JP2013503614A - オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドに関し、このポリペプチドをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチド配列に関する。本発明は、さらに2,5−フラン−ジカルボン酸(FDCA)の生成に関する。さらに、これらのポリペプチドを生成するのに適した、本発明によるポリヌクレオチドによって形質転換された細胞も、本発明に含まれ、これらの細胞はまた、ヒドロキシメチルフルフラール(HMF)のFDCAへの生体内変換のために使用することもできる。
2,5−フラン−ジカルボン酸(FDCA)は、PETなどのポリエステルの生成においてテレフタレートの生体ベースの代替物になる可能性が大きい。そのため、また他の理由から、FDCAは、バイオマスからの高付加価値化学物質(Top Value−Added Chemicals)に関するDOEレポートにおいてトップ12優先化学物質の1つと選定された(Top Value−Added Chemicals from Biomass、Volume I−Results of screening for potential Candidates from Sugars and Synthesis gas、 Department of Energy(USA)、2004)。この化合物は、酸性条件下でヘキソース糖を加熱することにより生成され得る5−ヒドロキシメチルフルフラール(HMF)の酸化によって得ることができる。DOEレポートの27ページに、FDCAのいくつかの潜在的な有用性が開示されている。これらの有用性には、コハク酸、2,5−ビス(アミノメチル)−テトラヒドロフラン、2,5−ジヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン、2,5−ジヒドロキシメチルフラン、および2,5−フランジカルバルデヒドを生成する基質としての役割が含まれる。C6糖の化学的酸化脱水によるFDCAの生成およびFDCAの用途はよく知られており、26ページの表13には技術的な障害も提示されているが、生体内変換(おそらく酵素的変換)については、その状況は不明であった。
本発明の目的は、分子状酸素をレドックス反応に使用することができるオキシドレダクターゼを提供することである。別の目的は、幅広い反応スペクトルを有するオキシドレダクターゼを提供することである。別の目的は、高い部位特異性を有するオキシドレダクターゼを提供することである。本発明のさらなる目的は、実質量の副生成物を回避することができる、FDCAを生成するための方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、実質量の副生成物を回避することができる、5−ヒドロキシメチル−2−フランカルボン酸(HMF酸)を生成するための方法を提供することである。本発明によってこれらの目的の1つまたは複数が達成される。
配列番号1は、プライマーFN23のDNA配列:5’−CGGAATTCCACATGACAAGGGGAGACCG−3’を示す。下線の配列は、EcoRI制限部位を示す。
配列番号2は、プライマーFN24のDNA配列:5’−CGGAATTCGCTTCGGTCTTCAACTCGGATG−3’を示す。下線の配列は、EcoRI制限部位を示す。
配列番号3は、HmfHのアミノ酸配列を示す。
配列番号4は、hmfHのコード配列を示す。
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、単語「含む(comprise)」および「含む(include)」、ならびに「含む(comprises)」、「含んでいる(comprising)」、および「含んでいる(including)」などの語尾変化語は、包含的であると解釈されるべきである。すなわち、これらの単語には、文脈の枠内で、具体的に列挙されない他のエレメントまたは整数も包含され得ることを示す意図がある。
オキシドレダクターゼ活性を有する本発明によるポリペプチドは、配列番号3に示されるアミノ酸配列もしくは配列番号4のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列または配列番号3に示される配列と少なくとも45%の配列同一性を有するその変異体ポリペプチドを含む。
