CN110066837B - 微生物高效催化5-羟甲基糠醛生产2,5-呋喃二甲醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了生产2,5‑呋喃二甲醇的方法,所述方法包括:利用阴沟肠杆菌对5‑羟甲基糠醛进行生物催化处理,以便获得2,5‑呋喃二甲醇。以阴沟肠杆菌作为生物催化剂,催化5‑羟甲基糠醛转化为2,5‑呋喃二甲醇,具有催化效率高、转化率高、产物选择性高、反应条件温和且环境友好等优点,具有广泛地应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地,本发明涉及生产2,5-呋喃二甲醇的方法。
背景技术
5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,HMF)是一种重要的生物基平台化合物,其分子中含有一个呋喃环,一个醛基和一个羟甲基,其化学性质比较活泼,可以制备多种衍生物。HMF经过选择性还原可以制备2,5-呋喃二甲醇(furan-2,5-diyldimethanol),2,5-呋喃二甲醇是重要的药物中间体,广泛应用于各种生物可降解材料的制备,具有重要的应用价值。
目前,主要采用化学法,利用金属催化剂将5-羟甲基糠醛选择性还原制备2,5-呋喃二甲醇。但是,存在反应条件苛刻、催化剂成本高、催化效率低等缺点。
近年来,生物催化法作为一种绿色的方法引起了广泛地重视,其反应条件温和,操作简单,产物选择性高。但是,由于5-羟甲基糠醛是一种微生物抑制物,会抑制微生物的生长和发酵。因此,可以在5-羟甲基糠醛体系中生长并将其转化为2,5-呋喃二甲醇的微生物较少,针对利用5-羟甲基糠醛制备2,5-呋喃二甲醇的研究也很少。
由此,开发微生物高效催化5-羟甲基糠醛制备2,5-呋喃二甲醇的方法尤为重要。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
为此,本发明提出了一种生产2,5-呋喃二甲醇的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:利用阴沟肠杆菌对5-羟甲基糠醛进行生物催化处理,以便获得2,5-呋喃二甲醇。
5-羟甲基糠醛通常对微生物具有一定的抑制作用,并非所有的微生物均可以在5-羟甲基糠醛体系下存活。即便是微生物具有5-羟甲基糠醛耐受性,可以将其催化转化为2,5-呋喃二甲醇,但是,会存在着转化率低、产物选择性低、反应时间长等缺点。发明人发现,相比于其他微生物,以阴沟肠杆菌作为生物催化剂,催化5-羟甲基糠醛转化为2,5-呋喃二甲醇,具有催化效率高、转化率高、产物选择性高、反应条件温和、用时短且环境友好等优点,具有广泛地应用前景。
根据本发明的实施例,所述生产2,5-呋喃二甲醇的方法还可以具有下列附加技术特征:
根据本发明的实施例,所述阴沟肠杆菌于2019年02月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.17265,分类命名为阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮政编码为100101。发明人发现,该阴沟肠杆菌M22对5-羟甲基糠醛具有较好的耐受性,以其作为生物催化剂,可以进一步提高转化率和产物选择性,反应时间短,生产效率高。
根据本发明的实施例,利用所述阴沟肠杆菌对含有5-羟甲基糠醛的培养基进行发酵培养。由此,在发酵过程中,阴沟肠杆菌可以将5-羟甲基糠醛转化为2,5-呋喃二甲醇,转化率和产物选择性较高。
根据本发明的实施例,所述培养基中5-羟甲基糠醛的含量为5~10g/L。在此条件下,阴沟肠杆菌可以生长,并有效地将5-羟甲基糠醛转化为2,5-呋喃二甲醇。若5-羟甲基糠醛的含量过高,阴沟肠杆菌几乎完全被抑制,停止生长。
根据本发明的实施例,所述生物催化处理包括:将所述阴沟肠杆菌接种于培养基中,进行预培养,以便获得预培养液;以及向所述预培养液中加入5-羟甲基糠醛,继续进行培养,以便获得2,5-呋喃二甲醇。
根据本发明的实施例,所述生物催化处理包括:将所述阴沟肠杆菌接种于含有5-羟甲基糠醛的培养基中,进行培养,以便获得2,5-呋喃二甲醇。
由于本发明的阴沟肠杆菌对5-羟甲基糠醛具有一定的耐受性,所以既可以直接催化5-羟甲基糠醛,也可以先预先培养一定时间,待菌体活性达到一定水平时,再与5-羟甲基糠醛接触,催化其转化为2,5-呋喃二甲醇。并且,预培养后,可以直接向培养液中加入5-羟甲基糠醛,无需分离出菌体并将其置于新培养基中,减少操作成本及废水的产生。
