CN117778281A

CN117778281A - 一种重组基因工程菌及(r)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的制备方法

Info

Publication number: CN117778281A
Application number: CN202311420453.5A
Authority: CN
Inventors: 赵海燕; 王雪英; 杨运航; 汪铭; 周国军; 郭鹏
Original assignee: Astatech (chengdu) Biopharmaceutical Corp
Current assignee: Astatech (chengdu) Biopharmaceutical Corp
Priority date: 2023-10-30
Filing date: 2023-10-30
Publication date: 2024-03-29

Abstract

本发明属于酶催化以及生物制药技术领域，具体涉及一种重组基因工程菌及(R)‑2‑(1‑氨基乙基)‑4‑氟苯酚的制备方法。本发明构建了具有高选择性、高活性的胺脱氢酶和甲酸脱氢酶，并且利用这两种酶作为催化剂提供了一种手性(R)‑2‑(1‑氨基乙基)‑4‑氟苯的制备方法，以5‑氟‑2‑羟基苯乙酮为原料，经过胺脱氢酶和甲酸脱氢酶一步酶催化获得合成(R)‑2‑(1‑氨基乙基)‑4‑氟苯酚。本发明提高了原料的转化率和产物收率，同时制备的手性产物选择性好且ee值大于99.9％。此外，本发明制备方法简化了下游分离精制工艺，是一种过程简洁、绿色环保的新工艺，具有工业化的潜力和良好的应用前景。

Description

一种重组基因工程菌及(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的制备方法

技术领域

本发明属于酶催化以及生物制药技术领域，具体涉及一种重组基因工程菌及(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的制备方法。

背景技术

洛普替尼(Repotrectinib TPX-0005)是一种抑制ROS1、TRK和ALK活性的广谱新一代酪胺酸激酶抑制剂(TKI)。它可以克服多种对其他TKI产生抗性的基因突变，并能杀死携带ROS1或NTRK基因融合的多种肿瘤细胞，因此非常有潜力治疗ROS1阳性的NSCLC，以及ROS1、NTRK和ALK阳性的实体瘤。为ROS1融合及耐药的患者提供了全新的治疗选择，对于ROS1阳性的非小细胞肺癌，Repotrectinib显示出超越其他靶向药的疗效，二线数据一枝独秀，而且在一线治疗中100％的脑转移控制率和100％的临床获益率更是令人惊艳。Repotrectinib身为多靶点抑制剂，在对抗黑色素瘤、甲状腺癌、肺腺癌、结肠癌、胃肠道间质瘤等实体瘤上的巨大潜力。

(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚作为洛普替尼的中间体，其高效和绿色的合成方法成为人们关注的焦点，美国的TP Therapeutics公司公布的世界专利WO2017007759公开了一类广谱的蛋白激酶调节剂，能够有效针对多种获得性的突变，从而提供一种全新的治疗癌症的方法。该方法是通过R-叔丁基亚磺酰胺作为手性辅剂，然后在低温(-65℃)条件下，通过甲基溴化镁和亚胺中间体，发生亲核加成反应，从而获得手性中心；后脱掉保护基团叔丁基亚磺酰基得到目标产物。该方法使用的初始原料2-羟基-5-氟苯甲醛以及手性辅剂R-叔丁基亚磺酰胺价格昂贵，成本较高；第二步手性诱导的选择性如何，文中并未提及；第二步加成反应需要在低温下进行，使得该方案很难放大生产。

总之，合成手性胺的化学方法存在步骤长，成本高，产量低以及反应条件较难操作等缺点。而目前酶催化合成方法需要用到催化剂酶、辅酶、助溶剂缓冲液等，且后续处理也需要用到较多试剂并在低温条件下处理，如需大量生产成本较高。因此，针对(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚酶合成方法，如何设计新的合成路线，并选择恰当的酶催化剂和合成条件，这是本领域亟需解决的问题。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种重组基因工程菌及(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的高效制备方法。

一种重组基因工程菌，它是包含胺脱氢酶或甲酸脱氢酶中至少一种酶的对应基因的重组菌。

优选的，所述重组菌为重组大肠杆菌。

优选的，所述胺脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述胺脱氢酶的对应基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述甲酸脱氢酶的对应基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的制备方法，包括如下步骤：