オキシドレダクターゼまたはオキシドレダクターゼを発現するDNA物質は、生物、好ましくはオキシドレダクターゼを発現する微生物から単離し得る。微生物はHMFを利用できることが好ましいが、これは必須ではない。微生物は、カプリアビダス属(Cupriavidus)、バークホルデリア属(Burkholderia)、ブラディリゾビウム属(Bradyhrizobium)、メチロバクテリウム属(Methylobacterium);カプリアビダス・バシレンシス(Cupriavidus basisliensis)、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)、ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyhrizobium japonicum)、メチロバクテリウム・ラデイオトレランス(Methylobacterium radiotolerans)、カプリアビダス・バシスレンシス(Cupriavidus basisliensis)HMF14、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)PsJN、ブラディリゾビウム・ジャポニクム(Bradyhrizobium japonicum)USDA110、メチロバクテリウム・ラデイオトレランス(Methylobacterium radiotolerans)JCM2831からなる群から選択されることが好ましい。
本明細書では、酸化反応は、本発明のオキシドレダクターゼおよび1つまたは複数の補酵素(本明細書の下記に記載)の存在下でのフラン化合物とオキシダントとの1回または複数回の反応である。この酸化反応は、生成物を生じる1回の酸化反応ステップ(例えばHMF−酸のFDCAへの酸化)を含むことができる。あるいは、この酸化反応は、2回以上の酸化反応ステップを含むことができ、各ステップで中間体が生まれ、最後の中間体が最終生成物である(例えばHMFのFDCAへの酸化)。酸化反応の例を図1に示す。
本発明による反応中のオキシダントは、任意のオキシダント、好ましくは酸素であってもよい。酸素の最も経済的な供給源は空気である。このことは、空気が大気から容易に得られ、無料、無毒性、かつ反応後に除去する必要もない点で有利である。あるいは、分子状酸素放出系を利用してもよい。酸素発生系は、当技術分野で開示された様々な酸素発生系から原則として選択し得る。例えば、反応混合物の中にすでに存在するカタラーゼ酵素を利用して、過酸化水素から酸素を発生させ得る。
本明細書では、フラン化合物は、2,5−フラン−ジカルボン酸またはその前駆体に酸化され得るフラン基を有する任意の化合物であると理解される。好ましいフラン化合物としては、ヒドロキシメチルフルフラール(HMF)、ヒドロキシメチルフランカルボン酸(HMF酸)、2,5−ジヒドロキシメチルフラン(HMFアルコール)が挙げられる。フラン環または任意もしくはその置換可能な側鎖は、例えばOH、C1〜C10アルキル、アルキル、アリル、アリール、またはRO−エーテル部分、および環式基により、フラン環の任意の可能な位置で置換されていてもよい。
酵素の発現のために利用される厳密な手法に関係なく、当技術分野で公知の方法を用いて、これらの酵素をコードする遺伝子を別の宿主細胞に導入して、その発現を移行させることができると考えられる。本明細書において定義する遺伝エレメントには、関連酵素を発現させるかまたはその発現を調節するタンパク質、特に酵素、アポタンパク質、またはアンチセンスRNAなどの生成物のための発現可能コード配列を有する核酸(一般にはDNAまたはRNA)が含まれる。発現されたタンパク質は、酵素として機能するか、酵素活性を抑制もしくは抑制解除するか、または酵素の発現を制御することができる。これらの発現可能配列をコードする組換えDNAは、染色体にある(例えば相同遺伝子組換えによって宿主細胞染色体へ組み込まれている)か、または染色体外にある(例えば、1つまたは複数のプラスミド、コスミド、および自己複製可能な他のベクターによって保持されている)ことができる。本発明による、宿主細胞を形質転換するために利用される組換えDNAには、構造遺伝子および転写因子に加えて、タンパク質、アポタンパク質、またはアンチセンスRNAのためのコード配列の発現または抑制除去を制御するように作用する、プロモーター、リプレッサー、およびエンハンサーを含む発現調節配列が含まれ得ることが理解される。例えば、このような制御配列は、野生型の宿主細胞に挿入されて、宿主細胞ゲノム中にすでにコードされていた、選択された酵素の過剰発現を促進することができる。あるいは、その代わりに染色体外にコードされた酵素の合成を制御するために使用することができる。
本発明の別の実施形態は、本発明によるポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、またはベクターを含む細胞である。宿主細胞は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、またはベクターが適切に発現され得る細胞である。
フルクタンが本来豊富な農業作物(例えばトビナンブールまたはチコリルート)は、従来の加水分解および熱化学(の組合せ)処理によってHMFに富んだ流加原料に変換し得る。フルクトースからHMFを生成する技術は確立しており、確固としたものである。さらにグルコースに富んだ流加原料も利用することができるが、HMFの熱化学的形成はフルクトースからの方がより効率的に起こる。したがって、グルコースイソメラーゼを使用してグルコースをフルクトースに変換するために、追加の酵素ステップを含むことができる。後者のプロセスは、加水分解されたデンプンから高フルクトースコーンシロップ(HFCS)を生成するために食品産業において確立されている。食品用途との競合を回避するならば、リグノセルロース水解物が、HMF/FDCAを生成するための好ましい流加原料になるであろう。
