CN108977472B - 一种串联酶法制备2,5-呋喃二甲酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物法制备大宗化学品领域，具体的说是采用生物酶催化氧化5‑羟甲基糠醛(HMF)制备2,5‑呋喃二甲酸(FDCA)的方法。本发明采用两种酶，包括5‑羟甲基糠醛氧化酶和5‑羟甲基糠醛氧化酶突变酶串联催化氧化HMF制备FDCA，实现FDCA的绿色制备过程。本发明所述的技术方案采用酶法催化氧化，在较低温度下进行，能耗小，效率高；在转化过程中不需要加入碱，过程更加简单、绿色；采用空气或者氧气为氧化剂，不需要加入过氧化氢，经济性更好。本发明所提供的技术具有很好的工业化前景。

Description

一种串联酶法制备2,5-呋喃二甲酸的方法

技术领域

本发明涉及生物法制备大宗化学品领域，具体的说是采用生物酶串联催化氧化5-羟甲基糠醛制备2,5-呋喃二甲酸的方法。

技术背景

2，5-呋喃二甲酸(2,5-Furandicarboxylic acid，FDCA)是碳水化合物脱水得到5-羟甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural，HMF)，然后氧化制备得到的具有环状共轭结构的二元酸，其结构与对苯二甲酸(p-Phthalic acid,PTA)十分相似，可替代对苯二甲酸制备聚酯、聚酰胺等材料，其市场规模为几千万吨级，且逐年增长。

在FDCA制备方面，目前主要采用非均相催化氧化HMF制备，催化剂主要为Au[Catalysis Today,2011,160(1):55-60]、Pt[Journal of catalysis,2014,315:67-74]及其负载型催化剂，在碱性溶液或者中性条件下反应，收率可超过90％。研究发现，在碱性条件下收率更高，其原因在于FDCA在碱性环境时成盐，从而不会影响固体催化剂的活性。但是，这一策略在提高收率的同时，却增加了后续的分离困难，需要将FDCA盐分离后重新酸化成FDCA。

生物转化相对于化学转化，具有反应条件温和，选择性高等优点。酶催化转化HMF制备FDCA逐渐引起关注。

Koopmand等将HMF氧化酶基因恶臭假单胞菌中表达，构建了全细胞催化剂，以HMF为原料，FDCA收率达97％[Bioresource Technology,2010,101:6291-629]，但是存在底物浓度较低、反应时间长等问题。Dijkman等从Methylovorus sp中发现了能氧化HMF的酶，将基因在大肠杆菌中表达，发现该酶能将HMF高选择性氧化5-甲酰基-2-呋喃甲酸(5-formyl-2-furancarboxylic acid，FFA)，收率达95％，而FDCA收率较低[Applied andEnvironmental Microbiology,2014,80(3):1082-1090]。Dijkman等进一步研究发现HMFO催化氧化HMF时，主要生成中间体，2,5-二甲酰呋喃(2,5-diformylfuran，DFF)和FFA。DFF然后在辅酶FAD参与的情况下，水合成偕二醇，然后经酶催化氧化成FDCA，加入FAD，FDCA收率可达95％。当不加入FDA时，DFF和FFA转化成FDCA的效率很低[Angewandte ChemieInternational Edition,2014,53:6515-6518]。

为了克服上述存在的问题，本发明将HMF氧化酶的两个氨基酸进行突变，得到HMF突变氧化酶，发现HMF突变氧化酶能催化氧化HMF氧化酶催化氧化HMF的产物，DFF和FFA，得到FDCA。本专利构建了以HMF氧化酶和HMF突变氧化酶串联催化HMF制备FDCA的生物酶法制备过程，实现FDCA的绿色制备过程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶法催化氧化HMF制备FDCA的绿色方法。

为了实现上述目标，本发明采用的技术方案为：

一种酶法制备2,5呋喃二甲酸的方法，将5-羟甲基糠醛溶解在溶剂中，以5-羟甲基糠醛氧化酶为催化剂，在氧气和/或者空气下反应1-48小时，优选24小时；然后加入5-羟甲基糠醛突变氧化酶，在氧气和/或者空气下反应1-48小时，优选24小时，得到2,5呋喃二甲酸。

