CN104313074A - 一种青霉催化生产吡啶基乙醇方法 - Google Patents

一种青霉催化生产吡啶基乙醇方法 Download PDF

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刘涛
刘均洪
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Abstract

一种青霉催化生产吡啶基乙醇方法,即用青霉菌细胞生物催化制备光活性(S)-1-(2-吡啶基)乙醇,反应罐中加入磷酸盐缓冲液,加入棉纱布调控底物、产物浓度。用青霉菌细胞进行生物催化反应,产品收率高,对映体过量率(ee%)高,具有很好的应用前景。

Description

一种青霉催化生产吡啶基乙醇方法
技术领域
 本发明属于制药工程技术领域,特别涉及到青霉菌细胞生物催化制备手性医药中间体(S)-1-(2-吡啶基)乙醇的技术。
背景技术
手性(S)-1-(2-吡啶基)乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备羟基手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的手性化合物。生物催化制备手性(S)-1-(2-吡啶基)乙醇具有很好的应用前景。
生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物催化法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。生物细胞还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。
 (S)-1-(2-吡啶基)乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块,由于有2个手性中心,使得化学合成较为困难,成本高。本发明将采用生物催化制备(S)-1-(2-吡啶基)乙醇。
发明内容
本发明采用青霉菌细胞催化制备(S)-1-(2-吡啶基)乙醇,反应式如下:
底物2-乙酰基吡啶(1)经青霉菌催化反应,得到产物(S)-1-(2-吡啶基)乙醇(2)。有多种微生物可以催化此反应,经过大量实验筛选,最终确定采用青霉菌作为催化剂,因为其催化1反应的效果最好,反应收率、对映体过量率(ee%)均很高。
许多青霉菌都可以进行生物催化本反应,然而,其效果不同,相差很大,经实验,本发明选用青霉菌菌株为ATCC 204045,其催化本反应效果最佳。
培养介质:
1、 培养液成份:玉米浆( 以干物质计)含量为35-45g/L, 酵母浸膏8-10 g/L,葡萄糖18-22 g/L,麦芽浸膏25-30 g,硫酸铵0.5-0.7g/L,硫酸镁0.3-0.4g/L,磷酸二氧钾1.8-2.3g/L,碳酸钙 0.7 g/L,硫酸亚铁 0.18 g/L,硫酸锰 0.025 g/L;pH 4.7-4.9。
2、固体培养基成份: 在液体培养基中加入1.5-2%的琼脂粉。
青霉菌细胞制备。青霉菌经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液;发酵罐加入培养液,装料系数为0.6-0.7,121℃高压灭菌30分钟,冷却至25-26℃,将青霉菌ATCC 204045种子液接种至发酵罐,接种比例为10-15%,通气比为0.5-1V/(V分钟),即每分钟通气量为0.5-1倍发酵液体积,25-26℃培养32-40小时,用过滤式离心机离心得到湿青霉菌细胞,用作生物催化反应催化剂。湿细胞制取技术为成熟技术。
由于底物、产物均对青霉菌细胞有抑制作用,为了减少底物、产物对细胞的抑制,本发明采用棉纱布吸附底物,反应中,当底物被细胞催化反应,浓度降低时,底物从棉纱布溶出,补充反应消耗的底物。同时,产物被棉纱布吸附,减少了其在水中的浓度,从而大幅度降低了底物、产物对细胞的抑制。底物与棉纱布的比率,决定了反应液中底物、产物的浓度,而且,浓度还与反应温度、反应液成份有关。不同细胞对底物、产物的敏感度不同,所以,要进行大量实验,才能确定最佳的底物与棉纱布的比率。实验表明,对于本发明的菌株、反应液成份、反应温度,最佳的底物与棉纱布的比率为0.3-0.32。具体吸附时,将底物2-乙酰基吡啶用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收,即得到吸附了底物的棉纱布。调节底物与棉纱布用量,使得底物与棉纱布的质量比率为0.3-0.32。所用棉纱布为普通棉纱布,从市场上购买后,切成0.5cmX0.5cm小块,灭菌,无菌保存待用。
底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液,装料系数为0.6-0.7,pH为6.0,加入吸附了底物2-乙酰基吡啶的棉纱布,使底物2-乙酰基吡啶添加量为80-90 g/L。玉米浆( 以干物质计)含量为12-15g/L,葡萄糖含量为 16-18g/L,木糖9-10 g/L,吐温80含量为15-16g/L,121℃高压灭菌30分钟;冷却至30-31℃时,加入湿青霉菌细胞使浓度为20-22g/L,通气比为0.1-0.12V/(V分钟),即每分钟通气量为0.1-0.12倍反应液体积,进行生物催化反应,反应时间为42-46小时;反应结束后,先滤出细胞,再滤出棉纱布,用0.3倍反应体积的乙酸乙酯萃取反应液2次,用3倍棉纱布质量的乙酸乙酯萃取棉纱布3次,合并乙酸乙酯萃取液,蒸出乙酸乙酯,反应转化率96-98%,产品收率94-96%,对映体过量率(ee%)98-99%。
本发明所开展工作包括菌株选择(从近百个菌株中选择)、催化反应条件优化(反应温度、通气量、pH)、反应介质选择和浓度优化(底物浓度、葡萄糖含量、木糖含量、表面活性剂种类(20多种选1)及浓度、其它多种成份选择排除),采用固体吸附控制底物产物浓度,从而减少对细胞的抑制,试验了白土、硅藻土、棉纱布、苎麻纱布、大孔树酯等多种固体材料,还曾进行了水-有机溶剂2相体系试验。由于试验量很大,尽管采用了响应面优化设计试验,大幅度减少了试验量,试验量仍然很大,全部试验进行2年多才完成,达成目前的技术方案。对于光活性产物而言,当反应转化率96-98%,产品收率94-96%时,对映体过量率(ee%)仍然高达98-99%,是非常不易的,我们的工作取得了显著进步。
