CN101619299A

CN101619299A - 一种赤红球菌以及利用该菌制备5-氰基戊酰胺的方法

Info

Publication number: CN101619299A
Application number: CN200910069641A
Authority: CN
Inventors: 王敏; 李晓丹; 申雁冰; 骆健美; 郑宇�; 孙华
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2009-07-08
Filing date: 2009-07-08
Publication date: 2010-01-06
Anticipated expiration: 2029-07-08
Also published as: CN101619299B

Abstract

本发明涉及一种赤红球菌以及利用该菌制备5－氰基戊酰胺的方法，需氧、无动力、无芽孢、革兰氏阳性菌，该菌种已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为：2009年6月4日，保藏号为：CGMCC No.3090。利用该菌制备5－氰基戊酰胺的方法，步骤为：(1)种子培养；(2)发酵培养；(3)制备赤红球菌悬浮液；(4)5－氰基戊酰胺粗品的制备；(5)5－氰基戊酰胺的纯化。本发明开发了一种赤红球菌区域选择性水解己二腈生成5－氰基戊酰胺的方法，该方法催化效率高，己二腈的转化率高达100％，对5－氰基戊酰胺的区域选择性为100％，无副产物己二酰胺生成，简化了5－氰基戊酰胺的分离纯化工艺。

Description

一种赤红球菌以及利用该菌制备5-氰基戊酰胺的方法

技术领域

本发明属生物化学工程技术领域，涉及赤红球菌及其应用，尤其是一种赤红球菌以及利用该菌制备5-氰基戊酰胺的方法。

背景技术

5-氰基戊酰胺(5-cyanovaleramide，5-CVAM)可用于合成唑啶草酮(Azafenidin)和6-氨基己酰胺，其中唑啶草酮(Azafenidin)可用于制备的植物种子出土前的除草剂，6-氨基己酰胺是合成己内酰胺的重要中间体，己内酰胺是一种常用的有机化工原料。5-氰基戊酰胺可通过化学催化或者生物催化己二腈发生水合反应方法予以制备，由于己二腈分子式中含有两个氰基，所以要求催化剂能够区域选择性水解其中的一个氰基生成5-氰基戊酰胺。

据检索，美国专利5347033报道了由1mol己二腈和5mol的水和80g甲醇以非离子化的铜为催化剂在90℃条件反应45min生产5-氰基戊酰胺的方法，该方法中己二腈转化率为7％，选择性为88％，同时产生大量的副产物己二酰胺。美国专利5302756报道了由尼龙66、尼龙6氨解或酶解合成5-氰基戊酰胺的方法，该反应过程需要在300-350℃的高温和500psig的高压下反应，反应条件较苛刻，且在得到目标产物的同时，会伴随生成副产物己二腈、6-氨基己酰胺、6-氨基己腈。美国专利5728556报道了利用区域选择性生物催化剂Pseudomonas putida 3L-G-1-5-1A-1(ATCC 55736)转化己二腈生成5-氰基戊酰胺，其中己二腈转化率为100％时，对5-氰基戊酰胺的选择性为98％。

美国杜邦公司开发了以二氧化锰为催化剂的己二腈化学水合法合成5-氰基戊酰胺，该工艺会产生大量副产物己二酰胺(占被转化己二腈的20％)，己二腈的转化率为25％，采用溶剂萃取法不易将5-氰基戊酰胺从未反应的己二腈中分离出来，同时二氧化锰的迅速减活导致每生产1kg 5-氰基戊酰胺就会浪费1.25kg催化剂。该公司还发现了一种工业用生产5-氰基戊酰胺的区域选择性催化剂Pseudomonas ehlororaphisB23(Nit-to化工公司的第二代丙烯酰胺生物催化剂)，B23细胞被固定于藻酸钙颗粒中以稳定酶的活性，并使生物催化剂易于回收和再利用，利用该方法生产时己二腈转化率为97％，5-氰基戊酰胺的最终产率为93％，选择性为96％，与以二氧化锰为催化剂的化学法相比减少了催化剂浪费，但这一反应过程中同样会有副产物己二酰胺的生成，增加了5-氰基戊酰胺分离纯化的难度。

