ES2885723T3 - Polipéptidos que tienen actividad oxidorreductasa y sus usos - Google Patents

Abstract

Proceso para la producción de un polímero a partir de uno o más monómeros, comprendiendo el proceso las etapas de: a) preparar un monómero FDCA mediante la conversión de uno o más precursores furánicos de ácido 2,5- furandicarboxílico (FDCA) en FDCA, mediante reacción con un oxidante en presencia de un catalizador de oxidorreductasa y opcionalmente una o más coenzimas, caracterizado por que el catalizador de oxidorreductasa comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3, en el que el catalizador de oxidorreductasa es un biocatalizador de células enteras que es una célula que comprende una construcción de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una oxidorreductasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, donde , dicha construcción de expresión es expresable en dicha célula y su expresión confiere o aumenta en la célula la capacidad de oxidar el ácido 5- hidroximetilfurfural (HMF) y el ácido 5-hidroximetil-2-furancarboxílico (ácido HMF) a ácido 2,5- furandicarboxílico (FDCA), en comparación con una célula de tipo silvestre correspondiente que carece de la construcción de expresión; y, b) producir un polímero a partir de uno o más monómeros, donde uno de los monómeros es el monómero FDCA producido en a).

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos que tienen actividad oxidorreductasa y sus usos

Campo de la invención

[0001] La invención se refiere a un polipéptido que tiene actividad oxidorreductasa y a secuencias de polinucleótidos que comprenden un gen que codifica el polipéptido. La invención se refiere, además, a la producción de ácido 2,5-furan-dicarboxílico (FDCA). También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido según la invención adecuado para producir estos polipéptidos, que también pueden usarse para la biotransformación de hidroximetilfurfural (HMF) en FDCA.

Antecedentes de la invención

[0002] El ácido 2,5-furan-dicarboxílico (FDCA) tiene un gran potencial para convertirse en una alternativa de base biológica para el tereftalato en la producción de poliésteres como el PET. Como tal, y por otras razones, el FDCA fue identificado como una de las 12 sustancias químicas prioritarias en el informe del DOE sobre sustancias químicas de mayor valor agregado de biomasa (Top Value-Added Chemicals from Biomass, Vol. I -Results of screening for potential Candidates from Sugars and Synthesis gas, Departamento de Energía (EE. UU.), 2004). Este compuesto puede obtenerse por oxidación de 5-hidroximetilfurfural (HMF), que puede producirse calentando azúcares de hexosa en condiciones ácidas. El informe del DOE revela en la página 27 algunas posibles utilidades para el FDCA. Estas incluyen un papel como sustrato para la producción de ácido succínico, 2,5-bis(aminometil)-tetrahidrofurano, 2,5-dihidroximetil-tetrahidrofurano, 2,5-dihidroximetilfurano y 2,5-furandicarbaldehído. Aunque la producción de FDCA por deshidratación oxidativa química de azúcares C6 y los usos del FDCA son muy conocidos y plantean barreras técnicas indicadas en la tabla 13 de la página 26, para la biotransformación (posiblemente conversiones enzimáticas), la posición era desconocida.

[0003] Un proceso para la preparación enzimática de FDCA se da a conocer en el documento WO2009/023174. En esta descripción, una especie hidroximetilfurfural se oxida con una cloroperoxidorreductasa y productos oxidados con peróxido de hidrógeno que tienen un grupo ácido carboxílico en la posición C1 del hidroximetilfurfural, en particular ácido formilfurancarboxílico o FFCA. Los resultados se muestran, por ejemplo, en la Figura 1. En otra forma de realización, el HMF se pone en contacto con una oxidorreductasa en presencia de un sustrato oxidante, por lo que el HMF se oxida a al menos uno de entre diformifurano o ácido formilfurancarboxílico.

[0004] Desventajas del proceso conocido en el documento WO2009/023174 son que la reacción requiere peróxido de hidrógeno y que el producto formado es una mezcla de FDCA con dos subproductos contaminantes, ácido hidroximetilfurancarboxílico (HmFCA) y ácido formilfurancarboxílico (FFCA). En consecuencia, el rendimiento de FDCA a partir de HMF se reduce y se necesitan etapas de recuperación adicionales para obtener FDCA en una forma sustancialmente purificada.

[0005] En la base de datos EBI, Uniprot B2T4R9, se identificó una secuencia de 577 aminoácidos que se infirió a partir de la homología como glucosa-metanol-colina oxidorreductasa en la "secuencia completa del cromosoma 1 de Burkholderia phytofirmans PsJN".

[0006] En la base de datos EBI, Uniprot B2JSZ0, se identificó una secuencia de 576 aminoácidos que se infirió a partir de la homología como glucosa-metanol-colina oxidorreductasa en la "secuencia completa del plásmido 1 de Burkholderia phymatum STM815".

[0007] En Deurzen, M.P.J. et al, J. Carbohydrate Chemistry 16(3), 299-309 (1997), se describe la oxidación catalizada por cloroperoxidasa de 5-hidroximetilfurfural. La reacción prosigue con una selectividad del 60-74 % a furan-2,5-dicarboxaldehído (FDC). Los subproductos fueron ácido 5-hidroximetil-2-furancarboxílico (HFCA) y ácido 5-formilfuran-2-carboxílico (FFCA).

[0008] En Kroger M. et al, Topics in Catalysis 13, 237-242 (2000), se describe un proceso para la producción de FDCA utilizando fructosa como material de partida. La reacción utiliza un sistema bifásico de agua/metil-isobutilcetona (MIBK) para prevenir la oxidación de la fructosa mientras se cataliza la oxidación in situ de HMF.

[0009] En Mitsukura Koichi et al, Biotechnology Letter, 26(21) 1643-1648 (2004), se describen bacterias que muestran una fuerte actividad oxidante de aldehídos. Luego se demostró que estas bacterias producen eficientemente ácido 2-furoico, ácido vanílico y ácido 5-hidroximetil-2-furancarboxílico. No se aislaron genes ni proteínas específicas de estas bacterias para su posterior análisis.

Resumen

[0010] Un objeto de la divulgación es proporcionar una oxidorreductasa que pueda usar oxígeno molecular para reacciones redox. Otro objeto es proporcionar una oxidorreductasa que tenga un amplio espectro de reacción. Otro objeto es proporcionar una oxidorreductasa que tenga una alta regioespecificidad. Otro objeto de la invención es proporcionar un proceso para la producción de FDCA en el que se pueda evitar una cantidad sustancial de subproductos. Otro objeto de la invención es proporcionar un proceso para la producción de ácido 5-hidroximetil-2-furancarboxílico (ácido HMF) en el que se pueda evitar una cantidad sustancial de subproductos. Uno o más de estos objetos se consiguen según la invención.

[0011] La presente divulgación proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen la actividad oxidorreductasa. Los polinucleótidos de la divulgación codifican típicamente un polipéptido que tiene actividad oxidorreductasa, en particular actividad HmfH oxidorreductasa.

[0012] Según la divulgación, se proporciona, por lo tanto, un polipéptido que tiene actividad oxidorreductasa que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4, o una variante de polipéptido de la misma que tiene un 45 % o más de identidad de secuencia o más con la secuencia de SEQ ID NO: 3.

[0013] Estos polipéptidos oxidorreductasa ofrecen una alternativa enzimática a las rutas de oxidación química para producir el compuesto de valor agregado FDCA, permitiendo condiciones de reacción suaves (30 °C, pH 7) y produciendo menos desechos. La oxidorreductasa es una verdadera oxidasa, es decir, solo se requiere oxígeno molecular para la reacción de oxidación, omitiendo el requisito de regeneración de cofactores costosos. La enzima ofrece una amplia especificidad de reacción y regioespecificidad, oxidando tanto grupos alcohol como aldehído a eventualmente ácido carboxílico, independientemente de si estos grupos están en la posición C2 o C5 del esqueleto del furano.

[0014] También se proporciona según la divulgación un vector, tal como un vector de expresión, que incorpora una secuencia polinucleotídica de la divulgación y una célula que comprende un polipéptido, un polinucleótido o un vector, según la divulgación.

[0015] La divulgación proporciona, además, un método para la preparación de un polipéptido que tiene actividad oxidorreductasa, método que comprende cultivar una célula de la divulgación en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente, recuperar el polipéptido expresado y un polipéptido obtenible mediante dicho método.

[0016] La divulgación se refiere, además, a un proceso integrado para la producción de FDCA a partir de corrientes de alimentación ricas en fructosa o enriquecidas con fructosa utilizando un biocatalizador robusto de células enteras.

[0017] En un aspecto, la invención proporciona un proceso para la producción de un polímero a partir de uno o más monómeros de FDCA, según lo definido en las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

[0018]

Fig. 1: Esquema de reacción de oxidaciones catalizadas por la HmfH oxidorreductasa.

Fig. 2: Mapa de plásmido del vector de expresión de HmfH pJT'hmfH. Ptac', promotor tac; rep, gen que codifica la proteína de replicación pRO1600; gmR, gen de resistencia a la gentamicina; bla, beta-lactamasa; pRO1600-ori, origen de replicación para P. putida; pUC ori, origen de replicación para E. coli.

Fig. 3: Representación esquemática de la organización genética de los genes metabólicos furfural y HMF en C. basilensis HMF14 (A) y otras especies (B) que fueron identificadas como potenciales usuarios de furfural y/o HMF.

Fig. 4: Formación de FDCA, alcohol HMF (H-oh) y ácido HMF (H-ácido) a partir de HMF en extracto celular crudo de P. putida S12 pJT'hmfH.

Fig. 5: Formación de ácido HMF y FDCA en un cultivo por lote alimentado de P. putida_pJT'hmfH. La flecha de la izquierda indica el inicio de la alimentación de HMF; la flecha de la derecha indica la adición de glicerol a la alimentación.

Fig. 6: Formación de ácido HMF y FDCA en un cultivo por lote alimentado de P. putida_pJT'hmfH. La flecha indica el inicio de la alimentación combinada de HMF y glicerol.

