렙토마이세스 리비단스, 시노리조븀 멜리오티 및 리조븀 라디오박터로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명에 따른 숙주 세포에서 생성된 화합물의 특정 용도를 위해, 숙주 세포의 선택은 상기 용도에 따라 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 숙주 세포에서 생성된 화합물이 식품 용도로 사용될 경우, 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지에와 같은 식품-등급 유기체로부터 선택될 수 있다. 특정 용도로는 식품, (동물) 사료, 약학, 작물-보호와 같은 농업, 및/또는 개인 관리 용도가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 세포를 상기 폴리펩티드를 발현시키는 조건하에서 배양하고, 선택적으로, 발현된 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 산화환원효소 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조 방법, 및 상기 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드에 관한 것이다.

공급원료

천연적으로 프럭탄이 풍부한 농작물(예를 들면, 토피남부어(topinambur) 또는 치커리)은 통상적인 (복합) 가수분해 및 열화학 공정에 의해 HMF-풍부 공급원료로 전환될 수 있다. 프럭토스로부터 HMF를 생성하는 기술은 잘 확립되어 있으며 유력하다. 글루코스-풍부 공급원료도 또한 사용할 수 있으나, HMF의 열화학적 생성은 프럭토스로부터 보다 효과적으로 진행된다. 그러므로, 글루코스를 프럭토스로 전환시키기 위해 글루코스 이소머라제를 사용하여 추가의 효소적 단계가 포함될 수 있다. 후자의 방법은 식품 산업에서 가수분해된 전분으로부터 고-프럭토스 옥수수 시럽(HFCS)을 생성하기 위해 잘 확립되어 있다. 식품 용도와의 경쟁을 피하기 위해, 리그노셀룰로스 가수분해물이 HMF/FDCA를 생성하는데 바람직한 공급원료이다.

생물전환

HMF를 FDCA로 생물전환시키기 위해, 본원에서 전술한 큐프리아비더스 바실렌시스 HMF 산화환원효소를 발현하는 유력한 전세포 생물촉매를 사용한다(유리 또는 고정화 세포). 전세포 생물촉매는 상기 공정에서 효소 촉매에 비해 여러 이점을 갖는다: HMF 산화환원효소는 매우 반응성인 기질에 의한 화학적 불활성화로부터 보호되며, 숙주-유래 데하이드로게나제는 HMF로부터 (아마도) 상응하는 일산(monoacid)으로 유도한 후 HmfH에 의해 이산(diacid)으로 전환시키는 처음 두 산화 단계에서 HMF 산화환원효소를 도울 수 있다. 바람직하게, 조효소 재생을 확실히 하기 위해 추가의 수단이 필요할 수도 있다. 전세포 생물촉매는 HMF 공급 스트림의 최소 가공을 허용해야 한다, 즉, 바람직하게는 낮은 pH, 높은 T, 및 공급원료의 가수분해/열화학적 전환에서 생성된 독성 화합물(그중에서 기질)을 허용해야 한다. 슈도모나스 푸티다 S12는 다양한 화학적 스트레스원, 그의 비교적 광범위한 pH 범위에 대한 그의 내성 및 FDCA로의 HMF의 보다 효과적인 생물전환을 제공하는 HMF 산화환원효소를 돕는 본래의 데하이드로게나제의 존재의 견지에서 적합한 숙주 유기체로서 적격일 수 있다.

전세포 생물촉매에 대안으로, 유사한 방식으로 전세포 생물촉매로서, 세포 용해물, 정제 효소 또는 고정화 효소를 단독으로 또는 효소 혼합물로서 사용할 수 있다.

생성물 및 바이오매스 회수

생물전환 후에, 세포는 확립된 방법에 의해 배양액으로부터 분리되고 재사용될 수 있다. FDCA는 산 침전에 의해 무세포 배양액으로부터 회수되고 고온에서 적절한 유기 용매에 재용해될 수 있다. 해리후에, FDCA는 산 침전 및 용매 추출, 또는 당해 분야에 공지된 다른 정제 방법에 의해, 이산 형태로(이것이 바람직한 경우에), 높은 순도로 회수할 수 있다.

FDCA 의 사용

FDCA는 폴리에스터의 생성에서 테레프탈레이트의 대체물로 사용될 수 있다. FDCA는 또한 많은 다양한 유용한 화합물의 대체물로 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 FDCA는 숙신산, 2,5-비스(아미노메틸)-테트라하이드로퓨란, 2,5-다이하이드록시메틸-테트라하이드로퓨란, 2,5-다이하이드록시메틸퓨란 및 2,5-퓨란다이카브알데하이드의 생성을 위한 공지된 기질이다. FDCA는 코팅재의 제조에, 예를 들면, 알키드 수지 및 열가소성 코팅재에 사용될 수 있다. 상기 FDCA는 또한 생물연료에 자일렌 등가물로서 및 용매로서 사용될 수 있다.

FDCA는 에스터화될 수 있으며, 상기 에스터는 가소제로 사용될 수 있다. 상기 FDCA는 그의 디올로 전환될 수 있으며, 상기 디올은 PET-유사 폴리에스터 및 폴리우레탄에 사용될 수 있다. 또한, FDCA는 그의 다이아민으로 전환될 수 있으며, 상기 다이아민은 쇄 연장제로 사용될 수 있으며, 다이아민은 다이-이소시아네이트로 전환될 수 있고 이것은 폴리우레탄의 생성에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법을 통해, FDCA 및 FDCA로부터 제조된 생성물은 생물전환을 통해 리그노셀룰로스 바이오매스를 포함하여 바이오매스로부터 제조될 수 있다.

실시예

일반적 방법

균주 및 플라스미드 DSMZ에 기탁된 큐프리아비더스 바실렌시스 HMF 14(큐프리아비더스 바실렌시스 HMF 14 = DSM 22875, 기탁일: 2009년 8월 19일)는 유일한 탄소 공급원으로 퓨란을 사용할 수 있는 토양 분리물이다. 슈도모나스 푸티다 S12(ATCC 700801)를 HMF 산화환원효소의 발현을 위한 숙주로 사용하였다. 에스케리키아 콜라이 DH5α(인비트로겐(Invitrogen))를 일반 클로닝 목적으로 사용하였다. pUCP22-유래 에스케리키아 콜라이-슈도모나스 푸티다 셔틀 플라스미드 pJT'mcs(미공개)를 구성적 tac 프로모터의 제어하에 HMF 산화환원효소의 발현에 사용하였다. 에스케리키아 콜라이에서의 복제를 위해, pUC 복제 기점을 사용하며; 슈도모나스 푸티다에서의 복제를 위해서는 pRO1600 복제 기점을 사용하였다. hmfH 유전자의 발현을 구성적 tac 프로모터로부터 유도하였다. β-락타마제 마커 유전자(bla)를 에스케리키아 콜라이에서의 항생물질 선별(암피실린 내성)에 사용하였다. 슈도모나스 푸티다에서의 항생물질 선별을 위해 젠타마이신 아세틸트랜스퍼라제 마커 유전자(gmR)를 사용하였다.

