CN101597634A - 15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，步骤是：(1)将雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)菌种接种于斜面培养基，制备出菌悬液；(2)一级种子培养；(3)二级发酵培养；(4)添加底物诱导；(5)进行左旋乙基甾烯双酮转化；(6)萃取制备成品。本发明采用的微生物转化方法具有很高的立体选择性、区域选择性和化学选择性，提高了底物转化率，在3‰投料量情况下，其转化率最高可达90％以上，简化了目标产物制备与纯化的过程，避免大量有机溶剂的使用，既符合环保要求，又降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法。
背景技术
孕二烯酮是迄今为止孕激素活性最强的甾体激素类药物，是新一代避孕药的主要成分之一，具有重要的医用价值。因其孕激素活性高、无副作用、吸收快、无残留、避孕效果可靠及良好的抑肿瘤作用，成为目前最为理想的口服避孕药的首选成分。
15α-羟基左旋乙基甾烯双酮是合成孕二烯酮的关键中间体，工业上主要采用化学方法合成15α-羟基左旋乙基甾烯双酮，该类方法步骤繁琐，成本较高，不适于药物的推广使用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用雷斯青霉催化甾体化合物左旋乙基甾烯双酮生成15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，该方法具有目标产物转化率高、纯化过程简单的优点。
本发明实现目的的技术方案是：
一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，步骤是：
(1)菌悬液的制备：将雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)菌种接种于斜面培养基，5天后，用无菌生理盐水制备出菌悬液；
(2)一级种子培养：将菌悬液接入种子培养基培养，接种量106-109个/mL，培养温度为25-30℃，转速80-120r/s，培养时间24-96h，得到种子培养液；
(3)二级发酵培养：将种子培养液以2-5％的接种量接入发酵罐继续培养，发酵控制条件为温度25-30℃，转速160-240r/min，通气量为2L/min，菌体培养时间为36-72h，得到发酵液；
(4)底物诱导：在已培养好的发酵液内加入0.1-0.3g/L的左旋乙基甾烯双酮诱导16-48h小时；
(5)左旋乙基甾烯双酮转化：加入底物进行微生物转化，采用将左旋乙基甾烯双酮底物用促溶剂溶解后加入发酵液的转化方式，转化条件为转速180-240r/min，转化温度为25-30℃，转化时间90-150h；
(6)萃取制备成品：料液经过滤，所得滤饼经萃取处理，即得15α羟基化左旋乙基甾烯双酮。
而且，所述促溶剂包括甲醇、乙醇、丙二醇、甘油、1，3-丁二醇、聚乙二醇、苯甲醇二甲亚砜、二甲基甲酰胺、丙酮、二甲基乙酰胺、乳酸乙酯、油酸乙酯，促溶剂浓度1-6％。
而且，所述步骤(5)中滤饼的萃取方法是将滤饼烘干后，以与原发酵液1∶10-1∶20的体积比采用萃取剂萃取。
而且，所述萃取剂是乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、正己烷。
本发明的优点和有益效果为：
1、本发明方法是在雷斯青霉的发酵液中，利用雷斯青霉菌体Penicilliumraistrickii(ATCC 10490)中所含的羟化酶，催化左旋乙基甾烯双酮的15α位发生羟基化反应，生成15α-羟基左旋乙基甾烯双酮，通过优化发酵条件及转化工艺，有效提高转化率。
2、本发明采用的微生物转化方法具有很高的立体选择性、区域选择性和化学选择性，提高了底物转化率，在3‰投料量情况下，其转化率最高可达90％以上，简化了目标产物制备与纯化的过程，避免大量有机溶剂的使用，既符合环保要求，又降低生产成本。
3、本发明15α羟基左旋乙基甾烯双酮制备过程中无需加入昂贵的金属催化剂，降低了生产成本；本方法各步骤反应条件温和，转化装置简单，适合工业化生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1：
一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，本实施例采用促溶剂1％二甲基甲酰胺的15α羟化反应，步骤是：
(1)菌悬液的制备：将雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)菌种接种于斜面培养基，5天后，用无菌生理盐水制备出菌悬液；
(2)一级种子培养：将菌悬液接入种子培养基培养，接种量106/mL，培养温度为28℃，转速120r/m，培养时间24h，得到适合接种的种子培养液；
(3)二级发酵培养：将生长良好的种子培养液以2-5％的接种量接入5L发酵罐继续培养，发酵控制条件为温度28℃，转速200r/m，通气量为2L/min，菌体培养时间为48h，得到发酵液；
(4)左旋乙基甾烯双酮转化：36h小时内，在已培养好的发酵液内加入0.2g/L的左旋乙基甾烯双酮诱导；
(5)加入底物进行微生物转化，转化方式是采用将左旋乙基甾烯双酮底物用促溶剂(1％的二甲基甲酰胺)溶解后加入发酵液的方式，转化条件为转速180r/min，转化温度为28℃，转化时间100h；
(6)萃取制备成品：料液经过滤，所得滤饼经萃取处理，萃取方法是将滤饼烘干后，以与原发酵液1∶10-1∶20的体积比采用萃取剂萃取，萃取剂选用乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮或正己烷，即得15α羟基化左旋乙基甾烯双酮。
分析测定转化率，转化率为80％。
实施例2：
一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，本实施例采用促溶剂2％甲醇助溶的15α羟化反应，步骤是：
(1)菌悬液的制备：将雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)菌种接种于斜面培养基，5天后，用无菌生理盐水制备出菌悬液；
(2)一级种子培养：将菌悬液接入种子培养基培养，接种量108/mL，培养温度为28℃，转速100r/m，培养时间36h，得到适合接种的种子培养液；
