CN104293847A - 一种生产亚环己基二氧基庚烯醇的产朊酵母催化法 - Google Patents
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Abstract
一种生产亚环己基二氧基庚烯醇的产朊酵母催化法。以产朊酵母细胞为催化剂，直接催化制备光活性(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇，反应罐中加入磷酸盐缓冲液，加入白土调控底物、产物浓度，用产朊假丝酵母细胞进行生物催化反应，产品收率高，对映体过量率高，充分发挥了生物催化的优势。
Description
技术领域
本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到产朊假丝酵母细胞生物催化制备手性医药中间体(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇的技术。
背景技术
(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称合成具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的手性化合物。生物催化制备(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇具有很好的应用前景。
生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。
(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，由于有2个手性中心，使得化学合成较为困难，成本高。本发明将采用生物催化制备(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇。
发明内容
本发明采用产朊假丝酵母细胞催化制备(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇，反应式如下：
底物S-亚环己基甘油醛（1）和4-溴-1-丁烯（2）经产朊假丝酵母催化催化，得到产物(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇（3）。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用产朊假丝酵母作为催化剂，因为其催化反应1和2反应的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%）均很高。
许多产朊假丝酵母都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用产朊假丝酵母菌株为ATCC 20262 ，其催化反应效果最佳。
培养介质：
1、 种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH6; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
2、培养液成份：葡萄糖18-22 g/L，麦芽浸膏25-30 g，木糖8-10 g/L，(NH4)2SO4 4.8-5.3 g/L，KH2PO4 9-11 g/L，MgSO4.7H2O 0.3-0.4 g/L，CaCl2 0.35-0.4 g/L,硫酸铵0.2-0.25g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L,pH5.6。
2、固体培养基成份： 在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
酵母细胞制备。产朊假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，产朊假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至27-28℃，将产朊假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6-6.5％，通气比为1.4-1.6V/（V分钟），27-28℃培养18-20小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
由于底物、产物均对酵母细胞有抑制作用，为了减少底物、产物对细胞的抑制，本发明采用白土吸附底物，反应中，当底物被细胞催化反应，浓度降低时，底物从白土溶出，补充反应消耗的底物。同时，产物被白土吸附，减少了其在水中的浓度，从而大幅度降低了底物、产物对细胞的抑制。底物与白土的比率，决定了反应液中底物、产物的浓度，而且，浓度还与反应温度、反应液成份有关。不同细胞对底物、产物的敏感度不同，所以，要进行大量实验，才能确定最佳的底物与白土的比率。实验表明，对于本发明的菌株、反应液成份、反应温度，最佳的底物与白土的比率为0.36-0.38。具体吸附时，将底物S-亚环己基甘油醛和4-溴-1-丁烯混溶，R-亚环己基甘油醛与4-溴-1-丁烯摩尔比为1，用白土吸收此溶液，即得到吸附了底物的白土。调节底物与白土用量，使得底物与白土的质量比率为0.35-0.38。所用白土为普通白土，从市场上购买后，灭菌，无菌保存待用。
底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6-0.7，pH为6.2，加入吸附了底物S-亚环己基甘油醛与4-溴-1-丁烯的白土，使底物S-亚环己基甘油醛添加量为80-90 g/L，底物S-亚环己基甘油醛与底物4-溴-1-丁烯摩尔比为1，由此2种底物浓度均确定了。麦芽浸膏25-30 g，木糖14-16 g/L，支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙烯醚为13-18g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至30-31℃时，加入湿酵母细胞使浓度为25-28g/L，通气比为0.10-14V/（V分钟），即每分钟通气量为0.1-0.14倍反应液体积，进行生物催化反应，反应时间为82-90小时；反应结束后，分别滤出细胞、白土，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取白土，合并乙酸乙酯萃取液和萃取白土的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇，反应转化率94-96％，产品收率92-94％，对映体过量率（ee%）97-98％。
本发明所开展工作包括菌株选择（从近百个菌株中选择）、催化反应条件优化（反应温度、通气量、pH）、反应介质选择和浓度优化（底物浓度、麦芽浸膏含量、木糖含量、表面活性剂种类（20多种选1）及浓度、其它多种成份选择排除），采用固体吸附控制底物产物浓度，从而减少对细胞的抑制，试验了白土、硅藻土、棉纱布、苎麻纱布、大孔树酯等多种固体材料，还曾进行了水-有机溶剂2相体系试验。由于试验量很大，尽管采用了响应面优化设计试验，大幅度减少了试验量，试验量仍然很大，全部试验进行2年多才完成，达成目前的技术方案。对于光活性产物而言，当反应转化率94-96％，产品收率92-94％时，对映体过量率（ee%）仍然高达97-98％，是非常不易的，我们的工作取得了显著进步。
