CN116355974B - 一种酶-化学法合成呋喃铵盐的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于呋喃铵盐制备的技术领域，具体涉及一种酶‑化学法合成呋喃铵盐的生产工艺。本发明提供了一种新型的、双酶催化的呋喃铵盐绿色合成工艺，该工艺以廉价易得的糠醛和甲醛为原料，经ThDP依赖型脱羧酶高效催化生成2‑呋喃基羟甲基酮，2‑呋喃基羟甲基酮之后被氧化酶氧化为呋喃酮酸，最后呋喃酮酸再经过化学法合成呋喃铵盐。本发明提供的呋喃铵盐绿色合成工艺，涉及到的双酶催化步骤可无缝集成到当前传统的化学合成工艺中，取代污染、耗能最为严重的步骤，极大地缩短了呋喃铵盐的制备反应路线，具有起始原料易获得、低成本、高效、环保、节能等多方面优势，有利于实现工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及呋喃铵盐的制备领域，具体涉及一种酶-化学法制备呋喃铵盐的生产工艺。
背景技术
呋喃铵盐是临床上运用很广的抗生素头孢呋辛的关键中间体之一，头孢呋辛是一种非经胃肠给药的半合成广谱头孢素菌类抗生素。
目前呋喃铵盐的主流生产工艺是采用乙酰呋喃为原料，首先经过氧化制得呋喃酮酸，再经甲氧胺肟化、通入氨气成盐得到呋喃铵盐。然而，现有市场上销售的乙酰呋喃基本是先采用糠醛脱羰基制得呋喃，再用醋酐酰化的方法来制备的。
但是，乙酰呋喃的原材料价格较高，随着市场竞争越来越激烈，导致呋喃铵盐的产品利润逐渐下滑，价格由2020年的每吨30万元左右下滑至目前的每吨15万元左右。
因此，亟需开发一种原料简单易得、绿色高效的呋喃铵盐制备工艺，缩短呋喃铵盐传统制备方法的反应路线，降低呋喃铵盐的生产成本，以适应当前市场的需求，这对促进呋喃铵盐的产业化升级意义重大。
发明内容
为了解决上述的技术问题，实现低成本、高效、绿色地制备呋喃铵盐，本发明开发了一种以糠醛和甲醛为原料，酶法和化学法相结合生产呋喃铵盐的新工艺。
本发明所提供的生产工艺，以糠醛和甲醛为起始原料，经过脱羧酶一步制得2-呋喃基羟基甲基酮，然后再通过氧化酶氧化制得呋喃铵盐中间体呋喃酮酸，不仅原料来源广泛、价格低廉，而且从起始原料到呋喃酮酸只需要两步酶催化，这样将显著缩短原本的反应路线，极大地降低了呋喃铵盐的生产成本。
具体的工艺路线如下式1。
式1双酶-化学法合成呋喃铵盐的工艺路线
目前还没有关于该工艺的相关报道。
需要进一步说明的是，本发明人在以往的研究(专利CN114591938A)过程中发现，采用酶法将糠醛转化成醇酮，应用于呋喃铵盐的制备过程中虽然已经能够较大程度地降低生产成本。但是研究发现，在后续的反应过程中，由于醇羟基与酮羰基均极易被氧化，在水溶液的条件下，难以找到一种传统的化学氧化剂在将醇羟基氧化成羧基的前提下，保证酮羰基不被氧化，所以，要想进一步在水溶液中实现把酮醇氧化成酮酸，经过大量的实验验证目前在化学上难以实现；唯一可行的方式就是将所获得的酮醇进行提纯，使其处于非水溶液的环境状态中，并采用有机溶剂萃取、蒸干，进一步采用化学方法把它氧化成酮酸，但是如此操作的成本太高，不利于呋喃铵盐的规模化生产。
因此，为了更进一步地缩短呋喃铵盐的制备路线，降低生产成本，本发明提供了一种从初始原料到呋喃铵盐的双酶-化学法生产工艺。
本发明提供的一种酶-化学法合成呋喃铵盐的工艺，包括如下的步骤：
(1)以糠醛和甲醛为底物，接着加入辅酶ThDP和含有Mg2+的物质，同时加入脱羧酶作为催化剂于一定温度及pH条件下进行反应，在脱羧酶的催化下反应生成2-呋喃基羟甲基酮；
(2)在步骤(1)糠醛转化率达到85％以上时，加入氧化酶作催化剂于一定温度及pH条件下进行反应，将步骤(1)中生成的2-呋喃基羟甲基酮氧化为呋喃酮酸；
(3)将步骤(2)获得的呋喃酮酸经肟化后加入氨气，制得呋喃铵盐。
上述的步骤(1)中，以糠醛和甲醛为原料。
上述的步骤(1)中，所述的脱羧酶，是以湿细胞的形态加入，湿细胞为脱羧酶的异源表达宿主，或由其他可产生脱羧酶的微生物经培养和诱导表达后离心收集而成，湿细胞的有效成分为脱羧酶。
