CN102834386B - 具有氧化还原酶活性的多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有氧化还原酶活性的多肽或其变体多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：3中公开的氨基酸序列或SEQ ID NO：4的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述变体多肽与SEQ ID NO：3的序列具有45％或更高的序列同一性。本发明还涉及用于生产2，5‑呋喃二羧酸(FDCA)或生产5‑羟甲基‑2‑呋喃羧酸(HMF酸)的方法。

Description

具有氧化还原酶活性的多肽及其用途
技术领域
本发明涉及具有氧化还原酶活性的多肽和包含编码该多肽的基因的多核苷酸序列。本发明还涉及2，5-呋喃二羧酸(2，5-Furan-dicarboxylic acid，FDCA)的生产。本发明还包括适用于生产这些多肽的、用根据本发明的多核苷酸转化的细胞，所述细胞也可以被用于将羟甲基糠醛(HMF)生物转化成FDCA。
背景技术
2，5-呋喃二羧酸(FDCA)具有在聚酯如PET的生产中成为对苯二酸酯的基于生物的替代物的巨大潜能。因此和由于其他原因，FDCA在关于Top Value-Added Chemicals fromBiomass的DOE报告中被鉴定为前12种最优选化学品之一(Top Value-Added Chemicalsfrom Biomass，Volume I-Results of screening for potential Candidates fromSugars and Synthesis gas，Department of Energy(USA)，2004)。该化合物可通过5-羟甲基糠醛(HMF)的氧化获得，所述HMF可通过在酸条件下加热己糖来生产。DOE报告在第27页公开了FDCA的一些可能的应用。这些应用包括作为用于生产琥珀酸、2，5-双(氨甲基)-四氢呋喃、2，5-二羟甲基-四氢呋喃、2，5-二羟甲基呋喃和2，5-呋喃二甲醛的底物的作用。尽管通过C6糖的化学氧化脱水进行的FDCA生产和FDCA的用途是公知的并且设置了第26页表13中所指出的技术障碍，但是对生物转化—可能的酶促转化—而言，状况是未知的。
WO2009/023174中给出了用于酶促制备FDCA的方法。在所述公开中，用氯过氧化还原酶(chloroperoxidoreductase)氧化羟甲基糠醛物类，并且被过氧化氢氧化的产物在羟甲基糠醛(特别是甲酰呋喃羧酸或FFCA)的C1位置处具有羧酸基团。结果例如展示于图1中。在另一实施方案中，HMF在存在氧化底物时与氧化还原酶接触，从而将HMF氧化成至少二甲酰基呋喃或甲酰基呋喃羧酸之一。
WO2009/023174中已知的方法的缺点在于，反应需要过氧化氢，并且形成的产物是FDCA与两种污染性副产物羟甲基呋喃羧酸(HmFCA)和甲酰基呋喃羧酸(FFCA)的混合物。因此，从HMF到FDCA的产率被降低，并且需要额外的回收步骤获得基本纯化形式的FDCA。
在数据库EBI，Uniprot B2T4R9中鉴定了一个577个氨基酸的序列，所述序列由作为“Burkholderia phytofirmans PsJN的染色体1的完整序列”中葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶的同源性推断而来。
在数据库EBI，Uniprot B2JSZ0中鉴定了一个576个氨基酸的序列，所述序列由作为“Burkholderia phymatum STM815的质粒1的完整序列”中葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶的同源性推断而来。
在Deurzen，M.P.J.et al，J.Carbohydrate Chemistry 16(3)，299-309(1997)中公开了氯过氧化物酶-催化的5-羟甲基糠醛的氧化。所述反应以针对呋喃-2，5-二甲醛(furan-2，5-dicarboxaldehyde，FDC)60-74％的选择性进行。副产物是5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HFCA)和5-甲酰基呋喃-2-羧酸(FFCA)。
发明内容
本发明的一个目的是提供能够使用分子氧进行氧化还原反应的氧化还原酶。另一个目的是提供具有广阔反应谱的氧化还原酶。另一个目的是提供具有高区域特异性(regiospecificity)的氧化还原酶。本发明的另一个目的是提供用于生产FDCA的方法，其中可以避免大量的副产物。本发明的另一个目的是提供用于生产5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMF酸)的方法，其中能够避免大量副产物。一个或多个这些目的根据本发明被实现。
本发明提供了编码具有氧化还原酶活性的多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸典型地编码具有氧化还原酶活性、特别是HmfH氧化还原酶活性的多肽。
因此，根据本发明提供了具有氧化还原酶活性的多肽或其变体多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：3中公开的氨基酸序列或由SEQ ID NO：4的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述变体多肽与SEQ ID NO：3的序列具有45％或更多的序列同一性。
这些氧化还原酶多肽提供了生产有附加价值的化合物FDCA的化学氧化途径的酶促替代方式，允许温和的反应条件(30℃，pH 7)并生产更少的废物。所述氧化还原酶是真正的氧化酶(true oxidase)，即氧化反应仅需要分子氧，省略了用于再生昂贵的辅因子的需求。所述酶提供广泛的反应特异性和区域特异性，将醇和醛基团均最终氧化成羧酸，而无论这些基团位于呋喃主链的C2或C5位。
根据本发明还提供了并入本发明多核苷酸序列的载体，例如表达载体，和包含根据本发明的多肽、多核苷酸或载体的细胞。
本发明还提供了用于制备具有氧化还原酶活性的多肽的方法和能够通过所述方法获得的多肽，所述方法包括在允许所述多肽表达的条件下培养本发明的细胞，并任选地回收所表达的多肽。
本发明的另一个实施方案涉及使用强效的全细胞生物催化剂由富含(富集)果糖的进料流生产FDCA的集成方法。
附图说明
图1：由HmfH氧化还原酶催化的氧化的反应流程。
图2：HmfH表达载体pJT’hmfH的质粒图谱。Ptac’，tac启动子；rep，编码pRO1600复制蛋白的基因；gmR，庆大霉素抗性基因；bla，β-内酰胺酶；pRO1600-ori，P.putida的复制起点；pUC ori，E.coli的复制起点。
图3：被鉴定为潜在的糠醛和/或HMF利用者的C.basilensis HMF14(A)和其他物种(B)中糠醛和HMF代谢基因的遗传构成的图示。
图4：在P.putida S12 pJT’hmfH的粗制细胞提取物中由HMF形成FDCA、HMF-醇(H-oh)和HMF-酸(H-酸)。
图5：在P.putida_pJT’hmfH的分批进料培养物中形成HMF酸和FDCA。左侧的箭头指出HMF进料的起点；右侧箭头指出对进料添加甘油。
图6.在P.putida_pJT’hmfH的分批进料培养物中形成HMF和FDCA。箭头指出合并的HMF和甘油进料的起点。
图7a：实施例VIII的分批进料发酵中，HMF酸、FDCA和生物质的浓度。7b：实施例VIII的分批进料发酵中甘油和HMF的进料速率。序列表概述
SEQ ID NO：1公开了引物FN23的DNA序列：5’-CGGAATTCCACATGACAAGGGGAGACCG-3’。加有下划线的序列指出EcoRI限制性位点；
SEQ ID NO：2公开了引物FN24的DNA序列；5’-CGGAATTCGCTTCGGTCTTCAACTCGGATG-3’。加有下划线的序列指出EcoRI限制性位点；
SEQ ID NO：3公开了HmfH的氨基酸序列；
SEQ ID NO：4公开了hmfH的编码序列。
发明详述
在本说明书和附带的权利要求书中，词语“包含”和“包括”及其变体如“包含”(″comprises″，″comprising″)、“包括”(″includes″and″including″)应被解释为开放式的。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在传达可能包括未明确指出的其它元素或整体。
冠词“一个”(“a”和“an”)在本文中被用于表示一个或多于一个(即一个或至少一个)所述冠词的语法客体。例如，“一个元件”可表示一个元件或多于一个元件。
广泛的反应谱在本文中表示氧化还原酶能够作为催化剂作用于许多不同的底物，例如HMF、HMF酸、HMF醇、糠醛、糠醇。区域特异性表示其仅氧化特定的C-原子。
氧化还原酶多肽
