JP2018504904A - Fdcaのデヒドロゲナーゼ触媒による生産 - Google Patents
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Abstract
Description
用語「相同性」、「配列同一性」などは、本明細書では同義的に使用される。配列同一性は、本明細書において、配列を比較することにより決定する場合、2つ以上のアミノ酸(ポリペプチド若しくはタンパク質)配列又は2つ以上の核酸(ポリヌクレオチド)配列間の関係として定義される。当技術分野において、「同一性」はまた、場合によっては、こうした配列のストリング間のマッチによって決定する場合、アミノ酸配列又は核酸配列間の配列相関性の程度を意味する。2つのアミノ酸配列間の「類似性」は、1つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第2のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法によって容易に計算することができる。
第1の態様において、本発明は、5−ヒドロキシメチル−2−フランカルボン酸(HMFCA)を5−ホルミルフロ酸(FFA)に酸化させる能力を有する細胞に関する。HMFCAをFFAに酸化させる能力は、HMFCAをFFAに酸化させる能力を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を含む核酸構築物で細胞を形質転換することによって細胞に付与する又は細胞において増大させるのが好ましい。デヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼであるのが好ましい(すなわち、EC1.1活性を有する)。したがって、細胞は、HMFCAをFFAに酸化させる能力を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含む細胞であるのが好ましい。本発明の好ましい細胞において、発現構築物は細胞において発現可能であり、デヒドロゲナーゼの発現は、発現構築物を欠損している対応する細胞、例えば野性型細胞と比べ、HMFCAをFFAに酸化させる能力を細胞に付与する又は細胞において増大させるのが好ましい。HMFCAをFFAに酸化させる酵素の比活性は、発現構築物を欠損している対応する細胞と比べ、少なくとも1.05、1.1、1.2、1.5、2.0、5.0、10、20、50又は100倍、細胞において増大させるのが好ましい。
(a)ポリペプチドが配列番号1(エアリバチルス・パリダス)、配列番号2(バチルス・クリベンシス)、配列番号3(ゲオバチルス・カウストフィルス)、配列番号4(アネウリニバチルス・テラノベンシス)、配列番号5(ブレビバチルス・サーモルーバー)、配列番号6(ブレビバチルス・パナチフミ)、配列番号7(バチルス属の種FJAT−14578)、配列番号8(デスルホトマクルム・クズネツォビイ)、配列番号9(デスルフリスポラ・サーモフィラ)、配列番号10(バチルス属の種.L1(2012))、及び配列番号11(ペロトマクルム・サーモプロピオニカム)のうちのいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、81.65、81.7、81.8、81.85、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、FEVIFCAデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列;
(b)その相補鎖が(a)のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列;並びに、
(c)その配列が遺伝コードの縮重により(b)のヌクレオチド配列の配列とは異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択される。
a)i)HMFをHMFCAに酸化させること、ii)DFFをFFAに酸化させること、及びiii)FFAをFDCAに酸化させること、のうちの少なくとも1つの能力を有し、
b)配列番号24、25、26、27、28、29及び30のうちのいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むのが好ましい。
a)少なくともHMFCA輸送能力を有し;
b)配列番号17、31、32、33及び34のうちのいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むのが好ましい。
第2の態様において、本発明は、フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現する細胞に関する。本細胞は、フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物で形質転換されるのが好ましい。フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドは、HMFCAを細胞内に輸送する能力を少なくとも含む、HMFCA輸送能力を有するポリペプチドであるのが好ましい。本細胞は、ポリペプチドが配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも86.5、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98、99又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくともHMFCAを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含むのが好ましく、発現構築物は細胞において発現可能であり、ポリペプチドの発現は、発現構築物を欠損している対応する野生型細胞と比べ、少なくともHMFCAを細胞内に輸送する能力を細胞に付与する又は細胞において増大させる。ポリペプチドがフラン化合物、特にHMFCAを細胞内に輸送する能力は、上述のようにアッセイすることができる。