优选的，步骤(1)中所述有效成分为脱羧酶的湿细胞的加入量为10-30g/L。
优选的，步骤(1)中，所述的脱羧酶，其有效成分包含ThDP依赖型脱羧酶。
优选的，辅酶ThDP的浓度为0.03-0.08g/L。
优选的，步骤(1)中，所述的脱羧酶，包含丙酮酸脱羧酶(PDC)、苯甲酰甲酸酯脱羧酶(BFD)、苯甲醛裂解酶(BAL)、α-酮酸脱羧酶(KDCA)中的任一种。
优选的，上述的步骤(1)中，加入的含有Mg2+的物质中Mg2+的浓度为0.03-0.10g/L。
优选的，上述的步骤(1)中，所加入的糠醛浓度为50-60g/L，加入的甲醛的摩尔浓度为糠醛的1-3倍。
上述的步骤(2)中，所述的氧化酶是以湿细胞的形态加入，湿细胞为氧化酶的异源表达宿主经培养和诱导表达后离心收集而成，湿细胞的有效成分为氧化酶。
优选的，步骤(2)中所述有效成分为氧化酶的湿细胞的加入量为20-40g/L。
优选的，步骤(2)中，所述的氧化酶，其有效成分包括半乳糖氧化酶、醇氧化酶、醛氧化酶、非特异性过加氧酶(UPO)中的至少一种。
上述的步骤(2)中，所述的反应温度为20-40℃，pH为5.0-8.0。
上述的步骤(2)中，在加入氧化酶的同时还加入酶激活剂、含有Cu2+的物质及过氧化氢酶或者可使过氧化氢分解为水和氧气的等效物。
优选的，上述所述的酶激活剂，为辣根过氧化物酶；或者，所述的酶激活剂，选自与辣根过氧化物酶的等效替代物中的任一种；或者，所述的酶激活剂，选自Mn(OAc)3、MnF3中的任一种。
优选的，步骤(2)中，加入氧化酶的同时还加入浓度为0.005-0.015g/L的酶激活剂、Cu2+浓度为0.5-1.5mM的含有Cu2+的物质以及浓度为0.1-0.3g/L的过氧化氢酶或者可使过氧化氢分解为水和氧气的等效物。
本发明提供的一种酶-化学法合成呋喃铵盐的生产工艺，包括以下步骤：
(1)以糠醛和甲醛为底物，接着加入辅酶ThDP和可溶性镁盐，同时加入脱羧酶作为催化剂于一定温度及pH的条件下进行反应，在脱羧酶的催化下生成2-呋喃基羟甲基酮；
其中，糠醛浓度为50-60g/L，加入的甲醛的摩尔浓度为糠醛的1-3倍，辅酶ThDP的浓度为0.03-0.08g/L，含有Mg2+的物质中Mg2+的浓度为0.03-0.10g/L，反应温度为20-50℃，pH 6.0-8.0，反应时间为6-15h；
其中，所述的脱羧酶是以湿细胞的形态加入，湿细胞为脱羧酶的异源表达宿主，或由其他可产生脱羧酶的微生物经培养和诱导表达后离心收集而成，湿细胞的有效成分为脱羧酶；
所述有效成分为脱羧酶的湿细胞的加入量为10-30g/L；
(2)在步骤(1)糠醛转化率达到85％以上时，加入氧化酶作催化剂进行反应，同时加入过氧化氢酶、辣根过氧化物酶和含有Cu2+的物质，于20-40℃，pH为5.0-8.0的条件下，将步骤(1)中生成的2-呋喃基羟甲基酮氧化为呋喃酮酸；
其中，所述的氧化酶是以湿细胞的形态加入，湿细胞为氧化酶的异源表达宿主经培养和诱导表达后离心收集而成，湿细胞的有效成分为氧化酶；
所述有效成分为氧化酶的湿细胞的加入量为20-40g/L；
(3)将步骤(2)获得的呋喃酮酸经肟化后加入氨气制得呋喃铵盐。
本发明的有益效果在于：
1.本发明所提供的酶-化学法合成呋喃铵盐生产工艺，从反应原料到呋喃酮酸仅经过两步酶催化反应即可实现，从呋喃酮酸再经肟化通氨即可获得呋喃铵盐，提供了一种新型的生物-化学合成呋喃铵盐的生产工艺，极大地缩短了呋喃铵盐的合成路线；
2.本发明所提供的生产工艺，不仅原料成本低廉，而且以具有高选择性和催化性的生物酶取代传统化学试剂的使用，整个工艺过程的毒性和危险性大幅度降低，且无需化学蒸馏和酰化等繁琐操作，具有操作工艺简单，呋喃铵盐收率高等优势，本发明的工艺所获得的呋喃铵盐收率均大于90％。
附图说明
图1为脱羧酶催化反应产物2-呋喃基羟甲基酮的HPLC图谱；
图2为氧化酶催化反应产物呋喃酮酸的HPLC图谱；