根据本发明的具有氧化还原酶活性的多肽包含SEQ ID NO：3中公开的氨基酸序列或SEQ ID NO：4的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或其与SEQ ID NO：3中公开的序列具有至少45％的序列同一性的多肽变体。
在一个实施方案中，变体核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO：4中所示核苷酸序列至少66％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更同源的基本同源的核苷酸序列。在另一实施方案中，变体蛋白质包含与SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更同源的基本同源的氨基酸序列。
本发明的一个实施方案是包括以下的多核苷酸：(a)SEQ ID NO：4中公开的核苷酸序列；(b)与属于SEQ ID NO：4的反向互补体的多核苷酸选择性杂交的核苷酸序列；(c)与SEQ ID NO：4的核苷酸序列具有至少66％或更大序列同一性的核苷酸序列；(d)如(a)、(b)或(c)中定义的核苷酸序列的片段，所述片段长度为至少约100个核苷酸；(e)由于遗传密码子而成为(a)、(b)、(c)或(d)任一中定义的序列的简并物的序列；(f)属于(a)、(b)、(c)、(d)或(e)中定义的核苷酸序列的反向互补体或编码多肽的核苷酸序列；还涉及相关多肽。
一个实施方案是包含多核苷酸的核酸构建体，其中GC含量可以是56％或更高，58％或更高，或58-65％。另一个实施方案是并入多核苷酸序列或核酸构建体的载体。
术语“同源性”、“序列同一性”等等在本文可互换使用。就本发明的目的而言，在本文中定义为了测定两条氨基酸序列或两条核酸序列共享的序列同一性程度，就最适比较的目的排列所述序列(例如为了与第二氨基酸或核酸序列最适比对，可以向第一氨基酸或核酸序列的序列中引入缺口)。这类排列可以在被比较的序列的全长上进行。或者，排列可在更短的长度上进行，例如在约20个、约50个、约100或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行。
然后比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一条序列中的一个位置被与第二序列中相应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置上是相同的。序列之间共享的同一性程度典型地被表述为所述两条序列之间的同一性百分比，并且是所述序列共享的相同位置数的函数(即％同一性＝相同位置数/位置总数(即重叠位置)x100)。优选地，被比较的两条序列具有相同或基本相同的长度。
技术人员应当明白下述事实：可获得若干种不同的计算机程序以测定两条序列之间的同源性。例如，可以使用数学算法完成两个序列之间的同一性百分比测定和序列比较。在一个优选的实施方案中，使用Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重测定两条氨基酸序列之间的同一性百分比，所述算法已经被整合进GCG软件包内的GAP程序中(可得自http://www.accelrys.com/products/gcg/)。技术人员应当知道：这些不同的参数会产生轻微差异的结果，但是使用不同的算法时两条序列的整体同一性百分比不会被显著改变。
在另一实施方案中，使用Accelrys GCG软件包(可得自http:// www.accelrys.com/products/gcg/)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重测定两条核苷酸序列之间的同一性百分比。在另一实施方案中，使用E.Meyers and W.Miller算法(CABIOS，4：11-17(1989))，使用PAM120权重残表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分测定两条氨基酸或核苷酸序列的同一性百分比，所述算法已被整合进ALIGN程序(2.0版)中(可得自http://vega.igh.cnrs.fr/bin/ align-guess.cgi)。
本发明的核酸和蛋白质序列还可以被用作“查询序列”，针对公开数据库进行搜索，以例如鉴定其它家族成员或相关序列。这类搜索可以使用Altschul，et al.(1990)J.MoI.Biol.215：403-10的BLASTN、BLASTP和BLASTx程序(2.0版)进行。可以使用BLASTN程序(评分＝100，词长＝12)在核苷酸数据库中进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的氧化还原酶核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTx程序(评分＝50，词长＝3)进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的氧化还原酶蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了就比较的目的获得带有缺口的比对，可以利用如Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述的Gapped BLAST。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如BLASTx和BLASTn)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上的NationalCenter for Biotechnology Information主页。
在本文中使用时，术语“选择性杂交”(″selectively hybridizing″、“hybridizesselectively”)和类似的术语旨在描述用于杂交和洗涤的下述条件，在所述条件下彼此至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、更优选地至少85％、进一步更优选地至少90％、优选地至少95％、更优选地至少98％或更优选地至少99％彼此同源的核苷酸序列典型地保持为彼此杂交。也就是说，这类杂交序列可共享至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、更优选地至少85％、进一步更优选地至少90％、更优选地至少95％、更优选地至少98％或更优选地至少99％的序列同一性。
这类杂交条件的一个优选的非限制性例子是：于约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后于约50℃、优选地约55℃、优选地约60℃和进一步更优选地约65℃下，在1X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。
高度严格条件包括例如于约68℃下在5x SSC/5x Denhardt′s溶液/1.0％SDS中杂交并于室温下在0.2x SSC/0.1％SDS中洗涤。或者，洗涤可以在42℃进行。
技术人员应当知道对于严格和高度严格的杂交条件而言应用何种条件。涉及这类条件的其它指示在该领域能够容易地获得，例如在Sambrook et al.，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；和Ausubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley & Sons，N.Y.)中。
当然，仅与多聚A序列(例如mRNA的3’末端多聚(A)束)或互补的T(或U)序列段杂交的多核苷酸不应被包括在被用于与本发明的核酸部分特异杂交的本发明多核苷酸内，因为这类多核苷酸会与含有多聚(A)序列段或其互补体的任何核酸分子(例如实际上任何双链的cDNA克隆)杂交。
可以以一种典型的途径，来筛选从其它生物(例如细菌，特别是来自Trichomaceae科、例如来自Burkholderia属的微生物，例如Burkholderia phytofirmans)构建的基因文库。
例如，可以通过Southern印迹分析，针对同源的氧化还原酶多核苷酸筛选Burkholderia菌株。检测到根据本发明的同源DNA限制性片段后，可以利用本领域技术人员公知的标准技术，由来自适当菌株的具有相同大小的染色体片段构建基因文库。或者，如果微生物是真核生物，则可以通过Northern杂交鉴定氧化还原酶HmfH的mRNA转录本，并且在鉴定转录本后，可以使用分离自真核微生物的总RNA制备cDNA文库。
可以例如通过进行PCR来分离同源的基因序列，所述PCR使用以本文所述核苷酸序列为基础设计的两个简并寡核苷酸引物池。
用于反应的模板可以是来自已知或怀疑表达本发明多核苷酸的菌株的总染色体DNA。可以对PCR产物进行亚克隆和测序，以确保被扩增的序列代表了新的氧化还原酶核酸序列的序列或其功能等同物。
或者，用于反应的模板可以是通过反转录mRNA获得的cDNA，所述mRNA从已知或怀疑表达本发明多核苷酸的菌株中制备。可以对PCR产物进行亚克隆和测序，以确保被扩增的序列代表了新的氧化还原酶核酸序列的序列或其功能等同物。
