CN104313064A - 一种细胞法生产手性溴苯基丙酸甲酯的方法 - Google Patents
一种细胞法生产手性溴苯基丙酸甲酯的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104313064A CN104313064A CN201410518168.1A CN201410518168A CN104313064A CN 104313064 A CN104313064 A CN 104313064A CN 201410518168 A CN201410518168 A CN 201410518168A CN 104313064 A CN104313064 A CN 104313064A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- substrate
- ethyl acetate
- ramie
- ramie gauze
- gauze
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 229940017219 methyl propionate Drugs 0.000 title claims abstract description 16
- -1 bromophenyl methyl Chemical group 0.000 title abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 3
- 240000008564 Boehmeria nivea Species 0.000 claims abstract description 69
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 69
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 241000235056 Pichia norvegensis Species 0.000 claims abstract description 20
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 126
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 42
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 19
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 19
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 17
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 7
- 208000012839 conversion disease Diseases 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 claims description 7
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 6
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N alpha-D-xylose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 6
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 6
- 238000003810 ethyl acetate extraction Methods 0.000 claims description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 6
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 6
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 claims description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 6
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 4
- 238000010531 catalytic reduction reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 abstract 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 2
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 241000024287 Areas Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101710157860 Oxydoreductase Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011914 asymmetric synthesis Methods 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001728 carbonyl compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
Abstract
一种细胞法生产手性溴苯基丙酸甲酯的方法，即挪威假丝酵母细胞直接催化还原制备手性(-)-(2R,3S)-3-（4-溴苯基）-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯的方法，反应罐中加入磷酸盐缓冲液，加入苎麻纱布调控底物、产物浓度，用酵母细胞进行生物还原反应，产品收率高，对映体过量率高，具有很好应用价值。
Description
技术领域
本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到挪威假丝酵母细胞生物还原制备手性医药中间体(−)-(2R,3S)-3-（4-溴苯基）-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯的技术。
背景技术
羟基手性酯是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化羰基化合物的不对称还原具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备羟基手性酯的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的羟基手性酯。生物催化制备羟基手性酯具有很好的应用前景。
生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。
生物还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。