a)HMFCAをFFAに酸化させるアルコールデヒドロゲナーゼ及びフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸へ酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性;
b)HMF、2,5−ジヒドロキシメチルフラン、HMFCA、FFA及び2,5−ジホルミルフランのうちの1種又は複数をFDCAに酸化させるオキシドレダクターゼ、好ましくはオキシダーゼ、並びに任意選択で、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸へ酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、
のうちの少なくとも1つを好ましくは含む、HMFをFDCAに変換するための酵素活性をさらに含むのが好ましい。
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、例えば、本発明のHMFCAデヒドロゲナーゼ若しくはトランスポーターをコードしているヌクレオチド配列、又はそれらの機能性均等物を含む、核酸構築物、例えば、クローニングベクター及び発現ベクターを含むベクター、並びに、例えば、本発明のポリペプチドの発現が生じる条件下で、適切な宿主細胞においてこのようなベクターを増殖、形質転換又はトランスフェクトする方法に関する。本明細書で使用する場合、用語「ベクター」及び「構築物」は同義的に使用され、本発明のポリヌクレオチドを含む、好ましくは輸送することができる、構築された核酸分子を意味する。
さらなる態様において、本発明は、フラン化合物を酸化させる方法に関する。特に、本発明は、FDCAのフラン前駆体を酸化させる方法に関する。本発明の方法は、生成物が得られる単一の酸化反応ステップ(例えば、HMFCAのFFAへの酸化)を含み得る。或いは、本発明の方法は、複数の酸化反応ステップを含むことができ、それぞれのステップは中間体を生じ、最後の中間体は最終生成物である。HMFが連続する酸化ステップでFDCAに酸化される、このような一連のステップの例としては、例えば:1)HMFをまずHMFCAに酸化させ、これを第2のステップでFFAに酸化させ、次いで、これを最終的にFDCAに酸化させるか、或いは、Dijkman et al.(2014,Angew.Chem.53(2014)6515−8)によって記載されているとおりである、2)HMFをまずDFFに酸化させ、これを第2のステップでFFAに酸化させ、次いで、これを最終的にFDCAに酸化させる、ステップが挙げられる。したがって、本発明の好ましい方法において、FDCAの1つ又は複数のフラン前駆体は、一連のステップで最終的にFDCAに酸化される。
さらなる態様において、本発明は、HMFCAデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドに関する。HMFCAデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号1(エアリバチルス・パリダス)のアミノ酸配列と少なくとも81.65、81.7、81.8、81.85、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有するが、それ以外は本明細書において上記で定義したとおりである、アミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸からなる。ポリペプチドは、単離されたポリペプチドであるのが好ましい。
a)ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも81.65、81.7、81.8、81.85、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなる、HMFCAデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列;
b)配列番号12又は13に示されているヌクレオチド配列
;c)長さが10、15、20、30、50又は100ヌクレオチドである(a)又は(b)で定義したヌクレオチド配列の断片;
d)遺伝コードの縮重によりb)又はc)のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列;及び、
e)a)〜d)で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、
のうちの少なくとも1つを含む、核酸分子に関する。
またさらなる態様において、本発明は、フラン化合物輸送能力を有するポリペプチドに関する。本ポリペプチドは、HMFCAを細胞に輸送する能力を少なくとも有しているのが好ましい。本ポリペプチドは、配列番号17(エアリバチルス・パリダス)のアミノ酸配列と少なくとも86.5、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有するが、それ以外は本明細書において上記で定義したとおりである、アミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸からなるのが好ましい。本ポリペプチドは、単離ポリペプチドであるのが好ましい。
a)ポリペプチドが、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも86.5、87、88、89、90、91、92、93、94、95、95、96、97、98、99又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなる、少なくともHMFCAを細胞内に輸送する能力を有しているポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列;
b)配列番号18に示されているヌクレオチド配列;
c)長さが10、15、20、30、50又は100ヌクレオチドである、(a)又は(b)で定義したヌクレオチド配列の断片;
d)遺伝コードの縮重によりb)又はc)のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列;及び、