然后可以通过多种已知方法，使用PCR片段来分离全长cDNA克隆。例如，被扩增的片段可以被标记，并用于筛选噬菌体或粘粒cDNA文库。或者，被标记的片段可以被用于筛选基因组文库。
也可以用PCR技术来从其它生物中分离全长cDNA序列。例如，可以根据标准步骤从合适的细胞或组织来源中分离RNA。可以使用对被扩增片段最5’端而言特异性的寡核苷酸引物，引导第一链合成，针对RNA进行反转录反应。
然后可以使用标准的末端转移酶反应将得到的RNA/DNA杂交体“加尾”(例如用鸟嘌呤)，可以用RNase H消化所述杂交体，然后(例如用多聚-C引物)引物引导第二链合成。因此，被扩增片段上游的cDNA序列可以容易地被分离。有用的克隆策略的综述，参阅例如上文Sambrook et al.；和上文的Ausubel et al.。
本发明的另一方面涉及包含编码氧化还原酶蛋白质或其功能性等同物的本发明多核苷酸的载体，包括克隆和表达载体，还涉及在例如本发明多肽发生表达的条件下，在合适的宿主细胞中培养、转化或转染这类载体的方法。本文使用的术语“载体”指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。
本发明的多核苷酸可以被掺入重组的可复制载体中，例如克隆或表达载体中。载体可被用于在相容的宿主细胞中复制核酸。因此在另一实施方案中，本发明提供了如下制造本发明多核苷酸的方法：将本发明的多核苷酸引入可复制载体中，将所述载体引入相容的宿主细胞中，并在使得所述载体复制的条件下培养所述宿主细胞。载体可以从宿主细胞中被回收。合适的宿主细胞在下文讨论。
其中插入本发明表达盒或多核苷酸的载体可以是能够便利地进行重组DNA操作的任何载体，并且所述载体的选择通常应取决于要引入它的宿主细胞。
根据本发明的载体可以是自主复制载体，即显示为染色体外实体的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒。或者载体可以是被引入宿主细胞中后被整合进宿主细胞基因组中，并与整合了它的染色体一起复制的载体。
一种类型的载体是“质粒”，质粒是指其中可以连接其它DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中其它DNA区段可以被连接进病毒基因组中。某些载体在它们被引入的宿主细胞中能够自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加体哺乳动物载体)在引入宿主细胞时被整合进宿主细胞的基因组中，从而随宿主细胞的基因组一起被复制。另外，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这类载体在本文中被称作“表达载体”。一般而言，重组DNA技术中使用的表达载体通常是以质粒的形式存在的。术语“质粒”和“载体”在本文中可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括这类表达载体的起等同作用的其它形式，如粘粒、病毒载体(例如复制缺陷反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)和噬菌体载体。
根据本发明的载体可以体外使用，例如用于生产RNA或用于转染或转化宿主细胞。
本发明的载体可包含两种或更多，例如三种、四种或五种本发明的多核苷酸，例如用于过表达。
本发明的重组表达载体以适合核酸在宿主细胞中表达的形式包含本发明的核酸，这意味着重组表达载体含有一个或多个与待表达的核酸序列可操作地连接的调节序列，以要用于表达的宿主细胞为基础选择所述调节序列。
在载体例如表达载体中，“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译体系中或当载体被引入宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式连接，即术语“可操作地连接”是指一种连接，其中所述组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。与编码序列“可操作地连接”的调节序列如启动子、增强子或其它表达调节信号以下述方式放置：在与所述控制序列相容的条件下实现所述编码序列的表达；或者所述调节序列被布置为使得它们与其预期目的一致地发挥功能，例如转录在启动子处开始并通过编码多肽的DNA序列继续。
术语“调节序列”或“控制序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。此类调节序列描述于例如Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中。
术语调节或控制序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的那些序列，或仅在某宿主细胞中指导核苷酸序列表达的那些序列(例如组织特异性调节序列)。
针对指定宿主细胞的载体或表达构建体因此可包含以下元件，所述元件以相对于编码第一发明的多肽的序列的编码链从5’-端到3’-端的连续顺序彼此可操作地连接：(i)能够在给定的宿主细胞中指导编码多肽的核苷酸序列转录的启动子序列；(2)任选地，能够指导多肽从给定的宿主细胞分泌进培养基中的信号序列；(3)本发明的DNA序列，其编码成熟和优选地活性形式的、具有纤维二糖水解酶活性的多肽；和优选地还有(4)能够终止编码多肽的核苷酸序列下游转录的转录终止区(终止子)。
根据本发明的核苷酸序列的下游可以是含有一个或多个转录终止位点(例如终止子)的3’非翻译区。终止子的起点较不关键。终止子可以例如对编码多肽的DNA序列而言是天然的。然而，优选地在酵母宿主细胞中使用酵母终止子并在丝状真菌宿主细胞中使用丝状真菌终止子。更优选地，终止子对宿主细胞(其中要表达编码多肽的核苷酸序列)而言是内源的。在被转录的区域中，可存在用于翻译的核糖体结合位点。构建体所表达的成熟转录本的编码部分应当包括位于要翻译的多肽起点处的翻译起始AUG和适当地位于结尾处的终止密码子。
本发明多核苷酸的增强的表达也可以通过对异源调节区(例如启动子、分泌前导肽和/或终止子区)的选择来实现，所述异源调节区可发挥以下作用：提高表达宿主对感兴趣的蛋白质的表达水平和需要时的分泌水平，和/或提供本发明多肽表达的诱导型控制。
本领域技术人员应当知道：对表达载体的设计可以以下述因素为基础，如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等。本发明的载体(例如表达载体)可以被引入宿主细胞中，从而生产由本文所述的核酸编码的蛋白质或肽(例如氧化还原酶蛋白质、氧化还原酶蛋白质的突变体形式，其片段、变体或功能等同物、融合蛋白等)。
本发明的载体(例如重组表达载体)可以被设计为用于在原核细胞和真核细胞中表达氧化还原酶蛋白质。例如，氧化还原酶蛋白质可以在细菌细胞如E.coli、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、丝状真菌、酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，CA(1990)中进一步讨论。适当宿主的代表性例子在下文中描述。
用于上述宿主细胞的适当培养基和条件是本领域已知的。
如上文所公开的，术语“控制序列”或“调节序列”在本文中被定义为至少包括对多肽表达而言必需和/或有利地任何组件。任何控制序列对于编码多肽的本发明核酸序列而言可以是天然的或外源的。此类控制序列可包括但不限于启动子、前导序列、最适翻译起始序列(如Kozak，1991，J.Biol.Chem.266：19867-19870中所述)、分泌信号序列、原-肽序列、多聚腺苷酸化序列、转录终止子。控制序列至少典型地包括启动子、转录和翻译终止信号。
稳定转化的微生物是下述微生物：其中引入了一种或多种DNA片段，使得被引入的分子在生长的培养物中被保持、复制并分离。稳定转化可归因于多个或单一的染色体整合，或通过染色体外元件例如质粒载体来实现。质粒载体能够指导具体DNA片段所编码的多肽的表达。
表达可以是组成型的，或由诱导型(或阻抑型)启动子调节，所述启动子值得能够高水平地转录编码特定多肽的与功能相关的DNA片段。
氧化还原酶的分离
氧化还原酶或表达氧化还原酶的DNA材料可从生物中分离，优选地从表达氧化还原酶的微生物中分离。优选地，所述微生物能够使用HMF，但是这不是必需的。微生物优选地选自由如下组成的组：Cupriavidus、Burkholderia、Bradyhrizobium、Methylobacterium；Cupriavidus basisliensis、Burkholderia phytofirmans、Bradyhrizobium japonicum、Methylobacterium radiotolerans、Cupriavidus basisliensis HMF14、Burkholderiaphytofirmans PsJN、Bradyhrizobium japonicum USDA110、Methylobacteriumradiotolerans JCM2831。
