CN104293856A - 一种细胞催化生产氟吡啶乙酮的方法 - Google Patents
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Abstract
一种细胞催化生产光活性苯乙醇的方法，即用青霉菌细胞生物催化制备光活性(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶，反应罐中加入磷酸盐缓冲液，加入苎麻纱布调控底物、产物浓度。用青霉菌细胞进行生物催化反应，产品收率高，对映体过量率（ee%）高，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到青霉菌细胞生物催化制备手性医药中间体(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶的技术。
背景技术
手性(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备羟基手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的手性化合物。生物催化制备手性(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶具有很好的应用前景。
生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物催化法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。生物细胞还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。
(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，由于有2个手性中心，使得化学合成较为困难，成本高。本发明将采用生物催化制备(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶。
发明内容
本发明采用青霉菌细胞催化制备(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶，反应式如下：
底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮（1）经青霉菌催化反应，得到产物(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶（2）。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用青霉菌作为催化剂，因为其催化1反应的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%）均很高。
许多青霉菌都可以进行生物催化本反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用青霉菌菌株为ATCC 204054，其催化本反应效果最佳。
培养介质：
1、 培养液成份：玉米浆( 以干物质计)含量为35-45g/L， 酵母浸膏8-10 g/L，葡萄糖18-22 g/L，麦芽浸膏25-30 g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L，碳酸钙 0.7 g/L,硫酸亚铁 0.18 g/L,硫酸锰 0.025 g/L;pH 4.7-4.9。
2、固体培养基成份： 在液体培养基中加入1.5-2%的琼脂粉。
青霉菌细胞制备。青霉菌经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至25-26℃，将青霉菌ATCC 204054种子液接种至发酵罐，接种比例为10-15％，通气比为0.5-1V/（V分钟），即每分钟通气量为0.5-1倍发酵液体积，25-26℃培养32-40小时，用过滤式离心机离心得到湿青霉菌细胞，用作生物催化反应催化剂。湿细胞制取技术为成熟技术。
由于底物、产物均对青霉菌细胞有抑制作用，为了减少底物、产物对细胞的抑制，本发明采用苎麻纱布吸附底物，反应中，当底物被细胞催化反应，浓度降低时，底物从苎麻纱布溶出，补充反应消耗的底物。同时，产物被苎麻纱布吸附，减少了其在水中的浓度，从而大幅度降低了底物、产物对细胞的抑制。底物与苎麻纱布的比率，决定了反应液中底物、产物的浓度，而且，浓度还与反应温度、反应液成份有关。不同细胞对底物、产物的敏感度不同，所以，要进行大量实验，才能确定最佳的底物与苎麻纱布的比率。实验表明，对于本发明的菌株、反应液成份、反应温度，最佳的底物与苎麻纱布的比率为0.24-0.26。具体吸附时，将底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮用尺寸为0.5cmX0.5cm的苎麻纱布吸收，即得到吸附了底物的苎麻纱布。调节底物与苎麻纱布用量，使得底物与苎麻纱布的质量比率为0.24-0.26。所用苎麻纱布为普通苎麻纱布，从市场上购买后，切成0.5cmX0.5cm小块，灭菌，无菌保存待用。
底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为5.2，加入吸附了底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮的苎麻纱布，使底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮添加量为80-90 g/L，玉米浆( 以干物质计)含量为11-13g/L，葡萄糖含量为 15-17g/L，木糖16-18g/L，吐温80含量为11-13g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至26-27℃时，加入湿青霉菌细胞使浓度为40-44g/L，通气比为0.15-0.16V/（V分钟），即每分钟通气量为0.15-0.16倍反应液体积，进行生物催化反应，反应时间为65-69小时；反应结束后，分别滤出细胞、苎麻纱布，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取苎麻纱布，合并乙酸乙酯萃取液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶，反应转化率96-98％，产品收率94-96％，对映体过量率（ee%）98-99％。
本发明所开展工作包括菌株选择（从近百个菌株中选择）、催化反应条件优化（反应温度、通气量、pH）、反应介质选择和浓度优化（底物浓度、葡萄糖含量、木糖含量、表面活性剂种类（20多种选1）及浓度、其它多种成份选择排除），采用固体吸附控制底物产物浓度，从而减少对细胞的抑制，试验了白土、硅藻土、棉纱布、苎麻纱布、大孔树酯等多种固体材料，还曾进行了水-有机溶剂2相体系试验。由于试验量很大，尽管采用了响应面优化设计试验，大幅度减少了试验量，试验量仍然很大，全部试验进行2年多才完成，达成目前的技术方案。对于光活性产物而言，当反应转化率96-98％，产品收率94-96％时，对映体过量率（ee%）仍然高达98-99％，是非常不易的，我们的工作取得了显著进步。
实施例1
用常规方法制取湿青霉菌ATCC 204054细胞，用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的苎麻纱布制作方法为，将底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮用尺寸为0.5cmX0.5cm的苎麻纱布吸收，即得到吸附了底物的苎麻纱布，调节底物与苎麻纱布用量，使得底物与苎麻纱布的质量比率为0.24。所用苎麻纱布为普通苎麻纱布，从市场上购买后，切成0.5cmX0.5cm小块，灭菌，无菌保存待用，其它实施例苎麻纱布处理相同。
