CN112458143B - 一种全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物催化领域，具体涉及一种全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法，该方法以全细胞Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479为催化剂，利用化合物II为原料，通过不对称还原反应制备得到依折麦布手性中间体。本发明通过采用Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479的冻干细胞可以有效提高生物催化效率，同时利用分阶段搅拌培养的方式，通过减压蒸馏去除丙酮，显著提高产物纯度及全细胞催化合成效率。

Description

一种全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法
技术领域
本发明属于生物催化领域，具体涉及一种全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法。
背景技术
依折麦布(Ezetimibe)化学名为(3R,4S)-1-(4-氟苯基)-3-[(3S)-3-(4-氟苯基)-3-羟基丙基]-4-(4-羟基苯基)-2-氮杂环丁酮，其结构式如下：
Figure SMS_1
该化合物是由美国Schering-Plough公司和德国Merck公司共同开发胆固醇吸收抑制剂类型的口服降胆固醇药物。
在依折麦布的合成工艺中，关键步骤是手性β内酰胺环四元环的构建和手性羰基的引入。目前现有技术中主要采用的技术是1998年美国Schering-Plough公司首次报道的代号为SCH 58235的化合物(结构式同上)的制备方法。
在该方法中氯甲酰丁酸甲酯和(Z)-1-(4-苄氧基苯基)-N-(4-氟苯基)甲亚胺缩合构建内酰胺四元环，通过手性制备得到RS构型异构体3-[(2S,3R)-2-(4-苄氧基苯基)-1-(4-氟苯基-4-氧代环丁胺-3-基]丙酸甲酯，经水解成羧酸后转化为3-[(2S,3R)-2-(4-苄氧基苯基)-1-(4-氟苯基)-4-氧代环丁胺-3-基]丙酰氯，再与对氟苯基溴化锌发生Negishi反应得到中间体(3R,4S)-1-(4-氟苯基)-3-[3-(4-氟苯基)-3-氧代丙基]-4-(4-苄氧基苯基)-2-氮杂环丁酮然后经过硼烷·二甲硫醚[BH3·S(CH3)2]还原酮羰基后，通过手性制备得到具有S构型羟基的中间体(3R,4S)-1-(4-氟苯基)-3-[(3S)-3-(4-氟苯基)-3-羟基丙基]-4-(4-苄氧基苯基)-2-氮杂环丁酮，最后经氢气脱苄得到产品。
上述方法通过化学法引入手性羰基，手性ee值低，成本较高，对环境污染严重。
相较于化学法，生物法具有立体专一性强、操作简便、反应条件温和、对环境友好等优点。因此，对于本领域的技术人员来说，选择适合的生物催化剂，实现手性中间体的高效制备，即是本领域的研究热点也是本领域的研究重点和难点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种依折麦布手性中间体的全细胞催化合成方法，从而能够通过全细胞催化的方式引入手性羰基，提高ee转化率，实现环境友好。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法，该方法以全细胞Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479为催化剂，利用化合物II为原料，通过不对称还原反应制备得到依折麦布手性中间体(化合物I)，其中所述催化剂为全细胞Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479的冻干细胞，
Figure SMS_2
进一步优选的，所述全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法包括以下步骤：
S1：制备Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479冻干细胞；
S2：将式II所示化合物、Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479冻干细胞、酶催化辅酶循环酶、辅酶/辅酶循环氢供体、pH值为7.0的缓冲溶液、助溶剂混合后，搅拌下培养，得到含有式I所示化合物的反应后溶液体系。
进一步优选的，所述搅拌下培养为分阶段培养法，具体包括两个阶段，假设总反应时间为21小时，则第一阶段为6小时；当搅拌培养6小时后，记录体系总液量，然后通过减压蒸馏的方式完全去除体系内的丙酮，去除完毕后，以异丙醇补至总液量全量；然后继续第二阶段搅拌培养，第二阶段为15小时，反应完成后得到含有式I所示化合物的反应后溶液体系。
作为优选的技术方案，所述Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479冻干细胞的制备方法是：将Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479的菌株接种于酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)液体培养基中，搅拌培养得到菌液后，分离得到菌体，冻干获得Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479冻干细胞。
进一步优选的是，所述酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)液体培养基中包括1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡糖，所述培养基的pH值为5.5。
作为一种优选，所述冻干细胞、辅酶/辅酶循环氢供体、辅酶循环酶之间的摩尔比为1:0.1～0.2/0.1～0.2:0.5～1。
作为一种优选，所述冻干细胞与化合物II的摩尔比为1:0.1～1。
作为一种优选，化合物II、助溶剂、缓冲液的摩尔比为1:10～100:10～60。
在一个优选的技术方案中，所述搅拌下培养的温度为33℃。这里主要是考虑全细胞催化过程中所使用酶的酶活在该温度下活性最佳。
在一个优选的技术方案中，所述酶催化辅酶循环酶为异丙醇脱氢酶。
在一个优选的技术方案中，所述辅酶/辅酶循环氢供体为NADP+。
在一个优选的技术方案中，所述助溶剂为异丙醇。