e)a)〜d)で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列、
の少なくとも1つを含む、核酸分子に関する。
株及びプラスミド
シュードモナス−プチダS12Δgcd若しくはシュードモナス・プチダKT2440Δgcd(それぞれ、シュードモナス・プチダS12(ATCC 700801)、シュードモナス・プチダKT2440(DSM6125)のグルコースデヒドロゲナーゼ欠損変異株))、又は野性型シュードモナス・プチダS12を、エアリバチルス・パリダスCA1828株由来のyiaY遺伝子を発現するための宿主として使用した(下記を参照)。大腸菌TG90株を一般的なクローニングの目的で使用した。
エアリバチルス・パリダス遺伝子のエピソームの発現については、pBBR1MCS−由来pBT’mcs(Koopman et al.,2010a,Biores Technol 101:6291−6196)を使用した。pBT’mcsにおいて、標的遺伝子の発現は、構成性tacプロモーターから作動される。
好中温性菌ミネラル塩培地(MMM)は、指定どおりに炭素源を補充して、下記を含有していた(脱イオン水1リットル当たり):15.52gのK2HPO4、6.52gのNaH2PO4、2.0gの(NH4)2SO4、0.1gのMgCl2・6H20、10mgのEDTA、2mgのZnSO4・7H20、1mgのCaCl2・2H20、5mgのFeSO4・7H20、0.2mgのNa2MoO4・2H20、0.2mgのCuSO4・5H20、0.4mgのCoCl2・6H20、及び1mgのMnCl2・2H20。
細胞乾燥重量(CDW)測定:
細菌培養のCDW含量は、Biowave Cell Density Meter(WPA Ltd)又はμQuant MQX200ユニバーサルマイクロプレート分光光度計(Biotek)を使用し、平底96ウェルマイクロプレート(Greiner)を用いて、600nm(OD600)で光学密度を測定することにより決定した。1.0のOD600は、シュードモナス・プチダに関しては、0.56gのCDW/L(Biowave)又は1.4gのCDW/L(μQuant)に対応する。
フラン化合物(FDCA、HMF、HMF−アルコール、HMFCA及びFFA)は、Koopman et al.(2010a,Biores Technol 101:6291−6196)によって開示されているRP−HPLCにより分析した。
5−ヒドロキシメチルフルフラール(HMF)は、Eurolabs Ltd (Poynton, UK)から購入した。FDCA及び5−ヒドロキシメチル−フロ酸(HMFCA)の分析標準は、Immunosource B.V.(Halle−Zoersel,Belgium)、Matrix Scientific(Columbia SC,USA)からそれぞれ購入した。他のすべての化学物質は、Sigma−Aldrich Chemie B.V.(Zwijndrecht,The Netherlands)から購入した。
ゲノムDNAは、マスターピュア(MasterPure)(商標)のグラム陽性のDNA精製キット(Epicentre)を使用してエアリバチルス・パリダスCA1828から単離した。プラスミドDNAは、JETSTAR Maxiプラスミド精製キット(GENOMED,ITK diagnostics)を用いて単離した。アガロース捕捉DNA断片は、DNAクリーン&コンセントレーター(DNA Clean & Concentrator)(商標)(Zymo research)を用いて単離した。PCR反応は、Phusion Flash PCR Master Mix(Thermo Scientific)を用いて、メーカーの使用説明書に従って実施した。オリゴヌクレオチドプライマー(実施例において特定したもの)は、Sigma−Aldrichによって合成された。プラスミドDNAは、Gene Pulserエレクトロポレーション装置(BioRad)を使用して、エレクトロコンピテント細胞に導入した。他の標準の分子生物学技術は、Sambrook and Russell(2001、前掲)に従って実施した。
コンポスト(15g)を0.9%(w/v)のNaCl溶液15mlと混合し、750rpm及び80℃で40分間インキュベートした。得られたコンポストスラリーを、振盪フラスコに0.65g/LのHMFを補充したTMM中で、3日間、60℃及び180rpmでインキュベートした。この培養物を一定間隔で新鮮なTMM−HMFに移し、固体TMM−HMF上にプレーティングした。単一のコロニーをTMM−HMFプレート及びTGPプレート上で再度平板画線し、HMF及びまたFDCAを代謝するそれらの能力について再評価した。HMF及びFDCAの両方を代謝した2種の単離物(CA1809株及びCA1828株)は、16S rDNAを配列決定することによりエアリバチルス・パリダスであると確認され、さらなる試験について選択した。
エアリバチルス・パリダスCA1809株及びCA1828株のゲノムは、PacBioシークエンシングによって配列決定し、自動ORF呼び出し及び注釈付けを実施した。注釈付けされたゲノムにおいて、フロ酸分解クラスターを構成する、カプリアビダス・バシレンシスHMF14株のhmfABCDE遺伝子の相同体が同定された(Koopman et al.,2010,Proc Nat Acad Sci USA 107:4919−4924)。
yiaY遺伝子は、プラスミドpKW007を産生するpBT’mcsにおいて、バチルス・コアグランスDSM1由来のPldhL1プロモーター領域を含む、1988bpの合成XbaI−SalI断片(配列番号15)としてクローニングされた。プラスミドpKW007をシュードモナス・プチダKT2440Δgcd(CA1877)に導入し、シュードモナス・プチダCA2101を得た。pBT’mcsを担持するシュードモナス・プチダKT2440Δgcd(CA2046株)を空ベクターの対照として試験した。
