发明内容
本发明所要解决的技术问题是,已报道的酶促不对称还原制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的方法中普遍出现的转化率低,反应时间长,需要添加昂贵辅酶及其它添加剂等问题。
本发明提供一株红球菌以及用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途
本发明通过下述具体技术方案以解决上述技术问题:
本发明的发明人从土壤中,经过初筛、复筛及分离纯化,获得一株能高效率不对称还原制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的红球菌(Rhodococcus baikonurensis),实验室编号为ECU1014,该菌株在2013年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏号为CGMCC No.7649。
Rhodococcus baikonurensis ECU1014(CGMCC No.7649)具有如下特征:
1.大小形态
球状,2~3μm,革兰氏染色阳性;
2.适合生长环境
可在温度25~35℃,pH5~9环境中生存;
3.平板培养菌落特性
淡粉色,潮湿状,底部有隆起,边缘粗糙,不透明。
经16S rDNA鉴定,确认该菌株为(Rhodococcus baikonurensis),标号为Rhodococcus baikonurensis ECU1014。
本发明的红球菌株Rhodococcus baikonurensis ECU1014可以不对称合成光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇,包括下列步骤:
1.菌株的培养
将所述的红球菌Rhodococcus baikonurensis ECU1014采用本领域常规的方法,在发酵培养基中进行扩增培养24~36h,温度20~50°C;
再以上述培养液做为种子,基于发酵培养基体积的接种量为1~10%(v/v),接种至50mL的发酵培养基中,在20~50℃下100~160rpm摇床上培养24~48h,离心得到静息细胞;
所述的发酵培养基可采用常规的培养基,其中各组分的含量如下:葡萄糖10~50g,蛋白胨1~20g,KH2PO41~10g,K2HPO41~10g,NaCl0.1~2g,MgSO40.1~2g,水1000mL,pH3~8。
2.底物的生物转化
将收获的静息细胞,悬浮于pH为5.5~7.0的缓冲液中,静息细胞的含量为1~300g(湿重)/L;在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NAD+的存在下,对潜手性羰基化合物进行不对称还原反应,制得光学活性手性醇。
所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度较佳的为1~15mmol/L(6-羰基-8-氯辛酸乙酯为1~300mmol/L)。葡萄糖脱氢酶的用量较佳的为0.2~3kU/L(以6-羰基-8-氯辛酸乙酯作为底物时为0.2~60kU/L)。葡萄糖的用量较佳的为0.3~4.5g/L(以6-羰基-8-氯辛酸乙酯作为底物时为0.3~90g/L)。外加NAD+的用量较佳的为0~1.0mmol/L。所述的缓冲液可为本领域常规磷酸盐缓冲液,如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05~0.1mol/L,所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称还原反应较佳的是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳 的为20~35℃。所述的不对称还原反应的时间较佳的以反应完全为准。不对称还原反应结束后,可按本领域常规方法从反应液中提取手性醇产物。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明的积极进步效果在于:本发明针对已报道的生物催化不对称合成(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的研究中存在产物浓度不高,转化率低,反应时间长,需要额外添加昂贵辅酶等问题,筛选得到一株红球菌作为催化剂,不对称还原6-羰基-8-氯辛酸酯及其它潜手性酮。在催化浓度高达300mmol/L(66g/L)的底物时,转化率仍可达99%以上,反应时间为36h,产物的ee值为93%,且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于已报道的其它不对称还原制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的方法,具有一定的工业应用前景。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术内容作进一步的描述。其目的仅在于更好地理解本发明的内容,而非限制本发明的保护范围。
实施例1菌株的筛选
配制富集培养基,成分如下:(NH4)2SO41.0g/L,KH2PO43.0g/L,K2HPO46.0g/L,MgSO40.5g/L,CaCl20.05g/L;另配制丰富培养基,组成如下:葡萄糖15g/L,酵母膏5g/L,蛋白胨5g/L,KH2PO41.0g/L,K2HPO41.0g/L,MgSO40.5g/L,pH7.0。在250mL的三角烧瓶内装50mL的富集培养基和2mM的底物作为碳源,加入土样后,于30℃,180rpm培养1~6天。之后将该培养液涂布于丰富培养基平板上,30℃培养1~3天,长出的单菌落进行平板划线分离纯化。底物为6-羰基-8-氯辛酸乙酯。