实施例1
种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH6; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为：葡萄糖18 g/L，麦芽浸膏25 g，木糖8 g/L，(NH4)2SO4 4.8 g/L，KH2PO4 9 g/L，MgSO4.7H2O 0.3 g/L，CaCl2 0.35 g/L,硫酸铵0.2g/L，硫酸镁0.3g/L,pH5.6。
湿酵母细胞制备过程如下：产朊假丝酵母ATCC 20262 经斜面、摇瓶培养，得到种子液。10L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6，121℃高压灭菌30分钟，冷却至27℃，将产朊假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6％，通气比为1.4V/（V分钟），27℃培养18小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的白土制作方法为，将底物S-亚环己基甘油醛和4-溴-1-丁烯混溶，R-亚环己基甘油醛与4-溴-1-丁烯摩尔比为1，用白土吸收此溶液，即得到吸附了底物的白土，调节底物与白土用量，使得底物与白土的质量比率为0.35。所用白土为普通白土，从市场上购买后，灭菌，无菌保存待用，其它实施例白土处理相同。
20L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6，pH为6.2，加入吸附了底物S-亚环己基甘油醛与4-溴-1-丁烯的白土，使底物S-亚环己基甘油醛添加量为80 g/L，底物S-亚环己基甘油醛与底物4-溴-1-丁烯摩尔比为1，麦芽浸膏25 g/L，木糖14 g/L，支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙烯醚为13g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至30℃时，加入湿酵母细胞使浓度为25g/L，通气比为0.1V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为82小时；反应结束后，分别滤出细胞、白土，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取白土，合并乙酸乙酯萃取液和萃取白土的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇，反应转化率94％，产品收率92％，对映体过量率（ee%）97％。
实施例2
种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH6; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为：葡萄糖22 g/L，麦芽浸膏30 g，木糖10 g/L，(NH4)2SO4 5.3 g/L，KH2PO4 11 g/L，MgSO4.7H2O 0.4 g/L，CaCl2 0.4 g/L,硫酸铵0.25g/L，硫酸镁0.4g/L,pH5.6。
湿酵母细胞制备过程如下：产朊假丝酵母ATCC 20262 经斜面、摇瓶培养，得到种子液。50L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至28℃，将产朊假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6.5％，通气比为1.6V/（V分钟），28℃培养20小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的白土制作方法为，将底物S-亚环己基甘油醛和4-溴-1-丁烯混溶，R-亚环己基甘油醛与4-溴-1-丁烯摩尔比为1，用白土吸收此溶液，即得到吸附了底物的白土，调节底物与白土用量，使得底物与白土的质量比率为0.38。
200L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.7，pH为6.2，加入吸附了底物S-亚环己基甘油醛与4-溴-1-丁烯的白土，使底物S-亚环己基甘油醛添加量为90 g/L，底物S-亚环己基甘油醛与底物4-溴-1-丁烯摩尔比为1，麦芽浸膏30 g，木糖16 g/L，支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙烯醚为18g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至31℃时，加入湿酵母细胞使浓度为28g/L，通气比为0.14V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为90小时；反应结束后，分别滤出细胞、白土，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取白土，合并乙酸乙酯萃取液和萃取白土的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇，反应转化率96％，产品收率94％，对映体过量率（ee%）97％。
实施例3
种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH6; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为：葡萄糖20 g/L，麦芽浸膏28 g，木糖9 g/L，(NH4)2SO4 5 g/L，KH2PO4 10 g/L，MgSO4.7H2O 0.35 g/L，CaCl2 0.38 g/L,硫酸铵0.22g/L，硫酸镁0.35g/L,pH5.6。
湿酵母细胞制备过程如下：产朊假丝酵母ATCC 20262 经斜面、摇瓶培养，得到种子液。300L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.65，121℃高压灭菌30分钟，冷却至27.5℃，将产朊假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6.2％，通气比为1.5V/（V分钟），27.5℃培养19小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的白土制作方法为，将底物S-亚环己基甘油醛和4-溴-1-丁烯混溶，R-亚环己基甘油醛与4-溴-1-丁烯摩尔比为1，用白土吸收此溶液，即得到吸附了底物的白土，调节底物与白土用量，使得底物与白土的质量比率为0.365。