溶剂为水、磷酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，醋酸-醋酸钠缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠，pH值为3-10，优选pH为7；

5-羟甲基糠醛于溶剂中的浓度为0.001-5mol/L，优选6mmol/L。

所述的5-羟甲基糠醛氧化酶为重组表达蛋白，其基因序列见序列表1，于溶剂中5-羟甲基糠醛氧化酶的加入量为：1-100μmol/L，优选60μmol/L。

所述的5-羟甲基糠醛突变氧化酶为重组表达蛋白，为将5-羟甲基糠醛的基因进行定点突变，其基因序列见序列表2，于溶剂中5-羟甲基糠醛氧化酶的加入量为：1-100μmol/L，优选60μmol/L。

反应的温度为20℃-70℃，优选25℃。

所述反应需在有氧条件下进行，即在氧气和/或空气存在条件下进行。

所述的5-羟甲基糠醛氧化酶制备具有制备过程如下：

将5-羟甲基糠醛氧化酶基因(序列表1)优化合成，用限制性内切酶XhoI和XbaI将HMF氧化酶基因接到pPICZa-A表达载体上，转化至大肠杆菌Top10，通过菌落PCR、酶切筛选鉴定阳性克隆子；重组质粒在大肠杆菌内扩增，用质粒纯化试剂盒回收质粒；将质粒采用电转的方式转入酵母中；挑选毕赤酵母阳性克隆转化子，进入诱导表达阶段，每隔24h向BMMY培养基中补加甲醇至终浓度(V/V)为0.5-1％进行诱导表达，连续表达72-144h；取发酵液离心,收集上清即为5-羟甲基糠醛氧化酶液。

所述的5-羟甲基糠醛突变氧化酶制备具有制备过程如下：

5-羟甲基糠醛突变氧化酶基因与5-羟甲基糠醛氧化酶基因的区别在于5-羟甲基糠醛氧化酶367位的缬氨酸突变为精氨酸，466位色氨酸突变为苯丙氨酸后为5-羟甲基糠醛突变氧化酶；HMF氧化酶基因接到pPICZa-A表达载体上，转化至大肠杆菌Top10后提质粒，设计突变引物扩增突变基因，突变基因转入TOP10，通过菌落PCR筛选鉴定阳性克隆子钙转的方式转入毕赤酵母中表达；进入诱导表达阶段，每隔24h向BMMY培养基中补加甲醇至终浓度(V/V)为0.5-1％进行诱导表达，连续表达72-144h；同时取发酵液离心,收集上清即为突变5-羟甲基糠醛氧化酶液。

本发明具有如下优点：

1.本发明所述的技术方案采用酶法催化氧化，在较低温度下进行，能耗小，效率高。

2.本发明所述的技术方案不需要加入碱，且在水溶液中过程更加简单、绿色。

3.本发明所述的技术方案采用分子氧，即空气或者氧气为氧化剂，不需要加入过氧化氢，经济性更好。

4.与其他生物法制备FDCA的技术相比，本发明所述的技术FDCA的收率更高，具有产业化的意义。

附图说明

图1.HMF氧化酶SDS-PAGE图。

图2.HMF突变氧化酶SDS-PAGE图。泳道1：诱导1d蛋白上清泳道2：诱导2d蛋白上清

泳道3：诱导3d蛋白上清泳道4：HMF突变酶浓缩蛋白。

图3.HMF氧化酶催化HMF反应过程图。HMF:6mM HMFO:200μL100mM磷酸钾缓冲液(pH7.15)27℃通空气。

图4.HMF氧化和HMF突变氧化酶串联催化氧化HMF制备FDCA反应过程图。HMF:22.0mg HMFO:250μL 30ml 100mM磷酸钾缓冲液25℃

HMF完全转化为FFA后加突变HMFO 250μL 25℃。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明：

实施例1、HMF氧化酶制备过程

1.合成5-羟甲基糠醛氧化酶基因(如序列3所示)，用限制性内切酶XhoI和XbaI将HMF氧化酶基因酶切后，连接到用同样的酶双酶切的pPICZa-A表达载体上。经T4连接酶过夜连接。取5μL连接液转化至大肠杆菌Top10，涂在含博莱霉素的抗性平板上过夜培养；取20mL低盐LB培养基于50mL锥形瓶中，加5μL100 mg/ml博莱霉素，接入转化菌种(TOP10)，28℃，摇菌16-18h。

