CN109797164B - 一种新型腈水合酶高效催化脂肪二腈水合反应的体系 - Google Patents

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Abstract

本发明属于绿色化学技术领域，提供了一种新型腈水合酶高效催化脂肪二腈水合反应的体系。本发明发现了来自红球菌Rhodococcus erythropolis CCM2595的腈水合酶在催化脂肪族二腈方面的全新应用。尤其该酶可选择性催化己二腈生成5‑氰基戊酰胺，反应速率高，反应条件简单温和，为5‑氰基戊酰胺的工业生产提供方法。

Description

一种新型腈水合酶高效催化脂肪二腈水合反应的体系
技术领域
本发明属于绿色化学技术领域，具体涉及来源于红球菌RhodococcuserythropolisCCM2595的腈水合酶在区域选择性催化脂肪二腈生成氰基酰胺方面的应用。
背景技术
腈水合酶(EC4.2.1.84,nitrile hydratase,简称NHase)是一类催化腈类化合物生成酰胺类化合物的金属酶。腈水合酶可催化腈类物质生产丙烯酰胺，烟酰胺、5-氰基戊酰胺等，在精细化学品尤其是农药和有机溶剂生产中应用广泛。腈类物质主要通过其生产单位的污水排放，除草剂或是意外泄露等方式进入人们生活。许多腈类都具有神经毒性，可使人或动物致癌、致畸。因此腈水合酶在环保领域也有重要作用，可以降解环境中的腈类物质。
5-氰基戊酰胺(5-CVAM)可用于合成唑啶草酮和6-氨基己酰胺，其中唑啶草酮可用于植物种子出土前的除草剂，6-氨基己酰胺是合成己内酰胺的重要中间体，己内酰胺是重要的化工原料。5-氰基戊酰胺可通过化学催化或生物催化己二腈发生水合反应予以制备。己二腈中含有2个氰基，要求催化剂能够区域选择性水合1个氰基生成5-氰基戊酰胺。相比于化学催化法反应条件苛刻(高温高压铜催化等)同时伴有大量副产物生成，生物催化具有反应快速温和、专一性强、选择性高、经济环保等优点。
目前根据权威生物合成催化酶数据库BRENDA表明，具有区域选择性能够部分催化己二腈生成5-氰基戊酰胺的微生物非常少，仅有假单胞菌属Pseudomonas chlororaphis。因此发现可用于工业快速高效生产5-氰基戊酰胺的新型腈水合酶是十分重要的。
本发明选用的Rhodococcuserythropolis CCM2595属红球菌，目前仅被报道具有降解苯酚衍生物的能力[Strnad H,Patek M,Fousek J,Szokol J,Ulbrich P,Nesvera J,Paces V,Vlcek C:Genome Sequence of Rhodococcuserythropolis Strain CCM2595,aPhenol Derivative-Degrading Bacterium.Genome announcements 2014,2(2)]，而其对脂肪族二腈的腈水合催化反应尚未有报道。
发明内容
本发明提供了来源于红球菌Rhodococcuserythropolis CCM2595的腈水合酶在催化脂肪二腈生成氰基酰胺方面的应用。
本发明的技术方案：
一种新型腈水合酶高效催化脂肪二腈水合反应的体系，腈水合酶菌体浓度1-3g/L,底物脂肪二腈终浓度20-50mM/L,转化体系为pH 7-8PBS缓冲溶液,25℃、200rpm振荡反应,反应5min后加入等反应体积甲醇终止反应，离心后取上清液，经过滤后进行高效液相色谱检测,对氰基酰胺产物生成的选择性大于90％。具体步骤如下：
(1)质粒构建：来源于红球菌RhodococcuserythropolisCCM2595的腈水合酶的核苷酸序列为：
Figure BDA0001965014920000021
Figure BDA0001965014920000031
Figure BDA0001965014920000041
该序列含有2596个核苷酸，以质粒pET-24a(+)为表达载体，根据其酶切位点特性，选择NdeI和HindIII酶切位点插入ReNHase基因片段，ReNHase基因片段来源于经过聚合酶链式反应简称(Polymerase Chain Reaction，PCR)得到的纯化产物；经过酶切后对相应DNA片段进行回收纯化，选用lacI启动子，加入卡那霉素KanR抗性基因片段，选用T7终止子，转化大肠杆菌TOP10，重组质粒经过酶切验证后命名为G0130349-1；
(2)蛋白表达验证：将步骤(1)中得到的重组质粒平行转化入BL21(DE3)和ArcticExpression(DE3)两种大肠杆菌感受态细菌中，加入LB液体培养基扩增培养后分别涂布于含50μg/ml卡那霉素(Kan)的LB固体平板，37℃倒置培养24h；分别挑取平板上单菌落接种于LB液体培养基中，培养至OD值为0.6-0.8时加入终浓度为0.1-1mM/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导3-24h；诱导完成后，离心收集菌体，洗涤后超声破碎菌体，进行SDS-PAGE分析，验证NHase蛋白表达情况；
(3)制备菌液：挑取步骤(2)中Arctic Expression(DE3)平板上单菌落接种于少量含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养12-18h得种子液；将种子液按体积1％接种量继续接种到含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD值为0.6-0.8时，加入IPTG使其终浓度为0.1mM/L，16℃、220rpm振荡培养24h得发酵液；离心去上清收集菌体，用pH7-8的PBS缓冲液洗涤2-3次后重新悬浮，得待用菌液；
(4)催化脂肪二腈水合反应：菌体浓度1-3g/L,底物脂肪二腈终浓度20-50mM/L,转化体系为pH 7-8PBS缓冲溶液,25℃、200rpm振荡反应,控制反应时间为5min-24h,加入等反应体积的甲醇终止反应，离心后取上清液，经过滤后送样进行高效液相色谱检测。