HmfH 발현 벡터 pJT'hmfH의 플라스미드 지도를 도 2에 제시하였다. Ptac', tac 프로모터; rep, 광범위한 숙주 범위의 복제 기점; gmR, 젠타마이신 내성 유전자; bla, 베타-락타마제; pUC ori, 에스케리키아 콜라이에서의 복제 기점.

배지 및 배양 조건 무기염 배지(MM)를 규정 배지로 사용하였다. MM은 (탈이온수 리터 당) 다음을 함유하였다: 3.88 g의 K₂HPO₄, 1.63 g의 NaH₂PO₄, 2.0 g의 (NH₄)₂SO₄, 0.1 g의 MgCl₂·6H₂O, 10 mg의 EDTA, 2 mg의 ZnSO₄·7H₂O, 1 mg의 CaCl₂·2H₂O, 5 mg의 FeSO₄·7H₂O, 0.2 mg의 Na₂MoO₄·2H₂O, 0.2 mg의 CuSO₄·5H₂O, 0.4 mg의 CoCl₂·6H₂O 및 1 mg의 MnCl₂·2H₂O, 명시된 바와 같은 탄소 공급원으로 보충됨. 루리아(Luria) 배지(L-배지: 10 g/L의 박토(Bacto) 트립톤(딥코(Difco)), 5 g/L의 효모 추출물(딥코), 5 g/L의 NaCl)을 슈도모나스 푸티다 S12 및유도체 균주, 큐프리아비더스 바실렌시스 HMF14 및 에스케리키아 콜라이 DH5α 및 유도체의 증식을 위한 완전 배지로 사용하였다. 고체 L-배지는 2%(w/v)의 아가(딥코)로 고형화시켰다.

유가식 실험을 위해, 초기 배치 단계를 하기 조성을 갖는 1 L의 개질된 무기염 배지에서 수행하였다: 3.88 g의 K₂HPO₄, 1.63 g의 NaH₂PO₄, 2.0 g의 (NH₄)₂SO₄, 0.2 g의 MgCl₂·6H₂O, 20 mg의 EDTA, 4 mg의 ZnSO₄·7H₂O, 2 mg의 CaCl₂·2H₂O, 10 mg의 FeSO₄·7H₂O, 0.4 mg의 Na₂MoO₄·2H₂O, 0.4 mg의 CuSO₄·5H₂O, 0.8 mg의 CoCl₂·6H₂O, 2 mg의 MnCl₂·2H₂O, 10 mg/L의 젠타마이신 및 100 mM 글리세롤. 초기 글리세롤의 고갈후에, 공급을 개시하고 배양물중 제한 기질로서 글리세롤을 유지하면서 최대 성장을 허용하도록 조절하였다. 공급액은 (L 당) 다음을 함유하였다: 368.4 g의 글리세롤 및 10 g/L의 MgCl₂·6H₂O 및 12.6 g/L의 HMF.

항생물질: 에스케리키아 콜라이의 경우 암피실린(amp)을 100 ㎍/ml로 첨가하였다. 슈도모나스 푸티다 S12의 경우 젠타마이신(gm)을 루리아 배지중 30 ㎍/ml 및 무기염 배지중 10 ㎍/ml로 첨가하였다. 항생물질은 시그마-앨드리치(Sigma-Aldrich)로부터 구입하였다.

배양: 슈도모나스 푸티다 및 큐프리아비더스 바실렌시스를 30 ℃에서 배양하였다. 에스케리키아 콜라이는 37 ℃에서 배양하였다. MM 상에서 교반 플라스크 실험을, 수평으로 교반되는 배양기에서 보스톤(Boston) 병(올테크 어플라이드 사이언시즈(Alltech applied sciences) BV; 네덜란드 브레다)에서 수행하였다. L-배지 상에서의 교반 플라스크 실험은 수평으로 교반되는 배양기에서 면 플러그를 갖는 엘렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 수행하였다. 유가식 실험은 바이오플로(BioFlo)110 조절기를 사용하여 1 L 발효조(뉴 브런스윅 사이언티픽(New Brunswick Scientific))에서 수행하였다. 초기 회분식 발효는 40 mM 글리세롤 및 2 mM 글루코스가 보충된 100 ml MM 중에서 밤새 미리배양한 예비배양물로부터 세척된 세포를 사용하여 개시하였다. 초기 교반 속도는 200 rpm으로 설정하였으며, M+W 인스트루먼츠 D-5111 질량 흐름 조절기를 사용하여 헤드 공간에 1 L/분으로 공급하였다. 용존 산소 분압(DO)을 인프로(InPro) 모델 6900 프로브(메틀러 톨레도(Mettler Toledo) BV; 네덜란드 티엘)로 연속적으로 모니터하고, 교반 속도를 최대 1000 rpm으로 자동으로 조정함으로써 30% 공기 포화도를 유지하였다. 최대 교반 속도에 도달하면, 공기를 0.2 L/분의 유량으로 정제 산소로 대체하고, 최대 교반 속도를 800 rpm으로 맞추었다. pH는 초기 배치 단계시에 25% NH₄OH의 자동 첨가에 의해 7.0에서 유지시켰으며, 공급 단계시 pH는 10 mM NaOH의 자동 첨가에 의해 일정하게 유지시켰다. 온도는 30 ℃에서 유지시켰다.

분석 및 분석 방법 세균 배양물의 세포 건조 중량(CDW) 함량은, 바닥이 편평한 96-웰 마이크로플레이트(그레이너(Greiner))를 사용하여, 바이오웨이브(Biowave) 세포 밀도 측정기(WPA Ltd) 또는 마이크로퀀트(μQuant) MQX200 일반 마이크로플레이트 분광광도계(바이오테크(Biotek))를 사용하여 600 nm(OD₆₀₀)에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 1.0의 OD₆₀₀은 슈도모나스 푸티다의 경우 0.56 g CDW/L(바이오웨이브) 또는 1.4 g CDW/L(마이크로퀀트)에 상응한다.