本发明中有用的最优选的氧化还原酶使用HMF，并且是分离自本文中Cupriavidusbasilensis HMF14的氧化还原酶，所述Cupriavidus basilensis HMF14根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约被保藏于DSMZ：Cupriavidus basilensis HMF14＝DSM 22875，保藏日2009年8月19日，保藏人TNO，Schoemakerstraat 97，2628VK Delft，荷兰。
因此我们分离了利用HMF的细菌Cupriavidus basilensis菌株HMF14，并鉴定了涉及HMF降解途径的基因。所述基因之一(在本文中被定义为hmfH)编码了579个氨基酸、62kDa的FAD-依赖型氧化还原酶，发现所述酶氧化糠醇、糠醛、HMF和5-羟甲基-糠酸。这些分子中C2和C5上的醇/醛基团被氧化，而不需要额外的编码还原酶的核酸构建体，尽管此类活性的存在可以是有利的(见图1)。
本发明因此提供了编码下述多肽的多核苷酸，所述多肽例如是具有氧化还原酶(EC 1.1+EC 1.2活性)活性的酶。酶在本文中是多肽的子类。
氧化反应
氧化反应在本文中是存在本发明的氧化还原酶和一种或多种辅酶(下文讨论)时氧化剂与呋喃化合物的一种或多种反应。氧化反应可包含得到产物的一个氧化反应步骤(例如HMF-酸成为FDCA的氧化)。或者其可包含多于一个反应步骤，每个步骤得到一种中间产物，其中最后的中间产物是终产物(例如HMF氧化成FDCA)。氧化反应的例子在图1中给出。
一种氧化反应是2，5-呋喃二羧酸(FDCA)的生产，其中FDCA的一种或多种前体在存在氧化还原酶催化剂和一种或多种辅酶时通过与氧化剂反应，转化成FDCA，其中所述氧化还原酶催化剂包括根据本发明的多肽。FDCA的呋喃前体可选自由5-羟甲基糠醛(HMF)、2，5-二羟甲基呋喃(HMF醇)和5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMF酸)组成的组，优选地呋喃前体是HMF。HMF可以常规方式，通过在存在酸时加热一种或多种己糖得到。己糖可得自生物质。氧化反应也可以是用于生产5-羟甲基-2-呋喃羧酸(HMF酸)的方法，其中HMF酸的一种或多种呋喃前体通过在存在氧化还原酶催化剂和一种或多种辅酶时与氧化剂反应，转化成HMF酸，其中所述氧化还原酶催化剂包括本发明的多肽。在一个实施方案中，HMF酸的呋喃前体选自5-羟甲基糠醛(HMF)和2，5-二羟甲基呋喃(HMF醇)的组。其他氧化方法是可能的。
氧化反应优选地在相对温和的温度即10-80℃下进行，更优选地20-45℃下，最优选地25-40℃左右。反应期间的pH优选地为pH 3到8，更优选地在pH 7左右。使用大气氧或纯氧的反应时间为6-18小时，优选地所述酶在更长的时间里有反应性。
反应器可以是任何合适的(充气)生物反应器。其可以分批、连续或优选地以分批进料的方式操作。
可以通过冷却/再结晶并分离结晶的氧化产物(例如结晶的FDCA)，从反应混合物中回收氧化产物例如FDCA、HMF酸等等。然而，其他回收方法是合适的，例如但不限于酸沉淀和溶剂萃取，如本领域所已知的。
任选地，反应在存在辅酶时发生。辅酶可以是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和/或黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和/或吡咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinolone，PQQ)。在本发明的氧化反应中发现与脱氢酶活性的协同效应，例如在下述细胞中发现内源脱氢活性，氧化反应发生在或存在于所述细胞的细胞提取物中。用于由一种或多种单体生产聚合物的方法，其中单体之一是FDCA。
氧化剂
根据本发明的反应期间的氧化剂可以是任何氧化剂，优选地是氧。氧的最经济的来源是空气。这是有利的，因为空气容易地以零成本得自大气，无毒，并且在反应后无需去除。或者可使用分子氧释放系统。氧生成系统原则上可以选自本领域已公开的各种氧生成系统。例如，可以使用反应混合物中已存在的过氧化氢酶，由过氧化氢产生氧。
呋喃化合物
呋喃化合物在本文中被理解为具有呋喃基团的任何化合物，其可以被氧化成2，5-呋喃二羧酸或其前体。优选的呋喃化合物包括羟甲基糠醛(HMF)、羟甲基呋喃羧酸(HMF酸)、2，5-二羟甲基呋喃(HMF醇)。呋喃环或其任何可取代的侧基可以在呋喃环中任何可用的位置上被例如OH、C1-C10烷基、烷基、芳基或RO-醚部分，包括环状基团取代。
氧化还原酶的表达
不管用于表达酶的精确机制如何，可以想到通过本领域已知的方法将编码这些酶的基因引入另一宿主细胞中来转移此类表达。在本文中定义的遗传元件包括具有针对产物的可表达编码序列的核酸(通常为DNA或RNA)，所述产物例如为蛋白质，尤其是酶，脱辅蛋白质或反义RNA(其表达或调控相关酶的表达)。被表达的蛋白质可发挥酶的作用，阻抑或去阻抑酶活性或控制酶的表达。编码这些可表达序列的重组DNA可以是染色体的(通过例如同源重组整合进宿主细胞染色体中)或染色体外的(例如由一种或多种质粒、粘粒或能够自我复制的其他载体载有)。应当理解，用于转化根据本发明的宿主细胞的重组DNA除了结构基因和转录因子以外，还可包含表达控制序列，包括启动子、阻抑子和增强子，它们发挥控制针对蛋白质、脱辅蛋白质或反义RNA的编码序列的表达或去阻抑的作用。例如，此类控制序列可以被插入野生型宿主细胞中，以促进宿主细胞基因组中已经编码的选定酶的过表达，或者它们可以被用于控制染色体外编码的酶的合成。
可以通过任何手段将重组的DNA引入宿主细胞中，所述手段包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、酵母人工染色体或介导遗传元件转移进宿主细胞中的其他载体。这些载体可包含复制起点，连同控制载体复制的顺式作用控制元件以及载体所载有的遗传元件。可选择标记物可存在于载体上，以帮助鉴定其中已引入遗传元件的宿主细胞。
用于将遗传元件引入宿主细胞中的手段(例如克隆)是技术人员公知的。可以利用染色体外多拷贝质粒载体来插入根据本发明的遗传元件。将质粒承载的遗传元件引入宿主细胞涉及最初用限制性酶切割质粒载体，之后连接质粒和编码根据本发明的目标酶物类的遗传元件。将连接的重组质粒再环化之后，利用感染(例如包装在噬菌体λ中)或质粒转移的其他机制(例如电穿孔、显微注射等等)将质粒转移进宿主细胞中。适合将遗传元件插入宿主细胞中的质粒是技术人员公知的。
其他基因克隆方法包括但不限于将遗传材料直接整合进染色体中。这可以通过多种手段来实现，包括在侧翼是宿主染色体的同源DNA序列的非复制型质粒上克隆本文所述的遗传元件；将所述重组质粒转化进宿主后，可以通过DNA重组将遗传元件引入染色体中。如果整合型DNA片段含有可选择标记物例如抗生素抗性，则能够回收此类重组菌株。或者，可以将遗传元件直接引入宿主细胞的染色体中，而不使用非复制型质粒。这可以通过合成生产根据本发明的遗传元件的DNA片段来实现，所述DNA片段也含有宿主染色体的同源DNA序列。此外，如果这些合成的DNA片段也含有可选择标记物，则遗传元件可以被插入宿主染色体中。
宿主细胞
本发明的另一实施方案是包含根据本发明的多肽、多核苷酸、核酸构建体或载体的细胞。宿主细胞是其中可以合适地表达多肽、多核苷酸、核酸构建体或载体的细胞。
氧化还原酶可以在宿主细胞中有利地表达。根据本发明的宿主细胞可以是任何宿主细胞。细胞可以是原核细胞、真核细胞、植物细胞或动物细胞。在此类细胞中，一个或多个基因可以被缺失、敲除或完全或部分打断，其中任选地一个或多个基因编码蛋白酶。根据一个实施方案，根据本发明的宿主细胞是真核宿主细胞。优选地，真核细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或藻类细胞。优选的哺乳动物细胞包括，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、293细胞、PerC6细胞和杂交瘤。优选的昆虫细胞包括例如Sf9和Sf12细胞及其衍生物。更优选地，真核细胞是真菌细胞，即酵母细胞，例如Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces或Yarrowia菌株。更优选地来自Kluyveromyces lactis、S.cerevisiae、Hansenula polymorpha、Yarrowialipolytica和Pichia pastoris，或丝状真菌细胞。最优选地，真核细胞是丝状真菌细胞。
“丝状真菌”包括(如Hawksworth et al.，In，Ainsworth and Bisby′sDictionary of The Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定义的)Eumycota和Oomycota亚门的所有丝状形式。丝状真菌的特征是由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成的菌丝壁。营养生长通过菌丝伸长进行，并且碳代谢是专性需氧的。丝状真菌菌株包括但不限于Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium和Trichoderma的菌株。