HMFのFDCAへの生体内変換については、本明細書において前述したカプリアビダス・バシレンシス(Cupriavidus basilensis)HMFオキシドレダクターゼを発現する強健な全細胞生体触媒(遊離細胞または固定化細胞)を使用する。このプロセスでは、全細胞生体触媒は酵素触媒にまさるいくつかの利点を有している。すなわち、HMFオキシドレダクターゼが高反応性基質による化学的不活性化から保護され、かつHMFから(おそらく)対応する一塩基酸に導き、次いでこの一塩基酸がHmfHによって二価酸に変換される最初の2つの酸化ステップにおいて、宿主固有のデヒドロゲナーゼが、HMFオキシドレダクターゼを助けることができる。補因子再生を確実にするために、追加の処置を要求し得ることが好ましい。全細胞生体触媒は、HMF流加を最小限で処理できるものであるべきである。すなわち、低pH、高温、および流加原料の加水分解/熱化学による変換中に生成される有毒化合物(その中に基質がある)に対する耐性があることが好ましい。シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)S12は、種々の化学的ストレス要因に対する耐性、比較的広いpH領域、およびHMFオキシドレダクターゼを助けてHMFのFDCAへのより効率的な生体内変換を生じさせる固有な(indiginous)デヒドロゲナーゼの存在の観点から、適切な宿主生物としての資格があると見なし得る。
生体内変換の後、細胞は確立した方法によってブロスから分離し、再使用してもよい。FDCAは酸沈殿によって無細胞ブロスから回収し、適切な有機溶媒中に高温で再溶解してもよい。溶解後に、FDCAは、酸沈殿および溶媒抽出、または当技術分野で公知の他の精製法によって、所望の場合には二価酸の形態にて高純度で回収してもよい。
FDCAはポリエステルの製造において、テレフタレート(terephtalate)の代わりとして使用し得る。FDCAはまた、極めて多様な高価値化合物のための基質として使用し得る。例えば、コハク酸、2,5−ビス(アミノメチル)−テトラヒドロフラン、2,5−ジヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン、2,5−ジヒドロキシメチルフラン、および2,5−フランジカルバルデヒドを製造するための公知の基質である。FDCAは、コーティングの製造において、例えばアルキド樹脂および熱可塑性コーティングの中に使用してもよい。FDCAはまた、バイオ燃料におけるキシレン等価物として、また溶媒として使用してもよい。
[一般的方法]
菌株およびプラスミド カプリアビダス・バシレンシス(Cupriavidus basilensis)HMF14は、DSMZ:カプリアビダス・バシレンシス(Cupriavidus basilensis)HMF14=DSM22875、寄託日:2009年8月19日に寄託されており、唯一の炭素源としてフランを使用することができる土壌分離菌である。シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)S12(ATCC700801)をHMFオキシドレダクターゼ発現のための宿主として使用した。大腸菌(Escherichia coli)DH5a(Invitrogen)を一般のクローニング目的に使用した。pUCP22由来の大腸菌(E.coli)−P.プチダ(P.putida)シャトルプラスミドpJT’mcs(未公表)を、構成的tacプロモーターの制御下でHMFオキシドレダクターゼを発現させるために使用した。大腸菌(E.coli)における複製については、pUC複製起点を使用する;P.プチダ(P.putida)における複製については、pRO1600複製起点を使用する。hmfH遺伝子の発現は構成的tacプロモーターにより促進される。大腸菌(E.coli)の抗生物質選択(アンピシリン抵抗性)のために、β―ラクタマーゼマーカー遺伝子(bla)を使用する。P.プチダ(P.putida)の抗生物質選択のために、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼマーカー遺伝子(gmR)を使用する。
[C.バシレンシス(C.basilensis)HMF14の細胞抽出物におけるFDCA生成]
12mMコハク酸および3mM HMFが添加されたMM上で増殖した、対数増殖期後半の前培養物(OD600およそ1.5)から得られたC.バシレンシス(C.basilensis)の細胞抽出物を、HMFまたはHMF酸のいずれかと共にインキュベートすると、FDCAの形成が観察された。
[HMFオキシドレダクターゼをコードするhmfH遺伝子の単離および特徴づけ]