HPLC 분석: FDCA, HMF, HFM-알콜 및 HMF-산을 230 nm에 설정된 다이오드 배열 검출기를 사용하여 RP-HPLC(에이질런트(Agilent) 1100 시스템)에 의해 분석하였다. 사용된 컬럼은 25 ℃에서 작동되는 조르박스 에클립스(Zorbax Eclipse) XDB-C8(80Å의 기공 크기, 180 m²/g의 표면적, 에이질런트)이었다. 용출제로서, 1% 아세토니트릴 하에 20 mM KH₂PO₄(pH 2 또는 pH 6)중 아세토니트릴의 구배를 1.2 ml/분의 유량으로 사용하여, 3.5 분내에 0에서 5%로, 2.5 분내에 5에서 40%로 증가하였다.

세포 추출물의 제조: HMF 산화환원효소를 발현하는 야생형 큐프리아비더스 바실렌시스 HMF14 또는 슈도모나스 푸티다 S12 형질전환체의 세포 추출물을, 12 mM 숙시네이트(큐프리아비더스 바실렌시스 HMF14, OD₆₀₀ 약 1.5) 또는 20 mM 글루코스(슈도모나스 푸티다 S12, OD₆₀₀ 약 4)로 보충된 MM을 사용하여 50 ml 후기 대수 성장기 배양물로부터 제조하였다. 배양물을 원심분리에 의해 수확하고 3 ml의 분석용 완충제에 재현탁시켰다. 브랜슨(Branson) 음파처리기(펄스 모드에서 마이크로 팁, 3으로 설정된 출력 및 40%로 설정된 사용율%(percentage duty cycle); 3 주기의 초음파처리: 45 초의 펄싱 및 15 초의 정지) 또는 소닉스 비브라-셀(Sonics Vibra-Cell)(소닉스 앤 머티리얼스(Sonics & Materials), 미국)(5 mm 테이퍼링된 마이크로팁; 1 분으로 설정된 펄스 모드(0.5 초 펄스, 2 초 정지)을 사용하여 초음파처리에 의해 세포를 파쇄하였다. 초음파처리후, 4 ℃에서 8228 x g로 3 분간 원심분리하여 세포파편을 제거하였다. 상등액을 PD10 겔 여과 컬럼(GE 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용하여 탈염시키고 HMF 산화환원효소 분석을 위한 세포 추출물로 사용하였다. 브래드포드(Bradford) 시약(시그마-앨드리치)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.

HMF 산화환원효소 분석: 큐프리아비더스 바실렌시스 HMF14 산화환원효소를 발현하는 야생형 큐프리아비더스 바실렌시스 HMF14 또는 슈도모나스 푸티다 S12 형질전환체의 세포 추출물중에서 HMF 산화환원효소 분석을 수행하였다. 음성 대조군으로, hmfH 유전자에 트랜스포존 삽입물을 갖는 야생형 슈도모나스 푸티다 S12 또는 큐프리아비더스 바실렌시스 HMF14 돌연변이체를 사용하였다. 세포 추출물을 산소화 조건하에 30 ℃에서 퍼퓨랄, 퍼퓨릴알콜, HMF 또는 HMF-산과 함께 배양하였다. 반응 혼합물은 1 ml의 세포 추출물, 976 ㎕의 산소-포화 MM, 20 ㎕의 2 mM 플라빈 아데닌 다이뉴클레오티드(FAD) 용액 및 4 ㎕의 기질(퍼퓨랄, 퍼퓨릴알콜, HMF 또는 FMH 산)의 0.5 M 저장액을 함유하였다. 샘플을 설정된 간격으로 뽑아내고, HCl을 1 M의 최종 농도로 첨가하여 반응을 즉시 중지시켰다. 샘플 중 기질 및 생성물 농도는 HPLC로 측정하였다. 산소-고갈 대조군으로, 상이한 성분의 반응 혼합물에서 질소 가스의 연속 스트림에 의해 산소를 고갈시키고, 동일한 반응 혼합물을 질소 가스하에 고무 마개를 갖는 헤드공간 바이알에서 배양하였다.

화학물질: FDCA의 분석 표준물을 임뮤노소스(Immunosouce) B.V.(할레-조에르셀(Halle-Zoersel), 벨기에)에서 구입하였다. 5-하이드록시메틸-퓨로산(HMF산)은 매트릭스 사이언티픽(Matrix Scientific)(콜럼비아(Columbia) SC, 미국)에서 구입하였다. 상기 화합물은 고도로 에스터화된 것으로 밝혀졌다. 사용 직전에, 에스터화 HMF 산의 10 mM 용액을 2 M H₂SO₄ 중에서 2 시간동안 비등시키고, 냉각시키고, 50 mM의 포스페이트 완충제를 첨가한 후 NaOH로 pH 7.0으로 조정하였다. 모든 다른 화학물질은 시그마-앨드리치 케미 B.V.(네덜란드 즈빈드레치)에서 구입하였다.

분자 및 유전자 기술 디엔이지(DNeasy) 조직 키트(키아겐(QIAGEN))를 사용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 키아프렙(QIAprep) 스핀 미니프렙 키트(키아겐)를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 키아엑스II(QIAEXII) 겔 추출 키트(키아겐)를 사용하여 아가로스-포획 DNA 단편을 분리하였다.

아큐프라임(Accuprime) Pfx 폴리머라제(인비트로겐)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 큐프리아비더스 바실렌시스 HMF14의 게놈 DNA로부터 HMF 산화환원효소를 증폭시키기 위해 사용된 프라이머는 FN23: 5'-CGGAATTCCACATGACAAGGGGAGACCG-3'(서열 번호 1) 및 FN24: 5'-CGGAATTCGCTTCGGTCTTCAACTCGGATG-3'(서열 번호 2)이었다. 밑줄 친 서열은 EcoRI 제한효소 부위를 나타낸다.

진 펄서(Gene Pulser) 전기천공 장치(바이오래드(BioRad))를 사용하여 플라스미드 DNA를 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 세포내에 도입하였다.

트랜스포존에 접해 있는 염색체 DNA를 당해 분야에 공지된 표준 방법에 의해 확인하고[Ausubel, F.M. et al., Current protocols in molecular biology(Green publishing association, New York) (1987)], 완전 유전자좌의 서열을 프라이머 워킹(walking)에 의해 수득하였다. 올리고뉴클레오티드 합성 및 DNA 서열분석은 MWG 바이오테크 AG(독일)에 의해 수행하였다.

다른 표준 분자 생물 기술은 샘브룩 및 러셀[Sambrook, J, Russel, D.W. Molecular cloning: a laboratory manual (Cold spring Harbor Laboratory Press, New York) (2001)]에 따라 수행하였다.