在一个优选的技术方案中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲溶液，更为优选的是0.1-0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液。
本发明以Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479作为催化剂，通过采用Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479的冻干细胞可以有效提高生物催化效率，进一步，在本发明中利用分阶段搅拌培养的方式，通过减压蒸馏去除丙酮，可以显著提高产物纯度，进一步提高全细胞催化合成效率。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。
除非有特殊说明，在本发明实施例中所用试剂均为普通市售产品。
实施例1冻干细胞的获得
将Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479的菌株接种于150ml YPD液体培养基中(1L锥形瓶)。其中培养基配比为：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，余量为水，以稀盐酸调配至培养基的pH值为5.5。
在30℃的条件下，以250rpm搅拌72h后，调节温度至4℃，然后再以12000rpm离心5min，收集下部的菌体，冻干获得冻干细胞。
实施例2化合物I的制备
在250mL的锥形瓶中加入1g化合物II，2g冻干细胞，0.5g异丙醇脱氢酶酶粉，6mgNADP+，20mL 0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.0)，30mL异丙醇，搅拌均匀，33℃恒温搅拌反应(250rpm)21h，得白色浑浊体系，即化合物I，经液相检测底物转换率为78％，ee值99.6％。
实施例3化合物I的制备
在250mL的锥形瓶中加入1g化合物II，2g冻干细胞，0.5g异丙醇脱氢酶酶粉，6mgNADP+，20mL 0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.0)，30mL异丙醇，搅拌均匀，33℃恒温搅拌反应(250rpm)6h，得白色浑浊体系，30℃下减压蒸馏去除体系中的丙酮，去除完毕后，体系补加异丙醇至原体积，在原条件(33℃恒温)下继续反应15h，终止反应获得化合物I，经液相检测底物转换率为97％，ee值99.8％。
以上所述是本发明的具体实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法，其特征在于：该方法以全细胞Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479为催化剂，利用式II所示化合物为原料，通过不对称还原反应制备得到依折麦布手性中间体，其中所述催化剂为全细胞Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479的冻干细胞，
Figure QLYQS_1
其中所述全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法包括以下步骤：
S1：制备Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479冻干细胞；
S2：将式II所示化合物、Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479冻干细胞、酶催化辅酶循环酶、辅酶循环氢供体、pH值为7.0的缓冲溶液、助溶剂混合后，搅拌下培养，得到含有式I所示化合物的反应后溶液体系；
所述搅拌下培养的温度为33℃；所述酶催化辅酶循环酶为异丙醇脱氢酶；所述辅酶循环氢供体为NADP+；所述助溶剂为异丙醇；所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液；
所述搅拌下培养为分阶段培养法，具体包括两个阶段，第一阶段为6小时；当搅拌培养6小时后，记录体系总液量，然后通过减压蒸馏的方式完全去除体系内的丙酮，去除完毕后，以异丙醇补至总液量全量；然后继续第二阶段搅拌培养，第二阶段为15小时，反应完成后得到含有式I所示化合物的反应后溶液体系。
2.根据权利要求1所述的全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为0.1-0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法，其特征在于，所述Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479冻干细胞的制备方法是：将Schizosaccharomyces octosporus ATCC2479的菌株接种于酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)液体培养基中，搅拌培养得到菌液后，分离得到菌体，冻干获得Schizosaccharomycesoctosporus ATCC2479冻干细胞。
4.根据权利要求3所述的全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法，其特征在于：所述酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)液体培养基中包括1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，所述培养基的pH值为5.5。
5.根据权利要求1所述的全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法，其特征在于：所述冻干细胞、辅酶循环氢供体、酶催化辅酶循环酶之间的摩尔比为1：0.1～0.2：0.5～1。
6.根据权利要求1所述的全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法，其特征在于：所述冻干细胞与式II所示化合物的摩尔比为1:0.1～1。
7.根据权利要求1所述的全细胞催化合成依折麦布手性中间体的方法，其特征在于：式II所示化合物、助溶剂、缓冲溶液的摩尔比为1:10～100:10～60。
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