CN101372676A

CN101372676A - 一株红球菌以及利用该菌株制备光学纯手性亚砜的用途

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Publication number: CN101372676A
Application number: CNA2008100424253A
Authority: CN
Inventors: 许建和; 李爱涛; 张建栋; 卢文芽; 林国强
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2008-09-03
Filing date: 2008-09-03
Publication date: 2009-02-25
Anticipated expiration: 2028-09-03
Also published as: CN101372676B

Abstract

本发明公开了一株红球菌(Rhodococcus sp.ECU0066)以及用途，该菌株保藏号为CGMCC No.2547。以该菌株的静息细胞为生物催化剂，对前手性的苯烷基硫醚及其衍生物进行不对称催化氧化，获得了光学活性的手性苯甲亚砜及其衍生物。本发明所述的菌株及其立体选择性生物氧化工艺不仅具有较好的催化效果，而且操作简单、安全，成本低廉，产物容易纯化，对环境友好。

Description

一株红球菌以及利用该菌株制备光学纯手性亚砜的用途

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一株红球菌及其用于生产光学纯手性亚砜的用途。

技术背景

有机硫化合物在有机合成中很早就得到了广泛的应用。光学活性的亚砜在不对称合成中的应用也日渐增多，成为诱导许多不对称转化的一个重要工具。尤其在过去的20年中，手性亚砜化合物作为手性辅助试剂在不对称合成领域中的应用呈现指数级的增长，确立了手性亚砜官能团在碳碳键和碳杂键形成过程中作为最有效、最通用手性控制因素的地位。

手性亚砜化合物作为最成功、最有效的手性控制因素之一，至少存在三个有利的因素：(1)手性亚砜具有高度的立体化学稳定性。由大多数亚砜的热力学常数计算表明，亚砜的两个异构体要在200℃左右才能发生转化或消旋化。(2)它是手性信息的有效载体。亚砜类化合物具有一个锥形结构，与其它手性基团相比，它至少有三个具有明显位阻和电子差异的取代基，即氧原子、孤对电子、两个取代基(烷基或芳基)。当两个取代基不同时，亚砜就具有手性特征。(3)两种构型的对映异构体都能较容易得到。

手性亚砜的功能进一步表现在一些含有硫原子手性中心的具有药理活性的化合物中。例如：苯并吡唑类质子泵抑制剂是治疗胃溃疡、十二指肠溃疡、反流性食管炎、Zollinger-Ellison综合症、HP感染等众多病症的有效药物。目前使用较多的是替莫拉唑(Timoprazole)、皮可拉唑(Picoprazole)、奥美拉唑(Omeprazole)、兰索拉唑(Lansoprazole)、潘妥拉唑(Pantoprazole)、雷贝拉唑(Rabeprazole)等。2002年这些质子泵抑制剂的全球销售额达219亿美元。然而在一些这类药物当中，只有一种对映体表现出所需要的或者更好的药理活性，因此这又进一步说明了获得光学活性的亚砜是非常必要的。

生产光学活性亚砜的途径可以分为两种，一种传统的途径是外消旋亚砜的动力学拆分，另一种途径是前手性硫醚的不对称氧化。外消旋体的拆分需要先将硫醚首先化学氧化为外消旋的亚砜，然后再对其进行拆分，过程比较繁琐并且最高的理论得率只有50％。而与传统的拆分相比较，硫醚的不对称氧化则更加直接和经济，它直接以前手性的硫醚为底物，理论得率可以达到100％。

近年来，金属催化剂和酶已经成功地用于前手性硫醚的不对称氧化来生产光学活性的亚砜。但是利用金属催化剂进行的硫醚不对称氧化反应，反应条件比较苛刻，操作比较繁琐，对环境不友好以及得到的产物ee值普遍不高。而利用分离得到的酶进行反应，还需要先将酶分离纯化出来，而酶的分离纯化是非常困难的，并且在反应过程中还需要添加昂贵的辅因子(NADH或NADPH)。