优选的丝状真菌细胞属于Aspergillus、Chrysosporium、Penicillium、Talaromyces或Trichoderma属的种，最优选地属于Aspergillus niger、Aspergillusawamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、Aspergillus fumigatus、Talaromyces emersonii、Aspergillus oryzae、Chrysosporium lucknowense、Trichoderma reesei或Penicillium chrysogenum的种。当根据本发明的宿主细胞是Aspergillus宿主细胞时，宿主细胞优选地是CBS513.88、CBS124.903或其衍生物。
根据另一个实施方案，根据本发明的宿主细胞是原核细胞。优选地，原核宿主细胞是细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物。合适的细菌可选自例如Escherichia、Anabaena、Caulobacter、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Rhizobium(Sinorhizobium)、Flavobacterium、Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Methylobacterium、Staphylococcus或Streptomyces。优选地，细菌细胞选自由以下组成的组：B.subtilis、B.amyloliquefaciens、B.licheniformis、B.puntis、B.megaterium、B.halodurans、B.pumilus、Gluconobacter oxydans、Caulobacter crescentus CB 15、Methylobacterium extorquens、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonaszeaxanthinifaciens、Pseudomonas putida、Pseudomonas putida S12、Paracoccusdenitrificans、E.coli、C.glutamicum、Staphylococcus carnosus、Streptomyceslividans、Sinorhizobium melioti和Rhizobium radiobacter。
丝状真菌的若干菌株是公众能够容易地从大量培养物保藏机构例如AmericanType Culture Collection(ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)和Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern RegionalResearch Center(NRRL)获得的：例如菌株Aspergillus niger CBS 513.88、Aspergillusoryzae ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892，P.chrysogenum CBS 455.95，Penicillium citrinum ATCC 38065，Penicillium chrysogenum P2，Talaromyces emersonii CBS 124.902，Acremoniumchrysogenum ATCC 36225或ATCC 48272，Trichoderma reesei ATCC 26921或ATCC 56765或ATCC 26921，Aspergillus sojae ATCC11906，Chrysosporium lucknowense ATCC44006。也可以使用其衍生物。
根据另一个实施方案，根据本发明的宿主细胞是原核细胞。优选地，原核宿主细胞是细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物。合适的细菌可选自例如Escherichia、Anabaena、Caulobacter、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Rhizobium(Sinorhizobium)、Flavobacterium、Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Methylobacterium、Staphylococcus或Streptomyces。优选地，细菌细胞选自由以下组成的组：B.subtilis、B.amyloliquifaciens、B.licheniformis、B.puntis、B.megaterium、B.halodurans、B.pumilus、G.oxydans、Caulobacter crescentus CB 15、Methylobacterium extorquens、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonas putida、Paracoccus zeaxanthinifaciens、Paracoccus denitrificans、E.coli、C.glutamicum、Staphylococcus carnosus、Streptomyces lividans、Sinorhizobium melioti和Rhizobium radiobacter。
对根据本发明的宿主细胞中生产的化合物的特定用途而言，宿主细胞的选择可以根据此类用途来进行。例如要在食品应用中使用根据本发明的宿主细胞中生产的化合物时，宿主细胞可选自食品级生物例如Saccharomyces cerevisiae。特定的用途包括但不限于，食品、(动物)饲料、药物、农业例如作物保护，和/或个人护理应用。
本发明还涉及用于制备具有氧化还原酶活性的多肽的方法和通过所述方法可获得的多肽，所述方法包括在允许所述多肽表达的条件下培养根据本发明的细胞，并任选地回收所表达的多肽。
原料
天然富含果聚糖(fructan)的农作物(例如洋姜(topinambur)或菊苣根(chicoryroots))可以通过常规(组合的)水解和热化学加工被转化成富含HMF的原料。由果糖产生HMF的技术是被广泛接受并且强效的。也可以利用富含葡萄糖的原料，但是HMF的热化学形成使用果糖时进行得更加高效。因此，可以包括额外的酶促步骤，使用葡萄糖异构酶将葡萄糖转化成果糖。后一过程在由水解淀粉生产高果糖玉米糖浆(HFCS)的食品工业中是被广泛接受的。为了避免与食品应用竞争，木质纤维素水解产物会是用于生产HMF/FDCA的优选的原料。
生物转化
为了将HMF生物转化成FDCA，使用表达前文所述的Cupriavidus basilensis HMF氧化还原酶的强效全细胞生物催化剂(游离细胞或固定的细胞)。在所述方法中全细胞生物催化剂具有由于酶催化剂的若干优点：HMF氧化还原酶被保护免受高度反应性底物的化学失活，并且宿主原生的脱氢酶能够在由HMF产生(可能的)相应一元酸的最初两个氧化步骤中帮助HMF氧化还原酶，所述一元酸随后被HmfH转化成二酸。优选地，可能需要额外的手段来确保辅因子再生。全细胞生物催化剂应当允许HMF进料流的最小加工，即优选地耐受低pH、高T和原料水解/热化学转化中产生的有毒化合物(其中有底物)。考虑到对多种化学应激源(stressor)的耐受、相对较宽的pH范围和原生脱氢酶的存在，Pseudomonas putidaS12可以满足合适宿主生物的资格，所述原生脱氢酶帮助HMF氧化还原酶导致更高效的HMF到FDCA的生物转化。
作为全细胞生物催化剂的替代方式，可以通过与全细胞生物催化剂相似的方式单独或作为酶混合物使用细胞裂解物、经纯化的酶、或经固定的酶。
产物和生物质回收
生物转化后，可以通过公认的方法将细胞从发酵液中分离并再使用。可以通过酸沉淀从无细胞发酵液中回收FDCA，并在提高的温度下重溶于合适的有机溶剂中。溶解后可以通过酸沉淀和溶剂萃取或本领域已知的其他纯化方法，以二酸形式以高纯度回收FDCA，如果需要的话。
FDCA的用途
FDCA可在聚酯的生产中被用作对苯二酸酯的替代物。其也可以被用作大量不同有价值化合物的底物。例如其是用于生产琥珀酸、2，5-双(氨甲基)-四氢呋喃、2，5-二羟甲基-四氢呋喃、2，5-二羟甲基呋喃和2，5-呋喃二甲醛的已知底物。FDCA可用于涂层例如醇酸树脂和热塑性涂层的生产。其也可被用作生物燃料中的二甲苯等同物或用作溶剂。