将5-氟-2-羟基苯乙酮原料、辅因子和酶催化剂加入缓冲溶液反应，即得(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚；

其中，所述辅因子为NAD⁺；

所述酶催化剂是上述重组基因工程菌，或含有胺脱氢酶和甲酸脱氢酶的粗酶液。

优选的，所述缓冲溶液为甲酸铵缓冲溶液；所述反应时使用氨水pH为8～9；所述反应的温度为30～60℃；反应的时间为15～25h。

优选的，所述5-氟-2-羟基苯乙酮和酶总质量的投料质量比为50～100:1；所述酶总质量为所述胺脱氢酶和甲酸脱氢酶的质量之和；所述5-氟-2-羟基苯乙酮和缓冲溶液的投料质量体积比为1g:20～50mL。

优选的，所述粗酶液的制备方法为：

步骤(1)，将权利要求1-4任一项所述重组基因工程菌培养至菌体密度OD₆₀₀值达到0.8；

步骤(2)，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至浓度为0.8～1mM，继续培养至OD₆₀₀值达到7～8；

步骤(3)，离心收集菌体，加入磷酸盐缓冲液重悬菌体后，超声破碎菌悬液，离心，上清液即为所述粗酶液；

其中，

步骤(1)中，所述培养的培养基为LB液体培养基，培养温度为20-37℃；步骤(2)中，所述加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至其浓度为0.1-1mM；步骤(2)中，所述培养的温度为20-28℃；步骤(2)中，所述OD₆₀₀值为2-8；步骤(3)中磷酸盐缓冲液的pH为7-8。

优选的，所述5-氟-2-羟基苯乙酮和所述粗酶液的投料质量比为10～20:1。

本发明首先构建了一种具有高选择性、高活性的胺脱氢酶和甲酸脱氢酶，然后利用该两种酶作为催化剂构建出一个高效和可再生的循环系统，提供了一种重要的医药中间体手性(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的制备方法。氧化还原酶比如胺脱氢酶大多依赖辅酶NADPH或NADH进行催化反应，是手性化合物合成的重要生物催化剂，然而辅酶会随着产物的生成而消耗，同时NAD(P)H的高成本阻碍了其大规模生产。因此本发明在反应系统中加入第二种氧化还原酶，以牺牲廉价的底物回收辅因子，构建一个高效、低成本的辅因子再生体系。

目前常见的催化氨基转移的酶为转氨酶，此酶可以手性催化氨基酸与酮酸之间氨基转移，但转氨酶有一些缺点，比如转氨酶需要辅酶磷酸吡哆醛参与转氨基作用，此辅酶成本较高；另外转氨酶由于底物结合区域特殊的空间结构，因此在底物特异性、稳定性、催化效率等方面存在诸多不足，目前满足工业应用需求的转氨酶仍较为有限。本发明涉及的双酶联用系统能够高选择性、高稳定性、高转化率的催化制备(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚。本发明制备方法的ee值大于99.9％，高于现有技术CN107586796A中单独的转氨酶催化得到(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的ee值(99.5％)。

此外，本发明以5-氟-2-羟基苯乙酮为原料，经过两种酶一步酶催化获得(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚，过程中只需要用到缓冲液，无需助溶剂和其他试剂，很大程度节约了成本。且本发明制备方法简化了下游分离精制工艺，是一种过程简洁、绿色环保、成本降低的新工艺。

综上所述，本发明具有工业化的潜力和良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1胺脱氢酶和甲酸脱氢酶

