CN102925500A - 一种手性4-羟基-4苯基丁酸酯的制备方法 - Google Patents

一种手性4-羟基-4苯基丁酸酯的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：将木兰假丝酵母（CandidamagnoliaeCGMCC2.1919）或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeCGMCC2.399）在121℃灭菌20min的PYG培养基平板上划线，于25-30℃静置培养1天后挑取单菌落，作为种子进行斜面静置培养，生长2天后于4℃保存备用；常规细胞培养：常规生物转化。本发明获得的产品光学纯度高、成本低且安全环保。

Description

一种手性4-羟基-4苯基丁酸酯的制备方法
技术领域
本发明涉及生化技术领域，具体来说涉及一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法。
 
背景技术
γ-羟基酸酯是一类重要的化工医药中间体以及很多重要生物活性化合物的重要结构单元，其手性单一对映异构体(R)和(S)-γ-羟基酸酯均是重要的手性砌块，4-羟基-4-苯基丁酸酯及其衍生物是合成手性内酯或者其他一些化工医药类化合物的重要结构单元。
目前所知的制备手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的方法，通常采用的是化学催化剂和酶催化酮酸酯的不对称还原法。化学方法主要采用金属催化剂，金属催化剂价昂贵，对环境污染大。
 
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供一种能获得光学纯度高、成本低且安全环保的手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法。
本发明的一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：
 （1）菌株的准备：将菌株在121 ℃灭菌20 min的PYG培养基平板上划线，于25-30 ℃静置培养1天后挑取单菌落，作为种子进行斜面静置培养，生长2天后于4 ℃保存备用；
（2）细胞的培养：挑取上述斜面培养的种子，接种到含有10 mL PYG培养基的50 mL的摇瓶中，在30 ℃和200 rpm的转速下进行培养24h后，按5%的接种量接种于含有100 mL PYG培养基的500 mL的大摇瓶中，在摇床上培养24h后取出，在4 ℃和8000 rpm的条件下离心去除上清液，所得细胞在4 ℃下用生理盐水洗涤二次，离心，获得菌株的湿细胞备用；
（3）生物转化：将所培养的菌株的湿细胞，以细胞湿重10 g /L的浓度悬浮于100 mL、 pH为6-8的缓冲液中，将底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反应体系之中，再加入有机溶剂5 mL，葡萄糖250 mg，放入摇床反应（30 ℃，300 rpm），HPLC跟踪反应，反应48小时，反应结束后，反应液离心处理取上清液，加入氯化钠饱和，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，获得手性4-羟基-4-苯基丁酸酯。
上述的一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，其中：菌种为木兰假丝酵母（Candida magnoliae CGMCC 2.1919）或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.399），既可以采用休止细胞，生长中的细胞，也可以是固定化的细胞，或者使用其所含的还原酶。
上述的一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，其中：PYG培养基的配方为蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 琼脂15.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0。
上述的一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，其中：缓冲液为K2HPO4-KH2PO4或NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液。
上述的一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，其中：有机溶剂为甲醇、乙醇、正己烷、四氢呋喃、N, N-二甲基甲酰胺、甲苯或甲基叔丁基醚等。
本发明与现有技术相比，具有以下明显的优点和有益的效果，从以上技术方案可知：在生物催化反应中，有机溶剂的影响，涉及到溶剂对酶的抑制作用，对活性中心的修饰作用以及底物的溶解性、分散度等等诸多因素。水相反应中加入少量的有机溶剂有时也会对反应有明显的影响，经实验证实加入了所选的有机溶剂，反应的转化率有所提高, 而对映选择性则基本上没有什么改变。实验证明，Candida magnoliae CGMCC 2.1919和Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.399两株酵母细胞内含有高立体选择性的还原酶，能有效的催化4-氧代-4-苯基丁酸乙酯的不对称还原反应，合成手性4-羟基-4-苯基丁酸酯。由于4-氧代-4-苯基丁酸酯易于合成且价格便宜，以其作为底物进行不对称氧化反应获取手性4-羟基-4-苯基丁酸酯是非常经济有效的制备途径。
本发明的具体实施方式来进一步说明本发明的有益效果。
 
具体实施方式
实施例1
一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：
（1）菌株的准备：将木兰假丝酵母（Candida magnoliae CGMCC 2.1919）（购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心）在121 ℃灭菌20 min的PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 琼脂15.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0）平板上划线，于25 ℃静置培养1天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养，约2天后保存于4 ℃冰箱中备用；
（2）细胞的培养：挑取上述斜面培养的种子，接种到10 mL PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0）的50 mL的摇瓶中，在30 ℃和200 rpm的转速下进行培养24h后，按5%的接种量接种于含有100 mL生长培养基的500 mL的大摇瓶中，在摇床上培养24 h后取出，在4 ℃和8000 rpm的条件下离心去除上清液，所得细胞在4 ℃下用生理盐水洗涤二次，离心，得木兰假丝酵母湿细胞（细胞内含有R-选择性的羰基还原酶）备用；
（3） 生物转化：取木兰假丝酵母湿细胞5 g，悬浮于50 mL pH 7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，将底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反应体系之中，加入乙醇5 mL，葡萄糖250 mg，放入摇床反应（30 ℃，300 rpm），HPLC跟踪反应，反应48小时，反应结束后，反应液离心处理取上清液，加入氯化钠饱和，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，得到(R)-4-羟基-4-苯基丁酸乙酯。42% 产率，产物做手性GC分析，99% ee。