综上所述，目前5-氰基戊酰胺的生产方法存在以下不足：1、部分方法的反应条件苛刻，对生产设备及生产条件要求较高，增加生产成本；2、部分生产方法转化率以及选择性均较低，原料利用率低，造成原料浪费；3、上述几种生产方法中，生成目标产物的同时产生的副产物也较多，增加了产品分离纯化的难度。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种赤红球菌以及利用该菌制备5-氰基戊酰胺的方法，该方法具有反应速度快、反应周期短、易分离纯化以及节省能源的优点。

本发明实现目的的技术方案是：

一种赤红球菌，形态特征为：需氧、无动力、无芽孢、革兰氏阳性菌，该菌种已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为：2009年6月4日，保藏号为：CGMCC No.3090。

而且，所述赤红球菌在LB培养基中培养初期菌体由球形细胞逐步变成长杆状，继续培养菌体逐步断裂变成短杆状，培养后期又变成球形；在LA培养平板上，菌落呈橙红色，不透明凸起，湿润，边缘平整。

而且，所述赤红球菌中的腈水合酶催化己二腈区域选择性水解生成5-氰基戊酰胺。

一种赤红球菌制备5-氰基戊酰胺的方法，制备的步骤是：

(1)种子培养：在摇瓶中加入种子培养基，从保藏的斜面中挑取菌种接于种子培养基中培养，得到种子液；

(2)发酵培养：在摇瓶中加入发酵培养基，按2-5％的接种量接入种子液，发酵培养，得到发酵液；

(3)制备赤红球菌悬浮液：将上述发酵液离心，去上清，所得湿菌体细胞用生理盐水洗涤2-4次，然后用pH 6-9缓冲液洗涤1-2次并悬浮于等体积的缓冲液中，得到赤红球菌悬浮液；

(4)5-氰基戊酰胺粗品的制备：配置反应物己二腈的浓度为0.5-2.5mol/L，赤红球菌细胞浓度控制在0.2-2.5g/L，在pH6-9缓冲液体系中加入终浓度为2.5％-20％的甲醇，反应温度为20-40℃，转速为110-220rpm，转化时间为120-300min，将得到的转化液离心除去菌体细胞，上清加入20％乙醇真空浓缩，得到5-氰基戊酰胺粗品；

(5)5-氰基戊酰胺的纯化：在5-氰基戊酰胺粗品中加入有机溶剂溶解，抽滤，上清液真空浓缩，加入乙酸乙酯重结晶，过滤，再用乙酸乙酯洗涤并重结晶2-4次，即得到5-氰基戊酰胺成品。

而且，所述种子培养基的优选配方及制备方法为：0.5％-1.0％甘油、0.3％-0.7％蛋白胨、0.2％-0.5％麦芽粉、0.2％-0.5％酵母粉、0.1％-0.2％NaCl，pH 7.0-8.0，121℃灭菌20-30min。

而且，所述发酵培养基的配方及制备方法为：1％-3％葡萄糖、0.2％-0.6％酵母粉、0.03％-0.06％K2HPO4、0.03％-0.06％KH2PO4、0.2％-0.6％MgSO4·7H2O、0.4％-1.0％尿素、0.1％-0.3％NaCl、0.001％-0.005％CoCl2、0.05％-0.2％谷氨酸钠，pH7.0-8.0，115℃灭菌20-30min；其中诱导剂CoCl2和尿素分别单独灭菌。

而且，所述乙酸乙酯重结晶的温度为-20℃。

本发明的优点和有益效果为：

1、本发明开发了一种赤红球菌区域选择性水解己二腈生成5-氰基戊酰胺的方法，该方法催化效率高，己二腈的转化率为100％，对5-氰基戊酰胺的区域选择性为100％，无副产物己二酰胺生成，简化了5-氰基戊酰胺的分离纯化工艺。