2.质粒提取：将步骤1中获得的菌液5000r离心5min。去上清液，沉淀用质粒试剂盒提取质粒。

3.质粒的转化，具体步骤如下：

(1)将步骤2中提取的质粒，转移到离心管中250μL，加入30μL bufferL，加20μLsacI酶，机械振荡摇匀，离心0.5min，封口膜封口，37℃培养箱放置5-10h。(2)5h后取出，冰箱4℃放置10min，加600μL无水乙醇，得线性化的重组质粒。

(3)取1-5μL加入到80μL毕赤酵母感受态细胞X-33菌液中，移入0.2cm电转化杯，冰浴5分钟；

(4)擦干水汽，置电转仪上，选择酵母参数(电击参数：1500V，200V，25μF)电转化；

(5)电击后立即加入1mL冰浴的1mol/L山梨醇，转入15ml离心管中，30度静置1h,然后加入2ml YPD培养基(w/v,1％酵母提取物,2％蛋白胨,2％葡萄糖)30度摇菌3h；

(5)低速离心后涂YPD板(w/v,1％酵母提取物,2％蛋白胨,2％葡萄糖,100μg/ml博来霉素)；

4.待步骤3中的菌长成，分别挑取10个单菌落(大而分散)到10μL无菌水中，做菌落PCR以及琼脂糖凝胶电泳，选择目的菌落。

5.诱导转化：选取琼脂糖凝胶电泳中最亮的条带对应的菌落，挑取单菌落，接种于200mLBMGY培养基中，28℃摇床摇20-24h，至OD₆₀₀＝2-6。将长成的菌液1500rpm离心5min，去上清，用BMMY培养基重悬细胞共200mL，分装在四个500mL的锥形瓶中，26℃摇床培养4天。每隔24h加甲醇(50％)0.5mL，并取样100μL。留做SDS-PAGE

6.浓缩：培养4天后菌液8000rpm离心20min，用30000超滤管5000rpm浓缩得到HMF氧化酶。

实施例2、HMF突变氧化酶制备过程

1.合成5-羟甲基糠醛突变氧化酶基因(如序列4所示)，用限制性内切酶XhoI和XbaI将HMF氧化酶基因酶切后，连接到用同样的酶双酶切的pPICZa-A表达载体上。经T4连接酶过夜连接。取5μL连接液转化至大肠杆菌Top10，涂在含博莱霉素的抗性平板上过夜培养；取20mL低盐LB培养基于50mL锥形瓶中，加5μL100 mg/ml博莱霉素，接入转化菌种(TOP10)，28℃，摇菌16-18h。

2.质粒提取：将步骤1中获得的菌液5000r离心5min。去上清液，沉淀用质粒试剂盒提取质粒。

3.基因突变及扩增：以步骤2中得到的质粒为模板，正向引物:CCTGTGTCCGGCCTCGCTAGCGCTCGTTTCTGGGGYGAACAAGCCTAGCAGC,反向引物：

GATCCTAGCGGTGCCGGAAGCATGGAACACTCCGCCCACGTTGGTCCTCAGG进行PCR扩增，获得突变的双链DNA引物，并以此为引物进行PCR扩增。

4.质粒的转化：将步骤3中得到的PCR扩增产物进行消化(9μL PCR产物+1μLDpN1)，37℃下过夜消化。消化后的产物加入到100μL已制备好的E.coli Top10感受态细胞中，在冰上混匀，放置10min。采用如下步骤进行转化：

(1)、将装有混合好的体系的2mL离心管置于42℃水浴中，热击2min

(2)、将离心管从水浴中取出，立即冰浴2min。

(3)、加入1mL低盐LB培养基，37℃，100r/min培养45min。

(4)、1500r/min离心5min，弃上清800μL。

(5)、将上述剩余体系用枪吹打混匀，涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养12～16h，观察菌落生长情况。从转化的平板上挑取新鲜的单菌落少许直接溶解到PCR反应混合物中，混匀后于PCR仪上进行反应菌落PCR验证筛选阳性克隆子，提取质粒。