(−)-(2R,3S)-3-（4-溴苯基）-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，由于有2个手性中心，使得化学合成较为困难，成本高。本发明将采用生物催化制备(−)-(2R,3S)-3-（4-溴苯基）-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯。
发明内容
本发明采用挪威假丝酵母细胞催化制备(−)-(2R,3S)-3-（4-溴苯基）-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯，反应式如下：
底物2-（4-溴苯甲酰）-2-丙烯酸甲酯（1）经挪威假丝酵母催化还原，得到产物(−)-(2R,3S)-3-（4-溴苯基）-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯（2）。有多种微生物可以催化还原，经过大量实验筛选，最终确定采用挪威假丝酵母作为催化剂，因为其催化还原1的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%）均很高。
许多挪威假丝酵母都可以进行生物催化还原，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用挪威假丝酵母菌株为ATCC 96301 ，其催化还原效果最佳。
培养介质：
1、 种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH自然; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉；
2、培养液成份：葡萄糖25-30 g/L，甘油25-30 g/L，玉米胚芽粉30-40 g/L， KH2PO4 9-11 g/L，MgSO4.7H2O 0.3-0.4 g/L，pH值为6.0。
2、固体培养基成份： 在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
酵母细胞制备。挪威假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至30-31℃，将挪威假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为8-10％，通气比为0.9-1.2V/（V分钟），30-31℃培养30-36小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。
由于底物、产物均对酵母细胞有抑制作用，为了减少底物、产物对细胞的抑制，本发明采用苎麻纱布吸附底物，反应中，当底物被细胞催化还原，浓度降低时，底物从苎麻纱布溶出，补充反应消耗的底物。同时，产物被苎麻纱布吸附，减少了其在水中的浓度，从而大幅度降低了底物、产物对细胞的抑制。底物与苎麻纱布的比率，决定了反应液中底物、产物的浓度，而且，浓度还与反应温度、反应液成份有关。不同细胞对底物、产物的敏感度不同，所以，要进行大量实验，才能确定最佳的底物与苎麻纱布的比率。实验表明，对于本发明的菌株、反应液成份、反应温度，最佳的底物与苎麻纱布的比率为0.36-0.38。具体吸附时，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为0.5：2，得到底物的乙酸乙酯溶液，用尺寸为0.5cmX0.5cm的苎麻纱布吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的苎麻纱布。调节底物与苎麻纱布用量，使得底物与苎麻纱布的质量比率为0.36-0.38。所用苎麻纱布为普通苎麻纱布，从市场上购买后，切成0.5cmX0.5cm小块，灭菌，无菌保存待用。
底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6-0.7，pH为6.0，加入吸附底物的苎麻纱布，使底物2-（4-溴苯甲酰）-2-丙烯酸甲酯添加量为80-90
g/L，葡萄糖含量为 20-25g/L，木糖10-12 g/L，山梨坦单月桂酸酯含量为19-20g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至30-31℃时，加入湿酵母细胞使浓度为22-26g/L，通气比为0.12-0.15V/（V分钟），即每分钟通气量为0.16-0.2倍反应液体积，进行生物还原反应，反应时间为80-85小时；反应结束后，分别滤出细胞、苎麻纱布，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取苎麻纱布，合并乙酸乙酯萃取液和萃取苎麻纱布的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2R,3S)-3-（4-溴苯基）-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯，反应转化率94-96％，产品收率92-94％，对映体过量率（ee%）97-98％。
本发明所开展工作包括菌株选择（从近百个菌株中选择）、催化还原条件优化（反应温度、通气量、pH）、反应介质选择和浓度优化（底物浓度、葡萄糖含量、木糖含量、表面活性剂种类（20多种选1）及浓度、其它多种成份选择排除），采用固体吸附控制底物产物浓度，从而减少对细胞的抑制，试验了白土、硅藻土、棉纱布、苎麻纱布、大孔树酯等多种固体材料，还曾进行了水-有机溶剂2相体系试验。由于试验量很大，尽管采用了响应面优化设计试验，大幅度减少了试验量，试验量仍然很大，全部试验进行2年多才完成，达成目前的技术方案。对于光活性产物而言，当反应转化率94-96％，产品收率92-94％时，对映体过量率（ee%）仍然高达97-98％，是非常不易的，我们的工作取得了显著进步。
实施例1
种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH自然; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉；
培养液成份为：葡萄糖25 g/L，甘油25 g/L，玉米胚芽粉30g/L， KH2PO4 9 g/L，MgSO4.7H2O 0.3g/L，pH值为6.0。
湿酵母细胞制备过程如下：挪威假丝酵母ATCC 96301 经斜面、摇瓶培养，得到种子液。10L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6，121℃高压灭菌30分钟，冷却至30℃，将挪威假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为8％，通气比为0.5V/（V分钟），即每分钟通气量为0.5倍反应液体积，30-31℃培养30小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。
吸附底物的苎麻纱布制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为0.5：2，得到底物的乙酸乙酯溶液，用尺寸为0.5cmX0.5cm的苎麻纱布吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的苎麻纱布，调节底物与苎麻纱布用量，使得底物与苎麻纱布的质量比率为0.36。所用苎麻纱布为普通苎麻纱布，从市场上购买后，切成0.5cmX0.5cm小块，灭菌，无菌保存待用，其它实施例苎麻纱布处理相同。