실시예 I

큐프리아비더스 바실렌시스 HMF14 의 세포 추출물에서 FDCA 생성

12 mM 숙시네이트 및 3 mM HMF로 보충된 MM 상에서 성장한 후기 지수기 예비배양물(OD₆₀₀ 약 1.5)로부터의 큐프리아비더스 바실렌시스의 세포 추출물을 HMF 또는 HMF 산과 함께 배양한 경우, FDCA의 생성이 관찰되었다.

HMF를 기질로 사용한 경우, HMF-산 및 HMF-알콜의 빠른 일시적 축적이 FDCA의 생성과 동시에 관찰되었다. 탈염된 세포 추출물에서, HMF-산 농도는 보다 느린 속도로 감소하였으며, FDCA 생성은 조 세포 추출물에 비해 더 느렸다. FDCA는 탈염 세포 추출물에서 뿐 아니라 조 세포 추출물에서도 생성되었으므로, HMF의 FDCA로의 전환은 보조인자를 수반하지 않는 것으로 생각되었다. 그럼에도 불구하고, 보조인자 또는 조 세포 추출물로부터의 다른 저분자량 성분들은 FDCA 생성에 상승 효과를 갖는 것으로 생각되었다. HMF-산을 기질로 첨가한 경우, 조 세포 추출물 및 탈염 세포 추출물 둘 다에서 즉각적인 FDCA의 생성이 관찰되었다. 또한, 혐기성 조건하에서는 FDCA가 생성되지 않았으므로 FDCA 생성에 산소의 존재가 필요한 것이 입증되었다. HMF 산의 FDCA로의 화학량론적 전환이 관찰되었다.

실시예 II

HMF 산화환원효소 를 암호화하는 hmfH 유전자의 분리 및 특성화

hmfH 유전자는 FAD-의존성 글루코스-메탄올-콜린(GMC) 산화환원효소 부류에 속하는 62,317 Da 단백질을 암호화하는 것으로 밝혀졌다. 상기 효소는 HMF-산을 퓨란-다이카복실산(FDCA)으로 산화시키는 능력을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 상기 효소는 또한 HMF를 기질로 받아들여, 이것은 HMF-산을 거쳐 FDCA로 산화되었다. 비-중복 NCBI 데이터베이스에서 HmfH와 최고의 상동성은 버크홀더리아 피토퍼만스 PsJN의 GMC 산화환원효소와인 것으로 밝혀졌다(유전자좌 꼬리 Bphyt_2180; 562-아미노산 연장부에 걸쳐 68% 동일성). 큐프리아비더스 바실렌시스 HMF14의 HMF/퍼퓨랄 오페론의 서열 데이터를 기준으로, 다른 잠재적 HMF/퍼퓨랄 분해제(degrader)를 동정하였다. 선택된 균주를 유일한 탄소 공급원으로 HMF 또는 퍼퓨랄을 함유한 무기염 배지 상에서의 성장에 대해 시험하였다. HMF 상에서 성장할 수 있었던 균주는 HmfH에 대해 45 내지 68% 동일한 산화환원효소를 암호화하는 hmfH 이종상동체(orthologue)를 가졌다. 한 균주(버크홀더리아 제노보란스 LB400)는 그 산화환원효소가 HmfH에 대해 44% 동일하긴 하지만 HMF를 이용할 수 없었다.

도 3은 큐프리아비더스 바실렌시스 HMF14(A) 및 잠재적 퍼퓨랄 및/또는 HMF 이용자로서 확인된 다른 종(B)에서 퍼퓨랄 및 HMF 대사 유전자의 유전적 구성을 도식적으로 나타낸 것이다. 도 1에서 색은 효소 활성에 해당한다. 화살표 아래의 굵은 활자의 숫자(x/y)는 y 아미노산 연장부에서 상응하는 큐프리아비더스 HMF14 단백질에 대한 동일성%(x)를 나타낸다. 이종상동성 유전자는 국립 생물 정보 센터의 비-중복 단백질 데이터베이스에서 BLASTx 상동성 조사에 의해 확인되었다. 퍼퓨랄 집단에 대한 히트(hit)는 hmfA, B, C, D 및 E에 대한 이종상동체가 단일 게놈에 존재하는 경우 적절한 것으로 정의하였으며, 이때 hmfA 이종상동체는 HmfA에 50% 이상 동일한 효소를 암호화한다. 동일 기준을 이용하여 hmfF 및 hmfG 이종상동체를 정의한 반면, HmfH에 대한 40% 동일성을 hmfH 이종상동체에 대한 기준으로 이용하였다. 이탤릭체로 나타낸 숫자는 지시된 균주의 게놈 유전자좌 꼬리를 나타낸다. 흰색 화살은 대사 기능을 갖지 않는 유전자를 나타낸 것이다. C: 유일한 탄소 공급원으로 퍼퓨랄 또는 HMF(3 mM)을 갖는 무기염 배지상에서 시험한 균주의 성장 표현형의 개요. ND: 측정되지 않음.

도면에 HMF-산화환원효소 HmfH를 암호화하는 개방형 해독틀의 뉴클레오티드 서열(도 4) 및 추정 아미노산 서열(도 3)을 나타내었다.

실시예 III

슈도모나스 푸티다 S12에서 hmfH의 클로닝 및 암호화된 산화환원효소의 발현

HMF 산화환원효소를 암호화하는 hmfH 유전자를 발현 벡터 pJT'mcs 내에 클로닝하였다. 큐프리아비더스 바실렌시스 HMF14 게놈 DNA 상에 프라이머 FN23 및 FN24를 사용하여 수득된 PCR 단편을 EcoRI(퍼멘타스(Fermentas))로 절단하였다. 절단된 단편을 EcoRI-절단되고 FastAP(퍼멘타스)-처리된 pJT'mcs 벡터내에 접합시켜 HmfH 발현 플라스미드 pJT'hmfH를 수득하였다. hmfH 삽입물의 정확한 배향은 조절 절단에 의해서 및 당해 분야에 공지된 뉴클레오티드 서열분석에 의해 입증하였다. HMF 산화환원효소의 발현은 기질로서 HMF 또는 HMF 산을 사용하여 FDCA를 생성함으로써 20 mM 글루코스 및 10 mg/L 젠타마이신이 보충된 MM에서 성장한 슈도모나스 푸티다_pJT'hmfH의 세포 추출물에서(OD₆₀₀ 약 4) 입증되었다(표 1).

슈도모나스 푸티다_pJT'hmfH의 세포 추출물에서 HMF 또는 HMF 산으로부터 FDCA의 생성. 대조군으로, 빈 발현 벡터 pJT'mcs를 갖는 슈도모나스 푸티다 S12의 세포 추출물을 사용하였다.