产物分析：4-羟基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR 和13C NMR如下：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ7.22 (d, 2H, Ph), 7.16 (d, 2H, Ph), 4.68 (pt.1H, CHOH), 2.40 (q 2H, CH2), 2.34 (s, 3H, CH3), 2.23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), 1.25 (q, 3H, CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ173, 145, 128, 126, 74, 61, 34, 30, 14.
实施例2
一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：
   （1）菌株的准备：将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.399）（购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心）在121 ℃灭菌20 min的PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 琼脂15.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0）平板上划线，于30 ℃静置培养1天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养，约2天后保存于4 ℃冰箱中备用；
（2）细胞的培养：挑取上述斜面培养的种子，接种到10 mL PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0）的50 mL的摇瓶中，在30 ℃和200 rpm的转速下进行培养24 h后，按5%的接种量接种于含有100 mL生长培养基的500 mL的大摇瓶中，在摇床上培养24 h后取出，在4 ℃和8000 rpm的条件下离心去除上清液，所得细胞在4 ℃下用生理盐水洗涤二次，离心，得酿酒酵母湿细胞（细胞内含有S-选择性的羰基还原酶）备用；
（3）生物转化：取酿酒酵母湿菌体5 g，悬浮于50 mL pH 7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，将底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反应体系之中，再加入乙醇5 mL，葡萄糖250 mg，放入摇床反应（30 ℃，300 rpm），HPLC跟踪反应，反应48小时，反应结束后，反应液离心处理取上清液，加入氯化钠饱和，用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥，过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，得到(S)-4-羟基-4苯基丁酸乙酯。38% 产率。产物用手性GC分析, 99% ee。
产物分析：4-羟基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR 和13C NMR如下：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ7.22 (d, 2H, Ph), 7.16 (d, 2H, Ph), 4.68 (pt.1H, CHOH), 2.40 (q 2H, CH2), 2.34 (s, 3H, CH3), 2.23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), 1.25 (q, 3H, CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ173, 145, 128, 126, 74, 61, 34, 30, 14.
实施例3
一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：
   （1）菌株的准备：将木兰假丝酵母（Candida magnoliae CGMCC 2.1919）（购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心）在121℃灭菌20 min的PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 琼脂15.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0）平板上划线，于25-30 ℃静置培养1天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养，约2天后保存于4 ℃冰箱中备用；
（2）细胞的培养：挑取上述斜面培养的种子，接种到10 mL PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0）的50 mL的摇瓶中，在30 ℃和200 rpm的转速下进行培养24 h后，按5%的接种量接种于含有100 mL生长培养基的500 mL的大摇瓶中，在摇床上培养24 h后取出，在4 ℃和8000 rpm的条件下离心去除上清液，所得细胞在4 ℃下用生理盐水洗涤二次，离心，得木兰假丝酵母湿细胞（细胞内含有R-选择性的羰基还原酶）备用；
（3）生物转化：取酿酒酵母湿菌体5 g，悬浮于50 mL pH 6.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液中，将底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反应体系之中，再加入甲醇5 mL，葡萄糖250 mg，放入摇床反应（30 ℃，300 rpm），HPLC跟踪反应，反应48小时，反应结束后，反应液离心处理取上清液，加入氯化钠饱和，用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥，过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离。得到(R)-4-羟基-4苯基丁酸乙酯，21% 产率。产物用手性GC分析, 99% ee。
产物分析：4-羟基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR 和13C NMR如下：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ7.22 (d, 2H, Ph), 7.16 (d, 2H, Ph), 4.68 (pt.1H, CHOH), 2.40 (q 2H, CH2), 2.34 (s, 3H, CH3), 2.23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), 1.25 (q, 3H, CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ173, 145, 128, 126, 74, 61, 34, 30, 14.