图3为肟化产物呋喃铵盐的HPLC图谱。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好地理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，并不以任何方式限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明专利之后，本领域技术人员对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落入本申请所述权利书要求所限定的范围。
主要试剂与耗材
pET-28a(+)质粒为已知的大肠杆菌表达载体，载体大小为5369bp，T7启动子，载体标签N-6×His和C-6×His，载体抗性Kanamycin(卡那霉素)，购自Novogen公司；E.coli DH5α感受态细胞(货号：G6016)，E.coli BL21(DE3)感受态细胞(货号：G6030)，均购买自昂羽生物公司；琼脂粉(货号：A8190)，购买值Solarbio公司；TRYPTONE(货号：LP0042)和YEASTEXTRACT(货号：LP0021)均购买自OXOID公司，NaCl(货号：10019318)、K2HPO4〃3H2O(货号：10017518)、KH2PO4(货号：10017618)和丙三醇(货号：10010618)等试剂均购买自国药集团化学试剂有限公司。
LB培养基、TB培养基的制备见本发明人专利CN114591938A中所公开的方法。
若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域的常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。
若未特别说明，以下实施例中使用的方法均为本领域常规方法，使用的实验条件均为本领域常规实验条件，可参考相关实验手册或厂商说明书。
实施例1脱羧酶的合成
将脱羧酶基因在大肠杆菌中进行异源表达，用以合成脱羧酶。具体步骤如下：
(1)蛋白表达感受态细胞转化
从-80℃超低温冰箱中分别取出E.coli BL21(DE3)、E.coli Rosetta(DE3)和Overexpress C43(DE3)、E.coli BL21-condon plus(DE3)感受态细胞，冰上放置；
待细胞融化后，分别向每种感受态细胞中加入1μL含有脱羧酶基因的pET-28a(+)质粒，冰上放置30min，然后42℃热激50s，再冰上放置3min，之后加入600μL无菌LB液体培养基，37℃，200rpm摇床培养1h；
吸取200μL培养好的菌液，涂布于含有Kana抗性(50μg/mL)的LB平板培养基上，37℃倒置培养过夜。
(2)含脱羧酶基因的表达菌株保存
挑取LB平板上的单菌落，接种于含有Kana抗性(50μg/mL)LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床过夜培养，用作脱羧酶的表达菌株，向菌液中加入终体积浓度为15％的无菌丙三醇，-80℃超低温冰箱中长期保存。
(3)蛋白表达
a.种子摇瓶培养
将100μL脱羧酶蛋白表达甘油菌接种入50mL无菌TB液体培养基中，卡那霉素终浓度为50μg/mL，37℃，200rpm培养8h。
b.发酵摇瓶培养
将10mL脱羧酶蛋白表达种子瓶菌液接种入350mL无菌TB液体培养基中，卡那霉素终浓度为50μg/mL，37℃，200rpm，待OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.3mM的无菌IPTG，28℃，200rpm诱导培养20h。
c.4000rpm离心12min收集菌体。
实施例2利用脱羧酶合成2-呋喃基羟基甲基酮
(1)2-呋喃基羟基甲基酮的合成
反应体系采用pH 7.0的水溶液配制，加入适量ThDP和含有Mg2+的物质，底物进行流加，反应底物终浓度为60g/L的糠醛和甲醛，反应温度35℃，脱羧酶用量为5-20g/L，反应6h后离心，8000rpm离心2min，上清液即为2-呋喃基羟基甲基酮样品。