hmfH遺伝子は、FAD依存性グルコース−メタノール−コリン(GMC)オキシドレダクターゼファミリーに属する62 317 Daのタンパク質をコードすることが見出された。この酵素にはフラン−ジカルボン酸(FDCA)へHMF−酸を酸化する能力があることが示された。さらに、この酵素は、基質としてHMFも受け入れ、HMFをHMF−酸を介してFDCAに酸化した。非重複性NCBIデータベース中でHmfHと最も高い相同性を有するものが、バークホルデリア・フィトフィルマンス(Burkholderia phytofirmans)PsJNのGMCオキシドレダクターゼであることがわかった(座位タグBphyt_2180;562個のアミノ酸ストレッチにわたって68%の同一性)。C.バシレンシス(C.basilensis)HMF14のHMF/フルフラールオペロンの配列データに基づいて、他の潜在的なHMF/フルフラールディグレーダー(degrader)が同定された。選択された菌株は、唯一の炭素源としてHMFまたはフルフラールのいずれかを含むミネラル塩培地上での増殖について試験された。HMF上で増殖できた菌株は、HmfHと45〜68%の同一性があるオキシドレダクターゼをコードするhmfHオルソログを有していた。1菌株(バークホルデリア・ゼノボランス(Burkholderia xenovorans LB400)は、そのオキシドレダクターゼがHmfHと44%の同一性があったが、HMFを利用することができなかった。
[P.プチダ(P.putida)S12中のhmfHのクローニングおよびコードされたオキシドレダクターゼの発現]
HMFオキシドレダクターゼをコードするhmfH遺伝子を、発現ベクターpJT’mcsにクローニングした。C.バシレンシス(C.basilensis)HMF14ゲノムDNA上でプライマーFN23およびFN24を用いて得られたPCRフラグメントを、EcoRI(Fermentas)により消化した。この消化フラグメントを、EcoRI消化およびFastAP(Fermentas)処理のpJT’mcsベクターに連結し、HmfH発現プラスミドpJT’hmfHを得た。hmfH挿入の方向が正しいことを、当技術分野で公知の制御消化およびヌクレオチド配列決定によって確認した。HMFオキシドレダクターゼの発現は、MM+20mMグルコースおよび10mg/lゲンタマイシン中で増殖したP.プチダ(P.putida)_pJT’hmfH(OD600およそ4)の細胞抽出物において、基質としてHMFまたはHMF酸を使用したときにFDCAが形成されたことによって実証された(表1)。
[HmfHを発現するP.プチダ(P.putida)S12によるHMFのFDCAへの全細胞変換]
P.プチダ(P.putida)S12の内因性デヒドロゲナーゼが、HMFからHMF−酸を生成する追加の手段となって、HMFのFDCAへの酸化においてHmfHと相乗的に作用することができるので、HMFのFDCAへの全細胞生体内変換法には、酵素法にまさる利点がある場合がある。この可能性を調べるために、静止細胞、増殖細胞、および破壊細胞を、HMFからFDCAの生成について試験した。
[HmfHを発現するP.プチダ(P.putida)S12を用いた、流加回分によるHMFからのFDCAの生成]
FDCAの生成は、HmfHを発現するP.プチダ(P.putida)S12の増殖細胞で最も効率的であることが見出された。そこで、P.プチダ(P.putida)S12 pJT’hmfHの全細胞によるFDCAの生成を実証するために流加回分実験を行った。
[発酵ブロスからのFDCAの精製]
pH1.0でのFDCAの溶解度は、水中で約1.5g/lであることがわかった。この特性を有利に利用して、発酵ブロスからFDCA生成物を回収した。遠心分離(9500×gで5分間)により細胞を除去した後に、室温で連続して撹拌しながらpH1になるまで、96%H2S04約10mlを透明ブロス100mlに加え、FDCAを沈殿させた。この沈殿を8228×gで10分間遠心分離して回収し、風乾したペレットを60℃でメタノール中に再融解した。予熱された0.22μmフィルターでろ過して溶解しないデブリを除去した後すぐに、そのろ液を純度分析のためにHPLCに供した。上記手順によって発酵ブロスから回収したFDCAの純度は、約65%であった。FDCAのさらなる精製は当技術分野で公知の方法により行うことができる。
[HmfHを発現するP.プチダ(P.putida)S12を用いた、流加回分によるHMFからのFDCAの生成]
第2の流加回分によるFDCA生成実験は、P.プチダ(P.putida)S12 pJT’hmfHの全細胞による、FDCAのタイターおよび生産性を向上させるために行った。
[発酵ブロスからのFDCAの精製]
pH0.5でのFDCAの溶解度は、水中で約0.4g/lであることがわかった。沈殿の後に、この濃度が溶液中に残るので、実施例VIIIで得られるタイターの増加は、沈殿による精製に起因する生成物の損失を顕著に減少させる。
Claims (19)
- オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドであって、配列番号3に示されるアミノ酸配列もしくは配列番号4のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列または配列番号3の配列と少なくとも45%以上の配列同一性を有するその変異体ポリペプチドを含むポリペプチド。
- (a)配列番号4に示される前記ヌクレオチド配列;
(b)配列番号4の逆相補鎖であるポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするヌクレオチド配列;
(c)配列番号4の前記ヌクレオチド配列と少なくとも66%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
(d)少なくとも約100ヌクレオチド長である、(a)または(b)で定義されるヌクレオチド配列のフラグメント;
(e)(a)、(b)、(c)、または(d)のいずれか1つに定義される配列に、遺伝子コードの結果として縮重した配列;
(f)(a)、(b)、(c)、(d)、または(e)に定義されるヌクレオチド配列の逆相補鎖であるヌクレオチド配列
を含むポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項2または3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
- 請求項2〜3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列または請求項4に記載の核酸構築物を挿入するベクター。
- 請求項1に記載のポリペプチド、請求項2もしくは3に記載のポリヌクレオチド、請求項4に記載の核酸構築物、または請求項5に記載のベクターを含む細胞。
- 前記細胞が、大腸菌属(Escherichia)、アナベーナ属(Anabaena)、コーロバクター属(Caulobacter)、グルコノバクター属(Gluconobacter)、ロドバクター属(Rhodobacter)、シュードモナス属(Pseudomonas)、パラコッカス属(Paracoccus)、バチルス属(Bacillus)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、リゾビウム属(Rhizobium)(シノリゾビウム属(Sinorhizobium))、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、クレブシェラ属(Klebsiella)、エンテロバクター属(Enterobacter)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、メチロバクテリウム属(Methylobacterium)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、もしくはストレプトミセス属(Streptomyces);またはB.スブチリス種(B.subtilis)、B.アミロリケファシエンス種(B.amyloliquefaciens)、B.リケニフォルミス種(B.licheniformis)、B.プンチス種(B.puntis)、B.メガテリウム種(B.megaterium)、B.ハロデュランス種(B.halodurans)、B.プミルス種(B.pumilus)、G.オキシダンス種(G.oxydans)、コーロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)CB15種、メチロバクテリウム・エキストロクエンス種(Methylobacterium extorquens)、ロドバクター・スフェロイデス種(Rhodobacter sphaeroides)、シュードモナス・プチダ種(Pseudomonas putida)、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス種(Paracoccus zeaxanthinifaciens)、パラコッカス・デニトリフィカンス種(Paracoccus denitrificans)、大腸菌種(E.coli)、C.グルタミクム種(C.glutamicum)、スタフィロコッカス・カルノーサス種(Staphylococcus carnosus)、ストレプトミセス・リビダンス種(Streptomyces lividans)、シノリゾビウム・メリオティ種(Sinorhizobium melioti)、およびリゾビウム・ラジオバクター種(Rhizobium radiobacter)の群から選択される細菌である、請求項6に記載の細胞。