本实施例提供了一种新的胺脱氢酶和一种新的甲酸脱氢酶，其中：

胺脱氢酶核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：

Atgaaagtgctggtgctgggcgcgggcctgatgggcaaagaagcggcgcgcgatctggtgcagagccaggatgtggaagcggtgaccctggcggatgtggatctggcgaaagcggaacagaccgtgcgccagctgcatagcaaaaaactggcggcggtgcgcgtggatgcgggcgatccgcagcagctggcggcggcgatgaaaggccatgatgtggtggtgaacgcgctgttttatcagtttaacgaaaccgtggcgaaaaccgcgattgaaaccggcgtgcatagcgtggatctgggcggccatattggccatattaccgatcgcgtgctggaactgcatgaacgcgcgcaggcggcgggcgtgaccattattccggatctgggcgtggcgccgggcatgattaacattctgagcggctatggcgcgagccagctggatgaagtggaaagcattctgctgtatgtgggcggcattccggtgcgcccggaaccgccgctggaatataaccatgtggcgagcctggaaggcctgctggatcattataccgatccggcgctgattattcgcaacggccagaaacaggaagtgccgagcctgagcgaagtggaaccgatttattttgatcgctttggcccgctggaagcgtttcataccagcggcggcaccagcaccctgagccgcagctttccgaacctgaaacgcctggaatataaaaccattcgctatcgcggccatgcggaaaaatgcaaactgctggtggatctgaccctgacccgccatgatgtggaagtggaaattaacggctgccgcgtgaaaccgcgcgatgtgctgctgagcgtgctgaaaccgctgctggatctgaaaggcaaagatgatgtggtgctgctgcgcgtgattgtgggcggccgcaaagatggcaaagaaaccgtgctggaatatgaaaccgtgacctttaacgatcgcgaaaacaaagtgaccgcgatggcgcgcaccaccgcgtataccattagcgcggtggcgcagctgattggccgcggcgtgattaccaaacgcggcgtgtatccgccggaacagattgtgccgggcgatgtgtatatggatgaaatgaaaaaacgcggcgtgctgattagcgaaaaacgcaccgtgcatagc；

胺脱氢酶氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：

Mkvlvlgaglmgkeaardlvqsqdveavtladvdlakaeqtvrqlhskklaavrvdagdpqqlaaamkghdvvvnalfyqfnetvaktaietgvhsvdlgghighitdrvlelheraqaagvtiipdlgvapgminilsgygasqldevesillyvggipvrpeppleynhvasleglldhytdpaliirngqkqevpslsevepiyfdrfgpleafhtsggtstlsrsfpnlkrleyktiryrghaekckllvdltltrhdveveingcrvkprdvllsvlkplldlkgkddvvllrvivggrkdgketvleyetvtfndrenkvtamarttaytisavaqligrgvitkrgvyppeqivpgdvymdemkkrgvlisekrtvhs；

甲酸脱氢酶核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：

Atggcgagccgcggcagccatcatcatcatcatcatggcgcgatgaaaattgtgctggtgctgtatgatgcgggcaaacatgcggcggatgaagaaaaactgtatggcgcgaccgaaaacaaactgggcattgcgaactggctgaaagatcagggccatgaactgattaccaccagcgataaagaaggcgaaaccagcgaactggataaacatattccggatgcggatattattattaccaccccgtttcatccggcgtatattaccaaagaacgcctggataaagcgaaaaacctgaaactggtggtggtggcgggcgtgggcagcgatcatattgatctggattatattaaccagaccggcaaaaaaattagcgtgctggaagtgaccggcagcaacgtggtgagcgtggcggaacatgtggtgatgaccatgctggtgctggtgcgcaactttgtgccggcgcatgaacagattattaaccatgattgggaagtggcggcgattgcgaaagatgcgtatgatattgaaggcaaaaccattgcgaccattggcgcgggccgcattggctatcgcgtgctggaacgcctgctgccgtttaacccgaaagaactgctgtattatagctttcgcgcgctgccgaaagaagcggaagaaaaagtgggcgcgcgccgcgtggaaaacattgaagaactggtggcgcaggcggatattgtgaccgtgaacgcgccgctgcatgcgggcaccaaaggcctgattaacaaagaactgctgagcaaatttaaaaaaggcgcgtggctggtgaacaccgcgcgcggcgcgatttgcgtggcggaagatgtggcggcggcgctggaaagcggccagctgcgcggctatggcggcgatgtgtggagcccgcagccggcgccgaaagatcatccgtggcgcgatatgcgcaacaaatatggcgcgggcaacgcgatgaccccgcattatagcggcaccaccctggatgcgcagacccgctatgcggaaggcaccaaaaacattctggaaagcttttttaccggcaaatttgattatcgcccgcaggatattattctgctgaacggcgaatatgtgaccaaagcgtatggcaaacatgataaaaaa；