Fig. 7a: Concentraciones de ácido HMF, FDCA y biomasa en la fermentación por lote alimentado del ejemplo VIII. 7b: velocidades de alimentación de glicerol y HMF en la fermentación por lote alimentado del ejemplo VIII.

Breve descripción del listado de secuencias

[0019]

SEQ ID NO: 1 establece la secuencia de ADN del cebador FN23: 5'-CGGAATTCCACATGACAAGGGGAGACCG-3'. La secuencia subrayada indica un sitio de restricción EcoRI;

SEQ ID NO: 2 establece la secuencia de ADN del cebador FN24; 5'-CGGAATTCGCTTCGGTCTTCAACTCGGATG-3'. La secuencia subrayada indica un sitio de restricción EcoRI;

SEQ ID NO: 3 establece la secuencia de aminoácidos de HmfH;

SEQ ID NO: 4 establece la secuencia de codificación de hmfH.

Descripción detallada

[0020] A lo largo de la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprender" e "incluir" y variaciones tales como "comprende", "comprendiendo", "incluye" e "incluyendo" deben interpretarse de manera inclusiva. Dicho de otro modo, estas palabras están destinadas a transmitir la posible inclusión de otros elementos o números enteros no indicados específicamente, cuando el contexto lo permita.

[0021] Los artículos "un" y "una" se utilizan en este documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, uno o al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.

[0022] El amplio espectro de reacción significa aquí que la oxidorreductasa puede actuar como catalizador para los muchos sustratos diferentes, p. ej., HMF, ácido HMF, alcohol ^h M^f , furfural, alcohol furfurílico. La regioespecificidad significa que solo oxida átomos de C específicos.

Polipéptido oxidorreductasa

[0023] Un polipéptido para usar en la invención que tiene actividad oxidorreductasa comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4, o una variante de polipéptido de la misma que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con la secuencia establecida en SEQ ID NO: 3.

[0024] En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico variante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente homóloga de al menos un 66 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más homóloga a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 4. En otra forma de realización, la proteína variante comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga de al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más homóloga a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3.

[0025] Una forma de realización de la divulgación es un polinucleótido que comprende: (a) la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 4; (b) una secuencia de nucleótidos que se hibrida selectivamente con un polinucleótido que es el complemento inverso de SEQ ID NO: 4; (c) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 66 % de identidad de secuencia o más con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4; (d) un fragmento de una secuencia de nucleótidos según lo definido en (a), (b) o (c) que tiene al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud; (e) una secuencia que se degenera como resultado del código genético en una secuencia según lo definido en cualquiera de (a), (b), (c) o (d); (f) una secuencia de nucleótidos que es el complemento inverso de una secuencia de nucleótidos según lo definido en (a), (b), (c), (d) o (e), o que codifica un polipéptido; y a los polipéptidos relacionados.

[0026] Una forma de realización es una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido, donde el contenido de GC puede ser del 56 % o más, del 58 % o más, o del 58-65 %. Otra forma de realización es un vector que incorpora la secuencia de polinucleótidos o una construcción de ácido nucleico.

[0027] Los términos "homología", "identidad de secuencia" y similares se usan indistintamente en el presente documento. Para el propósito de esta invención, en el presente documento se define que para determinar el grado de identidad de secuencia compartida por dos secuencias de aminoácidos o por dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para fines de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir espacios en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). Dicha alineación puede llevarse a cabo en todas las longitudes de las secuencias que se comparan. Alternativamente, la alineación se puede llevar a cabo en una longitud de comparación más corta; por ejemplo, en aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más ácidos nucleicos/bases o aminoácidos.

[0028] A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El grado de identidad compartido entre secuencias se expresa típicamente en términos de porcentaje de identidad entre las dos secuencias, y es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (es decir, posiciones superpuestas) x 100). Preferiblemente, las dos secuencias que se comparan son de la misma longitud o sustancialmente de la misma longitud.

[0029] El experto en la materia será consciente del hecho de que hay disponibles varios programas informáticos diferentes para determinar la homología entre dos secuencias. Por ejemplo, se puede realizar una comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias usando un algoritmo matemático. En una forma de realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)), que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software Accelrys GCG (disponible en http://www.accelrys.com/products/gcg/), utilizando una matriz Blossom 62 o bien una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El experto en la materia podrá apreciar que todos estos parámetros diferentes producirán resultados ligeramente distintos, pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente cuando se utilizan algoritmos diferentes.

[0030] En otra forma de realización más, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software Accelrys GCG (disponible en http://www.accelrvs.com/products/gcg/), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de espacio de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6.

[0031] En otra forma de realización, el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos se determina usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)), que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0) (disponible en ALIGN Query utilizando datos de secuencia del servidor Genestream, IGH Montpellier (Francia), http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4.

[0032] Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas para su uso en la presente invención pueden usarse, además, como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas se pueden realizar utilizando los programas BLASTn y BLASTx (versión 2.0) de Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Pueden realizarse búsquedas nucleótidos de BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico de oxidorreductasa para su uso en la invención. Pueden realizarse búsquedas de proteínas de BLAST con el programa BLASTx, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína oxidorreductasa para su uso en la invención. Para obtener alineaciones con espacios con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST, como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTx y BLASTn). Véase la página de inicio del Centro Nacional de Información Biotecnológica en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

[0033] Según se utiliza en el presente documento, los términos "hibridación selectiva", "hibrida selectivamente" y términos similares están destinados a describir las condiciones de hibridación y lavado en las que las secuencias de nucleótidos al menos un 66 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 % , más preferiblemente al menos un 85 %, incluso más preferiblemente al menos un 90 %, preferiblemente al menos un 95 %, más preferiblemente al menos un 98 % o más preferiblemente al menos un 99 % homólogas entre sí típicamente permanecen hibridadas entre sí. Es decir, dichas secuencias de hibridación pueden compartir al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, incluso más preferiblemente al menos el 90 %, más preferiblemente al menos el 95 %, más preferiblemente al menos el 98 % o más preferiblemente al menos el 99 % de identidad de secuencia.

[0034] Un ejemplo preferido no limitativo de tales condiciones de hibridación es la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o más lavados en 1 X SSC, SDS al 0,1 % a aproximadamente 50 °C, preferiblemente a aproximadamente 55 °C, preferiblemente a aproximadamente 60 °C e incluso más preferiblemente a aproximadamente 65 °C.

[0035] Las condiciones muy rigurosas incluyen, por ejemplo, hibridación a aproximadamente 68 °C en 5x SSC/5x solución de Denhardt/SDS al 1,0 % y lavado en 0,2x SSC/SDS al 0,1 % a temperatura ambiente. Alternativamente, el lavado se puede realizar a 42 °C.

[0036] El experto en la materia sabrá qué condiciones aplicar para condiciones de hibridación rigurosas y muy rigurosas. En la técnica se encuentra disponible una guía adicional con respecto a tales condiciones, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).

[0037] Evidentemente, un polinucleótido que se hibride solo con una secuencia poli A (como el tracto poli(A) terminal 3' de ARNm), o con un tramo complementario de residuos T (o U), no se incluiría en un polinucleótido para su uso en la invención utilizado para hibridarse específicamente con una porción de un ácido nucleico para su uso en la invención, ya que dicho polinucleótido se hibridaría con cualquier molécula de ácido nucleico que contenga un tramo de poli (A) o el complemento de este (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc bicatenario).

[0038] En un enfoque típico, bibliotecas de genes construidas a partir de otros organismos, p. ej., una bacteria, particularmente de la familia de microorganismos Trichomaceae, por ejemplo, del género Burkholderia, se pueden cribar como Burkholderia phytofirmans.

[0039] Por ejemplo, se pueden cribar cepas de Burkholderia para polinucleótidos de oxidorreductasa homólogos mediante análisis de transferencia Southern. Tras la detección de fragmentos de restricción de ADN homólogos para su uso según la invención, se pueden construir bibliotecas de genes a partir de fragmentos cromosómicos del mismo tamaño de la cepa apropiada, utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. Alternativamente, si el microorganismo es un eucariota, el transcrito de ARNm de la oxidorreductasa HmfH puede identificarse mediante hibridación Northern y, tras la identificación del transcrito, pueden prepararse bibliotecas de ADNc usando ARN total aislado del microorganismo eucariota.

[0040] Pueden aislarse secuencias de genes homólogas, por ejemplo, mediante la realización de PCR usando dos conjuntos de cebadores de oligonucleótidos degenerados diseñados en función de las secuencias de nucleótidos según lo enseñado en el presente documento.

[0041] El molde para la reacción puede ser ADN cromosómico total de la cepa que se sabe o se sospecha que expresa un polinucleótido para su uso según la invención. El producto de PCR se puede subclonar y secuenciar para garantizar que las secuencias amplificadas representan las secuencias de una nueva secuencia de ácido nucleico de oxidorreductasa, o un equivalente funcional de la misma.

[0042] Alternativamente, el molde para la reacción puede ser ADNc obtenido por transcripción inversa de ARNm preparado a partir de cepas que se sabe o se sospecha que expresan un polinucleótido para su uso según la invención. El producto de PCR se puede subclonar y secuenciar para garantizar que las secuencias amplificadas representan las secuencias de una nueva secuencia de ácido nucleico de oxidorreductasa, o un equivalente funcional de la misma.

[0043] El fragmento de PCR se puede usar después para aislar un clon de ADNc de longitud completa mediante una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, el fragmento amplificado se puede marcar y usar para cribar una biblioteca de ADNc de bacteriófagos o cósmidos. Alternativamente, el fragmento marcado se puede usar para cribar una biblioteca genómica.

[0044] La tecnología de PCR también se puede utilizar para aislar secuencias de ADNc de longitud completa de otros organismos. Por ejemplo, el ARN se puede aislar, siguiendo procedimientos estándar, de una fuente celular o tisular apropiada. Se puede realizar una reacción de transcripción inversa en el ARN usando un cebador oligonucleotídico específico para el extremo más 5' del fragmento amplificado para el cebado de la síntesis de la primera hebra.

