CN108753851B - 羰基还原酶生物催化生产手性1,2-二醇类化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用羰基还原酶生物催化制备手性单羟基衍生化的1,2‑醇类化合物的方法，即将羰基还原酶ChKRED12、底物、辅因子、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和缓冲液按一定比例混合，在pH7～8、温度为20～40℃下反应，可得到(2S,3S)‑构型的产物；与现有技术相比，本发明所采用的方法具有催化剂易制备、反应条件温和、反应体系简单、无副反应、得到的产物光学纯度高的优点，具有极大的工业应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于酶与生物催化领域，具体涉及利用羰基还原酶生物催化生产光学纯1,2-二醇衍生物的方法。
背景技术
手性的1,2-二醇及其衍生物是很多天然化合物的重要合成砌块，例如多糖类、聚酮化合物、生物碱等。它们还常常作为手性配体或手性辅助试剂应用于不对称合成。目前，制备手性单羟基衍生化的1,2-醇类化合物的方法主要有通过乙醇酸羟醛缩合合成法、环氧化-还原的方法和过渡金属不对称催化还原的方法，以及酵母细胞催化的不对称还原的方法。
乙醇酸羟醛缩合合成法，如下所示：
主要以醛和烯醇硅醚为起始原料，经过四氯化硅和二磷酰胺催化反应得到手性纯的syn- 羟醛产物。该方法存在反应繁琐，催化剂制备复杂，且需要化学计量的SiCl4使底物的酯基转变成活泼的烯醇硅醚(Angewandte Chemie International Edition,2008,47(10):1890-1892)。
环氧化-还原的方法，如下所示：
主要是以酮为起始原料，经过烯醇环氧化、还原得到手性的单羟基衍生化的anti-1,2-二醇衍生物，该方法反应步骤繁琐、反应条件苛刻，且反应需要加入大量的的催化剂(30mol％)，限制了它的应用(Journal of the American Chemical Society,2009,131(16):5763-5765)。
过渡金属不对称催化还原的方法，如下所示：
利用过渡金属不对称催化还原α-烷氧基-β-酮酯类消旋体偶联底物烯醇互变的动态动力学过程得到目标产物，该方法具有很好的立体选择性且产物的理论产率可达100％，但过渡金属对环境危害大且生产成本高(Organic Letters,2010,12(17):3788-3791)。
酵母细胞催化的不对称还原的方法，如下所示：
报道的这些生物催化反应均利用酵母细胞进行催化，底物投入量和催化效率低(底物浓度2-4g/l，反应时间2天)，并且细胞中含有的其他蛋白还会影响催化产物的立体选择性(ee 值为>99％，de值>80％)，无法满足工业化的需求(Tetrahedron:Asymmetry,1997.8(14): 2355-2359；Cheminform,1986.18(9):1367-1370.)。目前还没有文献报道利用羰基还原酶催化还原制备光学纯的1,2-二醇化合物的研究。
发明内容
为了克服现有技术所存在的上述缺陷，本发明旨在提供一种以羰基还原酶为生物催化剂制备手性单羟基衍生化的anti-1,2-二醇衍生物的方法，作为化学催化不对称还原的替代方法，以满足工业化生产要求。具体地，本发明所用的底物为如下结构通式(I)，利用高效高选择性羰基还原酶为生物催化剂，经不对称还原获得相应的(2S,3S)-构型手性醇。
生物催化过程可表示如下：
其中，R1在每次出现时独立地选择苯基，2-噻吩基，2-甲基苯基，3-甲基苯基，4-甲基苯基，3-甲氧基，4-甲氧基，3-氟苯基，4-氟苯基，4-氯苯基，4-溴苯基等；
R2在每次出现时独立地为甲基或乙基等；
R3在每次出现时独立地为甲基或乙基等；
进一步说，反应是将α-烷氧基-β-酮酯类化合物用羰基还原酶还原为相应的(2S,3S)-构型手性醇。
进一步说，所述的羰基还原酶为ChKRED12；所述的羰基还原酶是由基因工程大肠杆菌通过发酵表达得到。
进一步说，所述的羰基还原酶推荐以酶粉形式或含有羰基还原酶的细胞破碎液的形式加入。
根据本领域的公共知识，本领域技术人员可通过以下方式获得该生物催化剂。首先，羰基还原酶的信息(基因序列和氨基酸序列)可通过该酶的NCBI登录号查询获知，然后经基因合成公司合成获得，并以常规技术手段构建大肠杆菌表达体系，经过量表达获得上述酶作为生物催化剂。
ChKRED12在NCBI数据库的登录号为：KC342012。
本发明的生物催化体系及反应条件：
(1)生物催化剂为羰基还原酶ChKRED12纯酶或者粗酶时，生物催化体系为：磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7～8)、羰基还原酶、结构通式(I)底物和还原型辅酶NADPH；
或者，生物催化体系为：
磷酸盐缓冲(0.1M，pH 7～8)、羰基还原酶、结构通式(I)底物、氧化型辅酶NADP+，葡萄糖脱氢酶，葡萄糖。
上述反应体系中，羰基还原酶的酶量可根据底物浓度调整，较优的浓度为纯酶0.1～10g/l，粗酶1～20g/l(以总蛋白量计)，葡萄糖脱氢酶浓度0.5～5g/l；葡萄糖的浓度为5％～20％(w/v)。
优选的，底物终浓度为1～20g/l；NADP+浓度0.1～1g/l；NADPH的摩尔浓度大于等于底物的摩尔浓度。
生物催化条件：温度20～40℃，转速50～220rpm，转化时间为1～24h。
本发明的有益效果：