1000L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.65，pH为6.2，加入吸附了底物S-亚环己基甘油醛与4-溴-1-丁烯的白土，使底物S-亚环己基甘油醛添加量为85 g/L，底物S-亚环己基甘油醛与底物4-溴-1-丁烯摩尔比为1，麦芽浸膏27 g，木糖15 g/L，支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙烯醚为15g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至30.5℃时，加入湿酵母细胞使浓度为26g/L，通气比为0.13V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为88小时；反应结束后，分别滤出细胞、白土，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取白土，合并乙酸乙酯萃取液和萃取白土的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇，反应转化率95％，产品收率93％，对映体过量率（ee%）97.5％。
实施例4
种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH6; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
培养液成份为：葡萄糖21 g/L，麦芽浸膏30 g，木糖9 g/L，(NH4)2SO4 4.9 g/L，KH2PO4 9.5 g/L，MgSO4.7H2O 0.33 g/L，CaCl2 0.36 g/L,硫酸铵0.23g/L，硫酸镁0.4g/L,pH5.6。
湿酵母细胞制备过程如下：产朊假丝酵母ATCC 20262 经斜面、摇瓶培养，得到种子液。1000L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.65，121℃高压灭菌30分钟，冷却至27.5℃，将产朊假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6.2％，通气比为1.55V/（V分钟），27℃培养20小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
吸附了底物的白土制作方法为，将底物S-亚环己基甘油醛和4-溴-1-丁烯混溶，R-亚环己基甘油醛与4-溴-1-丁烯摩尔比为1，用白土吸收此溶液，即得到吸附了底物的白土，调节底物与白土用量，使得底物与白土的质量比率为0.38。
5000L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6，pH为6.2，加入吸附了底物S-亚环己基甘油醛与4-溴-1-丁烯的白土，使底物S-亚环己基甘油醛添加量为90 g/L，底物S-亚环己基甘油醛与底物4-溴-1-丁烯摩尔比为1，麦芽浸膏30 g，木糖15 g/L，支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙烯醚为17g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至30.5℃时，加入湿酵母细胞使浓度为28g/L，通气比为0.14V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为89小时；反应结束后，分别滤出细胞、白土，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取白土，合并乙酸乙酯萃取液和萃取白土的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇，反应转化率96％，产品收率94％，对映体过量率（ee%）98％。
Claims (4)
1.一种产朊假丝酵母细胞生物催化制备(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇的方法，其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6-0.7，pH为6.2，加入吸附了底物S-亚环己基甘油醛与4-溴-1-丁烯的白土，使底物S-亚环己基甘油醛添加量为80-90 g/L，底物S-亚环己基甘油醛与底物4-溴-1-丁烯摩尔比为1，麦芽浸膏25-30 g，木糖14-16 g/L，支链化13碳格尔伯特醇聚氧乙烯醚为13-18g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至30-31℃时，加入湿酵母细胞使浓度为25-28g/L，通气比为0.10-14V/（V分钟），进行生物催化反应，反应时间为82-90小时；反应结束后，分别滤出细胞、白土，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取白土，合并乙酸乙酯萃取液和萃取白土的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(2S,3S)-1,2-（亚环己基二氧基）庚-6-烯-3-醇，反应转化率94-96％，产品收率92-94％，对映体过量率（ee%）97-98％。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于湿酵母细胞制备过程如下：产朊假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至27-28℃，将产朊假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为6-6.5％，通气比为1.4-1.6V/（V分钟），27-28℃培养18-20小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物催化反应催化剂。
3. 权利要求1所述的方法，其特征在于种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH6; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉；
培养液成份为：葡萄糖18-22 g/L，麦芽浸膏25-30 g/L，木糖8-10 g/L，(NH4)2SO4 4.8-5.3 g/L，KH2PO4 9-11 g/L，MgSO4.7H2O 0.3-0.4 g/L，CaCl2 0.35-0.4 g/L,硫酸铵0.2-0.25g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L,pH5.6。
4. 权利要求1所述的方法，其特征在于所述吸附了底物的白土制作方法为，将底物S-亚环己基甘油醛和4-溴-1-丁烯混溶，R-亚环己基甘油醛与4-溴-1-丁烯摩尔比为1，用白土吸收此溶液，即得到吸附了底物的白土，调节底物与白土用量，使得底物与白土的质量比率为0.35-0.38。
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