实施例4：
一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：
（1）菌株的准备：将木兰假丝酵母（Candida magnoliae CGMCC 2.1919）（购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心）在121℃灭菌20 min的PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 琼脂15.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0）平板上划线，于25-30℃静置培养1天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养，约2天后保存于4 ℃冰箱中备用；
（2）细胞的培养：挑取上述斜面培养的种子，接种到10 mL PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 蒸馏水1.0 L, pH 6.8-7.0）的50 mL的摇瓶中，在30℃和200 rpm的转速下进行培养24h后，按5%的接种量接种于含有100 mL生长培养基的500 mL的大摇瓶中，在摇床上培养24 h后取出，在4 ℃和8000 rpm的条件下离心去除上清液，所得细胞在4 ℃下用生理盐水洗涤二次，离心，得木兰假丝酵母湿细胞（细胞内含有R-选择性的羰基还原酶）备用；
（3） 生物转化：取木兰假丝酵母湿细胞5 g，悬浮于50 mL pH 7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，将底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反应体系之中，加入正己烷5mL，葡萄糖250 mg，放入摇床反应（30 ℃，300 rpm），HPLC跟踪反应，反应48小时，反应结束后，反应液离心处理取上清液，加入氯化钠饱和，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，得到(R)-4-羟基-4-苯基丁酸乙酯。19% 产率，产物做手性GC分析，99% ee。
产物分析：4-羟基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR 和13C NMR如下：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ7.22 (d, 2H, Ph), 7.16 (d, 2H, Ph), 4.68 (pt.1H, CHOH), 2.40 (q 2H, CH2), 2.34 (s, 3H, CH3), 2.23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), 1.25 (q, 3H, CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ173, 145, 128, 126, 74, 61, 34, 30, 14.
实施例5：
一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：
   （1）菌株的准备：将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.399）（购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心）在121℃灭菌20 min的PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 琼脂15.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0）平板上划线，于25-30 ℃静置培养1天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养，约2天后保存于4 ℃冰箱中备用；
（2）细胞的培养：挑取上述斜面培养的种子，接种到10 mL PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 蒸馏水1.0 L, pH 6.8-7.0）的50 mL的摇瓶中，在30 ℃和200 rpm的转速下进行培养24 h后，按5%的接种量接种于含有100 mL生长培养基的500 mL的大摇瓶中，在摇床上培养24 h后取出，在4 ℃和8000 rpm的条件下离心去除上清液，所得细胞在4 ℃下用生理盐水洗涤二次，离心，得酿酒酵母湿细胞（细胞内含有S-选择性的羰基还原酶）备用；
（3）生物转化：取酿酒酵母湿菌体5 g，悬浮于50 mL pH 6.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液中，将底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反应体系之中，再加入四氢呋喃5 mL，葡萄糖250 mg，放入摇床反应（30 ℃，300 rpm），HPLC跟踪反应，反应48小时，反应结束后，反应液离心处理取上清液，加入氯化钠饱和，用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥，过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，得到(S)-4-羟基-4-苯基丁酸乙酯。33% 产率。产物用手性GC分析, 99% ee。
产物分析：4-羟基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR 和13C NMR如下：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ7.22 (d, 2H, Ph), 7.16 (d, 2H, Ph), 4.68 (pt.1H, CHOH), 2.40 (q 2H, CH2), 2.34 (s, 3H, CH3), 2.23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), 1.25 (q, 3H, CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ173, 145, 128, 126, 74, 61, 34, 30, 14.