(2)2-呋喃基羟基甲基酮的检测
将得到的2-呋喃基羟基甲基酮样品稀释10倍以达到更好的HPLC分离效果。利用HPLC检测样品中2-呋喃基羟基甲基酮的纯度。
HPLC仪器型号：岛津LC 2030C。
参数设置：色谱柱：Inertsil ODS-3V，4.6mm×250mm；波长274nm，柱温30℃；
流动相：A相为磷酸缓冲盐，磷酸二氢钾2.73g溶于1000mL水，用稀磷酸调至2.8；B相为乙腈；流速1mL/min。
根据峰面积确定样品中2-呋喃基羟基甲基酮的纯度。
结果见附图1。
从图1的结果中也可以看出，糠醛与甲醛为底物，在脱羧酶的作用下，在常温下即可获得纯度较高的2-呋喃基羟甲基酮，整个工艺过程的毒性和危险性大幅度降低。
实施例3呋喃酮酸的制备
一、氧化酶的合成
氧化酶合成步骤与例1中脱羧酶合成步骤类似，这里不再阐述。
二、利用氧化酶合成呋喃酮酸
1.呋喃酮酸的合成
反应体系采用pH 7.0的水溶液配制，加入适量过氧化氢酶、辣根过氧化物酶和含有Cu2+的物质，底物进行流加反应，反应底物终浓度为40-50g/L的2-呋喃基羟基甲基酮，反应温度30℃，氧化酶用量为20-30g/L，反应10h后离心，8000rpm离心2min，上清液即为呋喃酮酸样品。
2.呋喃酮酸的检测
将得到的2-呋喃基羟基甲基酮样品稀释10倍以达到更好的HPLC分离效果。利用HPLC检测样品中呋喃酮酸的纯度。
HPLC仪器型号：岛津LC 2030C。
参数设置：色谱柱岛津ODS-3V C18 250×4.6mm×5um(或其等效的同等类型色谱柱)，柱温：室温；
流动相：A相为磷酸缓冲盐，磷酸二氢钾3.4g溶于1000mL去离子水，用稀磷酸调至4.5；B相为甲醇；流速0.7mL/min；进样量20uL，运行时间20min。
结果见图2。
图2中明显可以看出，第一步反应生成的2-呋喃基羟甲基酮不需要化学蒸馏等繁琐处理，仅在氧化酶的作用下就可直接生成纯度较高的呋喃酮酸，工艺操作简单，通过氧化酶的作用，极大地缩短了呋喃酮酸的制备路线。
实施例4呋喃铵盐的制备
一、呋喃酮酸肟化制备(Z)-2-甲氧亚氨基-2-呋喃基乙酸
取实施例3得到的呋喃酮酸样品200-400mL，向其中加入10.0mL盐酸，然后滴加140-180g 9.6％甲氧胺水溶液，滴加时间控制在20-40min，反应温度保持在15-25℃，滴毕，反应液pH值维持在3.0-4.0之间，温度不变，持续搅拌3.5h。
液相中控肟化反应完成后，向反应液中加入85-100g工业盐，搅拌溶解后，加入40-60mL 10-14mol/L的浓盐酸，调节反应液pH至强酸性，加入100-140mL乙酸丁酯萃取，萃取2-3次，萃取完成后，产品萃取效果可达到98％以上。
二、加入氨气制备呋喃铵盐
向(Z)-2-甲氧亚氨基-2-呋喃基乙酸的乙酸丁酯有机相中加入20-30mL甲醇，在-5℃下缓慢滴加质量分数为20％的甲醇氨溶液(-20℃下氨气的甲醇饱和溶液)，滴加至pH值到5-6时(约1.5h)，停止滴加，在-5℃下保温搅拌20-40min，抽滤，得淡黄色固体，用体积比为乙酸丁酯：乙醇＝8:1-10:1的混合溶液泡洗滤饼，获得产品。
三、呋喃铵盐检测
将得到的2-呋喃基羟基甲基酮样品稀释10倍以达到更好的HPLC分离效果。利用HPLC检测样品中呋喃酮酸的纯度。
HPLC仪器型号：岛津LC 2030C。
参数设置：色谱柱岛津ODS-3V C18 250×4.6mm×5um(或其等效的同等类型色谱柱)，柱温：室温；
流动相：A相为磷酸缓冲盐，磷酸二氢钾3.4g溶于1000mL水，用稀磷酸调至4.5；B相为甲醇；流速0.7mL/min；进样量20uL，运行时间20min。
根据峰面积确定样品中呋喃铵盐的纯度。
结果见图3。
图3的色谱图中可知，呋喃酮酸再经过化学法合成纯度较高的呋喃铵盐，呋喃铵盐产品收率大于90％，呋喃铵盐的制备反应路线得到极大缩短，减少了污染、降低了能耗。