2、本发明在己二腈转化体系中加入赤红球菌，可人为调节和控制转化速率以及转化液中菌体细胞浓度，细胞生长和催化己二腈水解的过程可以独立优化，并可分别达到各自的最适反应条件，从而有效提高产物5-氰基戊酰胺的浓度，有利于产品的分离纯化，同时在转化过程不必考虑底物、产物以及有毒副产物对细胞生长的影响。

3、本发明涉及的生产方法与固定化细胞法相比，具有反应速度快、反应周期短、节省能源等优点，更加适合工业化的生产。

附图说明

图1为本发明产物5-氰基戊酰胺电喷雾质谱图；

图2为本发明产物5-氰基戊酰胺核磁共振氢谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明涉及的赤红球菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2009年6月4日，保藏号为CGMCC No.3090。本发明所涉及的赤红球菌中的腈水合酶(nitrile hydratase，NHase，E.C.4.2.1.84)可催化己二腈(adipicdinitrile，ADN)区域选择性水解生成5-氰基戊酰胺(5-cyanovaleramide，5-CVAM)，以下实施例所采用的菌种即为该保藏菌种。

赤红球菌(Rhodococcus ruber CGMCC No.3090)是从长期被丙烯腈污染的丙烯酰胺生产厂附近采集的土样中分离筛选得到，筛选过程中以葡萄糖为碳源，逐步增大培养基中丙烯腈浓度进行重复续代培养，富集培养三代后，涂布平板，挑取单菌落接种于斜面培养基保藏。

该赤红球菌的形态特征如下：需氧，无动力，无芽孢，革兰氏阳性菌，其细胞形态复杂多变：在LB培养基中培养初期菌体由球形细胞逐步变成长杆状，继续培养菌体逐步断裂变成短杆状，培养后期又变成球形，在LA培养平板上，菌落呈橙红色，不透明凸起，湿润，边缘平整。

实施例1：

一种利用赤红球菌制备5-氰基戊酰胺的方法，制备的步骤是：

(1)种子培养：在250mL的摇瓶中加入30mL种子培养基，从保藏的斜面菌种中挑取一环接于种子培养基中，30℃，180rpm培养28h，得到种子液；

种子培养基：1％甘油、0.5％蛋白胨、0.3％麦芽粉、0.3％酵母粉、0.1％NaCl、pH 7.2，121℃灭菌20min。

(2)发酵培养：在250mL的摇瓶中加入30mL发酵培养基，按3％的接种量接入种子液，28℃，180rpm培养48h；

发酵培养基：2％葡萄糖、0.5％酵母粉、0.05％K₂HPO₄、0.05％KH₂PO₄、0.4％MgSO₄·7H₂O、0.7％尿素、0.2％NaCl、0.002％CoCl₂、0.1％谷氨酸钠，pH 7.2，115℃灭菌20min；其中诱导剂CoCl₂和尿素分别单独灭菌，CoCl₂ 121℃灭菌20min，尿素115℃灭菌3min。

(3)制备赤红球菌悬浮液：将上述发酵液离心分离，去上清，所得湿菌体细胞用等体积的生理盐水洗涤两次，然后用pH 7.5 Tris-HCl洗涤一次并悬浮于等体积的该缓冲液中，得到用于生物转化己二腈的赤红球菌悬浮液；

(4)5-氰基戊酰胺粗品的制备：底物己二腈浓度为1.5mol/L，反应体积30mL，赤红球菌细胞浓度为1.05g/L，加入2.5％甲醇，转化体系为20mmol/L pH7.5 Tris-HCl缓冲液，温度为30℃，整个反应在水浴反应器中进行，转速为200rpm，转化时间为120min。转化结束后转化液离心除去菌体细胞，加入20％乙醇旋蒸除去水分，得到5-氰基戊酰胺粗品；

(5)5-氰基戊酰胺的纯化：在5-氰基戊酰胺粗品中加入甲苯和甲醇至粗品完全溶解，真空抽滤除去其中的盐，上清液旋转蒸发至液体被蒸干，加入一定体积乙酸乙酯于-20℃重结晶，真空过滤，再用乙酸乙酯洗涤并重结晶2次，得到5-氰基戊酰胺成品。