本发明首次公开了以羰基还原酶生物催化还原α-烷氧基-β-酮酯类化合物获得手性单羟基衍生化的anti-1,2-二醇衍生物，该方法的催化剂易制备，水相催化，反应条件温和，反应体系简单，无副反应，ee值大于99％，dr值绝大多数大于95/5，为手性1,2-二醇类化合物的生产提供了可选择的环境友好的生物催化方法，具有一定的工业应用潜力。
本发明所获得的手性1,2-二醇衍生物可作为化学合成中的重要合成砌块。以生产1b产物为例(见实施例1和实施例2)，ChKRED12催化底物1a时，底物浓度为20g/l时，转化率为 99％，ee值>99％，dr值为97/3，具有一定的工业应用潜力。
附图说明
附图为羰基还原酶ChKRED12生物催化过程图示。
具体实施方式
以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。
实施例1：羰基还原酶的筛选
以本领域熟知的方法，将羰基还原酶基因连入pET28a(+)载体，转入大肠杆菌BL21-DE3 中异源表达，6,000rpm，4℃离心10min获得重组菌湿菌体，重悬于磷酸钾缓冲液(0.1M， pH 7.0)，以均质机破碎细胞，13,00rpm，4℃离心20min，所得上清即为粗酶液，作为生物催化剂。我们对实验室的羰基还原酶工具箱进行了筛选。筛选时，生物催化及体系为：磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 7.0)、羰基还原酶粗酶液10g/l、底物(1a)1g/l、NAD+/NADP+浓度0.6g/l、葡萄糖脱氢酶3g/l和葡萄糖10％(w/v)。反应时间为12h，反应温度30℃，转速200rpm。
同时，将没有连入羰基还原酶基因的pET28(+)空载体同样转入大肠杆菌BL21-DE3中异源表达，重悬于磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 8.0)，以均质机破碎细胞，13,000rpm，4℃离心20min，所得上清为空白对照转化各类底物。
反应结束后，以等体积甲基叔丁基醚萃取3次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，而后减压旋蒸除去溶剂，加入异丙醇(HPLC级)溶解样品，高速离心后，HPLC测定样品的转化率及产物ee值，1HNMR测定产物dr值。经筛选，酶ChKRED12(该酶在NCBI数据库的登录号为：KC342012)的立体选择性最高，产物的ee值>99％，构型为(anti-2S，3S)，dr 值为97/3，且空白对照组不能转化底物。最终选定ChKRED12作为催化还原制备手性1,2-醇类化合物的目标酶。
实施例2：不同α-烷氧基-β-酮酯类化合物的产物标品的HPLC检测条件
产物anti-构型消旋体的手性HPLC检测条件见表1，ChKRED12催化底物1a得到(2S,3S)-构型产物。以下实施例的相应产物构型均相同，不再赘述。
表1底物及测定条件
实施例3：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化4g/l底物1a
取新鲜培养的羰基还原酶ChKRED12重组菌湿菌体重悬于磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)，以均质机破碎细胞，13,000rpm，4℃离心20min，所得上清即为粗酶液。
磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 8.0)，羰基还原酶ChKRED12浓度5g/l(粗酶液)，底物1a浓度4g/l，底物1g/l、NADP+浓度0.6g/l、葡萄糖脱氢酶2g/l和葡萄糖10％(w/v)。反应温度40℃，反应时间为12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明12h内4g/l底物就能转化完全，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee 值大于99％，dr值为97/3。
实施例4：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化20g/l底物1a
取新鲜培养的羰基还原酶ChKRED12重组菌湿菌体重悬于磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)，以均质机破碎细胞，13,000rpm，4℃离心20min，所得上清即为粗酶液。
磷酸钾缓冲液(0.1M，pH8.0)，羰基还原酶ChKRED12浓度10g/l(粗酶液)，底物1a浓度20g/l，NADP+浓度1g/l，葡萄糖脱氢酶3g/l和葡萄糖20％(w/v)。反应温度40℃，反应时间为16h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1 相同。结果表明16h内20g/l底物就能转化完全，得到(2S,3S)-构型醇，产物的ee值大于99％， dr值为97/3。
实施例5：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化4g/l底物2a
反应体系与实施例2相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明12h内，4g/l底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99％，dr值为99/1。