将得到的单菌落接种到液体丰富培养基中,在30℃,180rpm培养2天后,取一定量的湿细胞(0.1~0.5g)悬浮于1mL磷酸缓冲液(PBS,50mM,pH6.0)中,添加底物6-羰基-8-氯辛酸乙酯(10mM,以乙醇助溶)和5%葡萄糖,在30℃,1100rpm条件下反应24h。反应结束后,使用薄板层析(TLC)分析产物/底物比例,选择产物比例高的菌株进行复筛。
复筛中,菌体的培养方法和条件同上,反应结束后离心(12,000rpm,5min),收集的上清液用乙酸乙酯萃取两次,取上层有机相,用无水NaSO4干燥过夜,进行气相色谱分析,测定底物转化率和还原产物的ee值。
筛选结果是编号为ECU1014的菌株催化还原时具有最高的转化率与ee值。
产物ee值的具体分析条件如下:
使用气相色谱仪进行分析,色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasil-DEXCB,以氮气为载气,进样口温度280℃,检测器温度280℃,反应产物乙酰化后进行分析,柱温160℃。
实施例2–8静息细胞催化羰基化合物的不对称还原
在1mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH6.0)中加入0.01g Rhodococcus baikonurensis ECU1014的静息细胞和2U的葡萄糖脱氢酶粗酶液(制备方法参见:Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology2011,38,633–641),分别加入终浓度为10mmol/L的潜手性羰基化合物(实施例2–8),以及终浓度为0.5mmol/L的NAD+和3g/L的葡萄糖。在30°C,1100rpm振荡反应24h。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取,萃取两次,合并萃取液,加无水硫酸钠干燥过夜后分析测定底物转化率和还原产物的ee值,结 果见表1。
产物ee值的具体分析条件如下:
使用气相色谱仪进行分析,色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB,以氮气为载气,进样口温度280℃,检测器温度280℃,其它条件如下:
实施例2:反应产物乙酰化后进行分析,柱温80℃;
实施例3:柱温160℃;
实施例4:反应产物乙酰化后进行分析,柱温160℃;
实施例5:反应产物乙酰化后进行分析,柱温160℃;
实施例6:反应产物乙酰化后进行分析,柱温160℃;
实施例7:反应产物乙酰化后进行分析,柱温160℃;
实施例8:反应产物乙酰化后进行分析,柱温160℃;
表1.催化羰基化合物不对称还原反应的结果
实施例9静息细胞催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯的不对称还原
在10mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH6.0)中加入0.5g Rhodococcus baikonurensis ECU1014的静息细胞和100U的葡萄糖脱氢酶粗酶液,加入终浓度为50mmol/L的6-羰基-8-氯辛酸乙酯和15g/L的葡萄糖。反应在30℃下进行,pH控制为6.0,反应至产物的浓度不再增加为止,此时反应时间为12小时。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取,萃取两次,合并萃取液,加无水硫酸钠干燥过夜,用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB)分析测定底物转化率和还原产物的ee值。具体分析条件为:以氮气为载气,进样口温度280℃,检测器温度280℃,柱温160℃。转化率为99%,产物ee值为93%(R)。
实施例10静息细胞催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯的不对称还原
在100mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH6.0)中加入30g Rhodococcus baikonurensis ECU1014的静息细胞和6kU的葡萄糖脱氢酶粗酶液,加入终浓度为300mmol/L的6-羰基-8-氯辛酸乙酯和90g/L的葡萄糖。反应在30℃下进行,pH控制为6.0,反应至产物的浓度不再增加为止,此时反应时间为36小时。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取,萃取两次,合并萃取液,加无水硫酸钠干燥过夜,用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB)分析测定底物转化率和还原产物的ee值。转化率为99%,产物ee值为93%。旋转蒸发除去溶剂,获得产品34g。
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ4.13(q,J=7.1Hz,2H),3.93–3.81(m,1H),3.77–3.62(m,2H),2.32(t,J=7.3Hz,2H),1.97–1.80(m,2H),1.77–1.58(m,3H),1.55–1.45(m,3H),1.44–1.35(m,1H),1.26(t,J=7.1Hz,3H).
13C NMR(CDCl3,400MHz):δ14.3,24.7,25.0,34.2,37.1,39.7,42.0,60.4,68.5,173.8。