综合1-3的色谱图可以看出，利用本发明的酶-化学法合成呋喃铵盐的工艺过程中，酶催化法制备出的2-呋喃基羟甲基酮、呋喃酮酸等中间产物，其纯度均较高，杂质含量极少，从反应原料到呋喃酮酸仅经过两步反应就可实现，极大地缩短了传统呋喃酮酸制备的反应路线，提高了反应效率，降低了呋喃酮酸的制备成本。
此外，本发明所提供的酶-化学法合成呋喃铵盐的工艺，借助生物酶的高催化性和选择性进一步为呋喃铵盐的制备提供了新思路。
Claims (4)
1.一种酶-化学法合成呋喃铵盐的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以糠醛和甲醛为底物，接着加入辅酶ThDP和含有Mg2+的物质，同时加入脱羧酶作为催化剂进行反应，其中，糠醛的浓度为50~60 g/L，加入甲醛的摩尔浓度为糠醛的1~3倍，辅酶ThDP的浓度为0.03~0.08 g/L，含有Mg2+的物质中Mg2+的浓度为0.03~0.10 g/L，在脱羧酶的催化下，于20~50℃，pH为6.0~8.0，下反应6~15 h生成2-呋喃基羟甲基酮；所述的脱羧酶，以湿细胞的形态加入，湿细胞的加入量为10~30 g/L，所述的湿细胞为脱羧酶的异源表达宿主，或由其他可产生脱羧酶的微生物经培养和诱导表达后离心收集而成，湿细胞的有效成分为脱羧酶；
所述的脱羧酶，包含丙酮酸脱羧酶、苯甲酰甲酸酯脱羧酶、苯甲醛裂解酶、α-酮酸脱羧酶中的任一种；
（2）在步骤（1）糠醛转化率达到85%以上时，加入氧化酶作催化剂，同时加入酶激活剂、含有Cu2+的物质，以及过氧化氢酶或者可使过氧化氢分解为水和氧气的等效物，于20~40℃，pH为5.0~8.0的条件下进行反应，将步骤（1）中生成的2-呋喃基羟甲基酮氧化为呋喃酮酸；所述的氧化酶是以湿细胞的形态加入，湿细胞的加入量为20~40 g/L，湿细胞为氧化酶的异源表达宿主经培养和诱导表达后离心收集而成，湿细胞的有效成分为氧化酶；所述的氧化酶，包括半乳糖氧化酶、醇氧化酶、醛氧化酶、非特异性过加氧酶中的至少一种；
（3）将步骤（2）获得的呋喃酮酸经肟化后加入氨气，制得呋喃铵盐。
2.如权利要求1所述的酶-化学法合成呋喃铵盐的生产工艺，其特征在于，（2）中所述的酶激活剂，为辣根过氧化物酶；或者，所述的酶激活剂，选自与辣根过氧化物酶的等效替代物中的任一种；或者，所述的酶激活剂，选自Mn(OAc)3、MnF3中的任一种。
3.如权利要求1所述的酶-化学法合成呋喃铵盐的生产工艺，其特征在于，（2）中，酶激活剂的浓度为0.005~0.015 g/L、含有Cu2+的物质中Cu2+的浓度为0.5~1.5 mM，过氧化氢酶或者可使过氧化氢分解为水和氧气的等效物的浓度为0.1~0.3 g/L。
4.如权利要求1所述的酶-化学法合成呋喃铵盐的生产工艺，其特征在于，所述的（2）中，具体操作为：在步骤（1）糠醛转化率达到85%以上时，加入氧化酶作催化剂，同时加入0.005~0.015 g/L的酶激活剂、Cu2+的浓度为0.5~1.5 mM的含有Cu2+的物质，以及0.1~0.3g/L的过氧化氢酶或者可使过氧化氢分解为水和氧气的等效物，于20~40℃，pH为5.0~8.0的条件下进行反应，将步骤（1）中生成的2-呋喃基羟甲基酮氧化为呋喃酮酸；
所述的氧化酶是以湿细胞的形态加入，湿细胞的加入量为20~40 g/L，湿细胞为氧化酶的异源表达宿主经培养和诱导表达后离心收集而成，湿细胞的有效成分为氧化酶；所述的氧化酶，包括半乳糖氧化酶、醇氧化酶、醛氧化酶、非特异性过加氧酶中的至少一种；所述的酶激活剂，为辣根过氧化物酶；或者，所述的酶激活剂，选自与辣根过氧化物酶的等效替代物中的任一种；或者，所述的酶激活剂，选自Mn(OAc)3、MnF3中的任一种。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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