产物5-氰基戊酰胺的鉴定：

(1)理论上己二腈完全转化得到5-氰基戊酰胺的粗品为23.32g，纯度98.13％，经分离纯化后5-氰基戊酰胺纯品22.41g，纯度99.99％。

(2)纯品5-CVAM做熔点测定，测得其熔点为66.5-67℃。

(3)裂解电压为4.5kV时，全扫描模式(扫描质核比范围为50～500m/z)下，产物的电喷雾质谱图(ESI-MS)如图1所示：产物裂解成质核比为125.12的分子离子[M-H]^-，可判断的相对分子质量为126.12，底物己二腈的相对分子质量为108.14，产物比底物的相对分子质量增加了18，符合水合反应的特征。

(4)产物的核磁共振氢谱(¹H-NMR，300Hz，DMSO-d₆为溶剂)见图2：化学位移δ从8.0～1.0ppm区域共显示出五组质子峰，各峰分别与其分子中各质子相互对应，即：δ_H ¹H-NMR(300Hz，DMSO-d₆)δ_H 7.28(1H，s，NH)，6.76(1H，s，NH)，2.49(2H，t，J＝6.3Hz，H-5)，2.07(2H，t，J＝6.9Hz，H-2)，1.55(4H，m，H-3，H-4)。由此可知，产物6分子中共计九个氢，化学位移为7.28ppm和6.76ppm的质子峰对应为酰胺基团中的氢。

实施例2：

本实施例中步骤(1)、(2)、(3)和(5)均与实施例1相同，以下只叙述步骤(4)。

(4)5-氰基戊酰胺粗品的制备：底物己二腈浓度为0.5mol/L，反应体积30mL，赤红球菌细胞浓度为0.53g/L，加入2.5％甲醇，转化体系为20mmol/L pH7.5Tris-HCl缓冲液，温度为30℃，整个反应在水浴反应器中进行，转速为180rpm，转化时间为120min。转化结束后转化液离心除去菌体细胞，加入20％乙醇旋蒸除去水分，得到5-氰基戊酰胺粗品；

经检测本步骤中己二腈转化率达到100％，对5-氰基戊酰胺的选择性100％。

实施例3：

(4)5-氰基戊酰胺粗品的制备：底物己二腈浓度为0.8mol/L，反应体积30mL，赤红球菌细胞浓度为0.53g/L，加入2.5％甲醇，转化体系为20mmol/L pH7.5Tris-HCl缓冲液，温度为30℃，整个反应在水浴反应器中进行，转速为180rpm，转化时间为240min。转化结束后转化液离心除去菌体细胞，加入20％乙醇旋蒸除去水分，得到5-氰基戊酰胺粗品；

实施例4：

(4)5-氰基戊酰胺粗品的制备：底物己二腈浓度为1.0mol/L，反应体积30mL，赤红球菌细胞浓度为0.53g/L，加入2.5％甲醇，转化体系为20mmol/L pH7.5Tris-HCl缓冲液，温度为30℃，整个反应在水浴反应器中进行，转速为180rpm，转化时间为300min。转化结束后转化液离心除去菌体细胞，加入20％乙醇旋蒸除去水分，得到5-氰基戊酰胺粗品；

实施例5：

(4)5-氰基戊酰胺粗品的制备：底物己二腈浓度为1.5mol/L，反应体积30mL，赤红球菌细胞浓度为0.53g/L，加入2.5％甲醇，转化体系为20mmol/L pH7.5Tris-HCl缓冲液，温度为30℃，整个反应在水浴反应器中进行，转速为180rpm，转化时间为300min。转化结束后转化液离心除去菌体细胞，加入20％乙醇旋蒸除去水分，得到5-氰基戊酰胺粗品；

经检测本步骤中己二腈转化率达到92％，对5-氰基戊酰胺的选择性100％。

实施例6：

(4)5-氰基戊酰胺粗品的制备：底物己二腈浓度为2.0mol/L，反应体积30mL，赤红球菌细胞浓度为0.53g/L，加入2.5％甲醇，转化体系为20mmol/L pH7.5Tris-HCl缓冲液，温度为30℃，整个反应在水浴反应器中进行，转速为180rpm，转化时间为300min。转化结束后转化液离心除去菌体细胞，加入20％乙醇旋蒸除去水分，得到5-氰基戊酰胺粗品；