甲酸脱氢酶氨基酸序列(SEQ ID NO.4)：

Masrgshhhhhhgamkivlvlydagkhaadeeklygatenklgianwlkdqghelittsdkegetseldkhipdadiiittpfhpayitkerldkaknlklvvvagvgsdhidldyinqtgkkisvlevtgsnvvsvaehvvmtmlvlvrnfvpaheqiinhdwevaaiakdaydiegktiatigagrigyrvlerllpfnpkellyysfralpkeaeekvgarrvenieelvaqadivtvnaplhagtkglinkellskfkkgawlvntargaicvaedvaaalesgqlrgyggdvwspqpapkdhpwrdmrnkygagnamtphysgttldaqtryaegtknilesfftgkfdyrpqdiillngeyvtkaygkhdkk。

含有上述胺脱氢酶和甲酸脱氢酶的粗酶液或基因工程菌按照如下方法制备：

(1)表达胺脱氢酶、甲酸脱氢酶的菌株的构建和重组表达：

将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列按照现有方法进行全基因合成，并用T4 DNA ligase以黏性末端连接的方式构建在质粒载体pET-28a(+)上，酶切位点为EcoRI/BamHI和HindIII；然后将构建好的质粒导入表达宿主E.coli BL21(DE3)菌株中，即得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-AmDH和BL21(DE3)/pET-28a(+)-AmDH。

(2)胺脱氢酶/甲酸脱氢酶的生产-摇瓶程序：

将上述构建成功的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-ATA接种于LB液体培养基中，37℃摇床中，200rpm震荡培养4～5h，当菌体密度OD₆₀₀值达到0.8时，降温到25℃，并加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至其终浓度为1mM。之后将三角瓶转入28℃摇床中，200rpm继续培养16h至OD₆₀₀达到8，培养结束后，将得到的培养液8000rpm离心5min，弃上清，收集菌体细胞，然后用100mM、pH 7.5磷酸盐缓冲液重悬，重悬比例按照菌泥和磷酸盐缓冲液比例为质量体积比1:5，超声破碎菌悬液，离心后得到的上清为粗酶液。

(3)胺脱氢酶/甲酸脱氢酶的生产-发酵程序：

接种于LB液体培养基中，28℃摇床中，200rpm震荡培养12～16h，当菌体密度OD₆₀₀值达到4-8，以备上罐发酵。在充气、搅拌的15L发酵罐中使用6.0L生长培养基(0.88g/L硫酸铵、0.98g/L柠檬酸钠；12.5g/L磷酸氢二钾三水合物、6.25g/L磷酸二氢钾、3.3g/LTastone-154酵母提取物、0.083g/L柠檬酸铁铵，以及8.3毫升/升的微量元素溶液，含有2克/升二水氯化钙、2.2克/升七水硫酸锌、0.5克/升硫酸锰一水合物、1克/升七水硫酸亚铜、0.1克/升钼酸铵四水合物和0.02克/升四硼酸钠。将容器在121℃和15PSI下灭菌30分钟，灭菌后加入100μM吡哆醇。发酵罐接种OD₆₀₀值达到4-8的大肠杆菌晚期种子液，该培养物含有编码目的胺脱氢酶/甲酸脱氢酶基因的质粒。发酵罐以250-1250rpm搅拌，并以0.6-25L/min的速度向发酵容器供应空气，以保持50％饱和度或更高的溶解氧水平。通过加入7％v/v氢氧化铵，将培养物的pH值保持在0.20。通过添加含有500g/L葡萄糖、12g/L氯化铵和5.1g/L七水硫酸镁的饲料溶液来维持培养物的生长。培养至菌浓达到OD ₆₀₀为20后，通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM诱导胺脱氢酶/甲酸脱氢酶的表达，并继续发酵18小时。然后将培养物冷却至4℃并保持在该温度直至收获，将得到的培养液6000rpm离心5min收集细胞，收获的细胞直接用于下面的酶催化反应，或者它们可以储存-20℃直到使用。