- 前記細胞が、カンジダ属(Candida)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、クリベロミセス属(Kluyveromyces)、ピチア属(Pichia)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、もしくはヤロウイア属(Yarrowia);またはクリベロミセス・ラクチス種(Kluyveromyces lactis)、S.セルビシエ種(S.cerevisiae)、ハンゼヌラ・ポリモルファ種(Hansenula polymorpha)、ヤロウィア・リポリティカ種(Yarrowia lipolytica)、およびピチア・パストリス種(Pichia pastoris)からなる群からの酵母細胞、あるいはアスペルギルス属(Aspergillus)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)、ペニシリウム属(Penicillium)、タラロミセス属(Talaromyces)、もしくはトリコデルマ属(Trichoderma);または、アスペルギルス・ニガー種(Aspergillus niger)、アスペルギルス・アワモリ種(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フォエティダス種(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ソジェ種(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・フミガーツス種(Aspergillus fumigatus)、タラロミセス・エメルソニ種(Talaromyces emersonii)、アスペルギルス・オリゼ種(Aspergillus oryzae)、クリソスポリウム・ラクノウェンス種(Chrysosporium lucknowense)、トリコデルマ・リーゼイ種(Trichoderma reesei)、もしくはペニシリウム・クリゾゲヌム種(Penicillium chrysogenum)の群からの糸状菌細胞である、請求項6に記載の細胞。
- オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドを製造するための方法であって、前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、請求項6〜8のいずれか一項に記載の細胞を培養することと、場合によっては、発現されたポリペプチドを回収することとを含む方法。
- 請求項9に記載の方法によって得られるポリペプチド。
- 2,5−フランジカルボン酸(FDCA)を生成するための方法であって、オキシドレダクターゼ触媒および場合によっては1つまたは複数の補酵素の存在下でのオキシダントとの反応によって、FDCAの1つまたは複数のフラン前駆体がFDCAに変換され、前記オキシドレダクターゼ触媒が請求項1または請求項10に記載のポリペプチドを含む方法。
- FDCAの前記フラン前駆体が、5−ヒドロキシメチルフルフラール(HMF)、2,5−ジヒドロキシメチルフラン(HMFアルコール)、および5−ヒドロキシメチル−2−フランカルボン酸(HMF酸)からなる群から選択される群から選択され、好ましくは前記フラン前駆体がHMFである、請求項11に記載の方法。
- 前記前駆体がHMFであり、酸の存在下で加熱することにより1つまたは複数のヘキソース糖からHMFが得られ、好ましくは前記1つまたは複数のヘキソース糖がバイオマスから得られる、請求項15に記載の方法。
- 5−ハイドロキシメチル−2−フランカルボン酸(HMF酸)を生成するための方法であって、HMF酸の1つまたは複数のフラン前駆体が、オキシドレダクターゼ触媒および場合によっては1つまたは複数の補酵素補因子の存在下でのオキシダントとの反応によってHMF酸に変換され、前記オキシドレダクターゼ触媒が請求項1または請求項12に記載のポリペプチドを含む方法。
- HMF酸の前記フラン前駆体が、5−ヒドロキシメチルフルフラール(HMF)および2,5−ジヒドロキシメチルフラン(HMFアルコール)から選択される群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)および/またはピロロキノリンキノロン(PQQ)および/またはフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)である、請求項11または15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オキシドレダクターゼ触媒が、請求項6〜8のいずれか一項に記載の細胞の無細胞抽出物である、請求項11〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オキシドレダクターゼ触媒が、請求項6〜8のいずれか一項に記載の細胞である全細胞生体触媒である、請求項11〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数のモノマーからポリマーを生成するための方法であって、前記モノマーの1つが請求項18に記載のFDCAである方法。
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