	산소
세포 추출물	유	무
탈염	+	-
비 탈염	+	-
대조군, 탈염	-	-
대조군, 비 탈염	-	-

상기 결과는 FDCA의 생성이 산소의 존재하에서만 일어나며 hmfH-암호화된 산화환원효소에 의해 촉진됨을 입증하였다. HMF가 기질로 사용된 경우, HMF-산의 일시적 축적이 탈염 및 조 세포 추출물 둘 다에서 관찰되었다. 탈염 세포 추출물(저분자량 보조인자 제거)에서 HMF-산의 생성은 HmfH가 HMF-산을 FDCA로 산화시킬 뿐 아니라 또한 HMF를 그의 모노카복실산 형태로 산화시킬 수 있음을 시사하였다.

HmfH 이외에, 슈도모나스 푸티다 S12 유래의 겉보기에 비특이적 데하이드로게나제도 또한 HMF로부터 HMF 산을 생성할 수 있으나(표 2), 단, 환원 당량은 탈염에 의해 제거되지 않았다. 알데하이드 환원효소/알콜 데하이드로게나제 활성은 NADH/NAD+ 의존성인 반면, 알데하이드 데하이드로게나제 활성은 2개의 인공 전자 운반체인 PMS 및 DCPIP(여기서, PMS는 1차 전자 운반체이고 DCPIP는 최종 전자 수용체이다)의 조합에 의해 촉진될 수 있다. 유사한 활성이 큐프리아비더스 바실렌시스 HMF14의 세포 추출물에서 또한 관찰되었다.

야생형 슈도모나스 푸티다 S12의 세포 추출물에서 측정된 비-특이적 HMF-데하이드로게나제 활성

효소 활성	기질	생성물	보조인자	슈도모나스 푸티다 S12
알데하이드 환원효소	HMF	HMF 알콜	NADH	1106
알콜 데하이드로게나제	HMF 알콜	HMF	NAD⁺	ND
알데하이드 데하이드로게나제	HMF	HMF 산	PMS/DCPIP	8
ND: 상업적으로 시판하는 기질의 결여에 대해 측정되지 않음. 활성은 U g^-1 단백질로 나타냄. PMS/DCPIP: 페나진 메토설페이트/2,6-다이클로로페놀-인도페놀.

슈도모나스 푸티다 S12 pJT'hmfH의 조 세포 추출물에서 HMF로부터 FDCA, HMF-알콜(H-oh) 및 HMF-산(H-산)의 생성을 도 4에 나타내었다. 도 4는 슈도모나스 푸티다 S12 pJT'hmfH 세포 추출물에서 외인성 데하이드로게나제 및 HmfH의 상승 효과를 예시한다. 먼저, HMF에서의 급격한 감소가 아마도 알데하이드 환원효소에 의해 촉진된 HMF-알콜의 생성과 동시에 관찰되었다. 동시에, 또한 HMF-산(유사하게 알데하이드 데하이드로게나제에 의해) 및 FDCA(HmfH에 의해)가 축적되기 시작하였다. 생성 직후에, 아마도 HMF, HMF-산 및 FDCA로의 재산화를 통해 HMF-알콜이 소멸되었다. HMF-산 만이 25-시간 기간중에 FDCA로 (거의) 완전히 산화되기 전에 상당한 축적을 나타내었다. 이러한 결과는 HMF-산의 FDCA로의 산화가 상기 무세포 시스템에서 속도-제한 단계임을 시사한다.

실시예 IV

HmfH를 발현하는 슈도모나스 푸티다 S12에 의한 HFM의 FDCA로의 전세포 형질전환

슈도모나스 푸티다 S12의 외인성 데하이드로게나제가 HMF로부터 HMF-산을 생성하는 추가의 수단을 제공함으로써 HMF의 FDCA로의 산화에 HmfH와 상승적으로 작용할 수 있기 때문에, HMF의 FDCA로의 전세포 생물전환 방법이 효소적 방법에 비해 유리할 수 있다. 상기 가능성을 조사하기 위해, 휴지 세포, 성장 세포 및 파쇄된 세포를 HMF에서 FDCA의 생성에 대해 검사하였다.

교반 플라스크 배양물을 1 L 엘렌메이어 플라스크에서 10 mg/L의 젠타마이신이 보충된, 40 mM 글리세롤 및 2 mM 글루코스를 포함하는 150 ml의 MM 중에서 성장시켰다. 세포를 지수기 마지막에(OD₆₀₀ 약 4) 수거하고, 세척하고, 19.4 g/L의 K₂HPO₄, 8.15 g/L의 NaH₂PO₄, 40 mM 글리세롤 및 10 mg/L의 젠타마이신이 보충된 MM에서 농축시켰다. 농축된 세포 현탁액의 분취량(10 ml)(1.65 g CDW에 상응)을 250 ml 엘렌메이어 플라스크에서 HMF와 함께 배양하고, FDCA의 분석을 위해 샘플을 규칙적인 간격으로 취하였다. 휴지 세포의 경우, 글리세롤을 재현탁 배지에서 제외시키고, 파쇄된 세포는 초음파처리에 의해 수득하였다.

앞에서 관찰된 바와 같이, HMF는 HMF-알콜 및 HMF-산으로 신속히 전환된 후 HMF의 감소 및 FDCA의 동시 생성이 이어졌다. FDCA 생성률 및 HMF 산 감소율 둘 다를 시험한 HMF의 두 농도에 대해 표 3에 나타내었다.

HMF의 상이한 출발 농도에서, 슈도모나스 푸티다 S12 pJT'hmfH의 성장 세포, 휴지 세포 및 초음파처리된 세포를 이용한 HMF 및 HMF-산 감소율로부터 FDCA의 생성

	HMF-산 감소율 (μ몰/gCDW/h)			FDCA 생성률 (μ몰/gCDW/h)
HMF 농도(mM)	성장 세포	휴지 세포	파쇄 세포	성장 세포	휴지 세포	파쇄 세포
25	194±10^b	120^a	73^a	145±3.5^b	115^a	115^a
50	377±27^b	ND^c	ND^c	450±80^b	ND^c	ND^c
a) HMF-산의 FDCA로의 불완선 전환이 관찰되었다. b) 중복 실험; 편차는 두 독립적 실험의 평균으로부터의 최대 편차이다. c) ND = 측정되지 않음.