6.质粒提取，挑取单菌落在5mL低盐LB培养基(博莱霉素1.5μL)中，37℃下培养过夜，用质粒抽提试剂盒进行质粒的提取，提取方法参见试剂盒说明书。

7.质粒转化，步骤6中质粒用Sac I限制性内切酶在37℃温育箱中过夜线性化。线性化体系：85μL重组质粒，10μL bμffer L，5μL限制性内切酶Sac I。

在线性化产物中加入400μL无水乙醇，混匀后于-20℃静置10min，离心弃上清，待无水乙醇挥发干净后加入10μL ddH₂O，混匀后转化至毕赤酵母X-33感受态细胞中(电转条件：Voltage(V)2000，Capacitance(μF)25，Resistance(Ω)200，Cμvette(mm)2)涂YPDSZ平板，28℃培养4天。

8.诱导表达。挑取单菌落，接种于200mLBMGY培养基中，28℃摇床摇20-24h，至OD₆₀₀＝2-6。将长成的菌液1500rpm离心5min，去上清，用BMMY培养基重悬细胞共200mL，分装在四个500mL的锥形瓶中，26℃摇床培养4天。每隔24h加甲醇(50％)0.5mL，并取样100μL。留做SDS-PAGE。

9.浓缩：培养4天后菌液8000rpm离心20min，用30000超滤管5000rpm浓缩得到HMF突变氧化酶。

实施例3、HMF氧化酶催化氧化HMF过程

取23.8mg HMF于30mL 100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.15)中，加入200μL HMFO于27℃下搅拌反应24h。HPLC检测HMF转化率100％，FDCA收率4.5％。

实施例4、HMF突变氧化酶催化氧化HMF过程

取23.3mg HMF于30mL 100mM磷酸钾缓冲液中(pH 7.15)中，加入200μL HMF突变氧化酶，25℃搅拌反应24h。HPLC检测HMF不转化，检测不到FDCA。

实施例5、HMF氧化酶和HMF突变氧化酶串联催化氧化HMF过程

取22.0mg HMF于30mL 100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.15)中，加入200μL HMFO，27℃搅拌反应至HMF转化完全，然后加入200μL HMF突变氧化酶，25℃下搅拌反应36h。HPLC检测HMF转化率100％，FDCA收率99％。

实施例6、HMF氧化酶和HMF突变氧化酶串联催化氧化HMF过程

分别取50μL 20mg/mL HMF溶于930μL 50mM甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.2)，醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.0 5.0),50mM Tris-Hcl缓冲液(pH 8.0 8.9)50mM甘氨酸-氢氧化钠(pH9.0 10.0)中，分别加入20μL HMF氧化酶，25℃反应2h。然后分别加入20μL HMF突变氧化酶，25℃反应2h。HPLC检测发现甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.2)中HMF不转化；醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.0 5.0)中HMF转化率98％，FDCA收率95％；甘氨酸-氢氧化钠(pH 9.0 10.0)中HMF转化率99％，FDCA收率97％。

实施例7、HMF氧化酶和HMF突变氧化酶串联催化氧化HMF过程取6组50μL 20mg/mLHMF于930μL 50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中，加入20μL HMF突变氧化酶，分别在20，30，40，50，60，70℃下反应2h。然后加入20μL HMF氧化酶，继续反应2h。HPLC检测HMF转化率分别为100％，100％，99％，99％，99％和99％，FDCA收率分别为99％，99％，98％，98％，96％和94％。

实施例8、HMF氧化酶和HMF突变氧化酶串联催化氧化HMF过程

取23.0mg HMF于30ml 100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.15)中，加入20，40，80，120，160，200μL HMFO，27℃搅拌反应12h，然后分别加入20，40，80，120,160，200μL HMF突变氧化酶，25℃下搅拌反应36h。HPLC检测HMF转化率分别为90％，94％，96％，99％，100％和100％，FDCA收率分别为88％，92％，95％，98％，99％和99％。