实施例6：
一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：
（1）菌株的准备：将木兰假丝酵母（Candida magnoliae CGMCC 2.1919）（购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心）在121 ℃灭菌20 min的PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 琼脂15.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0）平板上划线，于25-30 ℃静置培养1天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养，约2天后保存于4 ℃冰箱中备用；
（2）细胞的培养：挑取上述斜面培养的种子，接种到10 mL PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0）的50 mL的摇瓶中，在30 ℃和200 rpm的转速下进行培养24h后，按5%的接种量接种于含有100 mL生长培养基的500 mL的大摇瓶中，在摇床上培养24 h后取出，在4 ℃和8000 rpm的条件下离心去除上清液，所得细胞在4 ℃下用生理盐水洗涤二次，离心，得木兰假丝酵母湿细胞（细胞内含有R-选择性的羰基还原酶）备用；
（3）生物转化：取木兰假丝酵母湿细胞5 g，悬浮于50 mL pH 7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，将底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反应体系之中，加入N, N-二甲基甲酰胺5mL，葡萄糖250 mg，放入摇床反应（30 ℃，300 rpm），HPLC跟踪反应，反应48小时，反应结束后，反应液离心处理取上清液，加入氯化钠饱和，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，得到(R)-4-羟基-4苯基丁酸乙酯。26% 产率，产物做手性GC分析，99% ee。
产物分析：4-羟基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR 和13C NMR如下：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ7.22 (d, 2H, Ph), 7.16 (d, 2H, Ph), 4.68 (pt.1H, CHOH), 2.40 (q 2H, CH2), 2.34 (s, 3H, CH3), 2.23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), 1.25 (q, 3H, CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ173, 145, 128, 126, 74, 61, 34, 30, 14。
 
实施例7：
一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：
   （1）菌株的准备：将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.399）（购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心）在121 ℃灭菌20 min的PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 琼脂15.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0）平板上划线，于25-30 ℃静置培养1天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养，约2天后保存于4 ℃冰箱中备用；
（2）细胞的培养：挑取上述斜面培养的种子，接种到10 mL PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0）的50 mL的摇瓶中，在30 ℃和200 rpm的转速下进行培养24 h后，按5%的接种量接种于含有100 mL生长培养基的500 mL的大摇瓶中，在摇床上培养24 h后取出，在4 ℃和8000 rpm的条件下离心去除上清液，所得细胞在4 ℃下用生理盐水洗涤二次，离心，得酿酒酵母湿细胞（细胞内含有S-选择性的羰基还原酶）备用；
（3）生物转化：取酿酒酵母湿菌体5 g，悬浮于50 mL pH 8.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液中，将底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反应体系之中，再加入甲苯5 mL，葡萄糖250 mg，放入摇床反应（30 ℃，300 rpm），HPLC跟踪反应，反应48小时，反应结束后，反应液离心处理取上清液，加入氯化钠饱和，用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥，过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，得到(S)-4-羟基-4苯基丁酸乙酯。22% 产率。产物用手性GC分析, 99% ee。
产物分析：4-羟基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR 和13C NMR如下：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ7.22 (d, 2H, Ph), 7.16 (d, 2H, Ph), 4.68 (pt.1H, CHOH), 2.40 (q 2H, CH2), 2.34 (s, 3H, CH3), 2.23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), 1.25 (q, 3H, CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ173, 145, 128, 126, 74, 61, 34, 30, 14.
实施例8：
一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：
（1）菌株的准备：将木兰假丝酵母（Candida magnoliae CGMCC 2.1919）（购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心）在121 ℃灭菌20 min的PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 琼脂15.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0）平板上划线，于25-30℃静置培养1天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养，约2天后保存于4 ℃冰箱中备用；
（2）细胞的培养：挑取上述斜面培养的种子，接种到10 mL PYG培养基（蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0）的50 mL的摇瓶中，在30 ℃和200 rpm的转速下进行培养24h后，按5%的接种量接种于含有100 mL生长培养基的500 mL的大摇瓶中，在摇床上培养24 h后取出，在4 ℃和8000 rpm的条件下离心去除上清液，所得细胞在4 ℃下用生理盐水洗涤二次，离心，得木兰假丝酵母湿细胞（细胞内含有R-选择性的羰基还原酶）备用；
（3） 生物转化：取木兰假丝酵母湿细胞5 g，悬浮于50 mL pH 7.0的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，将底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反应体系之中，加入甲基叔丁基醚5 mL，葡萄糖250 mg，放入摇床反应（30 ℃，300 rpm），HPLC跟踪反应，反应48小时，反应结束后，反应液离心处理取上清液，加入氯化钠饱和，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离。得到(R)-4-羟基-4-苯基丁酸乙酯，19% 产率，产物做手性GC分析，99% ee。
产物分析：4-羟基-4-苯基丁酸乙酯的1H NMR 和13C NMR如下：1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ7.22 (d, 2H, Ph), 7.16 (d, 2H, Ph), 4.68 (pt.1H, CHOH), 2.40 (q 2H, CH2), 2.34 (s, 3H, CH3), 2.23 (s, 1H, OH), 2.06 (pq, 2H, CH2), 1.25 (q, 3H, CH3). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ173, 145, 128, 126, 74, 61, 34, 30, 14.