15L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为5.2，加入吸附了底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮的苎麻纱布，使底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮添加量为80 g/L，玉米浆( 以干物质计)含量为11g/L，葡萄糖含量为 15g/L，木糖16g/L，吐温80含量为11g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至26℃时，加入湿青霉菌细胞使浓度为40g/L，通气比为0.15V/（V分钟），即每分钟通气量为0.15倍反应液体积，进行生物催化反应，反应时间为65小时；反应结束后，分别滤出细胞、苎麻纱布，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取苎麻纱布，合并乙酸乙酯萃取液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶，反应转化率96％，产品收率94％，对映体过量率（ee%）99％。
实施例2
用常规方法制取湿青霉菌ATCC 204054细胞，用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的苎麻纱布制作方法为，将底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮用尺寸为0.5cmX0.5cm的苎麻纱布吸收，即得到吸附了底物的苎麻纱布，调节底物与苎麻纱布用量，使得底物与苎麻纱布的质量比率为0.24-0.26。
100L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为5.2，加入吸附了底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮的苎麻纱布，使底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮添加量为90 g/L，玉米浆( 以干物质计)含量为13g/L，葡萄糖含量为17g/L，木糖18g/L，吐温80含量为13g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至27℃时，加入湿青霉菌细胞使浓度为44g/L，通气比为0.16V/（V分钟），即每分钟通气量为0.16倍反应液体积，进行生物催化反应，反应时间为69小时；反应结束后，分别滤出细胞、苎麻纱布，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取苎麻纱布，合并乙酸乙酯萃取液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶，反应转化率98％，产品收率96％，对映体过量率（ee%）98％。
实施例3
用常规方法制取湿青霉菌ATCC 204054细胞，用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的苎麻纱布制作方法为，将底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮用尺寸为0.5cmX0.5cm的苎麻纱布吸收，即得到吸附了底物的苎麻纱布，调节底物与苎麻纱布用量，使得底物与苎麻纱布的质量比率为0.25。
500L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为5.2，加入吸附了底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮的苎麻纱布，使底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮添加量为85 g/L，玉米浆( 以干物质计)含量为12g/L，葡萄糖含量为 16g/L，木糖17g/L，吐温80含量为12g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至26-27℃时，加入湿青霉菌细胞使浓度为42g/L，通气比为0.155V/（V分钟），即每分钟通气量为0.155倍反应液体积，进行生物催化反应，反应时间为67小时；反应结束后，分别滤出细胞、苎麻纱布，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取苎麻纱布，合并乙酸乙酯萃取液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶，反应转化率97.2％，产品收率95.1％，对映体过量率（ee%）98.4％。
实施例4
用常规方法制取湿青霉菌ATCC 204054细胞，用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的苎麻纱布制作方法为，将底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮用尺寸为0.5cmX0.5cm的苎麻纱布吸收，即得到吸附了底物的苎麻纱布，调节底物与苎麻纱布用量，使得底物与苎麻纱布的质量比率为0.26。
1000L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为5.2，加入吸附了底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮的苎麻纱布，使底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮添加量为89 g/L，玉米浆( 以干物质计)含量为12g/L，葡萄糖含量为 16g/L，木糖18g/L，吐温80含量为13g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至27℃时，加入湿青霉菌细胞使浓度为44g/L，通气比为0.16V/（V分钟），即每分钟通气量为0.16倍反应液体积，进行生物催化反应，反应时间为69小时；反应结束后，分别滤出细胞、苎麻纱布，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取苎麻纱布，合并乙酸乙酯萃取液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶，反应转化率98％，产品收率95.7％，对映体过量率（ee%）98.5％。
Claims (2)
1.一种青霉菌细胞生物催化制备(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶的方法，其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液，pH为5.2，加入吸附了底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮的苎麻纱布，使底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮添加量为80-90 g/L，玉米浆( 以干物质计)含量为11-13g/L，葡萄糖含量为 15-17g/L，木糖16-18g/L，吐温80含量为11-13g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至26-27℃时，加入湿青霉菌细胞使浓度为40-44g/L，通气比为0.15-0.16V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为65-69小时；反应结束后，分别滤出细胞、苎麻纱布，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取苎麻纱布，合并乙酸乙酯萃取液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(S)-5-（1-羟乙基）氟[2,3-c]吡啶，反应转化率96-98％，产品收率94-96％，对映体过量率（ee%）98-99％。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述吸附了底物的苎麻纱布制作方法为，将底物1-（5-（氟[2，3-c]吡啶基））乙酮用尺寸为0.5cmX0.5cm的苎麻纱布吸收，即得到吸附了底物的苎麻纱布，调节底物与苎麻纱布用量，使得底物与苎麻纱布的质量比率为0.24-0.26。
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