[0045] A continuación, el híbrido de ARN/ADN resultante se puede "elongar" (p. ej., con guaninas) utilizando una reacción de transferasa terminal estándar, el híbrido se puede digerir con RNasa H y, después se puede cebar la síntesis de la segunda hebra (p. ej., con un cebador poli-C). Por tanto, las secuencias de ADNc cadena arriba del fragmento amplificado pueden aislarse fácilmente. Para una revisión de las estrategias de clonación útiles, consúltese, por ejemplo, Sambrook et al., supra; y Ausubel et al., supra.

[0046] Otro aspecto se refiere a los vectores para su uso en la invención, incluidos los vectores de clonación y de expresión, que comprenden un polinucleótido que codifica una proteína oxidorreductasa o un equivalente funcional de la misma para su uso en la invención y métodos para hacer crecer, transformar o transfectar dichos vectores en una célula huésped adecuada, por ejemplo, en condiciones en las que se produce la expresión de un polipéptido para su uso en la invención. Según se utiliza en este documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido.

[0047] Los polinucleótidos para su uso en la invención pueden incorporarse en un vector replicable recombinante, por ejemplo, un vector de clonación o de expresión. El vector puede usarse para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible. Por tanto, en una forma de realización adicional, la divulgación proporciona un método para fabricar polinucleótidos para su uso en la invención mediante la introducción de un polinucleótido para su uso en la invención en un vector replicable, la introducción del vector en una célula huésped compatible y el crecimiento de la célula huésped en condiciones que provocan la replicación del vector. El vector se puede recuperar de la célula huésped. Las células huésped adecuadas se describen más adelante.

[0048] El vector en el que se inserta el casete de expresión o polinucleótido para su uso en la invención puede ser cualquier vector que se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la que se va a introducir.

[0049] Un vector para un uso según la invención puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, al introducirse en una célula huésped, se integre en el genoma de la célula huésped y se replique junto con el cromosoma o cromosomas en los que se ha integrado.

[0050] Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de doble hebra en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores pueden replicarse de forma autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped y, por tanto, se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están ligados operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante se encuentran a menudo en forma de plásmidos. Los términos "plásmido" y "vector" se pueden usar indistintamente en el presente documento, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, la divulgación pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como cósmidos, vectores virales (por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados y retrovirus sin capacidad de replicación) y vectores de fagos que cumplen funciones equivalentes.

[0051] Se pueden utilizar vectores para su uso según la invención in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN o para transfectar o transformar una célula huésped.

[0052] Un vector para su uso en la invención puede comprender dos o más, por ejemplo, tres, cuatro o cinco, polinucleótidos para usar en la invención, por ejemplo, para la sobreexpresión.

[0053] Los vectores de expresión recombinantes para usar en la invención comprenden un ácido nucleico para usar en la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en función de las células huésped que se vayan a utilizar para la expresión, que están ligadas operativamente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar.

[0054] Dentro de un vector, como un vector de expresión, la expresión "ligado/a(s) operativamente" pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés está ligada a la secuencia o secuencias reguladoras de tal manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (p. ej., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped), es decir, el término "ligado/a(s) operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia reguladora tal como un promotor, potenciador u otra señal de regulación de la expresión "ligada operativamente" a una secuencia codificante se coloca de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control, o las secuencias se disponen de manera que funcionan en armonía para su propósito previsto, por ejemplo, la transcripción se inicia en un promotor y avanza a través de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido.

[0055] El término "secuencia reguladora" o "secuencia de control" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señal de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990).

[0056] El término secuencias reguladoras o secuencias de control incluye aquellas secuencias que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en una determinada célula huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido).

[0057] Un vector o construcción de expresión para una célula hospedadora determinada puede comprender, por tanto, los siguientes elementos ligados operativamente entre sí en un orden consecutivo desde el extremo 5' al extremo 3' en relación con la hebra codificante de la secuencia que codifica el polipéptido para su uso en la primera invención: (1) una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en la célula huésped dada; (2) opcionalmente, una secuencia señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido desde la célula huésped dada a un medio de cultivo; (3) una secuencia de ADN para su uso en la invención que codifica una forma madura y preferiblemente activa de un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa; y, preferiblemente, también (4) una región de terminación de la transcripción (terminador) capaz de terminar la transcripción cadena abajo de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido.

[0058] Cadena abajo de la secuencia de nucleótidos para su uso según la invención puede haber una región 3' no traducida que contenga uno o más sitios de terminación de la transcripción (por ejemplo, un terminador). El origen del terminador es menos crítico. El terminador puede ser, por ejemplo, nativo de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Sin embargo, preferiblemente, se usa un terminador de levadura en células huésped de levadura, y se usa un terminador fúngico filamentoso en células huésped fúngicas filamentosas. Más preferiblemente, el terminador es endógeno a la célula huésped (en la que se va a expresar la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido). En la región transcrita, puede estar presente un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La porción codificante de los transcritos maduros expresados por las construcciones incluirá una traducción que inicia AUG al principio y un codón de terminación apropiadamente posicionado al final del polipéptido que se va a traducir.

[0059] La expresión mejorada del polinucleótido para su uso en la invención también se puede lograr mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, p. ej., región promotora, región de conducción de la secreción y/o región terminadora, que pueden servir para aumentar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés del huésped de expresión y/o para proporcionar el control inducible de la expresión de un polipéptido para su uso en la invención.

[0060] Los expertos en la materia podrán apreciar que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores, tales como los vectores de expresión, para su uso en la invención pueden introducirse en células huésped para producir de este modo proteínas o péptidos, codificados por ácidos nucleicos como se describe en este documento (por ejemplo, proteínas oxidorreductasa, formas mutantes de proteínas oxidorreductasa, fragmentos, variantes o equivalentes funcionales de las mismas, proteínas de fusión, etc.).

[0061] Los vectores, tales como los vectores de expresión recombinantes, para su uso en la invención, pueden diseñarse para la expresión de proteínas oxidorreductasa en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, las proteínas oxidorreductasa se pueden expresar en células bacterianas como E. coli, células de insectos (usando vectores de expresión de baculovirus), hongos filamentosos, células de levadura o células de mamífero. Las células huésped adecuadas se analizan con más detalle en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990). Más adelante, se describen ejemplos representativos de huéspedes apropiados.

[0062] Se conocen en la técnica medios de cultivo y condiciones apropiados para las células huésped anteriormente descritas.

[0063] Como se ha expuesto anteriormente, el término "secuencias de control" o "secuencias reguladoras" se define en el presente documento para incluir al menos cualquier componente que pueda ser necesario y/o ventajoso para la expresión de un polipéptido. Cualquier secuencia de control puede ser nativa o extraña a la secuencia de ácido nucleico para su uso en la invención que codifica un polipéptido. Dichas secuencias de control pueden incluir, pero no se limitan a, un promotor, un conductor, secuencias óptimas de iniciación de la traducción (como se describe en Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870), una secuencia señal de secreción, una secuencia pro-péptido, una secuencia de poliadenilación, un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen típicamente un promotor y señales de parada de la transcripción y de la traducción.

[0064] Un microorganismo transformado de manera estable es uno al que se le han introducido uno o más fragmentos de ADN de tal manera que las moléculas introducidas se mantienen, se replican y se segregan en un cultivo en crecimiento. La transformación estable puede deberse a una integración o integraciones cromosómicas múltiples o únicas o por un elemento o elementos extracromosómicos tales como un vector o vectores plasmídicos. Un vector plasmídico es capaz de dirigir la expresión de polipéptidos codificados por fragmentos de ADN particulares.

[0065] La expresión puede ser constitutiva o estar regulada por promotores inducibles (o reprimibles) que permiten altos niveles de transcripción de fragmentos de ADN funcionalmente asociados que codifican polipéptidos específicos.

Aislamiento de la oxidorreductasa

[0066] La oxidorreductasa o material de ADN que expresa la oxidorreductasa puede aislarse de un organismo, preferiblemente un microorganismo que expresa la oxidorreductasa. Preferiblemente, el microorganismo es capaz de usar HMF, pero esto no es necesario. El microorganismo preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en: Cupriavidus, Burkholderia, Bradyhrizobium, Methylobacterium; Cupriavidus basisliensis, Burkholderia phytofirmans, Bradyhrizobium japonicum, Methylobacterium radiotolerans, Cupriavidus basisliensis HMF14, Burkholderia phytofirmans PsJN, Bradyhrizobium japonicum USDA110, Methylobacterium radiotolerans JCM2831.

[0067] La oxidorreductasa más preferida útil en la presente invención es usando un HMF y es una oxidorreductasa aislada de Cupriavidus basilensis HMF 14 en este documento, depositado de conformidad con el Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional de los depósitos de microorganismos para los fines de procedimientos de patentes en la DSMZ: Cupriavidus basilensis HMF14 = DSM 22875, fecha de depósito: 19 de agosto de 2009, depositante TNO, Schoemakerstraat 97, 2628VK Delft, Países Bajos.

[0068] Por lo tanto, hemos aislado la bacteria que utiliza HMF, Cupriavidus basilensis cepa HMF14, e identificado los genes implicados en la vía degradativa de HMF. Uno de los genes (definido aquí como hmfH) codificaba una oxidorreductasa de 579 aminoácidos, de 62 kDa y dependiente de FAD que se observó que oxidaba alcohol furfurílico, furfural, HMF y ácido 5-hidroximetilfuroico. Los grupos alcohol/aldehído en C2 y C5, en estas moléculas, se oxidaron, sin el requisito de una construcción de ácido nucleico adicional que codifique una reductasa, aunque la presencia de tales actividades puede ser ventajosa (véase la figura 1).

En el presente documento se proporcionan, por tanto, polinucleótidos que codifican polipéptidos, p. ej., enzimas que tienen actividad oxidorreductasa (actividades EC 1.1 EC 1.2) para su uso en la invención. En el presente documento, las enzimas son una subclase de polipéptidos.