エアリバチルス・パリダスCA1828のyiaY遺伝子は、リボソーム結合部位TAGGAAAGGAAGATTAACCC(配列番号21)を含め合成した。yiaY断片(配列番号16)をKpnI及びXbaIで消化し、pBT’hmfH−adh(国際公開第2012064195号)のhmfH遺伝子で置き換え、プラスミドpKW010を得た。プラスミドpKW010を、pJNNhmfT1(t)(国際公開第2012064195号)を保有するシュードモナス・プチダS12Δgcdに導入し、シュードモナス・プチダCA2111を取得し、またシュードモナス・プチダKT2440Δgcd(pJNNhmfT1(t)も保有する)に導入し、シュードモナス・プチダCA2112を得た。したがって、yiaYによってコードされているHMFCA酸化アルコールデヒドロゲナーゼは、カプリアビダス・バシレンシスHMF14由来のHMFデヒドロゲナーゼ及びHMFCAトランスポーターを共発現させることができ、HMFCA及びHMFCAの取込みに対するHMF酸化の障害を排除することができた。
バチルス・クリベンシスDSM17871、ブレビバチルス・サーモルーバー423、バチルス属の種FJAT−14578、及びバチルス属の種L1(2012)のyiaY相同体は、リボソーム結合部位含有スペーサーTAGGAAAGGAAGATTAACCC(配列番号21)、並びに、クローニング用の制限酵素(それぞれ、KpnI、NheI;XbaIと適合可能)認識部位(配列番号:19、36、38及び39)を含めて合成された。
proP遺伝子(配列番号18)は、プライマーproP(f)(gccgaattcATGAAGAATATCGCTAATACG;配列番号22)及びproP(r)(gccgctagcTTATTTGAGGTTTCCTTTTGTTTCC;配列番号23)を使用し、PCRによって、エアリバチルス・パリダスCA1828のゲノムDNAから増幅させた。PCR産物を、pJNNmcs(t)に1350bpのEcoRI−NheI断片(配列番号20)として導入し、pJNNproP(t)を得た。プラスミドpBT’hmfH_aldh及びpJNNproP(t)を、シュードモナス・プチダKT2440Δgcd(CA1877)に連続的に導入し、シュードモナス・プチダCA21783を得た。シュードモナス・プチダCA21783は、50mg/Lのカナマイシン、30mg/Lのゲンタミシン及び100μMのサリチル酸を補充し、10mlのMM+80mMグリセロール及び2mMのグルコースを入れた100mlの振盪フラスコ内で培養した。細胞を対数期の終わり(OD600で約4)に回収し、洗浄し、MM50mg/Lのカナマイシン、30mg/Lのゲンタミシン及び10μMのサリチル酸に再懸濁した。洗浄した細胞懸濁液(OD600で1〜2)のアリコート(10ml)を、100mlのエルレンマイヤーフラスコ中のHMFと共にインキュベートし、試料をFDCA解析用に一定間隔で採取した。HMFCAトランスポーターをコードしているproPの発現は、proPを発現しない対応する対照株と比べ、HMFのFDCAへの酸化を顕著に促進することが明白である。
Claims (15)
- HMFCAの存在下で、好ましくは細胞によってHMFCAの酸化を促進する条件下で、細胞をインキュベートするステップを含む、5−ヒドロキシメチル−2−フランカルボン酸(HMFCA)を5−ホルミル−2−フロ酸(FFA)に酸化させる方法であって、
前記細胞が、配列番号1〜11のアミノ酸配列のうちのいずれか1つと少なくとも45%の同一性を有するアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含み、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記デヒドロゲナーゼの発現が、前記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、HMFCAをFFAに酸化させる能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させる、
方法。 - 1つ又は複数のFDCAのフラン前駆体を含む培地中で、好ましくは細胞によるFDCAのフラン前駆体のFDCAへの酸化を促進する条件下で、細胞をインキュベートするステップと、任意選択で、FDCAを回収するステップとを含む、FDCAを生産する方法であって、
前記細胞が、配列番号1〜11のアミノ酸配列のうちのいずれか1つと少なくとも45%の同一性を有するアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含み、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記デヒドロゲナーゼの発現が、前記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、HMFCAをFFAに酸化させる能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させ、
FDCAの少なくとも1つのフラン前駆体が、HMF、2,5−ジヒドロキシメチルフラン(DHF)、HMFCA、FFA及び2,5−ジホルミルフラン(DFF)からなる群から選択されるのが好ましく、そのうちHMFが最も好ましく、
FDCAのフラン前駆体が、好ましくは酸触媒による脱水によって、1つ又は複数のヘキソース糖、好ましくはリグノセルロースバイオマスから得られる1つ又は複数のヘキソース糖から得られる、
FDCAを生産する方法。 - 前記FDCAが、酸又は塩沈澱、続いて冷却結晶化及び/又は溶媒抽出を含む方法によって、培地から回収される、請求項2に記載のFDCAを生産する方法。
- a)請求項2又は3に記載の方法においてFDCAモノマーを調製するステップと;
b)a)で得られたFDCAモノマーからポリマーを生産するステップと
を含む、1つ又は複数のFDCAモノマーからポリマーを生産する方法。 - 1種又は複数のフラン前駆体をFDCAに生体内変換するための細胞の使用であって、
FDCAの少なくとも1つのフラン前駆体がHMF、DHF、HMFCA、FFA及びDFFからなる群から選択されるのが好ましく、そのうち、HMFが最も好ましく、