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1. 一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，包括以下步骤：
 （1）菌株的准备：将菌株在121 ℃灭菌20 min的PYG培养基平板上划线，于25-30 ℃静置培养1天后挑取单菌落，作为种子进行斜面静置培养，生长2天后于4 ℃保存备用；
（2）细胞的培养：挑取上述斜面培养的种子，接种到含有10 mL PYG培养基的50 mL的摇瓶中，在30 ℃和200 rpm的转速下进行培养24h后，按5%的接种量接种于含有100 mL PYG培养基的500 mL的大摇瓶中，在摇床上培养24h后取出，在4 ℃和8000 rpm的条件下离心去除上清液，所得细胞在4 ℃下用生理盐水洗涤二次，离心，获得菌株的湿细胞备用；
（3）生物转化：将所培养的菌株的湿细胞，以细胞湿重10 g /L的浓度悬浮于100 mL、 pH为6-8的缓冲液中，将底物4-氧代-4-苯基丁酸乙酯50 mg加入到反应体系之中，再加入有机溶剂5 mL，葡萄糖250 mg，放入摇床反应（30 ℃，300 rpm），HPLC跟踪反应，反应48小时，反应结束后，反应液离心处理取上清液，加入氯化钠饱和，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，加压蒸去溶剂，柱层析分离，获得手性4-羟基-4-苯基丁酸酯。
2.如权利要求1所述的一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，其中：菌种为木兰假丝酵母（Candida magnoliae CGMCC 2.1919）或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.399），既可以采用休止细胞，生长中的细胞，也可以是固定化的细胞，或者使用其所含的还原酶。
3.如权利要求1或2所述的一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，其中：PYG培养基的配方为蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, 葡萄糖1.0 g, 琼脂15.0 g, 蒸馏水1.0 L，pH 6.8-7.0。
4.如权利要求3所述的一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，其中：缓冲液为K2HPO4-KH2PO4或NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液。
5.如权利要求4所述的一种手性4-羟基-4-苯基丁酸酯的制备方法，其中：有机溶剂为甲醇、乙醇、正己烷、四氢呋喃、N, N-二甲基甲酰胺、甲苯、苯或甲基叔丁基醚。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104313064A (zh) * 2014-10-01 2015-01-28 青岛科技大学 一种细胞法生产手性溴苯基丙酸甲酯的方法
CN111454998A (zh) * 2020-04-21 2020-07-28 黄山科宏生物香料股份有限公司 一种手性羟基酸酯的生物制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101314784A (zh) * 2007-06-01 2008-12-03 重庆博腾科技有限公司 一种生物催化制备(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法
CN102618513A (zh) * 2012-05-04 2012-08-01 华东理工大学 一种羰基还原酶、基因和突变体及在不对称还原羰基化合物中的应用
CN102618590A (zh) * 2012-05-07 2012-08-01 江南大学 一种利用重组羰基还原酶催化制备(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101314784A (zh) * 2007-06-01 2008-12-03 重庆博腾科技有限公司 一种生物催化制备(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法
CN102618513A (zh) * 2012-05-04 2012-08-01 华东理工大学 一种羰基还原酶、基因和突变体及在不对称还原羰基化合物中的应用
CN102618590A (zh) * 2012-05-07 2012-08-01 江南大学 一种利用重组羰基还原酶催化制备(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104313064A (zh) * 2014-10-01 2015-01-28 青岛科技大学 一种细胞法生产手性溴苯基丙酸甲酯的方法
CN111454998A (zh) * 2020-04-21 2020-07-28 黄山科宏生物香料股份有限公司 一种手性羟基酸酯的生物制备方法
CN111454998B (zh) * 2020-04-21 2023-05-02 黄山科宏生物香料股份有限公司 一种手性羟基酸酯的生物制备方法

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