표 3은 HmfH를 발현하는 슈도모나스 푸티다 S12의 성장 세포를 사용하여 FDCA 생성이 더 효과적이었음을 나타낸다. 전체 FDCA 생성률, 전환 효율, 및 HMF-산 감소율인 성장 세포-배양의 경우보다 더 높았다. 또한, FDCA 생성률은 HMF의 초기 농도에 의존성이어서, 시스템이 포화되지 않았음을 시사한다.

실시예 V

HmfH를 발현하는 슈도모나스 푸티다 S12를 사용한 HMF로부터 FDCA의 유가식 생산

FDCA의 생성은 HmfH를 발현하는 슈도모나스 푸티다 S12의 성장 세포를 사용하여 가장 효과적인 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 슈도모나스 푸티다 S12 pJT'hmfH의 전세포를 사용하여 FDCA의 생성을 입증하기 위해 유가식 실험을 수행하였다.

초기 단계에서, 슈도모나스 푸티다_pJT'hmfH를 글리세롤의 공급하에 MM 상에서 13 g CDW/L의 세포 밀도로 배양하였다. 상기 단계 마지막에, HMF 공급을 개시하고, HMF를 0.8 mmol/L/h의 속도로 투여하였다. 글리세롤-동시 공급없이, HMF-산 및 FDCA는 0.41 mmol/L/h의 동일한 속도로 생성되었다(도 5 참조). 연속해서, 공급물을 0.21 M HMF 및 4 M 글리세롤을 함유하는 용액으로 대체하고, 약 5 ml/h로 공급하였다. 글리세롤 동시 공급하에, HMF-산 농도는 급속히 감소된 반면 FDCA의 생성은 대략 동일한 속도로 지속되었다(도 5). 44.6 mmol HMF의 총량이 공급 배치에 첨가되었을 때 실험을 중단하였다. 결과는 FDCA로의 거의 완전한 전환(즉, 96.5% 효율)을 나타내었다.

유사한 실험에서, 글리세롤을 HMF와 함께 0.7 mmol/L/h의 평균 속도로 동시-공급하였다. 상기 유가식 배양에서, HMF 산 중간체의 축적은 관찰되지 않았으며, 모든 HMF는 FDCA로 직접 전환되었다(도 6).

실시예 VI

발효액으로부터 FDCA 의 정제

1.0의 pH에서 FDCA의 용해도는 물 중에서 약 1.5 g/L인 것으로 밝혀졌다. 상기 성질은 발효액으로부터 FDCA 생성물의 회수에 유리하게 사용되었다. 원심분리(5 분간 9500 x g)에 의해 세포를 제거한 후, FDCA를 침전시키기 위해, pH 1까지 계속 교반하면서 실온에서 약 10 ml의 96% H₂SO₄를 100 ml의 정화된 발효액에 가하였다. 8228 x g에서 10 분간 원심분리에 의해 침전물을 회수하고, 공기-건조 펠릿을 60 ℃에서 메탄올에 재용해시켰다. 예열된 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시켜 미용해된 파편을 제거할 때, 여액을 HPLC에 의해 순도에 대해 분석하였다. 상기 절차에 의해 발효액으로부터 회수된 FDCA의 순도는 약 65%이었다. FDCA의 추가 정제는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 달성될 수 있다.

실시예 VII

슈도모나스 푸티다_pJT'hmfH의 전세포를 사용하여 FDCA 역가 및 생산성을 증가시키기 위해 두 번째 유가식 FDCA 생산 실험을 수행하였다.

초기 배치 단계에서, 슈도모나스 푸티다_pJT'hmfH를 23.2 시간의 발효후에 초기 글리세롤이 고갈될 때까지(OD₆₀₀ 약 8) MM 상에서 배양하였다. 이 시점에서, 약 0.45 g CDW/L/h의 바이오매스 증가를 허용하는 속도로 글리세롤 공급을 개시하였다. 50.7 시간의 발효 후에, 글리세롤 공급을 약 0.045 g CDW/L/h의 바이오매스 증가를 허용하는 속도로 감소시켰다. 123.4 시간의 발효 후에, 발효 마지막까지 약 0.25 g CDW/L/h의 바이오매스 증가를 허용하는 속도로 글리세롤 공급을 증가시켰다. 이 기간동안, HMF 공급을 적용하였다. HMF 공급은 26.7 시간의 발효후에 0.65 mmol/h/g CW의 속도로 개시하여, HMF 산 및 FDCA 둘 다의 축적을 야기하였다. HMF 공급 속도는 33.3 시간의 발효 후에 0.28 mmol/h/g CDW로 감소시켰고, 72.8 시간의 발효후에 0.09 mmol/h/g CDW로 더 감소시켰으며, 117.4 시간의 발효후에 중단하였다. HMF 공급의 감소는 발효조중 HMF 산 농도의 점차적 감소를 야기한 반면, FDCA 농도는 계속 증가되었다. HMF 산이 더 이상 검출되지 않을 때 발효를 중단하였다. 이 시점에서 188 mmol의 HMF를 발효조에 첨가하여 30.8 g/L의 농도에서 약 182 mmol FDCA(즉 97% 효율)의 생성을 야기하였다. 도 7a는 슈도모나스 푸티다_pJT'hmfH의 유가식 배양물 중 바이오매스, HMF 산 및 FDCA의 생성을 나타낸 것이다. 도 7b는 동일 배양물의 글리세롤 및 HMF의 공급 속도를 나타낸 것이다.

실시예 VIII

발효액으로부터 FDCA 의 정제

0.5의 pH에서 FDCA의 용해도는 물 중에서 약 0.4 g/L인 것으로 밝혀졌다. 상기 농도는 침전후에 용액중에서 유지되기 때문에, 실시예 VIII에서 수득된 증가된 역가는 침전에 의해 정제로부터 생성물의 훨씬 감소된 손실을 유도한다.

원심분리(15 분간 9500 x g)에 의해 세포를 제거한 후, 500 ml의 정화된 발효액을 3 분간 비등시켜 단백질을 침전시키고 9500 x g에서 20 분간 원심분리하였다. FDCA를 침전시키기 위해, pH 0.5까지 계속 교반하면서 4 ℃에서 약 50 ml의 96% H₂SO₄를 상등액에 가하였다. 8228 x g에서 20 분간 원심분리에 의해 침전물을 회수하고, 250 ml의 물로 1회 세척하고, 8228 x g에서 다시 20 분간 원심분리하였다. 생성된 펠릿을 공기 건조한 후, 30 ℃에서 약 1200 ml 테트라하이드로퓨란(THF)에 용해시켰다. 여과에 의해 미용해 파편의 제거시, 정화된 THF 용액을 11.8 g의 무수 FDCA 분말이 고 순도(>99%)하에(발효조에서 초기 FDCA의 78%이다) 유지될 때까지 50 ℃에서 진공하에, 정화된 THF 용액을 증발시켰다. 필요한 경우, FDCA의 정제는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 더 최적화될 수 있다.