实施例2、酶催化制备(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚

本实施例酶催化制备(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯的合成路线如下：

以5-氟-2-羟基苯乙酮为底物，来制备(R)-2-(1-10mg氨基乙基)-4-氟苯酚，制备体系为：总反应体系为100mL，包括1.2g 5-氟-2-羟基苯乙酮，5mL胺基脱氢酶粗酶液，5mL甲酸脱氢酶粗酶液(粗酶液按照实施例1步骤2制备，其中缓冲液为100mM/pH7.5磷酸盐缓冲液)，NAD⁺(1mM)在2mol/L甲酸铵维持pH＝8.5，50℃下敞口振荡反应48h后，用浓HCl(6mL)酸化反应，用MTBE(2×80mL)提取未反应的起始物质。加入Na₂CO₃(10M,12mL)后，用MTBE(2×120mL)提取胺产物。结合的有机层在MgSO₄上干燥，并在减压下浓缩，无需进一步纯化。用液相色谱法检测反应体系内生成的(R)-2-(1-胺基乙基)-4-氟苯含量，底物转化率88％，产品(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯的摩尔收率87％，ee值大于99.9％。

实施例3、酶催化制备(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚

以5氟2羟基苯乙酮为底物，来制备(R)-2-(1-10mg氨基乙基)-4-氟苯酚，制备体系为：总反应体系为100mL，包括1.2g 5氟2羟基苯乙酮，5mL胺基脱氢酶粗酶液，5mL甲酸脱氢酶粗酶液(粗酶液按照实施例1步骤2制备，其中缓冲液为100mM/pH8.0磷酸盐缓冲液)，NAD+(1mM)在2mol/L甲酸铵维持pH＝8.5，50℃下敞口振荡反应48h后，用浓HCl(6mL)酸化反应，用MTBE(2×80mL)提取未反应的起始物质。加入Na₂CO₃(10M,12mL)后，用MTBE(2×120mL)提取胺产物。结合的有机层在MgSO₄上干燥，并在减压下浓缩，无需进一步纯化。用液相色谱法检测反应体系内生成的(R)2(1胺基乙基)4氟苯含量，底物的转化率86％，产品(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯摩尔收率81％，ee值大于99.6％。

实施例4、酶催化制备(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚

以5氟2羟基苯乙酮为底物，来制备(R)-2-(1-10mg氨基乙基)-4-氟苯酚，制备体系为：总反应体系为100mL，包括1.2g 5氟2羟基苯乙酮，5mL胺基脱氢酶粗酶液，5mL甲酸脱氢酶粗酶液(粗酶液按照实施例1步骤2制备，其中缓冲液为100mM/pH8.5磷酸盐缓冲液)，NAD+(1mM)在2mol/L甲酸铵维持pH＝7.5，50℃下敞口振荡反应48h后，用浓HCl(6mL)酸化反应，用MTBE(2×80mL)提取未反应的起始物质。加入Na₂CO₃(10M,12mL)后，用MTBE(2×120mL)提取胺产物。结合的有机层在MgSO₄上干燥，并在减压下浓缩，无需进一步纯化。用液相色谱法检测反应体系内生成的(R)2(1胺基乙基)4氟苯含量，底物的转化率50％，产品(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯摩尔收率48％，ee值大于95％。

实施例5、酶催化制备(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚

以5-氟-2-羟基苯乙酮为底物，来制备(R)-2-(1-10mg胺基乙基)-4-氟苯酚，制备体系为：总反应体系为100mL，包括1.2g 5-氟-2-羟基苯乙酮，5mL胺基脱氢酶粗酶液，10mL甲酸脱氢酶粗酶液(粗酶液按照实施例1步骤2制备，其中缓冲液为100mM/pH7.5 Tris-HCl缓冲液)，超声破碎菌悬液，再离心后的上清液，NAD⁺(1mM)在2mol/L甲酸铵维持pH＝8.5，50℃下敞口振荡反应48h后，用浓HCl(6mL)酸化反应，用MTBE(2×80mL)提取未反应的起始物质。加入Na₂CO₃(10M,12mL)后，用MTBE(2×120mL)提取胺产物。结合的有机层在MgSO₄上干燥，并在减压下浓缩，无需进一步纯化。用液相色谱法检测反应体系内生成的(R)-2-(1-胺基乙基)-4-氟苯含量，底物转化率87％，产品(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯摩尔收率83％，ee值大于99.7％。