Reacción de oxidación

[0069] La reacción de oxidación es en el presente documento una o más reacciones de un oxidante con un compuesto furánico en presencia de la oxidorreductasa de la invención y una o más coenzimas (descritas más adelante en el presente documento). La reacción de oxidación puede comprender una etapa de reacción de oxidación que da como resultado un producto (por ejemplo, la oxidación del ácido HMF a FDCA). Alternativamente, puede comprender más de una etapa de reacción de oxidación, dando como resultado cada etapa un intermedio, donde el último intermedio es el producto final (por ejemplo, la oxidación de HMF a FDCA). En la figura 1 se dan ejemplos de reacciones de oxidación.

[0070] Una reacción de oxidación es la producción de ácido 2,5-furandicarboxílico (FDCA), en la que uno o más precursores furánicos de FDCA se convierten en FDCA, por reacción con un oxidante en presencia de un catalizador de oxidorreductasa y una o más coenzimas, donde el catalizador de oxidorreductasa comprende un polipéptido según la invención. El precursor furánico de FDCA puede seleccionarse del grupo que consiste en 5-hidroximetilfurfural (HMF), 2,5-dihidroximetil furano (alcohol HMF) y ácido 5-hidroximetil-2-furancarboxílico (ácido HMF), preferiblemente el precursor furánico es HMF. Puede obtenerse HMF a partir de uno o más azúcares de hexosa calentando en presencia de ácido, de forma convencional. Los azúcares de hexosa se pueden obtener a partir de biomasa. La reacción de oxidación también puede ser un proceso para la producción de ácido 5-hidroximetil-2-furancarboxílico (ácido HMF) en el que uno o más precursores furánicos de ácido HMF se convierten en ácido HMF por reacción con un oxidante en presencia de un catalizador de oxidorreductasa y una o más coenzimas, donde el catalizador de oxidorreductasa comprende un polipéptido para su uso en la invención. En una forma de realización, el precursor furánico del ácido HMF se elige del grupo seleccionado entre 5-hidroximetilfurfural (HMF) y 2,5-dihidroximetil furano (alcohol HMF). Son posibles otros procesos de oxidación.

[0071] Las reacciones de oxidación se llevan a cabo preferiblemente a una temperatura relativamente suave, es decir, 10-80 °C, más preferiblemente 20-45 °C, más preferiblemente en torno a 25-40 °C. El pH durante la reacción es preferiblemente pH 3 a 8, más preferiblemente en torno a pH 7. El tiempo de reacción es de 6 a 18 horas usando oxígeno atmosférico u oxígeno puro, y preferiblemente la enzima es reactiva durante tiempos más prolongados.

[0072] El reactor puede ser cualquier biorreactor adecuado (aireado). Puede ser operado por lotes, continuo o preferiblemente por lote alimentado.

[0073] Los productos de oxidación tales como FDCA, ácido HMF, etc. pueden recuperarse de la mezcla de reacción mediante enfriamiento/recristalización y separación del producto de oxidación cristalizado, p. ej., FDCA cristalizado. Sin embargo, son adecuados otros métodos de recuperación, tales como, entre otros, la precipitación ácida y la extracción con disolvente, como se conoce en la técnica.

[0074] Opcionalmente, la reacción tiene lugar en presencia de una coenzima. La coenzima puede ser el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) y/o el dinucleótido de flavina y adenina (FAD) y/o pirroloquinolina quinolona (PQQ). Se observó un efecto sinérgico en la reacción de oxidación de la invención con actividad deshidrogenasa, p. ej., la actividad de deshidrogenación endógena observada en una célula en la que tiene lugar la reacción de oxidación o está presente en un extracto celular de dicha célula. Proceso para la producción de un polímero a partir de uno o más monómeros, en el que uno de los monómeros es según FDCA.

Oxidante

[0075] El oxidante durante las reacciones según la invención puede ser cualquier oxidante, preferiblemente oxígeno. La fuente de oxígeno más económica es el aire. Esto es ventajoso porque el aire se obtiene fácilmente de la atmósfera sin coste, sin toxicidad y sin necesidad de eliminarlo después de la reacción. Alternativamente, se puede emplear un sistema de liberación de oxígeno molecular. En principio, el sistema de generación de oxígeno puede seleccionarse de entre los diversos sistemas de generación de oxígeno que se han descrito en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar las enzimas catalasa ya presentes en la mezcla de reacción para generar oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno.

Compuestos furánicos

[0076] Se entiende en la presente memoria que los compuestos furánicos son cualquier compuesto que tenga un grupo furano que pueda oxidarse a ácido 2,5-furandicarboxílico o a un precursor del mismo. Los compuestos de furano preferidos incluyen hidroximetilfurfural (HMF), ácido hidroximetilfurancarboxílico (ácido HMF), 2,5-dihidroximetilfurano (alcohol HMF). El anillo de furano o cualquiera o su grupo lateral sustituible puede estar sustituido, p. ej., con una porción OH, alquilo C1-C10, alquilo, alilo, arilo o éter RO, incluidos los grupos cíclicos, en el anillo de furano en cualquier posición disponible.

Expresión de oxidorreductasa

[0077] Independientemente del mecanismo exacto utilizado para la expresión de enzimas, se contempla que dicha expresión sea transferible mediante la introducción de genes que codifican estas enzimas en otra célula huésped mediante métodos conocidos en la técnica. Los elementos genéticos según lo definido en el presente documento incluyen ácidos nucleicos (generalmente ADN o ARN) que tienen secuencias codificantes expresables para productos tales como proteínas, específicamente enzimas, apoproteínas o ARN antisentido, que expresan o regulan la expresión de enzimas relevantes. Las proteínas expresadas pueden funcionar como enzimas, reprimir o desreprimir la actividad enzimática o controlar la expresión de las enzimas. El ADN recombinante que codifica estas secuencias expresables puede ser cromosómico (integrado en el cromosoma de la célula huésped mediante, por ejemplo, recombinación homóloga) o extracromosómico (por ejemplo, transportado por uno o más plásmidos, cósmidos y otros vectores capaces de autorreplicarse). Se entiende que el ADN recombinante utilizado para transformar la célula huésped para su uso según esta invención puede incluir, además de genes estructurales y factores de transcripción, secuencias de control de la expresión, incluidos promotores, represores y potenciadores, que actúan para controlar la expresión o desrepresión de secuencias codificantes de proteínas, apoproteínas o ARN antisentido. Por ejemplo, tales secuencias de control pueden insertarse en células huésped de tipo silvestre para promover la sobreexpresión de enzimas seleccionadas ya codificadas en el genoma de la célula huésped, o alternativamente pueden usarse para controlar la síntesis de enzimas codificadas extracromosómicamente.

[0078] El ADN recombinante puede introducirse en la célula huésped por cualquier medio, incluidos, entre otros, plásmidos, cósmidos, fagos, cromosomas artificiales de levadura u otros vectores que median la transferencia de elementos genéticos a una célula huésped. Estos vectores pueden incluir un origen de replicación, junto con elementos de control que actúan en cis que controlan la replicación del vector y los elementos genéticos transportados por el vector. Pueden estar presentes marcadores seleccionables en el vector para ayudar en la identificación de células huésped en las que se han introducido elementos genéticos.

[0079] Los medios para introducir elementos genéticos en una célula huésped (por ejemplo, clonación) son bien conocidos por el experto en la materia. Se puede utilizar un vector plasmídico extracromosómico de múltiples copias para insertar los elementos genéticos según la presente invención. La introducción del elemento genético a través del plásmido en las células huésped implica una escisión inicial de un vector plasmídico con una enzima de restricción, seguida de la ligación del plásmido y los elementos genéticos que codifican la especie enzimática diana según la invención. Tras la recircularización del plásmido recombinante ligado, se utiliza una infección (por ejemplo, empaquetamiento en fago lambda) u otro mecanismo de transferencia de plásmido (por ejemplo, electroporación, microinyección, etc.) para transferir el plásmido a la célula huésped. Los plásmidos adecuados para la inserción de elementos genéticos en la célula huésped son bien conocidos por el experto en la materia.

[0080] Otros métodos de clonación de genes incluyen, entre otros, la integración directa del material genético en el cromosoma. Esto puede ocurrir por una variedad de medios, incluida la clonación de los elementos genéticos descritos en este documento en plásmidos no replicantes flanqueados por secuencias de ADN homólogas del cromosoma huésped; tras transformar dicho plásmido recombinante en un huésped, los elementos genéticos pueden introducirse en el cromosoma mediante recombinación de ADN. Dichas cepas recombinantes se pueden recuperar si los fragmentos de ADN que se integran contienen un marcador seleccionable, como la resistencia a los antibióticos. Alternativamente, los elementos genéticos pueden introducirse directamente en el cromosoma de una célula huésped sin el uso de un plásmido no replicante. Esto se puede hacer produciendo sintéticamente fragmentos de ADN de los elementos genéticos según la presente invención que también contienen secuencias de ADN homólogas del cromosoma huésped. De nuevo, si estos fragmentos de ADN sintético también contienen un marcador seleccionable, los elementos genéticos pueden insertarse en el cromosoma del huésped.

Célula huésped

[0081] Otra forma de realización se refiere a una célula que comprende un polipéptido, un polinucleótido, una construcción de ácido nucleico o un vector para su uso según la invención. Una célula huésped es una célula en la que se puede expresar adecuadamente un polipéptido, un polinucleótido, una construcción de ácido nucleico o un vector.

[0082] La oxidorreductasa puede expresarse favorablemente en una célula huésped. La célula huésped para su uso según la invención puede ser cualquier célula huésped. La célula puede ser una célula procariota, una célula eucariota, una célula vegetal o una célula animal. En dicha célula, uno o más genes pueden eliminarse, desactivarse o interrumpirse total o parcialmente, donde, opcionalmente, uno o más genes codifican proteasa. Según una forma de realización, la célula huésped para su uso según la invención es una célula huésped eucariota. Preferiblemente, la célula eucariota es una célula de mamífero, insecto, planta, hongo o alga. Las células de mamífero preferidas incluyen, p. ej., células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células 293, células PerC6 e hibridomas. Las células de insecto preferidas incluyen, p. ej., células Sf9 y Sf21 y derivados de las mismas. Más preferiblemente, la célula eucariota es una célula fúngica, es decir, una célula de levadura, como Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o cepa Yarrowia. Más preferiblemente de Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica y Pichia pastoris, o una célula fúngica filamentosa. Más preferiblemente, la célula eucariota es una célula fúngica filamentosa.