前記細胞が、配列番号1〜11のアミノ酸配列のうちのいずれか1つと少なくとも45%の同一性を有するアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含み、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記デヒドロゲナーゼの発現が、前記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、HMFCAをFFAに酸化させる能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させる、
細胞の使用。 - 配列番号1〜11のアミノ酸配列のうちのいずれか1つと少なくとも45%の同一性を有するアミノ酸配列を有するデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含む細胞であって、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記デヒドロゲナーゼの発現が、前記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、HMFCAをFFAに酸化させる能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させ、
前記細胞が、
a)フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性であって、前記細胞が、アミノ酸配列の配列番号24、25、26、27、28、29及び30のうちのいずれか1つと少なくとも45%の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現するための第2の発現構築物を含むのが好ましく、前記第2の発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼの発現が、前記第2の発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、i)5−ヒドロキシメチルフルフラール(HMF)をHMFCAに酸化させる能力、ii)DFFをFFAに酸化させる能力、及びiii)FFAをFDCAに酸化させる能力のうちの少なくとも1つを前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させる、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性と;
b)フラン化合物を前記細胞内及び/又は細胞外に輸送する能力であって、前記細胞が、少なくともHMFCAを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための第3の発現構築物を含むのが好ましく、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列の配列番号17、31、32、33及び34のうちのいずれか1つと少なくとも45%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第3の発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記ポリペプチドの発現が、前記第3の発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、少なくともHMFCAを前記細胞内に輸送する能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させる、輸送する能力
のうちの少なくとも1つをさらに有する、
細胞。 - 前記細胞が微生物細胞であり、前記細胞が、カンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリベロミセス(Kluyveromyces)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウイア(Yarrowia)、アクレモニウム(Acremonium)、アガリクス(Agaricus)、アスペルギルス(Aspergillus)、アウレオバシディウム(Aureobasidium)、ミセリオフトーラ(Myceliophthora)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、コプリナス(Coprinus)、クリプトコックス(Cryptococcus)、フィリバシジウム(Filibasidium)、フザリウム(Fusarium)、フミコラ(Humicola)、マグナポルテ(Magnaporthe)、ムコール(Mucor)、ミセリオフトーラ(Myceliophthora)、ネオカリマスティクス(Neocallimastix)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペシロミセス(Paecilomyces)、ペニシリウム(Penicillium)、ピロミセス(Piromyces)、パネロカエテ(Panerochaete)、プロイロータス(Pleurotus)、シゾフィラム(Schizophyllum)、タラロミセス(Talaromyces)、サーモアスカス(Thermoascus)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)、及びトリコデルマ(Trichoderma)からなる群の属から選択される酵母又は糸状菌細胞であるのが好ましく、クリベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、サッカロミセス・セルビシエ(S.cerevisiae)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フォエティダス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ソジェ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、タラロミセス・エメルソニ(Talaromyces emersonii)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、ミセリオフトーラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、及びペニシリウム・クリゾゲヌム(Penicillium chrysogenum)からなる群の種から選択される酵母又は糸状菌細胞がより好ましく、或いは、