本发明的有益效果：本发明发现了来自红球菌RhodococcuserythropolisCCM2595的腈水合酶在催化脂肪族二腈方面的全新应用，该酶可选择性催化脂肪二腈生成氰基酰胺，反应速率高，反应条件简单温和，为氰基酰胺的工业生产提供方法。
附图说明
图1为重组质粒pET-24a(+)-ReNHase的图谱。
图2为ReNHase蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳图。
图中：LaneA:阴性对照；
Lane B:37℃诱导破碎沉淀(BL21(DE3))；
Lane C:37℃诱导破碎上清(BL21(DE3))；
Lane D:16℃诱导破碎沉淀(Arctic Expression(DE3))；
Lane E:16℃诱导破碎上清(Arctic Expression(DE3))。
图3为样品及产物的HPLC谱图。
图中：(a)己二酰二胺标样；(b)5-氰基戊酰胺标样；(c)ReNHase催化己二腈反应5min的产物；(d)ReNHase催化己二腈反应30min的产物。
图4为产物5-CVAM的酶活随时间变化曲线。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1ReNHase蛋白表达验证
将质粒1μl分别加入100μl BL21(DE3)和Arctic Expression(DE3)感受态细菌中，置于冰上20min，42℃热激90sec后迅速置冰中3min，加入600μl LB液体培养液，37℃220rpm振摇培养1h。取200μl菌液涂布于含50μg/ml Kan的LB平板，37℃倒置培养24h。次日，挑取2个BL21(DE3)和1个Arctic Expression(DE3)的单菌落分别接种于含50μg/ml Kan的4ml LB培养液的摇菌管中，37℃220rpm振摇培养至OD值约0.6。BL21(DE3)一管不加IPTG做阴性对照，一管加IPTG至终浓度为1mM/L，37℃诱导3小时。Arctic Expression(DE3)的单管加IPTG至终浓度0.1mM/L，16℃诱导24h。次日，12000rpm，1min离心去上清收集菌体，加入缓冲液(20mM PB，150mM NaCl，pH7.4)以300W功率，破碎4s，间隔6s，共30个循环破碎菌体。进行SDS-PAGE分析，选用12％分离胶及5％浓缩胶，电泳条件为先80V运行20min后160V运行100min。如图2所示，目的蛋白亚基(约27KDa)在上清液中有可溶性表达。
实施例2腈水合酶催化己二腈反应
(1)种子培养：挑1个Arctic Expression(DE3)单菌落接种于50μg/ml Kan的4mlLB培养液的摇菌管中，37℃220rpm振摇培养24h。
(2)诱导培养：取2ml菌液接种到装有50μg/ml Kan的200ml LB培养液的锥形瓶中，37℃220rpm振摇培养约3h至OD值为0.6-0.8，加入IPTG至其终浓度为0.1mM/L,16℃220rpm诱导24h。
(3)收集菌体：3000rpm10min离心去上清培养液，用pH7.4的PBS缓冲液洗涤菌体2次，最终用10ml PBS缓冲液重悬菌体。
(4)液相检测：将150μl菌液加入300μl PBS缓冲液中，然后加入50μl浓度为200mM己二腈底物，25℃200rpm振荡反应，控制反应时间分别为5min、10min、15min、30min、1h、2h、3h、6h、15h、24h，反应结束后加入500μl甲醇终止，13000rpm10min离心取上清液，经0.22μm滤膜过滤后送样进行高效液相色谱检测。HPLC检测方法：Ultimate 5μm 4.6×250mm LP-C18柱，流动相为25mM磷酸水溶液和甲醇(89:11，vol:vol)，检测波长200nm，柱温25℃，流速1ml/min。
如图3所示，(a)己二酰二胺标准品出峰时间为4.4min；(b)5-氰基戊酰胺标准品出峰时间为7.1min；(c)按照上述实例2步骤(4)条件反应5min时，己二腈转化率为100％，5-氰基戊酰胺选择性≥90％；(d)随着反应时间增加，5-氰基戊酰胺含量降低，己二酰二胺含量上升，说明该酶可以分步催化己二腈。
如图4所示，按照上述实例2步骤(4)条件进行反应，产物5-氰基戊酰胺初始总酶活可达4269U，随着反应时间增长，酶活逐渐降低。说明该酶可以高效短时催化己二腈生成5-氰基戊酰胺。
序列表
<110> 大连理工大学
<120> 一种新型腈水合酶高效催化脂肪二腈水合反应的体系
<130> 20191170
<141> 2019-01-30
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2596
<212> DNA
<213> 红球菌RhodococcuserythropolisCCM2595(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
catatgtcag taacgatcga ccacacaacg gagaacgccg caccggccca ggcgccggtc 60
tccgatcgcg cgtgggccct gttccgcgca ctcgacggta agggattggt acccgacggt 120
tacgtcgagg gatggaagaa gaccttcgag gaggacttca gtccaaggcg cggagcggaa 180
ttggtcgcgc gggcttggac cgaccccgat ttccggcaac tgcttctcac cgacggtacc 240
gccgcggttg cccagtacgg atatctgggc ccccagggcg aatacatcgt ggcagtcgaa 300
gacaccccga ccctcaagaa cgtgatcgtg tgctcgctgt gttcatgcac cgcgtggccc 360
atcctcggtc tgccgccgac ctggtacaag agtttcgaat accgtgcacg cgtggtccgc 420