FDCA可以被酯化，所述酯可被用作增塑剂。其可以被转化成其二醇，所述二醇可被用于类PET聚酯和聚氨酯中。另外，其可以被转化成其二胺，所述二胺可以被用作扩链剂，并且所述二胺可以被转化成二异氰酸酯，所述二异氰酸酯可用于聚氨酯的生产。通过根据本发明的方法，可通过生物转化，由生物质(包括木质纤维素生物质)通过生物转化制备FDCA和由FDCA制备的产品。
实施例
一般方法
菌株和质粒 于2009年8月19日保藏于DSMZ的Cupriavidus basilensis HMF 14：Cupriavidus basilensis HMF14＝DSM 22875是能够使用呋喃作为唯一碳源的土壤分离物。使用Pseudomonas putida S12(ATCC 700801)作为用于表达HMF氧化还原酶的宿主。使用Escherichia coli DH5α(Invitrogen)用于一般克隆的目的。使用源自pUCP22的E.coli-P.putida穿梭质粒pJT’mcs(未公开)，用于在组成型tac启动子的控制下表达HMF氧化还原酶。为了在E.coli中复制，使用pUC复制起点；为了在P.putida中复制，使用pRO1600复制起点。hmfH基因的表达由组成型tac启动子驱动。使用β-内酰胺酶标记物基因(bla)在E.coli中进行抗生素选择(氨苄西林抗性)。为了在P.putida中进行抗生素选择，使用庆大霉素乙酰基转移酶标记物基因(gmR)。
图2中给出了HmfH表达载体pJT’hmfH的质粒图谱。Ptac’，tac启动子；rep，宽泛宿主范围的复制起点；gmR，庆大霉素抗性基因；bla，β-内酰胺酶；pUC ori，针对E.coli的复制起点。
培养基和培养条件 使用矿物盐培养基(MM)作为定义的培养基，MM(每升去矿物质水)含有以下：3.88g的K2HPO4，1.63g的NaH2PO4，2.0g的(NH4)2SO4，0.1g的MgCl2·6H2O，10mg的EDTA，2mg的ZnSO4·7H2O，1mg的CaCl2·2H2O，5mg的FeSO4·7H2O，0.2mg的Na2MoO4·2H2O，0.2mg的CuSO4·5H2O，0.4mg的CoCl2·6H2O，和1mg的MnCl2·2H2O，根据说明补充碳源。使用Luria发酵液(L-发酵液：10g/l Bacto胰胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/l NaCl)作为用于P.putida S12和衍生菌株、C.basilensis HMF14和E.coli DH5α和衍生物繁殖的完全培养基。用2％(w/v)琼脂(Difco)固化固体L-发酵液。
对分批进料实验而言，在具有以下组成的1l经改造的矿物盐培养基中进行初始批次阶段：3.88g的K2HPO4、1.63g的NaH2PO4、2.0g的(NH4)2SO4、0.2g的MgCl2·6H2O、20mg的EDTA、4mg的ZnSO4·7H2O、2mg的CaCl2·2H2O、10mg的FeSO4·7H2O、0.4mg的Na2MoO4·2H2O、0.4mg的CuSO4·5H2O、0.8mg的CoCl2·6H2O、2mg的MnCl2·2H2O、10mg/L庆大霉素和100mM甘油。耗尽初始甘油后，开始并控制进料，以允许最大生长的同时保持甘油是培养物中的限制性底物。进料溶液(每升)含有：368.4g甘油和10g/L MgCl2.6H2O和12.6g/L HMF。
抗生素：针对E.coli添加氨苄西林(amp)至100μg/ml。针对P.putida S12添加庆大霉素(gm)至Luria发酵液中30μg/ml，矿物盐培养基中10μg/ml。抗生素购自Sigma-Aldrich。
培养：在30℃下培养P.putida和C.basilensis。在37℃下培养E.coli。在水平摇床培养箱中，在Boston瓶(Alltech applied sciences BV；Breda，荷兰)中进行MM上的摇瓶实验。在水平摇床培养箱中，在带有棉塞的Erlenmeyer摇瓶中进行L-发酵液上的摇瓶实验。使用BioFlo110控制器在1升发酵罐(New Brunswick Scientific)中进行分批进料实验。在补充有40mM甘油和2mM葡萄糖的100ml MM中，用来自过夜预培养物的经洗涤的细胞起始初始的分批发酵。初始的搅拌速度被设置为200rpm，使用M+W Instruments D-5111质量流控制器以1升/分钟对顶空供应空气。用InPro型6900探针(Mettler Toledo BV；Tiel，荷兰)持续监测溶解的氧张力(DO)，并通过自动化调节搅拌速度至最大1000rpm将其维持在30％的空气饱和度。达到最大搅拌速度后，用0.2升/分钟流速的经纯化的氧代替空气，并将最大搅拌速度设置为800rpm。在初始批次阶段期间，通过自动化添加25％NH4OH将pH维持在7.0，在进料阶段期间通过自动化添加10mM NaOH使pH保持恒定。温度保持在30℃。
测定&分析方法：使用平底96-孔微量培养板(Greiner)，使用Biowave细胞密度计(WPA Ltd)或μQuant MQX200通用微量培养板分光光度计(Biotek)，通过测量600nm处的光密度(OD600)，测定细菌培养物的细胞干重(CDW)含量。对P.putida而言，1.0的OD600对应于0.56g CDW/L(Biowave)或1.4g CDW/L(μQuant)。
HPLC分析：使用设定于230nm的二极管阵列检测器，通过RP-HPLC(Agilent 1100系统)分析FDCA、HMF、HMF-醇和HMF-酸。使用的柱是在25℃下操作的Zorbax Eclipse XDB-C8(孔径表面积180m2/g，Agilent)。以1.2ml/分钟的流速使用20mM KH2PO4(pH 2或pH6)中含有1％乙腈的乙腈梯度作为洗脱液，所述乙腈梯度在3.5分钟内从0提高至5％、在2.5分钟内从5％提高到40％。
细胞提取物的制备：使用补充有12mM琥珀酸盐(C.basilensis HMF14，OD600≈1.5)或20mM葡萄糖(P.putida S12，OD600≈4)的MM，由50-ml晚期指数生长阶段培养物制备表达HMF氧化还原酶的P.putida S12转化体或野生型C.basilensis HMF14的细胞提取物。通过离心收获培养物，并重悬于3ml测定缓冲液中。使用Branson超声波仪(脉冲模式的微尖端(micro tip)，输出设定为3，工作循环百分比设定为40％；3个超声处理循环：45s脉冲和15s暂停)或Sonics Vibra-Cell(Sonics&Materials，USA)(5mm锥形微尖端；脉冲模式设定为1分钟(0,5s脉冲，2秒暂停)，通过超声处理破坏细胞。超声处理后，于4℃下通过在8228×g离心3分钟去除碎片。使用PD10凝胶过滤柱(GE healthcare)使上清液脱盐，并用作HMF氧化还原酶测定的细胞提取物。使用Bradford试剂(Sigma-Aldrich)测量蛋白质浓度。
HMF氧化还原酶测定：在表达C.basilensis HMF14 HMF氧化还原酶的P.putidaS12转化体或野生型C.basilensis HMF14的细胞提取物中进行HMF氧化还原酶测定。使用在hmfH基因中带有转座子插入的C.basilensis HMF14突变体或野生型P.putida S12作为阴性对照。在30℃下充氧的条件下，用糠醛、糠醇、HMF或HMF酸孵育细胞提取物。反应混合物含有1ml细胞提取物、976μl氧饱和的MM、20μl 2mM黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)溶液和4μl 0.5M底物(糠醛、糠醇、HMF或HMF酸)储液。以设定的间隔采样，通过添加HCl至1M的终浓度，立即终止反应。通过HPLC测定样品中的底物和产物浓度。作为氧耗尽的对照，通过连续的氮气流使反应混合物的不同组分耗尽氧，并在氮气中在带有橡皮塞的有顶空的管中孵育相同的反应混合物。
化学品：FDCA的分析标准购自Immunosource B.V.(Halle-Zoersel，比利时)。5-羟甲基-呋喃甲酸(HMF酸)购自Matrix Scientific(Columbia SC，美国)。发现所述化合物被高度酯化。使用前即刻将经酯化的HMF酸的10mM溶液在2M H2SO4中煮两小时，冷却，并在添加50mM磷酸缓冲液后用NaOH调节至pH 7.0。所有其他化学品购自Sigma-Aldrich ChemieB.V.(Zwijndrecht，荷兰)。
分子和遗传技术：使用DNeasy组织试剂盒(QIAGEN)分离基因组DNA。用QIAprep离心小量制备试剂盒(QIAGEN)分离质粒DNA。用QIAEXII凝胶提取试剂盒(QIAGEN)分离被琼脂糖捕获的DNA片段。
根据制造商的说明，用Accuprime Pfx聚合酶(Invitrogen)进行PCR反应。用于从C.basilensis HMF14的基因组DNA扩增HMF氧化还原酶的引物是FN23：5’-CGGAATTCCACATGACAAGGGGAGACCG-3’(SEQ ID NO：1)和FN24；5’-CGGAATTCGCTTCGGTCTTCAACTCGGATG-3’(SEQ ID NO：2)。加有下划线的序列指出EcoRI限制性位点。
