CN102676596A - 生物酶手性合成立普妥中间体ats-7 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶法合成(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯(ATS-7，立普妥中间体)及其衍生物的制备方法，其制备过程用以下反应式表示：

Description

生物酶手性合成立普妥中间体ATS-7
技术领域
本发明涉及手性(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯(ATS-7，立普妥中间体)及其衍生物的酶法制备，属于酶在手性合成中的应用领域，本方法也属于绿色化学及基因工程领域。 
背景技术
(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯(ATS-7)是生产立普妥的关键手性中间体之一，中国大多用化学法在生产。成本高，纯度低，污染尤其严重，对环境的影响非常大。用生物转化来生产这些中间体，有明显的优势。目前，Ciba，Diverva，DSM，Codixis等公司在ATS-7合成中采用酶法工艺。在已有工艺和知识的基础上，我们筛选得到关键酶，包括酮还原酶，葡萄糖脱氢酶，在已知蛋白结构的基础上通过半随几饱和突变和定向突变等方法增加酶活性，手性反应选择性(光学纯度e.e值上升)，热稳定性和对有机溶剂耐受能力。因此，生物催化活性得以大大提高，反应的手性选择性也得到了加强，这就使得ATS-7的生产成本大大降低。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：将提供一种反应步骤短、成本较低、产品光学纯度高的(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯(ATS-7)及其衍生物的制备方法。 
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：所述的手性(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯(ATS-7)及其衍生物的制备方法，其制备过程用以下反应式表示： 
Figure BSA00000451451700021
上式中，R为甲基，乙基，丙基，丁基(ATS-7，R为叔丁基)，或苄基，以及其它C1-C8任意取代烷基。其主要原理是在缓冲溶液中，利用基因重组的氧化还原酶和相关辅酶还原化合物I中的羰基，得到手性化合物II(ATS-7，R为叔丁基)。 
所述制备方法包括如下步骤：将一摩尔的化合物I溶于500毫升到2000毫升的缓冲溶液和有机溶剂中，在上述有机溶液中加入重量为化合物I的0.1～20％的基因重组氧化还原酶、葡萄糖氧化酶、辅酶，保持体系在15到45摄氏度之间，优先在25～45摄氏度，搅拌48-120小时，停止反应，调节pH，用1000毫升左右的有机溶剂萃取3次，合并有机相，干燥剂干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标化合物II。 
上面所述的氧化还原酶是大肠杆菌高效表达酮还原酶。 
上面所述的氧化还原酶，用于其表达的大肠杆菌工程菌直接催化。 
上面所述的葡萄糖脱氢酶，利用一种噬热菌的葡萄糖脱氢酶变体高效还原NADP辅酶。变体和野生型相比有三个氨基酸差别。 
上面所述的葡萄糖脱氢酶，可利用大肠杆菌高效表达这个葡萄糖脱氢酶。 
上面所述的氧化还原酶及葡萄糖脱氢酶，利用大肠杆菌共表达S1酮还原酶和葡萄糖脱氢酶。 
上面所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、叔丁醇、己丙醇、四氢呋喃、甲基叔丁醚。 
上面所述的缓冲溶液为无机磷酸及无机磷酸盐。 
上面所述的所用的无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾。 
本发明的优点是：产率高，产品光学纯度高，反应时间短，氧化还原酶系基因重组产物，制备成本较低。 
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的描述，但不以任何方式限制本发明。 
实施例1： 
取50毫升，0.1M，pH＝7.0的Na2H2PO4.Na2HPO4缓冲溶液加入一三角瓶中，加入化合物1(10克)和氧化还原酶(0.1克)，葡萄糖脱氢酶(0.5克)，NADPH辅酶(0.05克)，于40摄氏度下搅拌72小时，控制pH值在7.5～8.5之间，高效液相色谱监控反应结束。乙酸乙酯提取两遍，有机相旋干得到9.2克ATS-7(光学纯度＞99％，产率＞90％) 。

Claims (10)

1.手性酶法合成(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯(ATS-7，立普妥中间体)及其衍生物的制备方法，其制备过程用以下反应式表示：
Figure FSA00000451451600011
上式中，R为甲基，乙基，丙基，丁基(叔丁基，ATS-7)，或苄基，以及其它C1-C8任意取代烷基。其主要原理是在缓冲溶液中，利用基因重组的氧化还原酶和相关辅酶还原化合物I中的羰基，通过无机酸碱调节pH值，利用有机溶剂提取，得到手性化合物II(ATS-7，R为叔丁基)。
2.Candida magnoliae酮还原酶的变体基因和蛋白序列。变体的序列和野生型序列有1-10个氨基酸改变。这些变体可更高效催化还原。
3.根据权利要求1所示的手性酶法合成(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯及衍生物，其特征在于：利用大肠杆菌高效表达酮还原酶。
4.根据权利要求1所示的手性酶法合成(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯及衍生物，其特征在于：利用这个大肠杆菌工程菌直接催化。
5.根据权利要求1所示的手性酶法合成(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯及衍生物，其特征在于：利用一种噬热菌的葡萄糖脱氢酶变体高效还原NADP辅酶。变体和野生型相比有三个氨基酸差别。
6.根据权利要求1所示的手性酶法合成(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯及衍生物，其特征在于：利用大肠杆菌高效表达这个葡萄糖脱氢酶。
7.根据权利要求1所示的手性酶法合成(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯衍生物，其特征在于：利用大肠杆菌共表达S1酮还原酶和葡萄糖脱氢酶。
8.根据权利要求1所示的手性酶法合成(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯及衍生物，其特征在于：利用这个大肠杆菌工程菌直接催化。
9.根据权利要求1所示的手性酶法合成(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯及衍生物，其特征在于：所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、叔丁醇、己丙醇、四氢呋喃、甲基叔丁醚。
10.根据权利要求1所示的手性酶法合成(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯及衍生物，其特征在于：所用缓冲溶液为无机磷酸及无机磷酸盐。
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