[0083] Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según lo definido por Hawksworth et al., en Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, octava edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido). Los hongos filamentosos se caracterizan por presentar una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo se produce por elongación de las hifas y el catabolismo del carbono es obligatoriamente aeróbico. Las cepas de hongos filamentosos incluyen, pero no se limitan a, cepas de Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium y Trichoderma.

[0084] Las células fúngicas filamentosas preferidas pertenecen a una especie de un género Aspergillus, Chrysosporium, Penicillium, Talaromyces o Trichoderma, y más preferiblemente una especie de Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Trichoderma reesei o Penicillium chrysogenum. Cuando la célula huésped para su uso según la invención es una célula huésped de Aspergillus, la célula huésped es preferiblemente CBS 513.88, CBS 124.903 o un derivado de las mismas.

[0085] Según otra forma de realización, la célula huésped para su uso según la invención es una célula procariota. Preferiblemente, la célula huésped procariota es una célula bacteriana. El término "célula bacteriana" incluye microorganismos tanto gramnegativos como grampositivos. Las bacterias adecuadas se pueden seleccionar de p. ej., Escherichia, Anabaena, Caulobacter, Gluconobacter, Rhodobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Staphylococcus o Streptomyces. Preferiblemente, la célula bacteriana se selecciona del grupo que consiste en B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. puntis, B. megaterium, B. halodurans, B. pumilus, Gluconobacter oxydans, Caulobacter crescentus CB 15, Methylobacterium extorquens, Rhodobacter sphaeroides, Pseudomonas zeaxanthinifaciens, Pseudomonas putida, Pseudomonas putida S12, Paracoccus denitrificans, E. coli, C. glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium melioti y Rhizobium radiobacter.

[0086] Varias cepas de hongos filamentosos son fácilmente accesibles para el público en una serie de colecciones de cultivos, como American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL): por ejemplo, las cepas Aspergillus niger CBS 513.88, Aspergillus oryzae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC 14488-14491, ATCC 11601, ATCC 12892, P. chrysogenum CBS 455.95, Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Talaromyces emersonii CBS 124.902, Acremonium chrysogenum ATCC 36225 o ATCC 48272, Trichoderma reesei At Cc 26921 o ATCC 56765 o ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC 11906, Chrysosporium lucknowense ATCC 44006. También se pueden usar derivados de las mismas.

[0087] Según otra forma de realización, la célula huésped para su uso según la invención es una célula procariota. Preferiblemente, la célula huésped procariota es una célula bacteriana. El término "célula bacteriana" incluye microorganismos tanto gramnegativos como grampositivos. Las bacterias adecuadas se pueden seleccionar de p. ej., Escherichia, Anabaena, Caulobacter, Gluconobacter, Rhodobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Staphylococcus o Streptomyces. Preferiblemente, la célula bacteriana se selecciona del grupo que consiste en B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. puntis, B. megaterium, B. halodurans, B. pumilus, G. oxydans, Caulobactert crescentus CB 15, Methylobacterium extorquens, Rhodobacter sphaeroides, Pseudomonas putida, Paracoccus zeaxanthinifaciens, Paracoccus denitrificans, E. coli, C. glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium melioti y Rhizobium radiobacter.

[0088] Para usos específicos de un compuesto producido en una célula huésped para su uso según la invención, la selección de la célula huésped puede realizarse de acuerdo con dicho uso. Cuando, p. ej., el compuesto producido en una célula huésped según la invención se vaya a utilizar en aplicaciones alimentarias, se puede seleccionar una célula huésped de un organismo de calidad alimentaria como Saccharomyces cerevisiae. Los usos específicos incluyen, aunque sin carácter limitativo, alimentos, piensos (animales), farmacéuticos, agrícolas, tales como protección de cultivos y/o aplicaciones de cuidado personal.

[0089] La divulgación se refiere además a un método para la preparación de un polipéptido que tiene actividad oxidorreductasa, método que comprende cultivar una célula según la invención en condiciones que permitan la expresión de dicho polipéptido y, opcionalmente, recuperar el polipéptido expresado y un polipéptido obtenible mediante ese método.

Materia prima

[0090] Los cultivos agrícolas naturalmente ricos en fructanos (por ejemplo, raíces de achicoria o topinambur) pueden convertirse en una materia prima rica en HMF mediante hidrólisis convencional (combinada) y procesamiento termoquímico. La tecnología para generar HMF a partir de fructosa está bien establecida y es sólida. También se puede utilizar materia prima rica en glucosa, pero la formación termoquímica de1HMF procede de manera más eficiente a partir de la fructosa. Por lo tanto, se puede incluir una etapa enzimática adicional para convertir la glucosa en fructosa, usando glucosa isomerasa. Este último proceso está bien establecido en la industria alimentaria para producir jarabe de maíz con alto contenido de fructosa (JMAF) a partir de almidón hidrolizado. Para evitar la competencia con las aplicaciones alimentarias, el hidrolizado lignocelulósico sería la materia prima preferida para producir HMF/FDCA.

Biotransformación

[0091] Para la biotransformación de HMF en FDCA, se emplea un biocatalizador robusto de células enteras (células libres o inmovilizadas) que expresa la HMF oxidorreductasa de Cupriavidus basilensis descrita anteriormente en el presente documento. Un biocatalizador de células enteras tiene varias ventajas sobre un catalizador enzimático en este proceso: la HMF oxidorreductasa está protegida de la inactivación química por el sustrato altamente reactivo, y las deshidrogenasas autóctonas del huésped pueden ayudar a la HMF oxidorreductasa en los dos primeros pasos de oxidación que conducen del HMF a (probablemente) el monoácido correspondiente, que luego se convierte en el diácido por HmfH. Preferiblemente, se pueden requerir medidas adicionales para asegurar la regeneración del cofactor. El biocatalizador de células enteras debería permitir un procesamiento mínimo de la corriente de alimentación de HMF, es decir, tolerar preferiblemente un pH bajo, una T alta y los compuestos tóxicos (entre los que se encuentra el sustrato) generados en la hidrólisis/conversión termoquímica de la materia prima. Pseudomonas putida S12 se puede calificar como un organismo huésped adecuado en vista de su tolerancia a diversos estresores químicos, su rango de pH relativamente amplio y la presencia de deshidrogenasas autóctonas que ayudan a la HMF oxidorreductasa, dando como resultado una biotransformación más eficiente de HMF en FDCA.

[0092] Como alternativa al biocatalizador de células enteras, de forma similar al biocatalizador de células enteras, se puede utilizar un lisado celular, una enzima purificada o una enzima inmovilizada sola o como mezcla de enzimas.

Recuperación de productos y biomasa

[0093] Después de la biotransformación, las células pueden separarse del caldo mediante métodos establecidos y reutilizarse. El FDCA puede recuperarse del caldo libre de células mediante precipitación ácida y redisolverse en un disolvente orgánico adecuado a temperatura elevada. Tras la disolución, el FDCA puede recuperarse mediante precipitación ácida y extracción con disolvente, u otros métodos de purificación conocidos en la técnica, con alta pureza en forma diácida, en caso de que se desee.

Usos del FDCA

[0094] El FDCA se puede utilizar como alternativa al tereftalato en la producción de poliésteres. También se puede utilizar como sustrato para una gran variedad de compuestos valiosos. Por ejemplo, es un sustrato conocido para la producción de ácido succínico, 2,5-bis(aminometil)-tetrahidrofurano, 2,5-dihidroximetiltetrahidrofurano, 2,5-dihidroximetilfurano y 2,5-furandicarbaldehído. El FDCA se puede utilizar en la producción de revestimientos, p. ej., en resinas alquídicas y revestimientos termoplásticos. También se puede utilizar como equivalente de xileno en biocombustibles y como disolvente.

[0095] El FDCA puede esterificarse y los ésteres pueden usarse como plastificantes. Puede convertirse en su diol, que puede usarse en poliuretanos y poliésteres similares al PET. Además, se puede convertir en su diamina, la diamina se puede usar como extensor de cadena y la diamina se puede convertir en diisocianato, que se puede usar en la producción de poliuretanos. Mediante el proceso según la invención, el FDCA, y los productos preparados a partir de FDCA, pueden obtenerse a partir de biomasa, incluida la biomasa lignocelulósica, mediante biotransformación.

EJEMPLOS

Metodología general

[0096] Cepas y plásmidos Cupriavidus basilensis HMF 14, depositado en DSMZ: Cupriavidus basilensis HMF 14 = DSM 22875, fecha de deposición: 19 de agosto de 2009, es un aislado de suelo que puede utilizar furanos como única fuente de carbono. Se usó Pseudomonas putida S12 (ATCC 700801) como huésped para la expresión de HMF oxidorreductasa. Se usó Escherichia coli DH5a (Invitrogen) para fines generales de clonación. Se usó el plásmido lanzadera pJT'mcs (no publicado) de E. coli-P. putida derivado de pUCP22 para la expresión de HMF oxidorreductasa bajo el control del componente constitutivo promotor tac. Para la replicación en E. coli, se emplea el origen de replicación pUC; para la replicación en P. putida, se emplea el origen de replicación pRO1600. La expresión del gen hmfH se conduce desde el componente constitutivo promotor tac. El gen marcador de la p-lactamasa (bla) se utiliza para la selección de antibióticos (resistencia a la ampicilina) en E. coli. Para la selección de antibióticos en P. putida, se utiliza el gen marcador de gentamicina acetiltransferasa (gmR).

[0097] En la Fig. 2 se muestra un mapa de plásmido del vector de expresión de HmfH pJT'hmfH. Ptac', promotor tac; rep, origen de replicación de amplio rango de huésped; gmR, gen de resistencia a la gentamicina; bla, betalactamasa; pUC ori, origen de replicación para E. coli.