使用Gene Pulser电穿孔设备(BioRad)将质粒DNA引入电感受态细胞(electrocompetent cell)中。
通过本领域已知的标准方法鉴定转座子侧翼的染色体DNA(Ausubel，F.M.etal.Current protocols in molecular biology(Green publishing association，NewYork；1987))，并通过引物步移法(primer walkin)获得完整的遗传基因座序列。通过MWGBiotech AG(德国)进行寡核苷酸合成和DNA测序。
根据Sambrook and Russell{Sambrook，J，Russel，D.W.Molecular cloning；alaboratory manual(Cold spring Harbor Laboratoy Press，New York：2001)进行其他标准分子生物学技术。
实施例I
C.basilensis HMF14细胞提取物中的FDCA生产
用HMF或HMF酸孵育下述C.basilensis细胞提取物时观察FDCA的形成，所述细胞提取物来自在补充有12mM琥珀酸盐和3mM HMF的MM上培养的晚期对数阶段预培养物(OD600≈1.5)。
使用HMF作为底物时，随着FDCA形成观察到HMF酸、HMF醇的迅速瞬时累积。在脱盐的细胞提取物中，与粗制细胞提取物相比，HMF酸浓度以较低的速率降低，FDCA生产更加缓慢。因为脱盐的细胞提取物以及粗制细胞提取物中均产生FDCA，所以HMF到FDCA的转化似乎不涉及辅因子。然而，来自粗制细胞提取物的辅因子或其他低分子量组分显示对FDCA形成具有协同作用。添加HMF酸作为底物时，在粗制细胞提取物和脱盐的细胞提取物中均观察到FDCA的立即形成。还证实FDCA形成需要氧的存在，因为在厌氧条件下不生产FDCA。观察了HMF酸到FDCA的化学计量转化。
实施例II
编码HMF氧化还原酶的hmfH基因的分离和表征
发现hmfH基因编码属于FAD-依赖型葡萄糖-甲醇-胆碱(GMC)氧化还原酶家族的62317Da蛋白质。所述酶显示能够将HMF酸氧化成呋喃二羧酸(FDCA)。另外，所述酶还接受HMF作为底物，所述HMF经由HMF酸被氧化成FDCA。在非冗余的NCBI数据库中与HmfH最高同源性发现是与Burkholderia phytofirmans PsJN的GMC氧化还原酶的(基因座标签Bphyt_2180；在562个氨基酸的序列段上具有68％同一性)。以C.basilensis HMF14的HMF/糠醛操纵子的序列数据为基础，鉴定了其他潜在的HMF/糠醛降解者。针对以HMF或糠醛作为唯一碳源在矿物盐培养基上的生长测试所选择的菌株。能够在HMF上生长的菌株具有下述hmfH直向同源物，其编码与HmfH同一性在45％到68％之间的氧化还原酶。一种菌株(Burkholderiaxenovorans LB400)不能够利用HMF，尽管其氧化还原酶与HmfH 44％相同。
图3给出被鉴定为潜在的糠醛和/或HMF利用者的C.basilensis HMF14(A)和其他物种(B)中糠醛和HMF代谢基因的遗传构成的图示。颜色对应于图1中的酶活性。箭头下的粗体数字(x/y)指出在y氨基酸序列段中与相应的C.basilensis HMF14蛋白质的同一性百分比(x)。
在National Center for Biotechnology Information的非冗余蛋白质数据库中，通过BLASTx同源性搜索鉴定直向同源基因。在下述情况下糠醛簇的命中(hits)被定义为相关的：hmfA、B、C、D和E的直向同源物存在于单个基因组中，其中hmfA直向同源物编码与HmfA至少50％相同的酶。使用相同的标准定义hmfF和hmfG直向同源物，其中与HmfH的40％同一性被用作hmfH直向同源物的标准。斜体数字指出所示菌株的基因组基因座标签。白色箭头描述了不具有代谢功能的基因。C：使用糠醛或HMF(3mM)作为唯一碳源的矿物盐培养基上所测试的菌株的生长表型概况。ND：未测定。
图中给出编码HMF氧化还原酶的HmfH的开放读码框的核苷酸序列(图4)和演绎的氨基酸序列(图3)。
实施例III
在P.putida S12中克隆hmfH并表达所编码的氧化还原酶
将编码HMF氧化还原酶的hmfH基因克隆进表达载体pJT’mcs中。用EcoRI(Fermentas)消化使用引物FN23和FN24在C.basilensis HMF14基因组DNA上获得的PCR片段。将经消化的片段连接进经EcoRI消化和FastAP(Fermentas)处理的pJT’mcs载体中，得到HmfH表达质粒pJT’hmfH。通过对照消化和本领域中已知的核苷酸测序，验证hmfH插入的正确定向。使用HMF或HMF酸作为底物，通过FDCA的形成，在MM+20mM葡萄糖和10mg/l庆大霉素上生长的P.putida_pJT’hmfH(OD600≈4)的细胞提取物中证实HMF氧化还原酶的表达(表1)。
表1.在P.putida_pJT’hmfH细胞提取物中由HMF或HMF酸形成FDCA。使用带有空表达载体pJT’mcs的P.putida S12的细胞提取物作为对照。
这些结果证实，FDCA的形成仅在存在氧时发生，并且由hmfH-编码的氧化还原酶催化。使用HMF作为底物时，在脱盐的细胞提取物和粗制细胞提取物中均观察到HMF酸的瞬时累积。脱盐细胞提取物(去除了低MW的辅因子)中HMF酸的形成表明HmfH不仅将HMF酸氧化成FDCA，而且也能够将HMF氧化成其单羧酸形式。
除了HmfH以外，显然P.putida S12的原生非特异性脱氢酶也能够从HMF形成HMF酸(表2)，前提是不通过脱盐去除还原当量(reducing equivalents)。醛还原酶/醇脱氢酶活性是NADH/NAD+依赖性的，而醛脱氢酶活性可由两种人工电子载体PMS和DCPIP的组合支持，其中PMS是初始电子载体(primary electron carrier)而DCPIP是最终电子受体(finalelectron acceptor)。在C.basilensis HMF14的细胞提取物中也观察到相似的活性。
表2.在野生型P.putida S12的细胞提取物中测量的非特异性HMF脱氢酶活性。
ND：因为缺乏可商业获得的底物所以未测定。活性以U g-1蛋白质为单位表示。PMS/DCPIP：吩嗪甲硫酸盐(phenazine methosulphate)/2，6-二氯苯酚靛酚(2，6-dichlorophenol-indophenol)。
图4中示出了由P.putida S12 pJT’hmfH的粗制细胞提取物中的HMF形成FDCA、HMF醇(H-oh)和HMF酸(H-酸)。图4说明了P.putida S12 pJT’hmfH细胞提取物中内源脱氢酶和HmfH的协同效应。首先，伴随着HMF醇的形成(这可能由醛还原酶催化)观察到HMF的快速减少。同时HMF酸(可能通过醛脱氢酶)和FDCA(通过HmfH)也开始累积。HMF醇就在形成后立即消失，可能被再氧化成HMF、HMF酸和FDCA。在25小时的时间跨度中，仅HMF酸在被(几乎)完全氧化成FDCA之前显示显著累积。这些结果提示，HMF酸到FDCA的氧化是所述无细胞系统中的限速步骤。
实施例IV
用表达HmfH的P.putida S12进行HMF到FDCA的全细胞转化
因为在HMF氧化成FDCA中，P.putida S12的内源脱氢酶能够通过提供由HMF产生HMF酸的额外手段而与HmfH协同作用，所以将HMF转化成FDCA的全细胞生物转化方法可具有优于酶促工艺的优点。为了研究所述可能性，针对由HMF生产FDCA测试了静息细胞、生长中的细胞和被破坏的细胞。
摇瓶培养物在1-L Erlenmeyer瓶中补充有10mg/L庆大霉素的150mlMM+40mM甘油和2mM葡萄糖中生长。对数阶段结束(OD600≈4)时收获细胞，洗涤并在补充有19.4g/L ofK2HPO4、8.15g/L NaH2PO4、40mM甘油和10mg/L庆大霉素的MM中浓缩。在250ml Erlenmeyer瓶中，用HMF孵育浓缩的细胞悬浮液(对应于1.65g的CDW)的小份式样(10ml)，并以有规律的间隔采样，用于分析FDCA。对静息细胞而言，从重悬培养基中省略甘油，而被破坏的细胞通过超声处理获得。
如先前所观察的，HMF被迅速转化成HMF醇和HMF酸，之后是HMF酸的减少，同时形成FDCA。对测试的两种HMF浓度而言，FDCA生产速率和HMF酸减少速率均展示于表IV-a中。
表3.在不同的HMF起始浓度下使用P.putida S12 pJT’hmfH的生长中的细胞、静息细胞和经超声处理的细胞时，由HMF生产FDCA的生产速率和HMF酸减少速率。
a)观察到HMF-酸不完全转化成FDCA。
b)一式两份的实验；变差是与两个独立实验的均值的最大偏差。
c)ND＝未测定
表3示出了使用表达HmfH的P.putida S12的生长中细胞时，FDCA生产更加高效。对生长中的细胞孵育而言，总体FDCA生产速率、转化效率以及HMF酸减少速率更高。另外，FDCA生产速率依赖于HMF的初始浓度，表明所述系统未饱和。
实施例V