实施例1 
  用常规方法制取湿青霉菌ATCC 204045细胞,用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的棉纱布制作方法为,将底物2-乙酰基吡啶用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收,即得到吸附了底物的棉纱布,调节底物与棉纱布用量,使得底物与棉纱布的质量比率为0.3。所用棉纱布为普通棉纱布,从市场上购买后,切成0.5cmX0.5cm小块,灭菌,无菌保存待用,其它实施例棉纱布处理相同。
15L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液,装料系数为0.6,pH为6.0,加入吸附了底物2-乙酰基吡啶的棉纱布,使底物2-乙酰基吡啶添加量为80 g/L,玉米浆( 以干物质计)含量为12g/L,葡萄糖含量为 16g/L,木糖9 g/L,吐温80含量为15g/L,121℃高压灭菌30分钟;冷却至30℃时,加入湿青霉菌细胞使浓度为20g/L,通气比为0.1V/(V分钟),即每分钟通气量为0.1倍反应液体积,进行生物催化反应,反应时间为42小时;反应结束后,分别滤出细胞、棉纱布,用乙酸乙酯萃取反应液、萃取棉纱布,合并乙酸乙酯萃取液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-1-(2-吡啶基)乙醇,反应转化率96%,产品收率94%,对映体过量率(ee%)99%。
实施例2 
  用常规方法制取湿青霉菌ATCC 204045细胞,用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的棉纱布制作方法为,将底物2-乙酰基吡啶用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收,即得到吸附了底物的棉纱布,调节底物与棉纱布用量,使得底物与棉纱布的质量比率为0.32。所用棉纱布为普通棉纱布,从市场上购买后,切成0.5cmX0.5cm小块,灭菌,无菌保存待用,其它实施例棉纱布处理相同。
100L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液,装料系数为0.7,pH为6.0,加入吸附了底物2-乙酰基吡啶的棉纱布,使底物2-乙酰基吡啶添加量为90 g/L,玉米浆( 以干物质计)含量为15g/L,葡萄糖含量为18g/L,木糖10 g/L,吐温80含量为16g/L,121℃高压灭菌30分钟;冷却至31℃时,加入湿青霉菌细胞使浓度为22g/L,通气比为0.12V/(V分钟),即每分钟通气量为0.12倍反应液体积,进行生物催化反应,反应时间为46小时;反应结束后,分别滤出细胞、棉纱布,用乙酸乙酯萃取反应液、萃取棉纱布,合并乙酸乙酯萃取液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-1-(2-吡啶基)乙醇,反应转化率98%,产品收率96%,对映体过量率(ee%)98%。
实施例3 
  用常规方法制取湿青霉菌ATCC 204045细胞,用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的棉纱布制作方法为,将底物2-乙酰基吡啶用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收,即得到吸附了底物的棉纱布,调节底物与棉纱布用量,使得底物与棉纱布的质量比率为0.31。所用棉纱布为普通棉纱布,从市场上购买后,切成0.5cmX0.5cm小块,灭菌,无菌保存待用,其它实施例棉纱布处理相同。
500L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液,装料系数为0.65,pH为6.0,加入吸附了底物2-乙酰基吡啶的棉纱布,使底物2-乙酰基吡啶添加量为85 g/L,玉米浆( 以干物质计)含量为13g/L,葡萄糖含量为 17g/L,木糖9.5 g/L,吐温80含量为15.5g/L,121℃高压灭菌30分钟;冷却至30.5℃时,加入湿青霉菌细胞使浓度为21g/L,通气比为0.11V/(V分钟),即每分钟通气量为0.11倍反应液体积,进行生物催化反应,反应时间为44小时;反应结束后,分别滤出细胞、棉纱布,用乙酸乙酯萃取反应液、萃取棉纱布,合并乙酸乙酯萃取液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-1-(2-吡啶基)乙醇,反应转化率97%,产品收率95%,对映体过量率(ee%)98.5%。
实施例4 
  用常规方法制取湿青霉菌ATCC 204045细胞,用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的棉纱布制作方法为,将底物2-乙酰基吡啶用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收,即得到吸附了底物的棉纱布,调节底物与棉纱布用量,使得底物与棉纱布的质量比率为0.32。所用棉纱布为普通棉纱布,从市场上购买后,切成0.5cmX0.5cm小块,灭菌,无菌保存待用,其它实施例棉纱布处理相同。
1000L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液,装料系数为0.67,pH为6.0,加入吸附了底物2-乙酰基吡啶的棉纱布,使底物2-乙酰基吡啶添加量为90 g/L,玉米浆( 以干物质计)含量为14g/L,葡萄糖含量为 17g/L,木糖10 g/L,吐温80含量为16g/L,121℃高压灭菌30分钟;冷却至31℃时,加入湿青霉菌细胞使浓度为21g/L,通气比为0.12V/(V分钟),即每分钟通气量为0.12倍反应液体积,进行生物催化反应,反应时间为45小时;反应结束后,分别滤出细胞、棉纱布,用乙酸乙酯萃取反应液、萃取棉纱布,合并乙酸乙酯萃取液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-1-(2-吡啶基)乙醇,反应转化率97%,产品收率95.5%,对映体过量率(ee%)98.5%。