根据本发明的实施例,所述培养基中含有10~30g/L的葡萄糖。由此,可以满足阴沟肠杆菌的生长代谢需求。
根据本发明的实施例,所述阴沟肠杆菌预先经过活化处理,以便获得种子液,将所述种子液以3~6体积%接种于所述培养基中。预先将阴沟肠杆菌进行活化处理,以便提高其生物活性。
根据本发明的实施例,所述预培养的时间为4~8小时。由此,阴沟肠杆菌可以达到一定的生物活性,从而具备相对较高的抑制物耐受性,并在短时间内将其催化转化为2,5-呋喃二甲醇。
根据本发明的实施例,所述预培养和培养分别独立地在30~40℃的温度及100~200rpm的转速下进行。由此,可以满足阴沟肠杆菌的生长及其耐受性需求,使其在短时间内即可将5-羟甲基糠醛转化为2,5-呋喃二甲醇。
根据本发明的实施例,所述培养基包括:1~5g/L的(NH4)2SO4,0.5~1g/L的K2HPO4,0.1~0.5g/L的KH2PO4,0.5~2g/L的酵母浸粉,0.1~0.5g/L的MgSO4·7H2O,0.5~1.5mL/L的微量元素,1~5mL/L的FeSO4溶液,pH6.5。由此,可以满足阴沟肠杆菌的生长及其耐受性需求,使其在短时间内即可将5-羟甲基糠醛转化为2,5-呋喃二甲醇。
根据本发明的实施例,进行所述培养过程中,补加5-羟甲基糠醛。为了降低高浓度底物抑制作用,可以采用补料方式,以便高产2,5-呋喃二甲醇,适于工业化生产。
根据本发明的实施例,进行所述培养过程中,流加5-羟甲基糠醛至培养液中5-羟甲基糠醛终浓度维持在0~3g/L;或者进行所述培养过程中,当培养液中5-羟甲基糠醛的浓度为0~3g/L时,补加终浓度为5~6g/L的5-羟甲基糠醛溶液。通过批次补料或者流加补料,以便降低高浓度底物抑制作用,获得大量2,5-呋喃二甲醇,适于工业化生产。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了根据本发明一个实施例的5-羟甲基糠醛不同添加浓度下M22的生长过程示意图;
图2显示了根据本发明一个实施例的M22的催化过程示意图;
图3显示了根据本发明一个实施例的补料催化程示意图;
图4显示了根据本发明另一个实施例的补料催化过程示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
LB培养基为:氯化钠10g/L,酵母浸粉5g/L,蛋白胨10g/L,琼脂15g/L。
种子培养基:葡萄糖30g/L,(NH4)2SO4 2g/L,K2HPO4 4.4g/L,KH2PO4 1.3g/L,酵母浸粉1g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,微量元素1mL/L,FeSO4溶液2mL/L,pH6.5。FeSO4溶液组成:FeSO4·7H2O 5g/L,HCl 4mL/L。
发酵培养基为葡萄糖3~30g/L,(NH4)2SO4 2g/L,K2HPO4 0.9g/L,KH2PO4 0.25g/L,酵母浸粉1g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,微量元素1mL/L,FeSO4溶液2mL/L,pH6.5。
其中,微量元素组成:ZnCl2 70mg/L,MnCl2·4H2O 0.1g/L,H3BO3 60mg/L,CoCl2·2H2O 0.2g/L,CuCl2·2H2O 20mg/L,NiCl2·6H2O 25mg/L,Na2MoO4·2H2O 35mg/L,HCl0.9mL/L。
实施例1阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae M22对5-羟甲基糠醛的耐受性考察—直接添加5-羟甲基糠醛
1、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae M22的活化培养:用接种环将冻存于甘油管中的阴沟肠杆菌划线接种于LB固体培养基上,于恒温培养箱中30℃培养12h。挑取单菌落接种于种子培养基中(250ml三角瓶装液量50ml),摇床30℃、150rpm培养14~16h待用。
2、将步骤1所获得的种子液按照5%接种量接种于发酵培养基中(500ml三角瓶装液量100ml),发酵培养基中葡萄糖浓度为30g/L,接种前往培养基中加入不同终浓度的5-羟甲基糠醛(0、3、5、7、9g/L),在摇床中35℃、150rpm培养,分别在0h、6h、12h、24h取样,按一定浓度稀释后利用紫外分光光度计检测其吸光度,紫外设定波长为600nm。