用表达HmfH的P.putida S12进行分批进料的FDCA生产
发现使用表达HmfH的P.putida S12的生长中的细胞时，FDCA的生产最为高效。因此，进行了分批进料实验，来证实使用P.putida S12 pJT’hmfH.的全细胞时FDCA的生产。
在初始阶段中，在MM上培养P.putida_pJT’hmfH，使用甘油进料至13g CDW/l的细胞密度。在这一阶段结束时，开始HMF进料，以0.8mmol/l/h的速率施用HMF。在不使用甘油共进料(glycerol-co-feeding)的情况下，以0.41mmol/l/h的相等速率形成HMF酸和FDCA(见图5)。随后用以约5ml/h供料的、含有0.21M HMF和4M甘油的溶液代替进料。通过所述甘油共进料，HMF酸浓度迅速降低，同时FDCA形成以大致相同的速率继续(图5)。向分批进料中添加44,6mmol HMF总量时停止实验。结果显示几乎完全转化(即96.5％的效率)成FDCA。
在相似的实验中，以0.7mmol/l/h的平均速率，与HMF一起共进料甘油。在该分批进料培养中，没有观察到HMF酸中间产物的累积，并且所有HMF被直接转化成FDCA(图6)。
实施例VI
从发酵液中纯化FDCA
发现在pH 1.0下，FDCA在水中的溶解度在1.5g/l左右。该特性被有利地用于从发酵液中回收FDCA产物。通过离心(9500x g 5分钟)去除细胞后，在室温下向100ml澄清的发酵液中添加约10ml 96％ H2SO4，同时连续搅拌直至pH 1，从而沉淀FDCA。通过在8228x g下离心10分钟回收沉淀物，并在60℃下将晾干的沉淀物重溶于甲醇中。通过预热的0.22-μm滤器过滤去除未溶解的碎片后，通过HPLC分析滤液的纯度。通过上述过程从发酵液中回收的FDCA的纯度约为65％。可以使用本领域公知的方法实现FDCA的进一步纯化。
实施例VII
用表达HmfH的P.putida S12进行由HMF到FDCA的分批进料生产
为了提高使用P.putida S12 pJT’hmfH的全细胞的FDCA效价和生产力，进行第二分批进料FDCA生产实验。
在初始批次阶段中，在MM上培养P.putida_pJT’hmfH，直至在发酵23.2小时后初始甘油被耗尽(OD600≈8)。在这一时间点，以允许约0.45g CDW/l/h的生物质增加的速率开始甘油进料。发酵50.7小时后，将甘油进料降低至允许约0.045g CDW/l/h的生物质增加的速率。发酵123.4小时后，将甘油进料提高至允许约0.25g CDW/l/h的生物质增加的速率，直至发酵结束。在这一段时间中，应用HMF进料。HMF进料在26.7小时的发酵后以0.65mmol/h/gCDW的速率开始，导致HMF酸和FDCA二者的累积。33.3小时的发酵后，HMF进料速率被降低至0.28mmol/h/g CDW，在72.8小时的发酵后进一步降低至0.09mmol/h/g CDW，并在117.4小时的发酵后停止。递减的HMF进料导致发酵罐中HMF酸浓度的逐步降低，同时FDCA浓度继续增加。不能检测到HMF酸时停止发酵。此时向发酵罐中添加188mmol HMF，导致以30.8g/l的浓度生产约182mmol的FDCA(即97％效率)。图7a展示了P.putida_pJT’hmfH分批进料培养物中生物质、HMF酸和FDCA的形成。图7b展示了相同培养物的甘油和HMF进料速率。
实施例VIII
从发酵液中纯化FDCA
发现pH 0.5下FDCA在水中的溶解度在0.4g/l左右。因为这一浓度在沉淀后保留在溶液中，所以在实施例VIII中获得的提高的效价导致通过沉淀纯化时少得多的产物损失。
通过离心(9500x g 15分钟)去除细胞后，将500ml澄清的发酵液煮沸3分钟以沉淀蛋白质，并在9500x g下离心20分钟。在4℃下向上清液中添加约50ml 96％H2SO4，同时连续搅拌直至pH 0.5，从而沉淀FDCA。通过在8228x g下离心20分钟回收沉淀物，用250ml水洗涤一次，在8228x g下再离心20分钟。将得到的球粒沉淀物晾干，然后在30℃下溶解于约1200ml四氢呋喃(THF)中。通过过滤去除未溶解的碎片后，在真空下于50℃蒸发澄清的THF溶液，直至留下11.8g具有高纯度(＞99％)的干燥FDCA粉末，这是发酵罐发酵液中初始FDCA的78％。需要时可以使用本领域公知的方法进一步优化FDCA的纯化。
申请人或代理人文件参考编号27470-WO-PCT 国际申请号：
与被保藏的微生物相关的说明
(PCT Rule 13bis)

Claims (16)

1.具有类别EC 1.1和EC 1.2的氧化还原酶活性的多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQID NO:3所公开的。
2.多核苷酸，其由以下组成：
(a)SEQ ID NO:4中公开的核苷酸序列；或
(b)属于(a)中定义的核苷酸序列的反向互补体的核苷酸序列。
3.包含根据权利要求2所述的多核苷酸的核酸构建体。
4.载体，其并入有根据权利要求2所述的多核苷酸序列或根据权利要求3所述的核酸构建体。
5.包含根据权利要求1所述的多肽、根据权利要求2所述的多核苷酸、根据权利要求3所述的核酸构建体或根据权利要求4所述的载体的细胞。
6.根据权利要求5所述的细胞，其中所述细胞是：
-选自下组的原核细胞，所述组由Escherichia、Anabaena、Caulobacter、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Rhizobium、Flavobacterium、Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Methylobacterium、Staphylococcus或Streptomyces组成；或
-选自下组的真核细胞，所述组由Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Yarrowia Aspergillus、Chrysosporium、Penicillium、Talaromyces或Trichoderma组成。
7.用于制备根据权利要求1所述多肽的方法，其中所述方法包括在允许所述多肽表达的条件下培养根据权利要求5或6所述的细胞。
8.用于生产2,5-呋喃二羧酸的方法，其中通过在存在氧化还原酶催化剂时与氧化剂的反应，将至少一种2,5-呋喃二羧酸前体转化成2,5-呋喃二羧酸，其中2,5-呋喃二羧酸前体选自由5-羟甲基糠醛、2,5-二羟甲基呋喃和5-羟甲基-2-呋喃羧酸组成的组，以及其中所述氧化还原酶催化剂包含下述多肽：氨基酸序列为SEQ ID NO:3中公开的氨基酸序列或SEQID NO:4的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的多肽。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述前体是5-羟甲基糠醛，并且5-羟甲基糠醛通过在存在酸时加热得自一种或多种己糖。
10.用于生产5-羟甲基-2-呋喃羧酸的方法，其中通过在存在氧化还原酶催化剂时与氧化剂反应，将5-羟甲基糠醛和2,5-二羟甲基呋喃的至少一种转化成5-羟甲基-2-呋喃羧酸，其中所述氧化还原酶催化剂包括下述多肽：氨基酸序列为SEQ ID NO:3中公开的氨基酸序列或SEQ ID NO:4的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的多肽。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述反应在存在至少一种辅酶时发生。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述辅酶是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和/或吡咯并喹啉醌和/或黄素腺嘌呤二核苷酸。
13.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述氧化还原酶催化剂是根据权利要求5或6所述的细胞的无细胞提取物。
14.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述氧化还原酶催化剂是全细胞生物催化剂，其为根据权利要求5或6所述的细胞。
15.用于从一种或多种2,5-呋喃二羧酸单体生产聚合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过根据权利要求8或权利要求9所述的方法制备2,5-呋喃二羧酸单体，
b)从a)中获得的2,5-呋喃二羧酸单体生产聚合物。
16.下述多肽作为类别EC 1.2的氧化还原酶的用途，其中所述多肽的氨基酸序列为SEQID NO:3中公开的氨基酸序列或SEQ ID NO:4的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
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