[0098] Medios y condiciones de cultivo Se utilizó un medio de sales minerales (MM) como medio definido. MM contenía lo siguiente (por litro de agua desmineralizada): 3,88 g de K2HPO4, 1,63 g de NaH2PO4, 2,0 g de (NH4)2SO4, 0,1 g de MgC^6H20, 10 mg de EDTA, 2 mg de ZnSO4-7H20, 1 mg de CaC^2H20, 5 mg de FeSO4-7H20, 0,2 mg de Na2MoO4-2H20, 0,2 mg de CuSO4-5H20, 0,4 mg de COCl2-6H20, y 1 mg de MnCl2-2H20, complementado con una fuente de carbono según lo especificado. Se utilizó caldo Luria (caldo L: 10 g/l de Bacto triptona (Difco), 5 g/l de extracto de levadura (Difco), 5 g/l de NaCl) como medio completo para la propagación de P. putida S12 y cepas derivadas, C. basilensis HMF14 y E. coli DH5a y derivados. El caldo L sólido se solidificó con un 2 % (p/v) de agar (Difco).

[0099] Para los experimentos por lote alimentado, la fase inicial por lotes se realizó en 1 l de medio de sales minerales adaptado con la siguiente composición: 3,88 g de K2HPO4, 1,63 g de NaH2PO4, 2,0 g de (NH4)2SO4, 0,2 g de MgC^6H20, 20 mg de EDTA, 4 mg de ZnSO4-7H20, 2 mg de CaC^2H20, 10 mg de FeSO4-7H20, 0,4 mg de Na2MoO^2H20, 0,4 mg de CuSO^5H20, 0,8 mg de CoCl2-6H20, 2 mg de MnC^2H20, 10 mg/l de gentamicina y glicerol 100 mM. Después del agotamiento del glicerol inicial, se inició la alimentación y se controló para permitir un crecimiento máximo mientras se mantenía el glicerol como sustrato limitante en el cultivo. La solución de alimentación contenía (por l): 368,4 g de glicerol y 10 g/l de MgCl2-6H2O y 12,6 g/l de HMF.

[0100] Antibióticos: se añadió ampicilina (amp) a 100 pg/ml para E. coli. Se añadió gentamicina (g) a 30 pg/ml en caldo Luria y 10 pg/ml en medio de sales minerales para P. putida S12. Los antibióticos se adquirieron de Sigma-Aldrich.

[0101] Cultivo: P. putida y C. basilensis se cultivaron a 30 °C. E. coli se cultivó a 37 °C. Los experimentos con matraces agitados sobre MM se realizaron en botellas Boston (Alltech Applied Sciences BV; Breda, Países Bajos) en una incubadora de agitación horizontal. Los experimentos con matraces de agitación en caldo L se realizaron en matraces Erlenmeyer con tapones de algodón en una incubadora de agitación horizontal. Se realizaron experimentos por lote alimentado en fermentadores de 1 l (New Brunswick Scientific) usando un controlador BioFlo110. La fermentación por lotes inicial se inició con células lavadas de un precultivo durante la noche en 100 ml de MM complementado con glicerol 40 mM y glucosa 2 mM. La velocidad de agitación inicial se fijó en 200 rpm y se suministró aire al espacio de cabeza a 1 l min-1 utilizando un controlador de flujo másico D-5111 de M+W Instruments. La tensión de oxígeno disuelto (OD) se controló continuamente con una sonda InPro modelo 6900 (Mettler Toledo BV; Tiel, Países Bajos) y se mantuvo al 30 % de saturación de aire mediante el ajuste automático de la velocidad de agitación a un máximo de 1000 rpm. Cuando se alcanzó la velocidad máxima de agitación, el aire se reemplazó con oxígeno purificado a un flujo de 0,2 l min-1 y la velocidad máxima de agitación se fijó en 800 rpm. El pH se mantuvo a 7,0 mediante la adición automática de NH4OH al 25 % durante la fase inicial por lotes, durante la fase de alimentación el pH se mantuvo constante mediante la adición automática de NaOH 10 mM. La temperatura se mantuvo a 30 °C.

[0102] Ensayos y métodos analíticos: El contenido de peso seco celular (CDW) de cultivos bacterianos se determinó midiendo la densidad óptica a 600 nm (OD600) utilizando un medidor de densidad celular Biowave (WPA Ltd) o un espectrofotómetro de microplacas universal pQuant MQX200 (Biotek), utilizando microplacas de fondo plano de 96 pocillos (Greiner). Una OD600 de 1,0 corresponde a 0,56 g CDW/l (Biowave) o 1,4 g CDW/l (pQuant) para P. putida.

[0103] Análisis de HPLC: Se analizaron FDCA, HMF, alcohol HMF y ácido HMF mediante RP-HPLC (sistema Agilent 1100) usando un detector de matriz de diodos ajustado a 230 nm. La columna utilizada fue una Zorbax Eclipse XDB-C8 (tamaño de poro de 80 A, área de superficie de 180 m2/g, Agilent) que funcionaba a 25 °C. Como eluyente, un gradiente de acetonitrilo en KH2PO420 mM (pH 2 o pH 6) con acetonitrilo al 1 % a un flujo de 1,2 ml/min, aumentando del 0 al 5 % en 3,5 min y del 5 al 40 % en 2,5 min.

[0104] Preparación de extractos celulares: Se prepararon extractos de células de transformantes de C. basilensis HMF14 o P. putida S12 de tipo silvestre que expresan HMF oxidorreductasa a partir de 50 ml de cultivos en fase de crecimiento exponencial tardío utilizando M^m suplementado con succinato 12 mM (C. basilensis HMF14, OD600 = 1,5) o glucosa 20 mM (P. putida S12, OD600 = 4). Los cultivos se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en 3 ml de tampón de ensayo. Las células se interrumpieron mediante sonicación, utilizando un sonificador Branson (micro punta en modo de pulso, salida establecida en 3 y ciclo de trabajo porcentual establecido en 40 %; 3 ciclos de sonicación: 45 s de pulsación y 15 s de pausa) o un Sonics Vibra-Cell (Sonics & Materials, EE. UU.) (micropunta cónica de 5 mm; modo de pulso establecido en 1 min (pulso de 0,5 s, pausa de 2 s). Después de la sonicación, los desechos se eliminaron centrifugando a 8228 x g durante 3 min a 4 °C. El sobrenadante se desaló usando una columna de filtración en gel PD10 (GE Healthcare) y se usó como extracto celular para ensayos de HMF oxidorreductasa. La concentración de proteínas se midió usando reactivo de Bradford (Sigma-Aldrich).

[0105] Ensayo de HMF oxidorreductasa: Los ensayos de HMF oxidorreductasa se realizaron en extractos de células de transformantes de C. basilensis HMF14 o P. putida S12 de tipo silvestre que expresan la HMF oxidorreductasa de C. basilensis HMF14. Como control negativo, se utilizó el mutante de P. putida S12 o C. basilensis HMF14 de tipo silvestre que llevaba una inserción de transposón en el gen hmfH. El extracto celular se incubó con furfural, furfurilalcohol, HMF o ácido HMF a 30 °C en condiciones oxigenadas. La mezcla de reacción contenía 1 ml de extracto celular, 976 pl de MM saturado de oxígeno, 20 pl de una solución de dinucleótido de flavina y adenina (FAD) 2 mM y 4 pl de una solución madre 0,5 M de sustrato (furfural, furfurilalcohol, HMF o ácido HMF). Se extrajeron muestras a intervalos establecidos y la reacción se detuvo inmediatamente mediante la adición de HCl hasta una concentración final de 1 M. Las concentraciones de sustrato y producto en las muestras se determinaron mediante HPLC. Como control sin oxígeno, se privó de oxígeno a los diferentes componentes de la mezcla de reacción mediante una corriente continua de gas nitrógeno y la misma mezcla de reacción se incubó en viales con espacio de cabeza con un tapón de goma con gas nitrógeno.

[0106] Productos químicos: El estándar analítico de FDCA se adquirió de Immunosource B.V. (Halle-Zoersel, Bélgica). El ácido 5-hidroximetil-furoico (ácido HMF) se adquirió de Matrix Scientific (Columbia SC, Estados Unidos). Se observó que este compuesto estaba altamente esterificado. Inmediatamente antes de su uso, se hirvió durante dos horas una solución 10 mM del ácido HMF esterificado en 2 M H2SO4, se enfrió y se ajustó a pH 7,0 con NaOH después de la adición de 50 mM de tampón fosfato. Todos los demás productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemie B.V. (Zwijndrecht, Países Bajos).

[0107] Técnicas moleculares y genéticas: El ADN genómico se aisló usando el kit de tejido DNeasy (QIAGEN).

El ADN plasmídico se aisló con el kit QIAprep spin miniprep (QIAGEN). Los fragmentos de ADN atrapados en agarosa se aislaron con el kit de extracción en gel QIAEXII (QIAGEN).

[0108] Las reacciones de PCR se realizaron con Accuprime Pfx polimerasa (Invitrogen) conforme a las instrucciones del fabricante. Los cebadores utilizados para amplificar la HMF oxidorreductasa a partir del ADN genómico de C. basilensis HMF14 fueron FN23: 5'-CGGAATTCCACATGACAAGGGGAGACCG-3' (SEQ ID NO:

1) y FN24; 5'-CGGAATTCGCTTCGGTCTTCAACTCGGATG-3' (SEQ ID NO: 2). Las secuencias subrayadas indican un sitio de restricción EcoRI.

[0109] El ADN plasmídico se introdujo en células electrocompetentes utilizando un dispositivo de electroporación Gene Pulser (BioRad).

[0110] El ADN cromosómico que flanquea el transposón se identificó mediante métodos estándar conocidos en la técnica {Ausubel, F.M. et al., Current protocols in molecular biology (Green publishing association, Nueva York;

1987)} y la secuencia de los loci genéticos completos se obtuvieron mediante paseo con cebador. La síntesis de oligonucleótidos y la secuenciación del ADN fueron realizadas por MWG Biotech AG (Alemania).