利用微生物整细胞作为催化剂进行硫醚的不对称氧化反应，可以克服以上金属催化剂和酶进行的反应所具有的缺点，它避免了酶的分离纯化，而且由于细胞本身具有辅酶再生体系，可避免使用昂贵的辅因子，并且反应过程简单、对环境友好，对于制备规模生产光学活性的亚砜是比较方便的。已有一些文献报道利用整细胞对硫醚进行不对称氧化得到光学活性的亚砜。例如，Beecher等人(Biotechnol.Lett.，1994，16：909-912)利用Pseudomonas putida NCBI10007和Acinetobacter calcoaceticus NCBI 9871对苯甲硫醚进行不对称氧化，结果苯甲亚砜的产率分别为87％和97％，ee分别为27％和85％。Beecher等人(Biotechnol.Lett.，1995，10：1069-1074)又利用Saccharomyces cerevisiae NCYC73不对称氧化苯甲硫醚，亚砜的得率为30％，ee为60％。Adam等人(Tetrahedron：Asymmetry，2004，15：983-985)利用Pseudomonas frederiksbergensis对苯甲硫醚进行不对称氧化，底物的转化率为87％，ee为91％。但这些以整细胞作为催化剂进行的硫醚不对称氧化，产物的ee值普遍不高，很难满足合成过程中纯度的要求。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一株红球菌及其用于制备光学活性亚砜的用途，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的红球菌(Rhodococcus sp.ECU0066)是一种属于红球菌属的菌株，是发明人从土壤样品中，经过初筛、复筛及分离纯化得到的高选择性硫醚单加酶产生菌，该菌株已于2008年06月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，，保藏号为CGMCC No.2547。

上述的菌株是从上海、江苏、山东等地区的200份土壤中筛选得到的，筛选的具体步骤如下：

从不同的环境中采集土壤样品，利用苯甲硫醚为唯一碳源进行两轮富集培养，筛选硫醚单加氧酶产生菌。通过反复筛选，分离得到一株高活力和高选择性的硫醚单加酶产生菌。

本发明的菌种具有如下的微生物学特征：

1、形态大小

球状，2～3μm，不产芽孢，无鞭毛，革兰氏染色阳性；

2、适宜生长环境

适宜的生长温度为25～35℃，可以在pH5～9环境中生存；

3、平板培养菌落特性

在30℃平板上培养12h可形成小的菌落，36h形成粘稠、湿润的白色菌落，边缘光滑，中间突出。随着培养时间的延长，有红色素生成，最后变成深红色菌落。

根据“伯杰氏鉴定手册”提供的鉴定方法和上述的微生物学特征，并经16SrDNA鉴定，确认该菌株为红球菌属(Rohodococcus sp.)，标号为Rohodococcus sp.ECU0066。

但该微生物菌体与之前报道的红球菌株有明显的不同，其主要不同之处在于：该菌能氧化一系列的硫醚，具有较高的产率和良好的选择性，与之前的红球菌相比较有很大的优势。

本发明的红球菌株Rohodococcus sp.ECU0066可以用于生产单一对映体的苯甲亚砜或其衍生物，生产的方法包括如下的步骤：

(1)菌种的准备

将红球菌ECU0066在灭过菌(121℃，20～40min)的丰富培养基(例如：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，琼脂1.5％)平板上划线，于25～30℃静置培养约2天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养(培养条件同上)，约2天后保存于4℃冰箱中备用。

(2)菌株的培养

将所述的红球菌Rohodococcus sp.ECU0066采用本领域常规的方法，在发酵培养基中进行扩增培养24～36h，温度20～50℃；

再以上述培养液作为种子，基于发酵培养基体积的接种量为1～10％(v/v)，接种至50ml的发酵培养基中，在20～50℃下100～160rpm摇床上培养24～48h，离心得到静息细胞；