经检测本步骤中己二腈转化率达到83％。

实施例7：

(4)5-氰基戊酰胺粗品的制备：底物己二腈浓度为1.5mol/L，反应体积30mL，赤红球菌细胞浓度为0.53g/L，加入2.5％甲醇，转化体系为pH7.5Tris-HCl缓冲液，温度为30℃，整个反应在水浴反应器中进行，转速为180rpm，转化时间为300min。转化结束后转化液离心除去菌体细胞，加入20％乙醇旋蒸除去水分，得到5-氰基戊酰胺粗品；

经检测本步骤中己二腈转化率达到80％。

实施例8：

(4)5-氰基戊酰胺粗品的制备：底物己二腈浓度为1.5mol/L，反应体积30mL，赤红球菌细胞浓度为0.79g/L，加入2.5％甲醇，转化体系为20mmol/L pH7.5Tris-HCl缓冲液，温度为30℃，整个反应在水浴反应器中进行，转速为180rpm，转化时间为300min。转化结束后转化液离心除去菌体细胞，加入20％乙醇旋蒸除去水分，得到5-氰基戊酰胺粗品；

经检测本步骤中己二腈转化率达到98.4％。

实施例9：

(4)5-氰基戊酰胺粗品的制备：底物己二腈浓度为1.5mol/L，反应体积30mL，赤红球菌细胞浓度为0.88g/L，加入2.5％甲醇，转化体系为20mmol/L pH7.5Tris-HCl缓冲液，温度为30℃，整个反应在水浴反应器中进行，转速为180rpm，转化时间为240min。转化结束后转化液离心除去菌体细胞，加入20％乙醇旋蒸除去水分，得到5-氰基戊酰胺粗品；

经检测本步骤中己二腈转化率达到100％。

Claims

1、一种赤红球菌，其特征在于：赤红球菌的形态特征为：需氧、无动力、无芽孢、革兰氏阳性菌，该菌种已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为：2009年6月4日，保藏号为：CGMCC No.3090。

2、根据权利要求1所述的一种赤红球菌，其特征在于：所述赤红球菌在LB培养基中培养初期菌体由球形细胞逐步变成长杆状，继续培养菌体逐步断裂变成短杆状，培养后期又变成球形；在LA培养平板上，菌落呈橙红色，不透明凸起，湿润，边缘平整。

3、根据权利要求1所述的一种赤红球菌，其特征在于：所述赤红球菌中的腈水合酶催化己二腈区域选择性水解生成5-氰基戊酰胺。

4、一种利用如权利要求1所述的赤红球菌制备5-氰基戊酰胺的方法，其特征在于：制备的步骤是：

5、根据权利要求4所述的利用赤红球菌制备5-氰基戊酰胺的方法，其特征在于：所述种子培养基的优选配方及制备方法为：0.5％-1.0％甘油、0.3％-0.7％蛋白胨、0.2％-0.5％麦芽粉、0.2％-0.5％酵母粉、0.1％-0.2％NaCl，pH 7.0-8.0，121℃灭菌20-30min。

6、根据权利要求4所述的利用赤红球菌制备5-氰基戊酰胺的方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方及制备方法为：1％-3％葡萄糖、0.2％-0.6％酵母粉、0.03％-0.06％K2HPO4、0.03％-0.06％KH2PO4、0.2％-0.6％MgSO4·7H2O、0.4％-1.0％尿素、0.1％-0.3％NaCl、0.001％-0.005％CoCl2、0.05％-0.2％谷氨酸钠，pH7.0-8.0，115℃灭菌20-30min；其中诱导剂CoCl2和尿素分别单独灭菌。

7、根据权利要求4所述的利用赤红球菌制备5-氰基戊酰胺的方法，其特征在于：所述乙酸乙酯重结晶的温度为-20℃。