gagccacgga aggttctctc cgagatggga accgagatcg cgtcggacgt cgagatccgc 480
gtctacgaca ccaccgccga aactcggtac atggtcctac cgcaacgtcc cgcaggcacc 540
gaaggctgga gccaggaaca actgcaggaa atcgtcacca aggactgcct gatcggcgtc 600
gcagtcccgc aggtccccac cgtctgacca ccccgacaag aaagaagcac accatggatg 660
gagtacacga tcttgccgga gttcaaggct tcggcaaagt cccgcatacc gtcaacgccg 720
acatcggccc caccttccac gccgagtggg aacacctgcc gtacagcctg atgttcgccg 780
gtgtcgccga actcggggcc ttcagcgtcg acgaagttcg atacgtcgtc gagcggatgg 840
agccccgcca ctacatgatg accccgtact acgagcggta cgtcatcggc gtcgcggcgc 900
tgatggtcga aaagggaatc ctgacgcagg aagagctcga aagccttgca ggaggaccgt 960
tcccactctc acggccaagc gaatccgaag gccgaccggc tcgcgtcgac acaaccacct 1020
tcgaggtcgg tcagcgagta cgtgtgcgag acgaatacgt tcccgggcat attcgaatgc 1080
ctgcttactg ccgaggacgg gtggggacca tcgctcaccg gaccaccgag aagtggccgt 1140
tccccgacgc aatcggtcac ggccgcaacg acgccggcga agaacccacc taccacgtga 1200
cgttcgctgc ggaggaattg ttcggcagcg acaccgacgg cggaagcgtc gttgtcgacc 1260
tcttcgaggg ttacctcgag cctgcggcct gatcttccag cattccaggc ggcggtcacg 1320
cgatcgcagc ggttcgcgtg accgccgcct gatcacaacg attcactcat tcggaaggac 1380
actggaaatc atggtcgaca cacgacttcc ggtcacggtg ctgtcaggtt tcctgggcgc 1440
cgggaagacg acgctactca acgagatcct gcgcaatcgg gagggccgcc gggttgcggt 1500
gatcgtcaac gacatgagcg aaatcaacat cgacagtgca gaagtcgagc gtgagatctc 1560
gctcagtcgc tccgaggaga aactggtcga gatgaccaac ggctgcatct gctgcactct 1620
gcgagaggat cttctttccg agataagcgc cttggccgcc gatggccgat tcgactacct 1680
tctcatcgaa tcttcgggca tctccgaacc gctgcccgtc gcggagacgt tcaccttcat 1740
cgataccgac ggccatgccc tggccgacgt cgcccgactc gacaccatgg tcacagtcgt 1800
cgacggcaac agttttctgc gcgactacac ggctggaggt cgcgtcgaag ccgatgcccc 1860
ggaagatgaa cgcgacatcg cggatctgct tgtcgatcag atcgagtttg ccgacgtcat 1920
cctggtgagc aaggccgatc tcgtctcgca ccagcacctg gtcgaattga cttcggtcct 1980
aagatctttg aacgcaactg ctgcgatagt tccgatgact ctcggccgta tcccactcga 2040
cacgattctc gataccggct tgttctcgct cgagaaagct gctcaggccc ctggatggct 2100
acaagaactc caaggtgaac acacccccga aaccgaggag tacggaatcg gttcggtggt 2160
gtaccgcgag cgcgcgccct tccacccaca acgcctgcat gatttcctga gcagcgagtg 2220
gaccaacgga aagttacttc gggccaaggg ctactactgg aatgccggcc ggttcaccga 2280
gatcgggagt atttctcagg ccggtcatct cattcgccac ggatacgtcg gccgttggtg 2340
gaagtttcta ccccgtgacg agtggccggc cgacgactac cgtcgcgacg gaatcctcga 2400
caagtgggaa gaacctgtcg gtgactgccg acaagaactc gtcttcatcg gccaatccat 2460
cgacccatct cgactgcacc gagaactcga cgcgtgtcta ctcaccacag ccgagatcga 2520
actcgggcca gacgtgtgga ccacctggag cgaccccctg ggcgtcggct ataccgacca 2580
gaccgtttga aagctt 2596