实施例6：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化4g/l底物3a
反应体系与实施例2相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明酶ChKRED12对底物3a不能转化。
实施例7：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化4g/l底物4a
反应体系与实施例2相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明12h内，4g/l底物的转化率为57％，产物的ee值大于99％，dr值为97/3。
实施例8：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化4g/l底物5a
反应体系与实施例2相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明12h内，4g/l底物的转化率为84％，产物的ee值大于99％，dr值为95/5。
实施例9：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化4g/l底物6a
反应体系与实施例2相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明12h内，4g/l底物的转化率为82％，产物的ee值大于99％，dr值为97/3。
实施例10：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化4g/l底物7a
反应体系与实施例2相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明12h内，4g/l底物的转化率为89％，产物的ee值大于99％，dr值为97/3。
实施例11：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化4g/l底物8a
反应体系与实施例2相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明12h内，4g/l底物的转化率为93％，产物的ee值大于99％，dr值为97/3。
实施例12：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化4g/l底物9a
反应体系与实施例2相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明12h内，4g/l底物的转化率为89％，产物的ee值大于99％，dr值为95/5。
实施例13：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化4g/l底物10a
反应体系与实施例2相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明12h内，4g/l底物的转化率为74％，产物的ee值大于99％，dr值为95/5。
实施例14：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化4g/l底物11a
反应体系与实施例2相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明12h内4g/l底物的转化率为92％，产物的ee值大于 99％，dr值为88/12。
实施例15：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化4g/l底物12a
反应体系与实施例2相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明12h内，4g/l底物的转化率为84％，产物的ee值大于99％，dr值为97/3。
实施例16：羰基还原酶ChKRED12粗酶液催化4g/l底物13a
反应体系与实施例2相同，转化时间12h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明12h内，4g/l底物的转化率为90％，产物的ee值大于99％，dr值为96/4。
Claims (1)
1.一种以羰基还原酶ChKRED12不对称生物催化α-烷氧基-β-酮酯类底物得到相应产物(2S,3S)-构型手性醇的方法，其特征在于，所述的羰基还原酶ChKRED12在NCBI数据库中的登录号为KC342012，所述羰基还原酶ChKRED12生物催化过程如下图所示，
具体包括以下12种底物，底物1a，
R1为苯基、R2为甲基、R3为乙基；底物2a，
R1为苯基、R2为乙基、R3为乙基；底物4a，
R1为3-甲基苯基、R2为甲基、R3为乙基；底物5a，
R1为4-甲基苯基、R2为甲基、R3为乙基；底物6a，
R1为3-甲氧基苯基、R2为甲基、R3为乙基；底物7a，
R1为4-甲氧基苯基、R2为甲基、R3为乙基；底物8a，
R1为3-氟苯基、R2为甲基、R3为乙基；底物9a，
R1为4-氟苯基、R2为甲基、R3为乙基；底物10a，
R1为4-氯苯基、R2为甲基、R3为乙基；底物11a，
R1为4-溴苯基、R2为甲基、R3为乙基；底物12a，
R1为2-噻吩基、R2为甲基、R3为乙基；底物13a，
R1为4-氟苯基、R2为甲基、R3为甲基。
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