20L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6，pH为6.0，加入吸附底物的苎麻纱布，使底物2-（4-溴苯甲酰）-2-丙烯酸甲酯添加量为80g/L，葡萄糖含量为 20g/L，木糖10 g/L，山梨坦单月桂酸酯含量为19g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至30℃时，加入湿酵母细胞使浓度为22g/L，通气比为0.12V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为80-85小时；反应结束后，分别滤出细胞、苎麻纱布，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取苎麻纱布，合并乙酸乙酯萃取液和萃取苎麻纱布的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2R,3S)-3-（4-溴苯基）-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯，反应转化率94％，产品收率92％，对映体过量率（ee%）97％。
实施例2
种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH自然; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉；
培养液成份为：葡萄糖30 g/L，甘油30 g/L，玉米胚芽粉40 g/L， KH2PO4 11 g/L，MgSO4.7H2O 0.4 g/L，pH值为6.0。
湿酵母细胞制备过程如下：挪威假丝酵母ATCC 96301 经斜面、摇瓶培养，得到种子液。50L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至31℃，将挪威假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为10％，通气比为0.8V/（V分钟），即每分钟通气量为0.8倍反应液体积， 31℃培养36小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。
吸附底物的苎麻纱布制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为0.5：2，得到底物的乙酸乙酯溶液，用尺寸为0.5cmX0.5cm的苎麻纱布吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的苎麻纱布，调节底物与苎麻纱布用量，使得底物与苎麻纱布的质量比率为0.38。
100L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.7，pH为6.0，加入吸附底物的苎麻纱布，使底物2-（4-溴苯甲酰）-2-丙烯酸甲酯添加量为90 g/L，葡萄糖含量为25g/L，木糖12 g/L，山梨坦单月桂酸酯含量为20g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至31℃时，加入湿酵母细胞使浓度为26g/L，通气比为0.15V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为85小时；反应结束后，分别滤出细胞、苎麻纱布，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取苎麻纱布，合并乙酸乙酯萃取液和萃取苎麻纱布的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2R,3S)-3-（4-溴苯基）-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯，反应转化率96％，产品收率94％，对映体过量率（ee%）97％。
实施例3
种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH自然; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉；
培养液成份为：葡萄糖28 g/L，甘油27 g/L，玉米胚芽粉35 g/L， KH2PO4 10 g/L，MgSO4.7H2O 0.35 g/L，pH值为6.0。
湿酵母细胞制备过程如下：挪威假丝酵母ATCC 96301 经斜面、摇瓶培养，得到种子液。10L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.65，121℃高压灭菌30分钟，冷却至30.5℃，将挪威假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为9％，通气比为0.65V/（V分钟），即每分钟通气量为0.65倍反应液体积，30.5℃培养33小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。
吸附底物的苎麻纱布制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为0.5：2，得到底物的乙酸乙酯溶液，用尺寸为0.5cmX0.5cm的苎麻纱布吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的苎麻纱布，调节底物与苎麻纱布用量，使得底物与苎麻纱布的质量比率为0.37。所用苎麻纱布为普通苎麻纱布，从市场上购买后，切成0.5cmX0.5cm小块，灭菌，无菌保存待用，其它实施例苎麻纱布处理相同。
15L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.65，pH为6.0，加入吸附底物的苎麻纱布，使底物2-（4-溴苯甲酰）-2-丙烯酸甲酯添加量为85 g/L，葡萄糖含量为 22g/L，木糖11 g/L，山梨坦单月桂酸酯含量为19.5g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至30-31℃时，加入湿酵母细胞使浓度为24g/L，通气比为0.135V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为83小时；反应结束后，分别滤出细胞、苎麻纱布，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取苎麻纱布，合并乙酸乙酯萃取液和萃取苎麻纱布的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2R,3S)-3-（4-溴苯基）-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯，反应转化率95％，产品收率93％，对映体过量率（ee%）97.5％。
实施例 4
种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH自然; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉；
培养液成份为：葡萄糖27 g/L，甘油27 g/L，玉米胚芽粉36g/L， KH2PO4 9.5 g/L，MgSO4.7H2O 0.3.7 g/L，pH值为6.0。
湿酵母细胞制备过程如下：挪威假丝酵母ATCC 96301 经斜面、摇瓶培养，得到种子液。1000L发酵罐加入培养液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至31℃，将挪威假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为10％，通气比为0.8V/（V分钟），即每分钟通气量为-0.8倍反应液体积， 31℃培养36小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。