(3)二级发酵培养：将生长良好的种子培养液以2-5％的接种量接入5L发酵罐继续培养，发酵控制条件为温度28℃，转速220r/m，通气量为2L/min，菌体培养时间为72h，得到发酵液；
(4)左旋乙基甾烯双酮转化：24h小时内，在已培养好的发酵液内加入0.2g/L的左旋乙基甾烯双酮诱导；
(5)加入底物进行微生物转化，转化方式是采用将左旋乙基甾烯双酮底物用促溶剂(2％甲醇)溶解后加入发酵液的方式，转化条件为转速200r/min，转化温度为28℃，转化时间120h；
(6)萃取制备成品：料液经过滤，滤饼经萃取处理后，即得15α羟基化左旋乙基甾烯双酮分析测定转化率，萃取方法同实施例1。
分析测定转化率，转化率为85％。
实施例3：
一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，本实施例采用促溶剂3％丙二醇助溶的15α羟化反应，步骤是：
(1)菌悬液的制备：将雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)菌种接种于斜面培养基，5天后，用无菌生理盐水制备出菌悬液；
(2)一级种子培养：将菌悬液接入种子培养基培养，接种量109/mL，培养温度为28℃，转速110r/m，培养时间48h，得到适合接种的种子培养液；
(3)二级发酵培养：将生长良好的种子培养液以2-5％的接种量接入5L发酵罐继续培养，发酵控制条件为温度28℃，转速160r/m，通气量为2L/min，菌体培养时间为36h，得到发酵液；
(4)左旋乙基甾烯双酮转化：48h小时内，在已培养好的发酵液内加入0.2g/L的左旋乙基甾烯双酮诱导；
(5)加入底物进行微生物转化，转化方式是采用将左旋乙基甾烯双酮底物用促溶剂(3％丙二醇)溶解后加入发酵液的方式，转化条件为转速240r/min，转化温度为28℃，转化时间150h；
(6)萃取制备成品：料液经过滤，滤饼经萃取处理后，即得15α羟基化左旋乙基甾烯双酮分析测定转化率，萃取方法同实施例1。
分析测定转化率，转化率为91％。
Claims (4)
1、一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，其特征在于：制备方法的步骤是：
(1)菌悬液的制备：将雷斯青霉Penicillium raistrickii(ATCC 10490)菌种接种于斜面培养基，5天后，用无菌生理盐水制备出菌悬液；
(2)一级种子培养：将菌悬液接入种子培养基培养，接种量106-109个/mL，培养温度为25-30℃，转速80-120r/s，培养时间24-96h，得到种子培养液；
(3)二级发酵培养：将种子培养液以2-5％的接种量接入发酵罐继续培养，发酵控制条件为温度25-30℃，转速160-240r/min，通气量为2L/min，菌体培养时间为36-72h，得到发酵液；
(4)底物诱导：在已培养好的发酵液内加入0.1-0.3g/L的左旋乙基甾烯双酮诱导16-48h小时；
(5)左旋乙基甾烯双酮转化：加入底物进行微生物转化，采用将左旋乙基甾烯双酮底物用促溶剂溶解后加入发酵液的转化方式，转化条件为转速180-240r/min，转化温度为25-30℃，转化时间90-150h；
(6)萃取制备成品：料液经过滤，所得滤饼经萃取处理，即得15α羟基化左旋乙基甾烯双酮。
2、根据权利要求1所述的15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，其特征在于：所述促溶剂包括甲醇、乙醇、丙二醇、甘油、1，3-丁二醇、聚乙二醇、苯甲醇二甲亚砜、二甲基甲酰胺、丙酮、二甲基乙酰胺、乳酸乙酯、油酸乙酯，促溶剂浓度1-6％。
3、根据权利要求1所述的15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中滤饼的萃取方法是将滤饼烘干后，以与原发酵液1∶10-1∶20的体积比采用萃取剂萃取。
4、根据权利要求3所述的15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的生物制备方法，其特征在于：所述萃取剂是乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、正己烷。
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Cited By (5)
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|---|---|---|---|---|
| CN102286596A (zh) * | 2011-06-27 | 2011-12-21 | 天津科技大学 | 一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法 |
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| CN111454855A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-07-28 | 天津科技大学 | 一种重组毕赤酵母及其构建方法和在高效制备15α-左旋乙基甾烯二酮中的应用 |
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286596A (zh) * | 2011-06-27 | 2011-12-21 | 天津科技大学 | 一种15α羟基化左旋乙基甾烯双酮的制备方法 |
| CN103834712A (zh) * | 2012-11-26 | 2014-06-04 | 复旦大学 | 去氧孕烯中间体纳米脂质体生物转化的优化方法 |
| CN103834712B (zh) * | 2012-11-26 | 2016-03-30 | 复旦大学 | 去氧孕烯中间体纳米脂质体生物转化的优化方法 |
| CN104293856A (zh) * | 2014-10-30 | 2015-01-21 | 青岛科技大学 | 一种细胞催化生产氟吡啶乙酮的方法 |
| CN107746849A (zh) * | 2017-09-29 | 2018-03-02 | 天津科技大学 | 一种甾体羟化酶基因的高效筛选方法 |
| CN111454855A (zh) * | 2020-05-13 | 2020-07-28 | 天津科技大学 | 一种重组毕赤酵母及其构建方法和在高效制备15α-左旋乙基甾烯二酮中的应用 |
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