Claims (2)

1.一种青霉菌细胞生物催化制备(S)-1-(2-吡啶基)乙醇的方法,其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液,装料系数为0.6-0.7,pH为6.0,加入吸附了底物2-乙酰基吡啶的棉纱布,使底物2-乙酰基吡啶添加量为80-90 g/L,玉米浆( 以干物质计)含量为12-15g/L,葡萄糖含量为 16-18g/L,木糖9-10 g/L,吐温80含量为15-16g/L,121℃高压灭菌30分钟;冷却至30-31℃时,加入湿青霉菌细胞使浓度为20-22g/L,通气比为0.1-0.12V/(V分钟),进行生物催化反应,反应时间为42-46小时;反应结束后,分别滤出细胞、棉纱布,用乙酸乙酯萃取反应液、萃取棉纱布,合并乙酸乙酯萃取液,蒸出乙酸乙酯,得到产物(S)-1-(2-吡啶基)乙醇,反应转化率96-98%,产品收率94-96%,对映体过量率(ee%)98-99%。
2.权利要求1所述的方法,其特征在于所述吸附了底物的棉纱布制作方法为,将底物2-乙酰基吡啶用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收,即得到吸附了底物的棉纱布,调节底物与棉纱布用量,使得底物与棉纱布的质量比率为0.3-0.32。
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CN114934083A (zh) * 2022-05-31 2022-08-23 重庆张邦医药科技有限责任公司 一种高纯度(s)-1-(吡啶-2-基)乙醇衍生物的制备方法

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