前記細胞が、エシェリヒア(Escherichia)、アナベーナ(Anabaena)、エアリバチルス(Aeribacillus)、アネウリニバチルス(Aneurinibacillus)、バークホルデリア(Burkholderia)、ブラジリゾビウム(Bradyrhizobium)、コーロバクター(Caulobacter)、カプリアビダス(Cupriavidus)、デスルホトマクルム(Desulfotomaculum)、デスルフリスポラ(Desulfurispora)、グルコノバクター(Gluconobacter)、ロドバクター(Rhodobacter)、ペロトマクルム(Pelotomaculum)、シュードモナス(Pseudomonas)、パラコッカス(Paracoccus)、バチルス(Bacillus)、ゲオバチルス(Geobacillus)、ブレビバチルス(Brevibacillus)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、リゾビウム(Rhizobium)(シノリゾビウム(Sinorhizobium))、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、クレブシェラ(Klebsiella)、エンテロバクター(Enterobacter)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、メチロバクテリウム(Methylobacterium)、ラルストニア(Ralstonia)、ロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、及びストレプトミセス(Streptomyces)からなる群の属から選択される細菌細胞であるのが好ましく、エアリバチルス・パリダス(A.pallidus)、アネウリニバチルス・テラノベンシス(A.terranovensis)、バチルス・スブチリス(B.subtilis)、バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、バチルス・コアグランス(B.coagulans)、バチルス・クリベンシス(B.kribbensis)、バチルス・リケニフォルミス(B.licheniformis)、バチルス・プンチス(B.puntis)、バチルス・メガテリウム(B.megaterium)、バチルス・ハロデュランス(B.halodurans)、バチルス・プミルス(B.pumilus)、バチルス・サーモルーバー(B.thermoruber)、バチルス・パナチフミ(B.panacihumi)、カプリアビダス・バシレンシス(C.basilensis)、デスルホトマクルム・クズネツォビイ(D.kuznetsovii)、デスルフリスポラ・サーモフィラ(D.thermophila)、ゲオバチルス・カウストフィルス(G.kaustophilus)、グルコノバクター・オキシダンス(G.oxydans)、コーロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)CB15、メチロバクテリウム・エキストロクエンス(Methylobacterium extorquens)、ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム(Pelotomaculum thermopropionicum)、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス(Pseudomonas zeaxanthinifaciens)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、パラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans)、大腸菌(E.coli)、コリネバクテリウム・グルタミクム(C.glutamicum)、スタフィロコッカス・カルノーサス(Staphylococcus carnosus)、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、シノリゾビウム・メリオティ(Sinorhizobium melioti)、及びリゾビウム・ラジオバクター(Rhizobium radiobacter)からなる群の種から選択される細菌細胞であるのがより好ましい、
請求項6に記載の細胞。 - 配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも81.65%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、HMFCAデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド。
- a)請求項8で定義したHMFCAデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列;
b)配列番号12又は13に示されているヌクレオチド配列;
c)長さが10、15、20、30、50又は100ヌクレオチドである、(a)又は(b)で定義したヌクレオチド配列の断片;
d)遺伝コードの縮重によりb)又はc)のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列;及び、
e)a)〜d)で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列
のうちの少なくとも1つを含む核酸分子であって、
ベクターであるのが好ましい、
核酸分子。 - 請求項8で定義したポリペプチド、及び請求項9で定義した核酸分子のうちの少なくとも1つを含む細胞であって、
培養細胞であるのが好ましい、
細胞。 - 少なくともHMFCAを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するための発現構築物を含む細胞であって、