实施例6、酶催化制备(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚

以5-氟-2-羟基苯乙酮为底物，来制备(R)-2-(1-10mg胺基乙基)-4-氟苯酚，制备体系为：总反应体系为100mL，包括1.2g 5-氟-2-羟基苯乙酮，5mL胺基脱氢酶粗酶液，10mL甲酸脱氢酶粗酶液(粗酶液按照实施例1步骤2制备，其中缓冲液为100mM/pH7.0 Tris-HCl缓冲液)，超声破碎菌悬液，再离心后的上清液，NAD⁺(1mM)在2mol/L甲酸铵维持pH＝8.5，50℃下敞口振荡反应48h后，用浓HCl(6mL)酸化反应，用MTBE(2×80mL)提取未反应的起始物质。加入Na₂CO₃(10M,12mL)后，用MTBE(2×120mL)提取胺产物。结合的有机层在MgSO₄上干燥，并在减压下浓缩，无需进一步纯化。用液相色谱法检测反应体系内生成的(R)-2-(1-胺基乙基)-4-氟苯含量，底物的转化率84％，产品(R)2(1氨基乙基)4氟苯摩尔收率80％，ee值大于99.5％。

实施例7、酶催化制备(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚

以5-氟-2-羟基苯乙酮为底物，来制备(R)-2-(1-10mg胺基乙基)-4-氟苯酚，制备体系为：总反应体系为100mL，包括1.2g 5-氟-2-羟基苯乙酮，5mL胺基脱氢酶粗酶液，10mL甲酸脱氢酶粗酶液(粗酶液按照实施例1步骤2制备，其中缓冲液为100mM/pH6.5Tris-HCl缓冲液)，超声破碎菌悬液，再离心后的上清液，NAD⁺(1mM)在2mol/L甲酸铵维持pH＝8.5，50℃下敞口振荡反应48h后，用浓HCl(6mL)酸化反应，用MTBE(2×80mL)提取未反应的起始物质。加入Na₂CO₃(10M,12mL)后，用MTBE(2×120mL)提取胺产物。结合的有机层在MgSO₄上干燥，并在减压下浓缩，无需进一步纯化。用液相色谱法检测反应体系内生成的(R)-2-(1-胺基乙基)-4-氟苯含量，底物的转化率45％，产品(R)2(1氨基乙基)4氟苯摩尔收率40％，ee值大于93％。

综上，本发明首先构建了一种具有高选择性、高活性的氧化还原酶胺脱氢酶和甲酸脱氢酶，两个酶的联合催化作用构建出一个高效且可再生的系统，提供了一种手性(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯的高效制备方法。本发明以5-氟-2-羟基苯乙酮为原料，经过胺脱氢酶和甲酸脱氢酶一步酶法催化获得(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯，在制备过程中只需要底物，酶和缓冲液不需要其他任何试剂，操作过程简单易行，反应条件温和。该方法不仅提高了原料的转化率和产物收率，同时制备的手性产物光学选择性好，ee值大于99.9％。此外，通过工业生物技术实现绿色清洁的生产工艺，是手性化合物制造产业转型升级的“绿色动力”，本发明的制备方法简化了下游分离精制工艺，是一种过程简洁、成本较低、绿色环保的新工艺，具有有工业化的潜力和良好的应用前景。

Claims

1.一种重组基因工程菌，其特征在于：它是包含胺脱氢酶或甲酸脱氢酶中至少一种酶的对应基因的重组菌。

2.按照权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述重组菌为重组大肠杆菌。

3.按照权利要求2所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述胺脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.按照权利要求3所述的重组基因工程菌，其特征在于：所述胺脱氢酶的对应基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述甲酸脱氢酶的对应基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.一种(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯酚的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

其中，所述辅因子为NAD⁺；

所述酶催化剂是权利要求1-4任一项所述重组基因工程菌，或含有胺脱氢酶和甲酸脱氢酶的粗酶液。

6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述胺脱氢酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲溶液为甲酸铵缓冲溶液；所述反应时使用氨水pH为8～9；所述反应的温度为30～60℃；反应的时间为15～25h。

8.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述5-氟-2-羟基苯乙酮和酶总质量的投料质量比为50～100:1；所述酶总质量为所述胺脱氢酶和甲酸脱氢酶的质量之和；所述5-氟-2-羟基苯乙酮和缓冲溶液的投料质量体积比为1g:20～50mL。

9.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述粗酶液的制备方法为：

其中，

10.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述5-氟-2-羟基苯乙酮和所述粗酶液的投料质量比为10～20:1。