ATGACCGACACCATCTTCGATTACGTGATCGTCGGCGGAGGCACCGCCGGCAGCGTGCTGGCTAATAGGCTGAGCGCCCGGCCTGAGAACAGGGTGCTGCTGATCGAGGCTGGCATCGATACCCCCGAGAACAACATCCCCCCCGAGATCCATGACGGCCTCAGGCCCTGGCTCCCTAGGCTGTCCGGAGACAAGTTCTTCTGGCCCAACCTCACCATTCACAGGGCCGCTGAGCATCCCGGCATCACCAGGGAGCCTCAGTTCTACGAACAGGGCAGGCTGCTGGGCGGCGGATCCTCCGTCAACATGGTGGTGTCCAACCGGGGCCTCCCCAGGGACTACGATGAGTGGCAGGCTCTGGGAGCCGACGGCTGGGATTGGCAGGGAGTGCTGCCCTACTTCATCAAGACCGAGAGGGATGCCGACTACGGAGATGATCCCCTGCATGGCAACGCCGGCCCTATCCCTATTGGCAGGGTGGACAGCAGGCACTGGTCCGACTTCACAGTGGCTGCTACCCAAGCTCTGGAGGCCGCTGGCCTGCCCAATATCCACGACCAGAACGCCAGGTTTGACGATGGCTATTTCCCCCCCGCTTTTACCCTGAAGGGCGAGGAGCGGTTTAGCGCCGCTAGGGGCTACCTGGATGCCTCCGTGAGGGTGCGGCCTAACCTGAGCCTCTGGACCGAGAGCCGGGTCCTGAAGCTCCTGACCACCGGAAACGCCATCACCGGCGTGAGCGTCCTGAGGGGCAGGGAAACCCTGCAGGTCCAGGCCAGGGAGGTGATCCTGACAGCCGGAGCCCTGCAGAGCCCTGCTATCCTGCTGCGGACCGGCATCGGCCCTGCTGCCGACCTGCATGCTCTCGGCATTCCTGTGCTCGCTGATAGGCCTGGCGTGGGACGGAACCTGTGGGAGCACAGCTCCATCGGCGTGGTGGCTCCCCTGACAGAGCAGGCTAGGGCTGACGCTAGCACCGGAAAGGCCGGAAGCAGGCACCAGCTCGGAATCCGGGCTTCCTCCGGAGTGGACCCTGCTACCCCCTCCGATCTGTTCCTGCACATCGGCGCCGATCCTGTGTCCGGCCTCGCTAGCGCTGTGTTCTGGGTGAACAAGCCTAGCAGCACCGGCTGGCTGAAGCTCAAGGACGCTGACCCCTTCAGCTACCCCGATGTGGACTTCAACCTGCTGTCCGATCCCCGGGATCTGGGAAGGCTGAAGGCTGGCCTGAGGCTGATCACACACTACTTCGCCGCCCCTAGCCTGGCTAAGTATGGCCTGGCTCTGGCCCTGAGCAGGTTTGCTGCTCCTCAGCCTGGCGGCCCCCTCCTGAATGACCTGCTCCAGGACGAGGCCGCCTTAGAAAGGTACCTGAGGACCAACGTGGGCGGAGTGTGGCATGCTTCCGGCACCGCTAGGATCGGCAGGGCCGACGATAGCCAGGCTGTGGTGGACAAGGCTGGCAGGGTCTACGGCGTGACAGGCCTGAGGGTGGCCGATGCCTCCATCATGCCTACCGTCCCTACCGCTAACACAAACCTGCCTACCCTGATGCTCGCCGAAAAGATCGCTGACGCTATCCTGACCCAGGCTTGA