所说的发酵培养基可采用常规的培养基，其中各组分的含量如下：葡萄糖10～50g，蛋白胨1～20g，KH₂PO₄1～10g，K₂HPO₄1～10g，NaCl0.1～2g，MgSO₄0.1～2g，水1000ml，pH3～8。

(3)底物的生物转化

将收获的静息细胞，悬浮于pH为6.0～8.0的磷酸钾缓冲溶液中，静息细胞的含量为10～100g(湿重)/L；加入前手性底物苯基甲基硫醚或其衍生物，最终浓度为5～100mM，在25～40℃和100～160rpm的恒温摇床上振荡反应6～18h，然后从反应液中收集产物(S)-(-)-苯甲亚砜，精制后得到纯品：无色油状液体，产率44.2％，ee99％，比旋光

(c0.7，acetone)。

所述的苯甲硫醚及其衍生物具有如下结构式：R₁-S-R₂，其中取代基R₁或R₂分别选自苯基、C1～4的烷基、C1～4的烷基苯基、C1～4的烷氧基苯基、卤代苯基、噻唑基或噻吩基中的任意一种，且R₁≠R₂。

由上述公开的技术方案可见，采用本发明的红球菌株生产光学纯的手性亚砜，不仅具有较好的催化效果，能够合成光学纯度(>99％)的亚砜，而且催化剂易于制备、反应条件温和、底物适应性广，具有很好的工业应用开发前景。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但是不能限制本发明的内容。

实施例1 菌株的筛选

配制富集培养基，成分如下：(NH₄)₂SO₄1.0g/L，KH₂PO₄3.0g/L，K₂HPO₄6.0g/L，MgSO₄0.5g/L，CaCl₂0.05g/L；另配制丰富培养基，组成如下：葡萄糖15g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，KH₂PO₄1.0g/L，K₂HPO₄1.0g/L，MgSO₄0.5g/L，pH7.0。取少量的土样悬浮于2ml的富集培养基中，加入苯甲硫醚的吐温-80乳化液或甲醇溶液为唯一碳源，在25～40℃条件下进行两轮富集培养，总共需要2～4天；富集培养之后进行薄板层析，半定量地检测产物苯甲亚砜的有无或含量。对有明显硫醚氧化产物的富集培养液，取少量稀释涂布于丰富培养基平板上培养1～2天，然后根据菌落的形态和颜色的不同挑取单菌落。将挑取的单菌落接种于2ml发酵液体培养基(其组成同丰富培养基)中，预培养24h，然后加入苯甲硫醚的甲醇溶液，使其终浓度为10mM，生物转化18h之后，用乙酸乙酯萃取后点样进行薄板层析，检测苯甲亚砜的生成量，对有明显硫醚氧化活性的菌株进行保藏。将保存的有明显活性的菌株接种于50ml的发酵液培养基中，培养24h后，离心收集菌体。然后将离心下来的菌体再悬浮于10ml的磷酸缓冲液(50mM，pH7.0)中，再加入底物苯甲硫醚进行生物转化，转化18h后，用等体积的乙酸乙酯萃取后进行HPLC(使用日本Daicel公司的手性色谱柱Chiracel OD-H，φ0.46cm×25cm，流动相为正己烷/异丙醇＝93:7，v/v，流速1ml/min)分析测定产物的对映体过量值(ee_p)和底物的转化率。最后在800多株候选菌株中筛选出了能立体选择性氧化苯甲硫醚生成(S)-苯甲亚砜的微生物Rohodococcus sp.ECU0066。

实施例2 微生物的培养

培养基配方：葡萄糖15g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，KH₂PO₄1.0g/L，K₂HPO₄1.0g/L，MgSO₄0.5g/L，pH7.0，121℃高温灭菌20min。

取4℃保藏的红球菌斜面，挑取一环接种至装有50ml培养基的250ml的摇瓶中。在30℃下，160rpm培养12h，按5％(v/v)的接种量转接至装有100ml培养基的500ml的摇瓶中，于30℃、160rpm继续培养30h，离心收获细胞。测得发酵液的酶活力约为34U/L，细胞浓度约30g(湿重)/L，单位湿细胞的酶活为1.0U/g湿细胞。