吸附底物的苎麻纱布制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为0.5：2，得到底物的乙酸乙酯溶液，用尺寸为0.5cmX0.5cm的苎麻纱布吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的苎麻纱布，调节底物与苎麻纱布用量，使得底物与苎麻纱布的质量比率为0.38。
5000L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.7，pH为6.0，加入吸附底物的苎麻纱布，使底物2-（4-溴苯甲酰）-2-丙烯酸甲酯添加量为90 g/L，葡萄糖含量为25g/L，木糖12 g/L，山梨坦单月桂酸酯含量为20g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至31℃时，加入湿酵母细胞使浓度为26g/L，通气比为0.15V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为85小时；反应结束后，分别滤出细胞、苎麻纱布，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取苎麻纱布，合并乙酸乙酯萃取液和萃取苎麻纱布的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2R,3S)-3-（4-溴苯基）-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯，反应转化率96％，产品收率94％，对映体过量率（ee%）98％。
Claims (4)
1.一种挪威假丝酵母细胞生物还原制备(−)-(2R,3S)-3-（4-溴苯基）-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯的方法，其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6-0.7，pH为6.0，加入吸附底物的苎麻纱布，使底物2-（4-溴苯甲酰）-2-丙烯酸甲酯添加量为80-90 g/L，葡萄糖含量为 20-25g/L，木糖10-12 g/L，山梨坦单月桂酸酯含量为19-20g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至30-31℃时，加入湿酵母细胞使浓度为22-26g/L，通气比为0.12-0.15V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为80-85小时；反应结束后，分别滤出细胞、苎麻纱布，用乙酸乙酯萃取反应液、萃取苎麻纱布，合并乙酸乙酯萃取液和萃取苎麻纱布的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2R,3S)-3-（4-溴苯基）-3-羟基-2-甲基丙酸甲酯，反应转化率94-96％，产品收率92-94％，对映体过量率（ee%）97-98％。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于湿酵母细胞制备过程如下：挪威假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至30-31℃，将挪威假丝酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为8-10％，通气比为0.5-0.8V/（V分钟），30-31℃培养30-36小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH自然; 配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉；
培养液成份为：葡萄糖25-30
g/L，甘油25-30 g/L，玉米胚芽粉30-40 g/L， KH2PO4 9-11
g/L，MgSO4.7H2O
0.3-0.4 g/L，pH值为6.0。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于所述吸附底物的苎麻纱布制作方法为，将底物溶于乙酸乙酯，底物与乙酸乙酯的比率为0.5：2，得到底物的乙酸乙酯溶液，用尺寸为0.5cmX0.5cm的苎麻纱布吸收此溶液，然后，烘干、回收乙酸乙酯，即得到吸附底物的苎麻纱布，调节底物与苎麻纱布用量，使得底物与苎麻纱布的质量比率为0.36-0.38。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410518168.1A CN104313064A (zh) | 2014-10-01 | 2014-10-01 | 一种细胞法生产手性溴苯基丙酸甲酯的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410518168.1A CN104313064A (zh) | 2014-10-01 | 2014-10-01 | 一种细胞法生产手性溴苯基丙酸甲酯的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104313064A true CN104313064A (zh) | 2015-01-28 |
Family
ID=52368374
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410518168.1A Pending CN104313064A (zh) | 2014-10-01 | 2014-10-01 | 一种细胞法生产手性溴苯基丙酸甲酯的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104313064A (zh) |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1160421A (zh) * | 1994-10-12 | 1997-09-24 | 纳幕尔杜邦公司 | 制备手性α叔羧酸酯的酶促方法 |
| CN1266904A (zh) * | 1999-02-25 | 2000-09-20 | Basf公司 | 立体异构羧酸酯的制备方法 |
| CN1375013A (zh) * | 1999-08-05 | 2002-10-16 | 诺沃挪第克公司 | 取代的3－苯基丙酸酯和取代的3－苯基丙酸的制备方法 |
| WO2004033432A1 (ja) * | 2002-10-09 | 2004-04-22 | Ssp Co., Ltd. | 抗真菌活性を有する新規ピラゾール化合物 |
| WO2006021885A1 (en) * | 2004-08-26 | 2006-03-02 | Pfizer Inc. | Enantioselective biotransformation for preparation of protein tyrosine kinase inhibitor intermediates |
| CN1946855A (zh) * | 2004-04-29 | 2007-04-11 | 安资科技株式会社 | 从外消旋酯中制备光学活性的酯衍生物及其酸的方法 |
| CN1993476A (zh) * | 2004-08-11 | 2007-07-04 | 陶氏环球技术公司 | 用于制备(s)－5－氯－2－异丙基戊－4－烯酸酯的方法 |