[0111] Se realizaron otras técnicas estándar de biología molecular según Sambrook y Russell {Sambrook, J, Russel, D.W. Molecular cloning; a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratoy Press, Nueva York: 2001).

Ejemplo I

Producción de FDCA en extracto celular de C. basilensis HMF14

[0112] Cuando el extracto celular de C. basilensis, de un precultivo en fase logarítmica tardía (OD600 ~ 1,5) cultivado en MM suplementado con succinato 12 mM y HMF 3 mM, se incubó con HMF o ácido HMF, se observó la formación de FDCa .

[0113] Cuando se utilizó HMF como sustrato, se observó una acumulación transitoria rápida de ácido HMF y alcohol HMF concurrente con la formación de FDCA. En el extracto celular desalado, la concentración de ácido HMF disminuyó a un ritmo más lento y la producción de FDCA fue más lenta en comparación con el extracto celular crudo. Dado que el FDCA se produjo en el extracto celular desalado, así como en el extracto celular crudo, la conversión de HMF en FDCA no pareció involucrar a los cofactores. Sin embargo, los cofactores u otros componentes de bajo peso molecular del extracto celular crudo parecen tener un efecto sinérgico sobre la formación de FDCA. Cuando se añadió ácido HMF como sustrato, se observó la formación inmediata de FDCA tanto en el extracto celular crudo como en el desalado. Además, se demostró que la presencia de oxígeno era necesaria para la formación de FDCA, ya que no se produjo FDCA en condiciones anaeróbicas. Se observó la conversión estequiométrica del ácido ^h M^f en FDCA.

Ejemplo II

Aislamiento y caracterización del gen hmfH que codifica HMF oxidorreductasa

[0114] Se observó que el gen hmfH codifica una proteína de 62 317 Da que pertenece a la familia de oxidorreductasa glucosa-metanol-colina (GMC) dependiente de FAD. Se demostró que esta enzima tiene la capacidad de oxidar el ácido HMF a ácido furandicarboxílico (FDCA). Además, la enzima también aceptó HMF como sustrato, que se oxidó, a través del ácido HMF, a FDCA. La homología más alta con HmfH en la base de datos NCBI no redundante se observó con la GMC oxidorreductasa de Burkholderia phytofirmans PsJN (etiqueta de locus Bphyt_2180; 68 % de identidad en un tramo de 562 aminoácidos). En función de los datos de secuencia del operón HMF/furfural de C. basilensis HMF14, se identificaron otros degradadores potenciales de HMF/furfural. Se ensayó el crecimiento de cepas seleccionadas en un medio de sales minerales con HMF o furfural como única fuente de carbono. Las cepas que pudieron crecer en HMF tuvieron un hmfH ortólogo que codifica oxidorreductasas que son entre un 45 y un 68 % idénticas a HmfH. Una cepa (Burkholderia xenovorans LB400) no pudo utilizar HMF, aunque su oxidorreductasa era un 44 % idéntica a HmfH.

[0115] La Fig. 3 muestra una representación esquemática de la organización genética de los genes metabólicos furfural y HMF en C. basilensis HMF14 (A) y otras especies (B) que fueron identificadas como potenciales usuarios de furfural y/o HMF. Los colores corresponden a las actividades de las enzimas en la figura 1. Los números en negrita (x/y) debajo de las flechas indican el porcentaje de identidad (x) con la correspondiente proteína HMF14 de C. basilensis en un tramo de aminoácidos y. Los genes ortólogos se identificaron mediante búsquedas de homología BLASTx en la base de datos de proteínas no redundantes del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Los éxitos para el grupo furfural se definieron como relevantes cuando los ortólogos de hmfA, B, C, D y E estaban presentes en un solo genoma, con el hmfA ortólogo que codifica una enzima que es al menos un 50 % idéntica con HmfA. Se utilizó el mismo criterio para definir hmfF y hmfG ortólogos, mientras que el 40 % de identidad con HmfH se utilizó como criterio para hmfH ortólogos. Los números en cursiva indican etiquetas de locus del genoma de la cepa indicada. Las flechas blancas representan genes sin función metabólica. C: Resumen del fenotipo de crecimiento de las cepas de ensayo en medio de sales minerales con furfural o HMF (3 mM) como única fuente de carbono. ND: no determinado.

[0116] En las figuras se da la secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto que codifica HmfH de HMF oxidorreductasa (figura 4) y la secuencia de aminoácidos deducida (figura 3).

Ejemplo III

Clonación de hmfH en P. putida S12 y expresión de la oxidorreductasa codificada

[0117] El gen hmfH que codifica la HMF oxidorreductasa se clonó en el vector de expresión pJT'mcs. El fragmento de PCR obtenido con los cebadores FN23 y FN24 en ADN genómico de C. basilensis HMF14 se digirió con EcoRI (Fermentas). El fragmento digerido se ligó en el vector pJT'mcs digerido con EcoRI y tratado con FastAP (Fermentas), produciendo el plásmido de expresión pJT'hmfH de HmfH. La orientación correcta del inserto hmfH se verificó mediante digestión de control y mediante secuenciación de nucleótidos conocidas en la técnica. La expresión de HMF oxidorreductasa se demostró en extracto celular de P. putida_pJT'hmfH cultivado en MM glucosa 20 mM y gentamicina 10 mg/l (OD600 ~ 4) por la formación de FDCA usando HMF o ácido HMF como sustrato (Tabla 1).

Tabla 1. Formación de FDCA a partir de HMF o ácido HMF en extracto celular de P. putida_pJT'hmfH. Como

'

[0118] Estos resultados confirmaron que la formación de FDCA solo ocurre en presencia de oxígeno, y es catalizada por la oxidorreductasa codificada por hmfH. Cuando se usó HMF como sustrato, se observó una acumulación transitoria de ácido HMF tanto en el extracto celular desalado como en el crudo. La formación de ácido HMF en el extracto celular desalado (eliminados los cofactores de bajo peso molecular) indicó que HmfH no solo oxidó el ácido HMF a FDCA, sino que también puede oxidar el HMF a su forma de ácido monocarboxílico.

[0119] Además de HmfH, también deshidrogenasas aparentemente inespecíficas que son autóctonas de P. putida S12 pueden formar ácido HMF a partir de HMF (Tabla 2), siempre que los equivalentes reductores no se eliminen mediante desalación. La actividad de la aldehído reductasa/alcohol deshidrogenasa dependía de NADH/NAD+, mientras que la actividad de la aldehído deshidrogenasa podría estar respaldada por una combinación de los dos portadores de electrones artificiales, PMS y DCPIP, en los que PMS es el portador de electrones primario y DCPIP es el aceptor de electrones final. También se observaron actividades similares en el extracto celular de C. basilensis HMF14.

Tabla 2. Actividades inespecíficas de HMF-deshidrogenasa medidas en extracto celular de P. putida S12 de tipo silvestre.

[0120] En la figura 4 se muestra la formación de FDCA, alcohol HMF (H-oh) y ácido HMF (H-ácido) a partir de HMF en extracto celular crudo de P. putida S12 pJT'hmfH. La figura 4 ilustra los efectos sinérgicos de las deshidrogenasas endógenas y HmfH en extracto celular de P. putida S12 pJT'hmfH. Primero, se observó una rápida disminución de HMF concomitante con la formación de alcohol HMF que probablemente fue catalizada por la aldehído reductasa. Al mismo tiempo, también comenzaron a acumularse ácido HMF (probablemente a través de la aldehído deshidrogenasa) y FDCA (a través de HmfH). Inmediatamente después de su formación, el alcohol HMF desapareció, probablemente por reoxidación a HMF, ácido HMF y FDCA. Solo el ácido HMF mostró una acumulación significativa antes de oxidarse (casi) completamente a FDCA en un lapso de tiempo de 25 h. Estos resultados sugieren que la oxidación del ácido HMF a FDCA fue el paso limitante de la velocidad en este sistema libre de células.

Ejemplo IV

Transformación de células enteras de HMF a FDCA con P. putida S12 expresando HmfH

[0121] Debido a que las deshidrogenasas endógenas de P. putida S12 pueden actuar sinérgicamente con HmfH en la oxidación de HMF a FDCA proporcionando un medio adicional para generar ácido HMF a partir de HMF, un proceso de biotransformación de células enteras de HMF a FDCA puede tener ventajas sobre un proceso enzimático. Para investigar esta posibilidad, se analizaron las células en reposo, las células en crecimiento y las células alteradas para determinar la producción de HMF a FDCA.

[0122] Los cultivos en matraces agitados se hicieron crecer en 150 ml de MM glicerol 40 mM y glucosa 2 mM suplementados con 10 mg/l de gentamicina en matraces Erlenmeyer de 1 l. Las células se recolectaron al final de la fase logarítmica (OD600 ~ 4), se lavaron y se concentraron en MM suplementado con 19,4 g/l de K2HPO4, 8,15 g/l de NaH2PO4, glicerol 40 mM y 10 mg/l de gentamicina. Se incubaron alícuotas (10 ml) de las suspensiones celulares concentradas (correspondientes a 1,65 g de CDW) con HMF en matraces Erlenmeyer de 250 ml y se extrajeron muestras a intervalos regulares para el análisis de FDCA. Para las células en reposo, se omitió el glicerol del medio de resuspensión y las células alteradas se obtuvieron mediante sonicación.

[0123] Como se ha observado anteriormente, el HMF se convirtió rápidamente en alcoho1HMF y ácido HMF, seguido de una disminución del ácido HMF y la formación simultánea de FDCA. Tanto las tasas de producción de FDCA como las tasas de disminución de ácido HMF se presentan en la Tabla IV-a, para dos concentraciones de HMF analizadas.

Tabla 3. Producción de FDCA a partir de HMF y tasa de disminución del ácido HMF usando células en crecimiento, células en reposo y células sonificadas de P. putida S12 pJT'hmfH, a diferentes concentraciones iniciales de HMF.

[0124] La Tabla 3 muestra que la producción de FDCA fue más eficiente con células en crecimiento de P. putida S12 que expresa HmfH. La tasa general de producción de FDCA, la eficiencia de conversión y la tasa de disminución del ácido HMF fueron más altas para las incubaciones de células en crecimiento. Además, la tasa de producción de FDCA dependía de la concentración inicial de HMF, lo que sugiere que el sistema no estaba saturado.