细胞酶活力单位的定义为：在30℃、pH8.0的条件下，每分钟催化苯甲硫醚氧化生成1.0μmol苯甲亚砜所需要的细胞量。

实施例3 利用静息细胞制备(S)-(-)-苯甲亚砜

将离心得到的红球菌Rohodococcus sp.ECU0066静息细胞12g悬浮于100ml磷酸缓冲液(50mM，pH8.0)中，加入底物苯甲硫醚，使其终浓度为5mM，在30℃和160rpm的恒温摇床上振荡反应4h后，将反应液以12,000×g离心10min，除去细胞。在上清液中加入NaCl至饱和，用50ml的乙酸乙酯萃取，重复三次。离心得到的细胞用20ml乙酸乙酯浸泡，重复两次，将这两部分乙酸乙酯合并，然后用饱和的NaCl溶液洗涤两次，每次10ml。得到的乙酸乙酯萃取液用无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到产物的结晶粗品，通过硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯，体积比2:1)纯化后得到(S)-(-)-苯甲亚砜：无色油状液体，产率44.2％，光学纯度99％ee

(c0.7，acetone)。

实施例4～10光学纯苯甲亚砜衍生物的合成

称取实施例2的湿重12g的Rohodococcus sp.ECU0066静息细胞，以下列表中所列的苯甲硫醚衍生物为底物，底物浓度为5mM，反应体积为100ml，在30℃和160rpm的恒温摇床振荡反应大约4h，间歇取样测定反应的转化率，至转化完全时结束反应。将反应液以12,000×g离心10min，除去细胞。在离心之后的上清液中加入NaCl至饱和，用50ml的乙酸乙酯萃取，重复三次，离心得到的细胞用20ml的乙酸乙酯浸泡，重复两次，将这两部分乙酸乙酯合并，然后用饱和NaCl溶液洗涤两次，每次10ml。将得到的乙酸乙酯萃取液用无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到结晶粗品，通过硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯，体积比2:1)纯化后得到产物的纯品，用液相色谱分析产物的ee值，称量产物的质量计算产物的分离产率，并测定产物的比旋光度，对照文献确定产物的绝对构型。反应的结果如下表所示。

Claims

1.一株红球菌(Rhodococcus sp.ECU0066)，保藏号为CGMCC No.2547。

2.一种如权利要求1所述的红球菌(Rhodococcus sp.ECU0066)用于制备光学纯苯甲亚砜及其衍生物。

3.如权利要求2所述的红球菌(Rhodococcus sp.ECU0066)的用途，其特征是通过如下步骤制备光学纯苯甲亚砜及其衍生物：

(1)将所述的红球菌Rhodococcus sp.ECU0066在发酵培养基中进行扩增培养，离心得到静息细胞；

(2)将(1)收获的静息细胞悬浮于pH为6.0～8.0的磷酸钾缓冲液中，加入前手性的苯甲硫醚底物及其衍生物，在25～40℃反应6～18h，然后采用常规的分离方法从反应混合物中收集光学纯的苯甲亚砜及其衍生物；

4.根据权利2所述的方法，其特征在于，静息细胞在磷酸缓冲液中的含量为10～100g湿重/L。

5.根据权利2所述的方法，其特征在于，前手性底物苯甲硫醚及其衍生物的浓度为5～100mmol/L。

6.根据权利2所述的方法，其特征在于，所说的发酵培养基组成如下：葡萄糖10～50g，蛋白胨1～20g，KH₂PO₄1～10g，K₂HPO₄1～10g，NaCl0.1～2g，MgSO₄0.1～2g，自来水1000ml，pH3～8。

7.根据权利3所述的方法，其特征在于，所述的硫醚底物选自苯环对位被取代的苯甲硫醚衍生物或者侧链被取代的苯基乙基硫醚以及带有杂环的硫醚。