序列3.HMF氧化酶基因序列

ATGACCGACACCATCTTCGATTACGTGATCGTCGGCGGAGGCACCGCCGGCAGCGTGCTGGCTAATAGGCTGAGCGCCCGGCCTGAGAACAGGGTGCTGCTGATCGAGGCTGGCATCGATACCCCCGAGAACAACATCCCCCCCGAGATCCATGACGGCCTCAGGCCCTGGCTCCCTAGGCTGTCCGGAGACAAGTTCTTCTGGCCCAACCTCACCATTCACAGGGCCGCTGAGCATCCCGGCATCACCAGGGAGCCTCAGTTCTACGAACAGGGCAGGCTGCTGGGCGGCGGATCCTCCGTCAACATGGTGGTGTCCAACCGGGGCCTCCCCAGGGACTACGATGAGTGGCAGGCTCTGGGAGCCGACGGCTGGGATTGGCAGGGAGTGCTGCCCTACTTCATCAAGACCGAGAGGGATGCCGACTACGGAGATGATCCCCTGCATGGCAACGCCGGCCCTATCCCTATTGGCAGGGTGGACAGCAGGCACTGGTCCGACTTCACAGTGGCTGCTACCCAAGCTCTGGAGGCCGCTGGCCTGCCCAATATCCACGACCAGAACGCCAGGTTTGACGATGGCTATTTCCCCCCCGCTTTTACCCTGAAGGGCGAGGAGCGGTTTAGCGCCGCTAGGGGCTACCTGGATGCCTCCGTGAGGGTGCGGCCTAACCTGAGCCTCTGGACCGAGAGCCGGGTCCTGAAGCTCCTGACCACCGGAAACGCCATCACCGGCGTGAGCGTCCTGAGGGGCAGGGAAACCCTGCAGGTCCAGGCCAGGGAGGTGATCCTGACAGCCGGAGCCCTGCAGAGCCCTGCTATCCTGCTGCGGACCGGCATCGGCCCTGCTGCCGACCTGCATGCTCTCGGCATTCCTGTGCTCGCTGATAGGCCTGGCGTGGGACGGAACCTGTGGGAGCACAGCTCCATCGGCGTGGTGGCTCCCCTGACAGAGCAGGCTAGGGCTGACGCTAGCACCGGAAAGGCCGGAAGCAGGCACCAGCTCGGAATCCGGGCTTCCTCCGGAGTGGACCCTGCTACCCCCTCCGATCTGTTCCTGCACATCGGCGCCGATCCTGTGTCCGGCCTCGCTAGCGCTCGTTTCTGGGTGAACAAGCCTAGCAGCACCGGCTGGCTGAAGCTCAAGGACGCTGACCCCTTCAGCTACCCCGATGTGGACTTCAACCTGCTGTCCGATCCCCGGGATCTGGGAAGGCTGAAGGCTGGCCTGAGGCTGATCACACACTACTTCGCCGCCCCTAGCCTGGCTAAGTATGGCCTGGCTCTGGCCCTGAGCAGGTTTGCTGCTCCTCAGCCTGGCGGCCCCCTCCTGAATGACCTGCTCCAGGACGAGGCCGCCTTAGAAAGGTACCTGAGGACCAACGTGGGCGGAGTGTTCCATGCTTCCGGCACCGCTAGGATCGGCAGGGCCGACGATAGCCAGGCTGTGGTGGACAAGGCTGGCAGGGTCTACGGCGTGACAGGCCTGAGGGTGGCCGATGCCTCCATCATGCCTACCGTCCCTACCGCTAACACAAACCTGCCTACCCTGATGCTCGCCGAAAAGATCGCTGACGCTATCCTGACCCAGGCTTGA

序列4.HMF突变氧化酶基因序列

本发明采用两种酶，包括5-羟甲基糠醛氧化酶和5-羟甲基糠醛氧化酶突变酶串联催化氧化HMF制备FDCA，实现FDCA的绿色制备过程。本发明所述的技术方案采用酶法催化氧化，在较低温度下进行，能耗小，效率高；在转化过程中不需要加入碱，过程更加简单、绿色；采用空气或者氧气为氧化剂，不需要加入过氧化氢，经济性更好。本发明所提供的技术具有很好的工业化前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种串联酶法制备2,5-呋喃二甲酸的方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

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acccccgaga acaacatccc ccccgagatc catgacggcc tcaggccctg gctccctagg 180

ctgtccggag acaagttctt ctggcccaac ctcaccattc acagggccgc tgagcatccc 240

ggcatcacca gggagcctca gttctacgaa cagggcaggc tgctgggcgg cggatcctcc 300

gtcaacatgg tggtgtccaa ccggggcctc cccagggact acgatgagtg gcaggctctg 360

ggagccgacg gctgggattg gcagggagtg ctgccctact tcatcaagac cgagagggat 420

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ctgcccaata tccacgacca gaacgccagg tttgacgatg gctatttccc ccccgctttt 600

accctgaagg gcgaggagcg gtttagcgcc gctaggggct acctggatgc ctccgtgagg 660

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gaggtgatcc tgacagccgg agccctgcag agccctgcta tcctgctgcg gaccggcatc 840