Ejemplo V

Producción de FDCA por lotes alimentados de HMF con P. putida S12 que expresa HmfH

[0125] Se observó que la producción de FDCA es más eficiente con células en crecimiento de P. putida S12 que expresa HmfH. Por lo tanto, se realizaron experimentos por lotes alimentados para demostrar la producción de FDCA con células enteras de P. putida S12 pJT'hmfH.

[0126] En la fase inicial, se cultivó P. put/da_pJT'hmfH en MM con una alimentación de glicerol hasta una densidad celular de 13 g CDW/l. Al final de esta fase, se inició la alimentación de HMF, administrando HMF a una velocidad de 0,8 mmol/l/h. Sin coalimentación con glicerol, se formaron ácido HMF y FDCA a una velocidad igual a 0,41 mmol/l/h (véase la figura 5). Posteriormente, la alimentación se reemplazó con una solución que contenía HMF 0,21 M y glicerol 4 M, alimentada a aproximadamente 5 ml/h. Con esta alimentación conjunta de glicerol, la concentración de ácido HMF disminuyó rápidamente mientras que la formación de FDCA continuó aproximadamente a la misma velocidad (Fig. 5). El experimento se detuvo cuando se añadió una cantidad total de 44,6 mmol de HMF al lote alimentado. Los resultados mostraron una conversión casi completa (es decir, una eficiencia del 96,5 %) en FDCA.

[0127] En un experimento similar, se coalimentó glicerol a una velocidad media de 0,7 mmol/l/h junto con HMF. En este cultivo de alimentación por lotes, no se observó acumulación del intermedio ácido de HMF y todo e1HMF se convirtió directamente en FDCA (Fig. 6).

Ejemplo VI

Purificación de FDCA a partir de caldo de fermentación

[0128] Se observó que la solubilidad de FDCA a un pH de 1,0 era de alrededor de 1,5 g/l en agua. Esta propiedad se utilizó ventajosamente para la recuperación del producto FDCA del caldo de fermentación. Después de la eliminación de las células por centrifugación (9500 x g durante 5 min), aproximadamente 10 ml de H2SO4 al 96 % se añadieron a 100 ml del caldo clarificado a temperatura ambiente con agitación continua hasta pH 1, con el fin de precipitar FDCA. El precipitado se recuperó mediante centrifugación a 8228 x g durante 10 min y el sedimento secado al aire se redisolvió en metanol a 60 °C. Tras la eliminación de los residuos no disueltos mediante filtración a través de un filtro de 0,22 |_im precalentado, se analizó la pureza del filtrado mediante HPLC. La pureza del FDCA recuperado del caldo de fermentación mediante el procedimiento anterior fue aproximadamente del 65 %. Puede lograrse una purificación adicional de FDCA usando métodos conocidos en la técnica.

Ejemplo VII

Producción de FDCA por lotes alimentados de HMF con P. putida S12 que expresa HmfH

[0129] Se realizó un segundo experimento de producción de FDCA en lotes alimentados con el fin de aumentar el título y la productividad de FDCa con células enteras de P. putida S12 pJT'hmfH.

[0130] En la fase inicial del lote, se cultivó P. putida_pJT'hmfH en MM hasta que se agotó el glicerol inicial (OD600 ~ 8) después de 23,2 horas de fermentación. En este punto, la alimentación de glicerol se inició a una velocidad que permitió un aumento de biomasa de aproximadamente 0,45 g CDW/l/h. Después de 50,7 horas de fermentación, la alimentación de glicerol se redujo a una velocidad que permitió un aumento de biomasa de aproximadamente 0,045 g CDW/l/h. Después de 123,4 horas de fermentación, la alimentación de glicerol se incrementó a una velocidad que permitió un aumento de biomasa de aproximadamente 0,25 g CDW/l/h hasta el final de la fermentación. Durante este período, se aplicó una alimentación de HMF. La alimentación de HMF comenzó a una velocidad de 0,65 mmol/h/g CDW después de 26,7 horas de fermentación, lo que provocó la acumulación de ácido HMF y FDCA. La velocidad de alimentación de HMF se redujo a 0,28 mmol/h/g CDW después de 33,3 horas de fermentación, disminuyó aún más a 0,09 mmol/h/g CDW después de 72,8 horas de fermentación y se detuvo después de 117,4 horas de fermentación. La disminución de la alimentación de HMF condujo a una disminución gradual de la concentración de ácido HMF en el fermentador, mientras que la concentración de FDCA continuó aumentando. La fermentación se detuvo cuando no pudo detectarse más ácido HMF. En este punto, se agregaron 188 mmol de HMF al fermentador, lo que condujo a la producción de aproximadamente 182 mmol de FDCA (es decir, 97 % de eficiencia) a una concentración de 30,8 g/l. La figura 7a muestra la formación de biomasa, ácido HMF y FDCA en el cultivo por lotes alimentados de P. putidajpJT'hmfH. La figura 7b muestra las velocidades de alimentación de glicerol y HMF del mismo cultivo.

Ejemplo VIII

Purificación de FDCA a partir de caldo de fermentación

[0131] Se observó que la solubilidad de FDCA a un pH de 0,5 era de aproximadamente 0,4 g/l en agua. Dado que esta concentración permanece en solución después de la precipitación, el título aumentado obtenido en el ejemplo VIII conduce a una pérdida mucho menor de producto de la purificación por precipitación.

[0132] Después de la eliminación de las células por centrifugación (9500 x g durante 15 min), se hirvieron 500 ml del caldo clarificado durante 3 minutos para precipitar las proteínas y se centrifugaron durante 20 min a 9500 x g. Se añadieron aproximadamente 50 ml de H2SO4 al 96 % al sobrenadante a 4 °C con agitación continua hasta pH 0,5, con el fin de precipitar FDCA. El precipitado se recuperó por centrifugación a 8228 x g durante 20 min, se lavó una vez con 250 ml de agua y se volvió a centrifugar a 8228 x g durante 20 min. El sedimento resultante se secó al aire y luego se disolvió en aproximadamente 1200 ml de tetrahidrofurano (THF) a 30 °C. Tras la eliminación de los residuos no disueltos por filtración, la solución de THF clarificada se evaporó al vacío a 50 °C hasta que quedaron 11,8 g de polvo de FDCA seco con una elevada pureza (>99 %), que es el 78 % del FDCA que había inicialmente en el caldo del fermentador. Si es necesario, la purificación de FDCA se puede optimizar aún más usando métodos conocidos en la técnica.

INDICACIONES RELATIVAS AL DEPÓSITO DE UN MICROORGANISMO

O DE OTRO MATERIAL BIOLÓGICO

(Regla 13A/Hdel PCT)

Formulario PCT/RO/134 (Julio 1992)

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Proceso para la producción de un polímero a partir de uno o más monómeros, comprendiendo el proceso las etapas de:

a) preparar un monómero FDCA mediante la conversión de uno o más precursores furánicos de ácido 2,5-furandicarboxílico (FDCA) en FDCA, mediante reacción con un oxidante en presencia de un catalizador de oxidorreductasa y opcionalmente una o más coenzimas, caracterizado por que el catalizador de oxidorreductasa comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 3,

en el que el catalizador de oxidorreductasa es un biocatalizador de células enteras que es una célula que comprende una construcción de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una oxidorreductasa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, donde , dicha construcción de expresión es expresable en dicha célula y su expresión confiere o aumenta en la célula la capacidad de oxidar el ácido 5-hidroximetilfurfural (^h M^f ) y el ácido 5-hidroximetil-2-furancarboxílico (ácido HMF) a ácido 2,5-furandicarboxílico (FDCA), en comparación con una célula de tipo silvestre correspondiente que carece de la construcción de expresión; y,

b) producir un polímero a partir de uno o más monómeros, donde uno de los monómeros es el monómero FDCA producido en a).

2. Proceso según la reivindicación 1, en el que la célula es una bacteria seleccionada del grupo que consiste en el género Escherichia, Anabaena, Caulobacter, Gluconobacter, Rhodobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Staphylococcus o Streptomyces; o la especie B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. puntis, B. megaterium, B. halodurans, B. pumilus, G. oxydans, Caulobacter crescentus CB 15, Methylobacterium extorquens, Rhodobacter sphaeroides, Pseudomonas putida, Paracoccus zeaxanthinifaciens Paracoccus denitrificans, E. coli, C. glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium melioti y Rhizobium radiobacter.

3. Proceso según la reivindicación 1, en el que la célula es una célula de levadura seleccionada del grupo que consiste en el género Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia; o la especie Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica y Pichia pastoris o una célula fúngica filamentosa del grupo del género Aspergillus, Chrysosporium, Penicillium, Talaromyces o Trichoderma; o la especie Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Trichoderma reesei o Penicillium chrysogenum.

4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que el precursor furánico de FDCA se selecciona del grupo que consiste en 5-hidroximetilfurfural (HMF), 2,5-dihidroximetil furano (alcoho1HMF) y ácido 5-hidroximetil-2-furancarboxílico (ácido HMF).

5. Proceso según la reivindicación 4, en el que el precursor furánico de FDCA es HMF.

6. Proceso según la reivindicación 4 o 5, en el que el HMF se obtiene a partir de uno o más azúcares hexosa por calentamiento en presencia de ácido, en el que preferiblemente el uno o más azúcares hexosa se obtiene a partir de biomasa.

7. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en el que el monómero FDCA se convierte en su diol, que se usa en poliuretanos y poliésteres de tipo PET.

8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en el que el monómero FDCA se convierte en su diamina.

9. Proceso según la reivindicación 9, en el que la diamina se usa como extensor de cadena en la producción de poliuretanos.

10. Proceso según la reivindicación 9, en el que la diamina se convierte en diisocianato y en el que el diisocianato se usa en la producción de poliuretanos.

11. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en el que el polímero es una resina alquídica.

12. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en el que el polímero es un revestimiento termoplástico.