前記ポリペプチドが、配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも86.5%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記発現構築物が前記細胞において発現可能であり、前記ポリペプチドの発現が、前記発現構築物を欠損している対応する野性型細胞と比べ、少なくともHMFCAを前記細胞内に少なくとも輸送する能力を前記細胞に付与する又は前記細胞において増大させ、
前記細胞がHMFをFDCAに変換するための酵素をさらに含み、
HMFをFDCAに変換するための前記酵素が、
a)HMFCAをFFAに酸化させるアルコールデヒドロゲナーゼ及びフランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性;並びに、
b)HMF、2,5−ジヒドロキシメチルフラン、HMFCA、FFA及び2,5−ジホルミルフランのうちの1種又は複数をFDCAに酸化させるオキシドレダクターゼ、並びに任意選択で、フランアルデヒドを対応するフランカルボン酸に酸化させるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性
のうちの少なくとも1つを含むのが好ましい、
細胞。 - 前記細胞が微生物細胞であり、前記細胞が、カンジダ、ハンゼヌラ、クリベロミセス、ピチア、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ヤロウイア、アクレモニウム、アガリクス、アスペルギルス、アウレオバシディウム、ミセリオフトーラ、クリソスポリウム、コプリナス、クリプトコックス、フィリバシジウム、フザリウム、フミコラ、マグナポルテ、ムコール、ミセリオフトーラ、ネオカリマスティクス、ニューロスポラ、ペシロミセス、ペニシリウム、ピロミセス、パネロカエテ、プロイロータス、シゾフィラム、タラロミセス、サーモアスカス、チエラビア、トリポクラジウム、及びトリコデルマからなる群の属から選択される酵母又は糸状菌細胞であるのが好ましく、クリベロミセス・ラクチス、サッカロミセス・セルビシエ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ヤロウイア・リポリティカ、ピチア・パストリス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ソジェ、アスペルギルス・フミガーツス、タラロミセス・エメルソニ、アスペルギルス・オリゼ、ミセリオフトーラ・サーモフィラ、トリコデルマ・リーゼイ、及びペニシリウム・クリゾゲヌムからなる群の種から選択される酵母又は糸状菌細胞であるのがより好ましく;或いは、
前記細胞が、エシェリヒア、アナベーナ、エアリバチルス、アネウリニバチルス、バークホルデリア、ブラジリゾビウム、コーロバクター、カプリアビダス、デスルホトマクルム、デスルフリスポラ、グルコノバクター、ロドバクター、ペロトマクルム、シュードモナス、パラコッカス、バチルス、ゲオバチルス、ブレビバチルス、ブレビバクテリウム、コリネバクテリウム、リゾビウム(シノリゾビウム)、フラボバクテリウム、クレブシェラ、エンテロバクター、ラクトバチルス、ラクトコッカス、メチロバクテリウム、ラルストニア、ロドシュードモナス、スタフィロコッカス、及びストレプトミセスからなる群の属から選択される細菌細胞であるのが好ましく、エアリバチルス・パリダス、アネウリニバチルス・テラノベンシス、バチルス・スブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・クリベンシス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プンチス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ハロデュランス、バチルス・プミルス、バチルス・サーモルーバー、バチルス・パナチフミ、カプリアビダス・バシレンシス、デスルホトマクルム・クズネツォビイ、デスルフリスポラ・サーモフィラ、ゲオバチルス・カウストフィルス、グルコノバクター・オキシダンス、コーロバクター・クレセンタスCB15、メチロバクテリウム・エキストロクエンス、ロドバクター・スフェロイデス、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム、シュードモナス・ゼアキサンチニファシエンス、シュードモナス・プチダ、パラコッカス・デニトリフィカンス、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミクム、スタフィロコッカス・カルノーサス、ストレプトミセス・リビダンス、シノリゾビウム・メリオティ、及びリゾビウム・ラジオバクターからなる群の種から選択される細菌細胞であるのがより好ましい、
請求項11に記載の細胞。 - 配列番号17のアミノ酸配列と少なくとも86.5%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくともHMFCAを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチド。
- a)請求項13で定義した、少なくともHMFCAを細胞内に輸送する能力を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列;
b)配列番号18に示されているヌクレオチド配列;
c)長さが10、15、20、30、50又は100ヌクレオチドである(a)又は(b)で定義したヌクレオチド配列の断片;
d)遺伝コードの縮重によりb)又はc)のヌクレオチド配列の配列と配列が異なるヌクレオチド配列;及び、
e)a)〜d)で定義したヌクレオチド配列の逆相補体であるヌクレオチド配列
のうちの少なくとも1つを含む核酸分子であって、
ベクターであるのが好ましい、
核酸分子。 - 請求項13で定義したポリペプチド、及び請求項14で定義した核酸分子のうちの少なくとも1つを含む細胞であって、
培養細胞であるのが好ましい、
細胞。
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