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<213> HMF突变氧化酶基因

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acccccgaga acaacatccc ccccgagatc catgacggcc tcaggccctg gctccctagg 180

ctgtccggag acaagttctt ctggcccaac ctcaccattc acagggccgc tgagcatccc 240

ggcatcacca gggagcctca gttctacgaa cagggcaggc tgctgggcgg cggatcctcc 300

gtcaacatgg tggtgtccaa ccggggcctc cccagggact acgatgagtg gcaggctctg 360

ggagccgacg gctgggattg gcagggagtg ctgccctact tcatcaagac cgagagggat 420

gccgactacg gagatgatcc cctgcatggc aacgccggcc ctatccctat tggcagggtg 480

gacagcaggc actggtccga cttcacagtg gctgctaccc aagctctgga ggccgctggc 540

ctgcccaata tccacgacca gaacgccagg tttgacgatg gctatttccc ccccgctttt 600

accctgaagg gcgaggagcg gtttagcgcc gctaggggct acctggatgc ctccgtgagg 660

gtgcggccta acctgagcct ctggaccgag agccgggtcc tgaagctcct gaccaccgga 720

aacgccatca ccggcgtgag cgtcctgagg ggcagggaaa ccctgcaggt ccaggccagg 780

gaggtgatcc tgacagccgg agccctgcag agccctgcta tcctgctgcg gaccggcatc 840

ggccctgctg ccgacctgca tgctctcggc attcctgtgc tcgctgatag gcctggcgtg 900

ggacggaacc tgtgggagca cagctccatc ggcgtggtgg ctcccctgac agagcaggct 960

agggctgacg ctagcaccgg aaaggccgga agcaggcacc agctcggaat ccgggcttcc 1020

tccggagtgg accctgctac cccctccgat ctgttcctgc acatcggcgc cgatcctgtg 1080

tccggcctcg ctagcgctcg tttctgggtg aacaagccta gcagcaccgg ctggctgaag 1140

ctcaaggacg ctgacccctt cagctacccc gatgtggact tcaacctgct gtccgatccc 1200

cgggatctgg gaaggctgaa ggctggcctg aggctgatca cacactactt cgccgcccct 1260

agcctggcta agtatggcct ggctctggcc ctgagcaggt ttgctgctcc tcagcctggc 1320

ggccccctcc tgaatgacct gctccaggac gaggccgcct tagaaaggta cctgaggacc 1380

aacgtgggcg gagtgttcca tgcttccggc accgctagga tcggcagggc cgacgatagc 1440

caggctgtgg tggacaaggc tggcagggtc tacggcgtga caggcctgag ggtggccgat 1500

gcctccatca tgcctaccgt ccctaccgct aacacaaacc tgcctaccct gatgctcgcc 1560

gaaaagatcg ctgacgctat cctgacccag gcttga 1596

Claims (5)

1.一种酶法制备2,5呋喃二甲酸的方法，其特征在于：将5-羟甲基糠醛溶解在溶剂中，以5-羟甲基糠醛氧化酶为催化剂，在氧气和/或者空气下反应1-48小时；然后加入5-羟甲基糠醛突变氧化酶，在氧气和/或者空气下反应1-48小时，得到2,5呋喃二甲酸；溶剂为磷酸盐缓冲液，醋酸-醋酸钠缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠，所述的5-羟甲基糠醛氧化酶的基因序列如序列3所示，所述的5-羟甲基糠醛突变氧化酶的基因序列如序列4所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述溶剂的pH值为3-10；5-羟甲基糠醛于溶剂中的浓度为 0.001-5mol/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：溶剂中5-羟甲基糠醛氧化酶的加入量为：1-100μmol/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：溶剂中5-羟甲基糠醛氧化酶的加入量为：60μmol/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：反应的温度为20℃-70℃。

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