| CN101260415A (zh) * | 2008-04-21 | 2008-09-10 | 中科院嘉兴中心应用化学分中心 | 生物催化法制备4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的两种高光学活性对映体 |
| CN101314784A (zh) * | 2007-06-01 | 2008-12-03 | 重庆博腾科技有限公司 | 一种生物催化制备(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法 |
| CN102586349A (zh) * | 2012-02-24 | 2012-07-18 | 重庆邮电大学 | 一种微生物还原和化学催化氢化组合制备（r）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯方法 |
| CN102925500A (zh) * | 2012-11-05 | 2013-02-13 | 遵义医学院 | 一种手性4-羟基-4苯基丁酸酯的制备方法 |
-
2014
- 2014-10-01 CN CN201410518168.1A patent/CN104313064A/zh active Pending
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1160421A (zh) * | 1994-10-12 | 1997-09-24 | 纳幕尔杜邦公司 | 制备手性α叔羧酸酯的酶促方法 |
| CN1266904A (zh) * | 1999-02-25 | 2000-09-20 | Basf公司 | 立体异构羧酸酯的制备方法 |
| CN1375013A (zh) * | 1999-08-05 | 2002-10-16 | 诺沃挪第克公司 | 取代的3－苯基丙酸酯和取代的3－苯基丙酸的制备方法 |
| WO2004033432A1 (ja) * | 2002-10-09 | 2004-04-22 | Ssp Co., Ltd. | 抗真菌活性を有する新規ピラゾール化合物 |
| CN1946855A (zh) * | 2004-04-29 | 2007-04-11 | 安资科技株式会社 | 从外消旋酯中制备光学活性的酯衍生物及其酸的方法 |
| CN1993476A (zh) * | 2004-08-11 | 2007-07-04 | 陶氏环球技术公司 | 用于制备(s)－5－氯－2－异丙基戊－4－烯酸酯的方法 |
| WO2006021885A1 (en) * | 2004-08-26 | 2006-03-02 | Pfizer Inc. | Enantioselective biotransformation for preparation of protein tyrosine kinase inhibitor intermediates |
| CN101314784A (zh) * | 2007-06-01 | 2008-12-03 | 重庆博腾科技有限公司 | 一种生物催化制备(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法 |
| CN101260415A (zh) * | 2008-04-21 | 2008-09-10 | 中科院嘉兴中心应用化学分中心 | 生物催化法制备4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的两种高光学活性对映体 |
| CN102586349A (zh) * | 2012-02-24 | 2012-07-18 | 重庆邮电大学 | 一种微生物还原和化学催化氢化组合制备（r）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯方法 |
| CN102925500A (zh) * | 2012-11-05 | 2013-02-13 | 遵义医学院 | 一种手性4-羟基-4苯基丁酸酯的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MICHEL R.B.等: "Regio- and enantioselective bioreduction of methyleneketoesters using both polymeric resin and cellulose matrix", 《JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B: ENZYMATIC》 * |
| 林建平等: "木兰假丝酵母不对称还原制备（S）-CHBE", 《浙江大学学报（工学版）》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104313064A (zh) | 一种细胞法生产手性溴苯基丙酸甲酯的方法 | |
| CN104212843B (zh) | 一种酿酒酵母还原生产溴苯基丙酸甲酯的方法 | |
| CN104328147A (zh) | 一种含氯(2r,3s)甲基丙酸甲酯的生产方法 | |
| CN104293851A (zh) | 一种链格孢菌生产羟乙基吡啶的方法 | |
| CN104328153A (zh) | 一种细胞法生产手性烯醇的方法 | |
| CN104313074A (zh) | 一种青霉催化生产吡啶基乙醇方法 | |
| CN104263769A (zh) | 一种生物法生产氯苯基丙酸甲酯的方法 | |
| CN104342464A (zh) | 一种黄蓝状菌催化生产手性苯基甲醇方法 | |
| CN104278061A (zh) | 一种生产氟苯基甲基丙酸甲酯的产朊酵母还原法 | |
| CN104263767A (zh) | 一种产朊酵母还原生产碘苯基丙酸甲酯的方法 | |
| CN104263773A (zh) | 一种生物法生产二氧基庚烯醇的方法 | |
| CN104263768A (zh) | 一种假丝酵母生产(2r,3s)含氟丙酸甲酯的方法 | |
| CN104263774A (zh) | 一种酿酒酵母催化生产手性亚环己基烯醇的方法 | |
| CN104313066A (zh) | 一种生产(2r,3s)含碘甲基丙酸甲酯的生物还原法 | |
| CN104263776A (zh) | 一种生物催化生产手性吡啶乙醇的方法 | |
| CN104313072A (zh) | 一种假丝酵母生产(1r,3s) 二氧基庚烯醇的方法 | |
| CN104313073A (zh) | 一种 (2r,3r) 庚烯醇的生产方法 | |
| CN104293847A (zh) | 一种生产亚环己基二氧基庚烯醇的产朊酵母催化法 | |
| CN104293848A (zh) | 一种生产(1s,3r) 亚环己基二氧基庚烯醇的方法 | |
| CN104313078A (zh) | 一种生物催化生产手性噻唑乙醇的方法 | |
| CN104263775A (zh) | 一种黑霉菌催化生产4-吡啶乙醇的方法 | |
| CN104313076A (zh) | 一种生物催化生产甲基吡啶乙醇的方法 | |
| CN104313075A (zh) | 一种光活性溴吡啶乙醇的细胞生产方法 | |
| CN104357504A (zh) | 一种细胞催化生产手性甲氧基吡啶乙醇 | |
| CN104328152A (zh) | 一种产朊酵母催化生产亚环己基烯醇的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150128 |