Claims (4)

1.一种新型腈水合酶高效催化脂肪族二腈水合反应的方法，其特征在于，含有来源于红球菌Rhodococcuserythropolis CCM2595的腈水合酶的菌体的浓度为1-3g/L,底物脂肪族二腈终浓度20-50mM/L,转化体系为pH 7-8PBS缓冲溶液,25℃、200rpm振荡反应，反应5min后加入等反应体积甲醇终止反应，离心后取上清液，经过滤后进行高效液相色谱检测,氰基酰胺选择性大于90％；编码所述的腈水合酶的核苷酸序列为序列表中序列1所示；
所述的脂肪族二腈为己二腈。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，含有所述的腈水合酶的菌体制备步骤如下：
(1)质粒构建：来源于红球菌Rhodococcuserythropolis CCM2595的腈水合酶的基因序列由2596个核苷酸组成，以质粒pET-24a(+)为表达载体，根据其酶切位点特性，选择NdeI和HindIII酶切位点插入编码所述腈水合酶的基因序列，编码所述腈水合酶的基因序列来源于经过PCR得到的纯化产物；经过酶切后对相应DNA片段进行回收纯化，选用lacI启动子，加入卡那霉素KanR抗性基因片段，选用T7终止子，转化大肠杆菌TOP10，重组质粒经过酶切验证后命名为G0130349-1；
(2)蛋白表达验证：将步骤(1)中得到的重组质粒平行转化入BL21(DE3)和ArcticExpression(DE3)两种大肠杆菌感受态细菌中，加入LB液体培养基扩增培养后分别涂布于含50μg/ml卡那霉素(Kan)的LB固体平板，37℃倒置培养24h；分别挑取平板上单菌落接种于LB液体培养基中，培养至OD值为0.6-0.8时加入终浓度为0.1-1mM/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导3-24h；诱导完成后，离心收集菌体，洗涤后超声破碎菌体，进行SDS-PAGE分析，验证NHase蛋白表达情况；
(3)制备菌液：挑取步骤(2)中Arctic Expression(DE3)平板上单菌落接种于少量含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养12-18h得种子液；将种子液按体积1％接种量继续接种到含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD值为0.6-0.8时，加入IPTG使其终浓度为0.1mM/L，16℃、220rpm振荡培养24h得发酵液；离心去上清收集菌体，用pH7-8的PBS缓冲液洗涤2-3次后重新悬浮，得待用菌液。
3.如权利要求1所述方法中来源于红球菌Rhodococcuserythropolis CCM2595的腈水合酶在催化己二腈反应中的应用。
4.如权利要求1所述方法中来源于红球菌Rhodococcuserythropolis CCM2595的腈水合酶在制备5-氰基戊酰胺中的应用。
CN201910098275.6A 2019-01-31 2019-01-31 一种新型腈水合酶高效催化脂肪二腈水合反应的体系 Active CN109797164B (zh)

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