结果如图1所示,初期,M22主要先代谢5-羟甲基糠醛,催化转化为2,5-呋喃二甲醇,即消耗抑制物的过程,此时菌体生长缓慢。待抑制物消耗殆尽,M22利用培养基中的营养物质,快速生长。随着5-羟甲基糠醛初始浓度的增加,菌体生长逐渐变慢。5-羟甲基糠醛初始浓度为3g/L和5g/L时,到24h菌体生长均能达到与对照相当水平,5-羟甲基糠醛初始浓度为7g/L时,菌体有微弱生长,5-羟甲基糠醛初始浓度为9g/L时,菌体完全被抑制,停止生长。综合考虑,选择6g/L作为适宜添加浓度,在此条件下,M22的代谢情况参见图2,当培养10小时,5-羟甲基糠醛的转化率可以达到99%,2,5-呋喃二甲醇的选择性达到99%,产量为5.87g/L。
实施例2阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae M22对5-羟甲基糠醛的耐受性考察—预培养后再添加5-羟甲基糠醛
1、按照实施例1的方法获得种子液。
2、将种子液按照5%接种量接种于发酵培养基中(500ml三角瓶装液量100ml),发酵培养基中葡萄糖浓度为10g/L,在摇床中35℃、150rpm培养6h后,往培养基中加入终浓度为10g/L的5-羟甲基糠醛开始反应,用高效液相色谱检测5-羟甲基糠醛和2,5-呋喃二甲醇的浓度。反应5h 5-羟甲基糠醛的转化率可以达到97%,2,5-呋喃二甲醇的选择性达到99%,产量为9.83g/L。
实施例3补料发酵
1、按照实施例1的方法获得种子液,以5%接种量接种于发酵培养基中(500ml三角瓶装液量100ml),发酵培养基中葡萄糖浓度为25g/L,在摇床中35℃、150rpm培养6h后,往培养基中加入终浓度为5.5g/L的5-羟甲基糠醛开始反应,当体系中5-羟甲基糠醛的浓度为0~3g/L时,向体系中补加5-羟甲基糠醛,用高效液相色谱检测5-羟甲基糠醛和2,5-呋喃二甲醇的浓度,具体如图3所示。反应42h后,5-羟甲基糠醛总转化率达到89%,2,5-呋喃二甲醇的选择性达到99%,产量为25.64g/L。
2、按照实施例1的方法获得种子液,以5%接种量接种于发酵培养基中(1L发酵罐装液量500ml),发酵培养基中葡萄糖初始浓度为30g/L,发酵罐温度35℃、200rpm培养6h后,向培养基中流加5-羟甲基糠醛开始反应,反应过程中保持5-羟甲基糠醛浓度为0~3g/L,当葡萄糖浓度为0~2g/L时,补加葡萄糖至终浓度为5~6g/L。用高效液相色谱检测5-羟甲基糠醛和2,5-呋喃二甲醇的浓度,具体如图4所示。反应34h后,5-羟甲基糠醛总转化率达到99%,2,5-呋喃二甲醇的选择性达到99%,产量为40.23g/L。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (3)
1.一种生产2,5-呋喃二甲醇的方法,其特征在于,包括:
利用阴沟肠杆菌对5-羟甲基糠醛进行生物催化处理,以便获得2,5-呋喃二甲醇;
所述阴沟肠杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC NO.17265;
所述生物催化处理包括:
将所述阴沟肠杆菌接种于培养基中,进行预培养,以便获得预培养液;以及
向所述预培养液中加入5-羟甲基糠醛,继续进行培养,以便获得2,5-呋喃二甲醇;
进行所述培养过程中,流加5-羟甲基糠醛至培养液中5-羟甲基糠醛终浓度维持在0~3g/L;或者
进行所述培养过程中,当培养液中5-羟甲基糠醛的浓度为0~3g/L时,补加终浓度为5~6g/L的5-羟甲基糠醛溶液。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养基中含有10~30g/L的葡萄糖。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述阴沟肠杆菌预先经过活化处理,以便获得种子液,将所述种子液以3~6体积%接种于所述培养基中;
所述预培养的时间为4~8小时;
所述预培养和培养分别独立地在30~40℃的温度及100~200rpm的转速下进行;
所述培养基包括:1~5g/L的(NH4)2SO4,0.5~1g/L的K2HPO4,0.1~0.5g/L的KH2PO4,0.5~2g/L的酵母浸粉,0.1~0.5g/L的MgSO4·7H2O,0.5~1.5mL/L的微量元素,1~5mL/L的FeSO4溶液,pH6.5。
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