DSMZ(독일 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하)

DSM22875

20090819

SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> POLYPEPTIDES HAVING OXIDOREDUCTASE ACTIVITY AND THEIR USES <130> 27470-WO-PCT <140> PCT/EP2010/062896 <141> 2010-09-02 <150> EP 09169227.7 <151> 2009-09-02 <150> EP 09172555.6 <151> 2009-10-08 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 cggaattcca catgacaagg ggagaccg 28 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 cggaattcgc ttcggtcttc aactcggatg 30 <210> 3 <211> 579 <212> PRT <213> Cupriavidus basilensis <400> 3 Met Asp Thr Pro Arg Glu Arg Phe Asp Tyr Val Ile Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Asn Arg Leu Ser Gln Asp Pro Ala Ile 20 25 30 Arg Val Ala Leu Ile Glu Ala Gly Val Asp Thr Pro Pro Asp Ala Val 35 40 45 Pro Ala Glu Ile Leu Asp Ser Tyr Pro Met Pro Leu Phe Phe Gly Asp 50 55 60 Arg Tyr Ile Trp Pro Ser Leu Gln Ala Arg Ala Val Ala Gly Gly Arg 65 70 75 80 Ser Lys Val Tyr Glu Gln Gly Arg Val Met Gly Gly Gly Ser Ser Ile 85 90 95 Asn Val Gln Ala Ala Asn Arg Gly Leu Pro Arg Asp Tyr Asp Glu Trp 100 105 110 Ala Ala Ser Gly Ala Ser Gly Trp Ser Trp Gln Asp Val Leu Pro Tyr 115 120 125 Phe Arg His Leu Glu Arg Asp Val Asp Tyr Gly Asn Ser Pro Leu His 130 135 140 Gly Ser His Gly Pro Val Pro Ile Arg Arg Ile Leu Pro Gln Ala Trp 145 150 155 160 Pro Pro Phe Cys Thr Glu Phe Ala His Ala Met Gly Arg Ser Gly Leu 165 170 175 Ser Ala Leu Ala Asp Gln Asn Ala Glu Phe Gly Asp Gly Trp Phe Pro 180 185 190 Ala Ala Phe Ser Asn Leu Asp Asp Lys Arg Val Ser Thr Ala Ile Ala 195 200 205 Tyr Leu Asp Ala Asp Thr Arg Arg Arg Ala Asn Leu Arg Ile Tyr Ala 210 215 220 Glu Thr Thr Val Arg Lys Leu Val Val Ser Gly Arg Glu Ala Arg Gly 225 230 235 240 Val Ile Ala Met Arg Ala Asp Gly Ser Arg Leu Ala Leu Asp Ala Gly 245 250 255 Glu Val Ile Val Ser Ala Gly Ala Leu Gln Ser Pro Ala Ile Leu Met 260 265 270 Arg Ala Gly Ile Gly Asp Ala Gly Ala Leu Gln Ala Leu Gly Ile Glu 275 280 285 Val Val Ala Asp Arg Pro Gly Val Gly Arg Asn Leu Gln 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Ala His Ala 500 505 510 Asp Arg Ser Ala Val Thr Asp Ala Ala Gly Arg Val His Asp Val Gly 515 520 525 Arg Leu Arg Val Ile Asp Ala Ser Leu Met Pro Arg Leu Pro Thr Ala 530 535 540 Asn Thr Asn Ile Pro Thr Ile Met Leu Ala Glu Lys Ile Ala Asp Thr 545 550 555 560 Met Gln Ala Glu Arg Arg Ala Val Arg Pro Ala Ser Ser Glu Val Ala 565 570 575 His Pro Ser <210> 4 <211> 1740 <212> DNA <213> Cupriavidus basilensis <400> 4 atggatacgc cgagggagcg tttcgactac gtgattgttg gcggcgggtc cgccggttgc 60 gtactggcca atcgcctgtc gcaggacccg gccatccgcg tcgcgctgat cgaggcgggc 120 gtcgatacgc cgccggacgc tgtgccggcg gagatcctcg acagctatcc gatgcccttg 180 ttcttcggtg accggtatat ctggccatcg ctgcaagccc gcgccgtggc agggggcagg 240 tccaaggtct acgagcaagg gcgcgtcatg ggcggcggct ccagcatcaa cgtgcaggcg 300 gcaaaccgcg ggctgccgcg cgactacgat gagtgggccg cgtcgggcgc gtccggatgg 360 tcgtggcagg atgtgctgcc gtatttccgc caccttgagc gcgatgtgga ttacggcaac 420 agcccgctgc acggcagcca cggaccggtg ccgatccgcc gcatcctgcc gcaggcttgg 480 ccgccgttct gcacggagtt tgcgcacgcg atgggccgca gcggcttgtc cgcgctggcc 540 gaccagaacg cggagttcgg cgatggctgg tttccggccg ccttctcgaa cctggatgac 600 aagcgggttt cgaccgccat cgcctatctc gacgcggata cgcgccggcg ggccaatctg 660 cggatctatg ccgagacaac ggtgcgcaag ctcgtcgtat ccggccggga agcgcgtggg 720 gtgatcgcca tgcgggccga tgggtcgcgg ctggcgctgg acgccgggga ggtcatcgtg 780 tccgcgggcg ccttgcagtc gcccgccatc ctgatgcgcg cggggatcgg cgacgccggc 840 gcgctgcagg ccctcggcat cgaggtcgta gccgaccgac ccggcgttgg ccgcaatctc 900 caggatcatc ccgcgctgac gttctgccag ttcctcgcgc cccagtaccg catgccgctc 960 tcgcgccggc gcgctagcat gacggcggcg cggttctcat cgggggtgcc aggtggcgag 1020 gcgtcggaca tgtacctgtc cagttccaca cgggcaggct ggcatgcact cggtaatcgg 1080 ctcggcctct tcttcctgtg gtgcaatcgg ccattctcgc gcgggcaggt gagccttgcg 1140 ggagcccagc cggatgtgcc gcccatggtg gagctcaacc tgctcgacga cgagcgggat 1200 ctgcggcgca tggtggccgg cgtacgcaag ttggtgcaga tcgtgggtgc gtcggccttg 1260 catcagcatc ccggtgattt cttccccgct acgttttcgc cgcgcgtcaa ggcgctgagc 1320 cgcgtgagcc gcggcaatgt gttgctcacg gagttgctgg gggcagtgct tgatgtctcg 1380 gggccgctgc gcagaagcct gatcgcgcgc tttgtcacgg gcggcgcaaa cctggccagc 1440 ctgctgacgg atgagtccgc gctagagggc ttcgtgcgcc agagcgtctt cggggtctgg 1500 catgccagcg gcacttgccg gatgggcgcg catgcggacc ggagcgcggt gacggatgcg 1560 gcgggccgcg ttcacgatgt tggcaggctg cgcgttattg acgcctctct gatgccgcgg 1620 ctgccgacgg ccaataccaa catccccacc atcatgctcg cggaaaagat tgccgacacc 1680 atgcaagccg agcgccgcgc ggtccggccg gcatcgagcg aagttgccca tccgagttga 1740

Claims

서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 3의 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 산화환원효소 활성을 갖는 폴리펩티드로서,
5-하이드록시메틸퍼퓨랄(HMF) 및 5-하이드록시메틸-2-퓨란카복실산(HMF 산)을 2,5-퓨란다이카복실산(FDCA)으로 산화시키는 능력을 갖는, 폴리펩티드.
(a) 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열;
(b) 제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 또는
(c) 상기 (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열의 상보적 가닥인 뉴클레오티드 서열
을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
삭제
제 2 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조물.
제 2 항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 제 4 항에 따른 핵산 구조물을 포함하는 벡터.
서열 번호 3의 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 산화환원효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 위한 발현 구조물을 포함하는 세포로서,
상기 발현 구조물이 상기 세포에서 발현가능하고,
산화환원효소의 발현이, 발현 구조물을 포함하지 않는 대응 야생형 세포와 비교하여, 세포에 5-하이드록시메틸퍼퓨랄(HMF) 및 5-하이드록시메틸-2-퓨란카복실산(HMF 산) 중 하나 이상을 2,5-퓨란다이카복실산(FDCA)으로 산화시키는 능력을 부여하거나 향상시키는, 세포.
제 6 항에 있어서,
세포가 에스케리키아, 아나베나, 카울로박터, 글루코노박터, 로도박터, 슈도모나스, 파라코커스, 바실러스, 브레비박테리움, 코리네박테리움, 리조븀, 플라보박테리움, 클렙시엘라, 엔테로박터, 락토바실러스, 락토코커스, 메틸로박테리움, 스태필로코커스 또는 스트렙토마이세스 속; 및 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 푼티스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 할로듀란스, 바실러스 푸밀러스, 글루코노박터 옥시단스, 카울로박터 크레센터스 CB 15, 메틸로박테리움 엑스토르퀀스, 로도박터 스페로이데스, 슈도모나스 푸티다, 파라코커스 제아잔티니파시엔스, 파라코커스 데니트리피칸스, 에스케리키아 콜라이, 코리네박테리움 글루타미컴, 스태필로코커스 카르노서스, 스트렙토마이세스 리비단스, 시노리조븀 멜리오티 또는 리조븀 라디오박터 종으로 이루어진 군에서 선택된 세균인 세포.
제 6 항에 있어서,
세포가 캔디다, 한세눌라, 클루이베로마이세스, 피치아, 사카로마이세스, 쉬조사카로마이세스 또는 야로이야 속; 및 클루이베로마이세스 락티스, 사카로마이세스 세레비지에, 한세눌라 폴리모파, 야로이야 리포라이티카 또는 피치아 파스토리스 종으로 이루어진 군에서 선택된 효모 세포이거나, 또는 아스퍼질러스, 크리소스포륨, 페니실리움, 탈라로마이세스 또는 트리코더마 속; 및 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 포에티더스, 아스퍼질러스 소재, 아스퍼질러스 푸미가투스, 탈라로마이세스 에머소니, 아스퍼질러스 오리재, 크리소스포륨 루크노웬스, 트리코더마 리세이 또는 페니실리움 크리소게넘 종으로 이루어진 군에서 선택된 사상균 세포인 세포.
제 6 항에 따른 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 제 1 항의 산화환원효소 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조 방법.
삭제
2,5-퓨란다이카복실산(FDCA)의 하나 이상의 퓨란 전구체를 산화환원효소 촉매의 존재하에서 산화제와의 반응에 의해 FDCA로 전환시키는 단계를 포함하고, 이때 산화환원효소 촉매가 제 1 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는, FDCA의 제조 방법.
제 11 항에 있어서,
FDCA의 퓨란 전구체가 5-하이드록시메틸퍼퓨랄(HMF), 2,5-다이하이드록시메틸 퓨란(HMF 알콜) 및 5-하이드록시메틸-2-퓨란카복실산(HMF 산)으로 이루어진 군에서 선택되는, 제조 방법.
제 12 항에 있어서,
전구체가 HMF이고, HMF가 하나 이상의 육탄당으로부터 산의 존재하에 가열에 의해 수득되는, 제조 방법.
5-하이드록시메틸-2-퓨란카복실산(HMF 산)의 하나 이상의 퓨란 전구체를 산화환원효소 촉매의 존재하에 산화제와의 반응에 의해 HMF 산으로 전환시키는 단계를 포함하고, 이때 산화환원효소 촉매가 제 1 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는, HMF 산의 제조 방법.
제 14 항에 있어서,
HMF 산의 퓨란 전구체가 5-하이드록시메틸퍼퓨랄(HMF) 및 2,5-다이하이드록시메틸 퓨란(HMF 알콜)으로 이루어진 군에서 선택되는, 제조 방법.
제 11 항 또는 제 14 항에 있어서,
산화제와의 반응이, 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드(NAD+), 피롤로퀴놀린 퀴놀론(PQQ) 및 플라빈 아데닌 다이뉴클레오티드(FAD)로 구성된 군에서 선택되는 조효소, 및 산화환원효소 촉매의 존재하에 이루어지는, 제조 방법.
제 11 항에 있어서,
산화환원효소 촉매가 제 6 항에 따른 세포의 무세포 추출물인, 제조 방법.
제 11 항에 있어서,
산화환원효소 촉매가 제 6 항에 따른 세포인 전세포 생물촉매인, 제조 방법.
a) 제 11 항에 따른 방법으로 FDCA 단량체를 제조하는 단계, 및
b) a)단계에서 수득한 FDCA 단량체로부터 중합체를 제조하는 단계
를 포함하는, 하나 이상의 FDCA 단량체로부터 중합체를 제조하는 방법.
제 12 항에 있어서,
FDCA의 퓨란 전구체가 5-하이드록시메틸퍼퓨랄(HMF)인, 제조 방법.
제 13 항에 있어서,
하나 이상의 육탄당이 바이오매스로부터 수득되는, 제조 방법.